（生物化学与分子生物学专业论文）pin1蛋白家族的结构研究.pdf

p i i l l 蛋自家族的结构研究 摘要 蛋白质脯氨酸前的丝氨酸或苏氨酸的可逆磷酸化是一种重要的细胞信号调 控机制。近来发现的肽基脯氨酰顺反异构酶p i n l 能特异地识别和结合蛋白质磷 酸化的丝苏一脯氨酸基序，催化磷酸化的丝苏一脯氨酸肽键发生顺反异构，从而 改变磷酸化蛋白质的功能。越来越多的研究数据表明这种构型的改变影响了蛋白 质的催化活性、去磷酸化水平、蛋白质与蛋白质之间的相互作用、蛋白质的亚细 胞定位及蛋白的转运等。而且，这种磷酸化后的调节机制在细胞生长和疾病发生 如癌症和阿尔茨海默氏病中起重要作用。但目前对于p i n l 的这种催化调节机制、 以及其与底物相互作用的研究还很少。 本论文主要对人类p i n l 蛋白及p i n l 的两个关键结构域中的几个关键氨基酸 t r p 3 4 、l y s 6 3 、c y s l1 3 、m e t l 3 0 进行定点突变，我们对这些蛋白进行了大量表 达、分离、纯化，然后用悬吊液滴蒸汽扩散法制备得到晶体，通过回摆法收集衍 射数据并进行晶体结构解析。目前我们得到了h u m a np i n l w t 、p i n i - w 3 4 a 、 p i n i - k 6 3 a 、p i n l - c 1 1 3 a 、p i n l - m 1 3 0 a 。研究结果表明突变体p i n i - w 3 4 a 对底物 磷酸化特异性的识别能力及在体外的催化功能均丧失，而突变体p i n i - k 6 3 a 、 p i n l - c 1 1 3 a 其底物磷酸化特异性识别功能不受影响，但它的催化功能丧失；同 时，从p i n l k 6 3 a 、p i n l _ c l1 3 a 和p i n l m 1 3 0 a 中我们发现p p i a s e 结构域可能存 在两个磷酸根结合位点。同时我们成功克隆、表达了只含有p p i a s e 结构域的拟 南芥p i n l ( a t p i n l ) 、大肠杆菌p i n l ( e c o l ip a r l o ) 和布氏锥虫p i n l ( t b p i n l ) ， 并得到了a t p i n l 和e c o l ip a r l o 的晶体，但因a t p i n l 和e c o l ip a r l o 的晶体 质量不高，还需再进行优化；而t b p i n l 目前还没有得到其晶体。该研究为进一 步研究p i n l 的作用机制奠定基础，并为以后基于p i n l 的新药设计提供结构理论 依据。 关键词：p i n l ，圆二色谱，结晶，结构 a b s t r a c t p i n l 蛋白家族的结构研究 s t r u c t u r a la n a l y s i so fp i n l a n di t sh o m o l o g u e s t h er e v e r s i b l ep h o s p h o r y l a t i o no fp r o t e i n so ns e r i n eo rt h r e o n i n er e s i d u e s p r e c e d i n gp r o l i n e ( s e r t h r - p r o ) i sam a j o rc e l l u l a rs i g n a l i n gm e c h a n i s m r e c e n t i d e n t i f i c a t i o no ft h en o v e lp r o l y li s o m e r a s ep i nlt h a ts p e c i f i c a l l yi s o m e r i z e so n l yt h e p h o s p h o r y l a t e ds e r t h r - p r ob o n d si nc e r t a i np r o t e i n sl e d u st op r o p o s ean e w s i g n a l i n g m e c h a n i s m ， w h e r e b yp r o l y l i s o m e r i z a t i o n c a t a l y t i c a l l y i n d u c e s c o n f o r m a t i o n a lc h a n g e si np r o t e i n sf o l l o w i n gp h o s p h o r y l a t i o nt or e g u l a t ep r o t e i n f u n c t i o n e m e r g i n gd a t ai n d i c a t e st h a ts u c hc o n f o r m a t i o n a lc h a n g e sh a v ep r o f o u n d e f f e c t so n c a t a l y t i ca c t i v i t y , d e p h o s p h o r y l a t i o n ，p r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n s ， s u b c e l l u l a rl o c a t i o na n d o rt u r n o v e r f u r t h e r m o r e ，t h i s p o s t p h o s p h o r y l a t i o n m e c h a n i s mm i g h tp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nc e l lg r o w t hc o n t r o la n dd i s e a s e ss u c ha s c a n c e ra n da i z h e i m e r sd i s e a s e v e 叮l i t t l ei sk n o w na b o u ti t sc a t a l y t i cm e c h a n i s m a n di t si n t e r a c t i o nw i t hi t sb i o l o g i c a ls u b s t r a t e s t h e r e f o r e ，i nt h ec u r r e n ts t u d i e s ，w eh a v ef o c u s e do nt h es t r u c t u r a la n df u n c t i o n a l s t u d i e so np i nlm u t a n t sa n di t sh o m o l o g u e s w ec o n s t r u c t e df o u rp i n lm u t a n t s ：o n ei n t h ew wd o m a i n ( w 3 4 a ) a n dt h r e ei nt h ep p l a s ed o m a i n ( k 6 3 a ，c113 a ，m13 0 a ) p i nlw i l dt y p ea n dm u t a n t s p r o t e i nw e r ee x p r e s sa n dp u r i f i c a t i o n c r y s t a l so ft h e s e p i n lp r o t e i n sa r eo b t a i n e db yt h eh a n g i n gd r o pv a p o rd i f f u s i o nm e t h o d t h er e s u l t s i n d i c a t em u t a n tp i n1 w 3 4d e s t a b i l i z et h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h es u b s t r a t ei f , e g4 0 0 ) a n dp i n la n dt h u sa b o l i s h e dt h eb i n d i n go fs u b s t r a t e w ea l s of i n dp e g4 0 0m o l e c u l e h a sav e r ys i m i l a ro r i e n t a t i o nw i t ht h ep i nl w ti nt h ec a t a l y t i cp p l a s ed o m a i n m u t a n t ss t r u c t u r es u c h 私ci13 aa n dm i3 0 a f r o mo u rm u t a n t sk 6 3 a c113 aa n d mi3 0 a ，s u g g e s t i n gt h es e c o n ds u l f a t ei o ni sm o s tl i k e l yt h er e p r e s e n t a t i v eo ft h e s e c o n dp h o s p h a t eb i n d i n gs i t e i nas u m m a r y , t h e s es t u d i e sa l s op r o v i d e dn e w i n f o r m a t i o no np o t e n t i a lr e s i d u e si ns u b s t r a t eb i n d i n ga n dad e e p e ru n d e r s t a n d i n go f h o wp i nli n t e r a c t sw i t hi t sb i o l o g i c a lt a r g e tp r o t e i n s ，w h i c hc o u l dp e r h a p sh e l p e f f e c t i v er a t i o n a ld r u gd e s i g n p i n l 蛋白家族的结构研究 k e y w o r d s ：p i n l ，c r y s t a l l i z a t i o n ，s t r u c t u r e i l l p i n i 蛋白家族的结构研究 英文缩写目录 l i s to fa b b r e v i a t i o n s a 1 3 a m y l o i d1 3p e p t i d e s a d a i z h e i m e r sd i s e a s e a p ca d e n o m a t o u sp o l y p o s i sp r o t e i n a p p a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n a p s a m m o n i u mp e r s u l p h a t e a t h a l i a n a a r a b i d o p s i st h a l i a n a c d c i r c u l a rd i c h r o i s m c d k 2 c y c l i n - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e2 c s a c y c l o s p o r i n ea c t dc - t e r m i n a lr e p e a t e dd o m a i n c t f c a r b o x y - t e r m i n a lf r a g m e n t s c y pc y c l o p h i l i n e c o l i e s c h e r i c h i ac o l i f k b p f k 5 0 6 一b i n d i n gp r o t e i n h r ph o r s er a d i s hp e r o x i d a s e f p l cf a s tp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i p t g i s o p r o p y l1 3 - o 1 - - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e 刷k j u nn - t e r m i n a lp r o t e i nk i n a s e i v p i n l 蛋白家族的结构研究 l bl u r i ab e r t a n ib r o t h 礁气p k m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e n f t s n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s n i m an e v e r - i n m i t o s i sa p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l p h f sp a i r e dh e l i c a lf i l a m e n t s p l i s o e l e c t r i cp o i n t p i n l p e p t i d y l p r o l y lc i s t r a n si s o m e r a s en i m a i n t e r a c t i n g1 p p l a s e p e p t i d y l p r o l y li s o m e r a s e p p 2 a p r o t e i np h o s p h a t a s e2 a p s e r t h r - p m p h o s p h o r y l a t e ds e r i n eo rt h r e o n i n ef o l l o w e db yap r o l i n e s d s p a g e s o d i u md o d e c y ls u l p h a t ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s t bt e r r i f i cb r o t h z b r u c e i t r y p a n o s o m ab r u c e i t c f t e r n a r yc o m p l e xf a c t o r t e m e d n 潜n ，n ，- t e t r a m e t h y i e t h y l e n e d i a m i n e t m m e l t i n gt e m p e r a t u r e w tw i l dt y p e v 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果， 均在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究 生学术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( ”1 、关粒) 课题 ( 组) 的研究成果，获得( ”i ，1 i r 殡蒎皇) 课题( 组) 经费或实 验室的资助，在( 垃孵俄迳) 实验室完成。( 请在以上括号 内填写课题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的， 可以不作特别声明。) 声明人( 签名) ：磷。雨南 ：呻) 年毛月2 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实簏办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送 交学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图 书馆及其数据库被查阅、借阅。本人犀意厦门大学将学位论文加入 全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的 标题和摘要汇编出舨，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位 论文。 本学位论文属于： () 王经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月曰解密，解密后适用上述授权。 ( ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“或填上相应内容。保密学位论 文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学 保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的， 默认为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：凇，蕊戋 。亩c ) 年6 月二e t p i n l 蛋自家族豹结构研究 1 前言 i 1 肽基脯氮酰顺反异构酶( p p l a s e ) 家族 肽基脯氨酰顺反异构酶( p e p t i d y l 一p r o l y li s o m e r a s e ，p p i a s e ) ( e e5 。2 1 8 ) 是一种在原核和真核生物体内普遍表达的蛋白，它能催化加速肽基脯氨酸的顺反 异构，首先发现它能在蛋白质的折叠解折叠中起重要作用。它也可参与蛋白质 复合物的组装解组装、蛋白质运输以及蛋白质活性的调节雒1 。p p i a s e s 根据其序 列同源性和功能特异性可分为三大家族：亲环蛋自( c y c l o 曲i l i n ) 家族、f k 5 0 6 结合蛋自( f k b p ) 家族、微小菌素蛋匙家族( p a r v u l i nf a m i l y ) 。 亲环蛋白能特异性地和免疫抑制剂环胞霉素a ( c y c l o s p o r i n ea ，c s a ) 结合。 亲环蛋白作用涉及抑制t 细胞活化信号的传导、肽基脯氨酸顺反异构酶活性、蛋 白折叠、分子伴侣活性、人类免疫缺陷病毒以及光转导等。亲环蛋白对于器官移 植中免疫抑制剂的作用和人类类固醇激素受体的活化调节都具有重要意义晗1 。 f k 5 0 6 结合蛋白荧l j 特异性地和免疫抑制齐j f k 5 0 6 结合，f k 5 0 6 是从t s u k u b a e n s i s 链 霉菌发酵产物中提取的大环内酯类抗生素，具有显著的免疫抑制功能，可抑制机 体的细胞和体液免疫过程，在抑制多种器官同种异体移植术后排斥反应方面，也 显示了高度的免疫抑制作用，并明显强于c s a 。f k 5 0 6 与c s a 的免疫抑制机制相似， 主要是通过与t 细胞表面相应的结合蛋白( f k 5 0 6 结合蛋白和环亲合素) 结合，作 用于细胞内的钙和钙调蛋白依赖性的蛋白磷酯酶，使t 细胞活化核因子的核内转 移受到抑制，从而抑制转录i l - 2 、i l 2 r 的基因表达，使t 细胞的增殖和免疫活性 受到抑制嚏引。微小菌素蛋白主要是与真核细胞生长密切相关的酶，包括人类p i n l 蛋囊及酿酒酵母菸s 圭p t f l 蛋自酶。 这三个家族在主要序列和三维结构上并不相似，却都能催化蛋自质脯氨酸残 基n 末端肽键的顺反异构化反应。肽基脯氨酰顺反异构酶是催化蛋白折叠的限 速步骤，此异构反应可自主进行，亦可由p p i a s e 催化。假脯氨酸残基前s e r t h r 的磷酸化在很大程度上制约了s e r t h r p r o 序列中肽键的自发异构并且使其对其 p m l 自家族结构研究 他p h a s e ：如亲环紊、f k 5 0 6 结合蛋白以及其他微小菌素的结台具抵抗性。相反， p i n l 型p p i a s e 却j 能有效催化磷酸化p s e r t h r p r o 的异构而对非磷酸化 s e r t h r p r o 无催化异构作用7 ( 图l1 ) 。 蛋白质分子在其脯氨跤前的丝苏氨酸( s e r t h r p r o ) 发生可逆磷酸化是调 节蛋白质功能的一种重要机制，但研究证明这仅是改变蛋白质功能的第步，这 类磷酸化蛋白定区段内磷酸化丝苏氨酸基序( p s e r t h rp r o ) 还必须被肚基脯 氨酰顺反异酶p i n l 进行高度专一性的顺反异构，从而改变靶蛋白的构象，调节 靶蛋白的活陛、稳定性、磷酸化水平、亚细胞定位以及与其他蛋白质之间的相互 作用8 。这种新的磷酸化后调节机制对调节蛋白质的功能起着重要作用。机体 内参与渊节细胞周期运行、基因转录、及众多信号转导途径等的蛋白质多含有丝 苏氨酸基序，它们的活性和功能均受p i n l 的调节。 “。 乌 。 = 。：i i 。ue t a l ( 2 0 0 2 ) t r e n d i n c e l l b i o l o g y 图1 - 1p p l a s e s 和p i n l 的功能 f i g u r e l - l ：t h e f u n c t i o no f p p l a s e sa n d p i n l 1 2p i n l 蛋白家族组成与分布 p i n l ( e c 52l8 ) 是1 9 9 6 年首次被发现，是进化r 非常保守的肽基脯氨酰顺 反异构酶家族的成员，属微小菌素蛋白家族成员。最初是由酵母双杂交筛选出来 l：，审。鼙。 、 ?二， p i n l 蚩白家磋的结构研究 的一种功能蛋白，它能结合并且抑制n i m a ( n e v e r i nm i t o s i sa ) 的毒| 生，而 n i m a 是+ 种作用于口s e r t h rp r o 基序l 的真菌有丝分裂磷酸化激酶，并且诱导 真核细胞有丝分裂。因此p i n l 的名字柬源于p e p t i d y l p r o l y lc i s t r a n s i s o m e r a s en i m a i n t e r a c t i n g1 。目前，p i n l 蛋白家族成妯已有1 2 个，在原 核和真核生物体内都广泛分布( 图1 2 ) 。本硷文主要帆人类p i n l 、植物p i n l ( m p i n l ) 、大肠杆菌p i n l ( ec o llp a r l o ) 和布氏锥虫p i n l ( t b p i n l ) 这叫种 同源蛋白来研究p i n l 蚩白的结构和功能。 p i n la n di t sh o m o l o g u e s p i n l h u m a n 口二：习 d o c i o d r o s o p h i l a p i r l l a s p e r o i l l u s $ s p ln e u r o s p o m p _ n ad b t v o s t e f i u m p i n l ad r o s o o h i l a 引n 1t c r u z i p f n l7 - b r u c e d i n l l m a i o r p i n l 晰a f 目月a p a r l0e c o i l 二二二二五主二 ：墨【l 二二五三二 髓p _ o l v 【o 堕圣二 工面丑 田墨 一 l 二墨_ 工二二至五二二二 ： r 磊i _ 一 _ l ? “n ： i 图卜2 不同物种的p i n l 的一级结构示意圈 f i g u r e l - 2s c h e r o a f i cr e p r e s e n t a t i o no f t h e p i n p r i m a r yd o m a i n s t r u c t u r eo f s e l e c t e dp i n lp r o t e i n sf r o md i f f e r e n ts p e c i e s 1 2 1 胁p i n l 蛋自 人类删基冈编码r 种调节有丝分裂的核蛋白，是肽基脯氨酰顺反异构 酶家族成员之。用人类基因表达序列标签( e x p r e s s i o ns e q u e n c et a g ，e s t ) 研 p h i 置自家族的镕构研究 究发现，它有两种非常相似但又不尽相同的转录本，其中一种转录本对应于尸舢 基因序列。荧光原位杂交分析证实r 这两种转录本基凶的染色体定位：p n 1 定 位于1 9 p 1 3 ：兄一成员p i n i l 则定位于l p 3 1 。二者的c d n a 序列同源性达8 9 。 目前p i n i l 编码的蛋白质的功能尚未完全阐明，p i n l l 可能足一个被转录的假基 凼。p i n i 基 e l 编码的p i n l 蚩自是种相对分子量( i b k d a ) 的肽基脯氨酰顺反异 构酶，由t 6 3 个氨基酸残基组成，包含阿个结构域，个是氨基末端的色氢酸 色氨酸中心( w w ) 区，由3 9 个氨基酸残基组成，咀两个恒定的色氨酸为特征，介 导其与磷酸化底物蛋白质的结合；另个为羧基末端的肽基脯氨酰顺反异构酶 ( p p i a s e ) 区，由1 2 0 个氨基酸残基组成，此区包含活化位点( 图卜3 ) 。w w 区与 p p i a s e 区由可变性序列连接。”。p i n l 和耙蛋白的相互作用大致分为三步：首 先激酶在s e r t h rp r o 位点磷酸化底物：然后p i n l 结合该位点：最后p i n l 催化 异构该蛋白，改变其活【生“。 w t 一 ： ! ! ! ! ! i _ _ l _ _ i i j z l ! i ：5 日z i e e e i ：e _ 。t 一n u s p p b 6 ed o m a i n w wd o m a i n r a n g a n a t t m n , re ta i c e 1 9 9 7 图卜3 人类p i n l 的一维结构示意圈和三维结构图 f i g u r e l - 3 t h e p r i m a r ya n d t e t e r i a l s t r u c t u r eo f h u m a n p i n l p l n l 无任何信号输出功能，其弧细胞定位取决于w w 区与底物之间的相互作 用“。在体外培养细胞中，p i n l 土要位于细胞核“；但在体内多种细胞类型的胞 核和胞质中均发现y p i n l 的存在”“，这很可能是凼为体内细胞质中有更多p i n l p i n l 蛋囱家族静结构磷究 底物的存在。在阿尔茨海默氏( a d ) 病入神经元中，h n l 与磷酸化的t a u 或者其 他有丝分裂磷酸化蛋白单克隆抗体( m p m 2 ) 共定位于细胞质中滔，1 2 ，蠲。 1 2 2a r a b i d o p s i st h a l i a n ap i n l 蛋白 在拟南芥中，发现了一种和人类位点特异性的肽基脯氨酰顺反异构酶p i n l 的同源蛋自a t p i n l 。该a t p i n i 基因定位于拟南芥的二号染色体上，有一个内含 子，其c d n a 由3 5 7 个碱基组成i l5 。a t p i n l 的m r n a 在植物的所有组织都可以 检测到。在真核生物中，a t p i n l 蛋白是第一个被发现没有n 端或c 端延伸的微 小菌素蛋白。该a t p i n l 蛋白由1 1 9 个氨基酸残基组成，和h u m a np i n l 蛋白相比， 它没有氨基端的色氨酸一色氨酸( w wd o m a i n ) 结构域，只有肷基脯氨酰顺反异 构酶( p h a s e d o m a i n ) 结构域 1 6 1 a t p i n l 蛋自帮其他p i n i 型p p i a s e s 通过序列比对， 显示他 | 、措l 催化中心有很高的保守性( 图l - 4 ) ，它的催化中心跟人类p i n l 有5 3 的同源性。虽然a t p i n l 没有w w 结构域，但跟其他p i n l 型p p i a s e s 相比，它有 一个四个氨基酸残基插入区( k i i l ) ( 图1 4 ) ，该区与磷酸化底物的特异识别有 关，所以a t p i n l 也仅特异专一识别磷酸化的s e r - p r o 键，属于p i n l 型p p i a s e s 1 7 - 1 9 1 。 zb r u c e ip i n l 是来源于布氏锥虫( zb r u c e d 体内的一种新的p i n l 型 p p l a s e 。它壹1 1 5 个氨基酸残基组成，跟a t p i n l 一样，也只有肽基脯氨酰颁反 异构酶( p p i a s e ) 结构域，没有氨基端的色氨酸色氨酸( w w ) 结构域，研究发现 它也属于p i n l 型p p i a s e s t 2 0 1 。寄生于入体的锥虫有聪种类型，它们分别引起非洲 锥虫病( a f r i c a nt r y p a n o s o m i a s i s ) 和美洲锥虫病( a m e r i c a nt r y p a n o s o m i a s i s ) 。 前者又称非洲昏睡病或睡眠病( a f r i c a ns l e e p i n gs i c k n e s s ) ，后者则又称恰加 斯病( c h a g a s d i s e a s e ) 。非洲锥虫病是由布氏锥虫复合体( t r y p a n o s o m ab r u c e i c o m p l e x ) 内的3 个驱种，即布氏冈比亚锥虫( fb r u c e ig a m a b i e n s e ) 、布氏罗得 西囊锥虫( 互b r u c e ir h o d e s i e n s e ) 和布氏锥虫( 五b r u c e lb r u c e d7 1 起的。美洲 锥虫病是由克氏锥虫( 王c r u z i ) 孳| 起的。 5 p i n f 蛋白象旌的结构研究 墨墨厨 口蕊 品蕊赢高删- e k l10， ! ! - 一二二二二二二二! ! 二二! 二二二! ! 二二= _ _ lf 焉一燃露_ 唧曼| !曩! 曼专南 瞽 二 i ：辫皋：嚣目：1 蘸麟需 1 j 口_ 一- j “一一di h jw j j j 0 i l l - 一j - _ 黔粉麓雉| | 图l _ 4p i n l 型p p i a s e s 的氨基酸序列比对 f i g u r e4a m i n oa c i ds e q u e n c ea l i g n m e n to ft h ep i n l t y p ep p l a s e so ft h e p a r v a l i nf a m i l yu s i n gt h ec l u s t a l w 2p r o g r m n r e s i d u e si d e n t i c a lt 0t h ec o l u m n c o n s e n s u sa r ec o l o rb a c k 2 r o u n d ；s i m i l a rr e s i d u e st ot h ec o l u m nc o n s e n s u sa r e s h a d e di nt h es a m ec o l o nh p i n li sf r o mh u m a n ( a c c e s s i o n sn u m b e ra a c 5 0 4 9 2 ) ， d o d oi sf r o md m e l a n o g a s t e r ( a a c 2 8 4 0 8 ) a t p i n li sf r o ma t h a h a ，m f a a d 2 0 1 2 2 ) t b p i n l i sf r o mz b r u c e i ( a a x 6 9 3 5 7 ) , a n dp a r l 0i sf r o me c o l i $ 4 8 6 5 8 ) t h ef o u r - r e s i d u ei n s e r t i o ni nt h ep l a n tp r o t e i ni sb o x e d l2 4e s c h e r i c h i ac o l ip a x l 0 蛋白 微小菌素蛋白( p a r v u l i n s ) 在原核和真棱生物体内都广泛存在，在日前基冈 组史库里其【司源蚩白的分了壁范围在1 0 - 6 8 k d a 之问1 。e c o l i p a r l o 蛋白是肽 ，日hljld 篙 再 堕i 三叫= _ 坐熏 西” 丛需 i v 一藿 册叩肟；雌 id日 m叭旺州鲋；：=n叫 h e 0 k e 比札垤bf旷lr由虬 伸忡n叫 咛a _，丑 ， _ p i n l 蛋囱家族盼结构研究 基脯氨酰顺反异构酶家族中微小菌素蛋白的最小成员，由9 3 个氨基酸残基组成， 和人类p i n l 蛋白相比，它只有一个肽基脯氨酰顺反异构酶( p p l a s e ) 结构域，没有 色氨酸色氨酸中心( w w ) 结构域。研究发现p a r l 0 蛋自与a t p i n l 蛋白的一样，璃 p i n l 型p p i a s e s ，作用于脯氨酸所形成的肽键，并且使其发生顺反异构。在大肠 杆菌中，p a r l 0 帮助蛋白质的成熟和参与蛋白质的功能调节 2 2 - 2 4 1 。 1 3pin 1 的功能调控 p i n l 的功能受到多种机制的紧密调控。首先，它严格依赖于底物中特定 s e r t h r p r o 的磷酸化【1 。p i n l 仅特异性催化p s e r t h r - p r o 的异构体，而对非磷酸化 的s e r f r h r p r o 无作用。其次，p i n l 由转录因子e 2 f 介导的生长信号诱导表达，其 蛋白表达水平随正常细胞周期波动，它在正常细胞内表达量主要与细胞增殖相关 瑟弱。最后，p i n l 还受转录震修饰，如磷酸化调控2 6 。w w 区s e r l 6 位于p s e r t h r - p r o 结合西袋的中心，其磷酸化会抑制巍n l 与其底物结合并影响其功麓刀。p i n l 的磷 酸化在整个正常细胞周期中均受到调控。此外，p i n l 还受蛋白水解酶的调控。 i 4p i n l 与细胞周期调控 l 。4 1p i n l 与c y e l i n d 在细胞增值周期中，c y c l i n d 是g i s 期时相转变调控点的重要调控因子。 在g i s 期，c y c l i n d 累积达到一定阙筐爱，即与楣废的c d k ( 主要是c d k 4 积 c d k 6 ) 结合进两作用于p r b ，使之磷酸化后释放e 2 f ，以启动驱动基因t x 的转 录表达，驱使细胞通过检测点，启动d n a 复制。抑制c y c l i n d 的表达，可使细 胞不能从g 1 期进入s 期，而其过表达则使g 1 期缩短。 p i n l 可直接或间接与c y c l i n d l 相互作用而调节细胞周期( 图1 5 ) 。p i n l 基因 的启动子有3 个e 2 f 的结合位点。e 2 f 家族蛋白都可以与这些位点结合而激活 p i n l 启动子。嚣2 f 承b 通路异常可弓| 起p i n l 的商表达。 p i n l 可经r a s 信号转导途径活化c - j u n ，增强c y c l i n d l 的转录。r a s 经一个 信号级联反应两活化一系列蛋自激酶，特别是m a p k ( 有丝分裂原活化蛋白激 酶，m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s ，m a p 激酶) ，它直接使c - j u n 的第6 3 ，7 3 7 p m l 蛋自家旗的结掏究 位s e r 磷酸化，无活性的c - j u n 变为有活性的c - j u n m 。p m l 与磷酸化的c - j u n 结 合并将其异构化：即由顺式变为反式，并使其完全活化，活化后的c - j u n 继而激 活c y c l i n d l 启动子的a p 1 位点，导致c y c l i n d l 的表达2 ”。a p 1 编码转录因子 j u n ，f o s 等，在c y c l i n d l 启动了有结合位点。抑制体内的p i n l ，使磷酸化c - j u n 的转录活陛降低叫】。存对鼠的研究巾发现，敲除c y c l i n d l 基因，会抑制由n e u r a s p i n l 也经b - c a t e m n 信号转导通路卜调c y c l i n d l 。1 3 - c a t e n i n 是一种多功能蛋白 大肠腺瘤息肉样蛋白( a d e n o m a t o u sp o l y p o s i sc o l i ，a p c ) 复合体结合，从细胞核 转移到细胞质并经泛素一蛋白酶小体系统降解。p i a l 与b 。c a t e n i n 邻近a p c 结合位 导致b c a t e n i n 在细胞核内聚集，而作用于c y c l i n d l 启动了的t c f ( t c e l lf a c t o r ) 位 点，提高了d c a t e n i n t c f 信号转导通路激活下游耙基因的能力，从而使c y c l i n d l 转录增强，其表达上调0 3 叩”。p i n l 基因敲除小鼠中1 3 - c a t e n i n 表达f 调，这与 c y c l i n d l 皋冈敲除小鼠表型相似】，致癌基因转录激活子b c a t e n i n 的上调在癌症 、l c “5 互、三二龟。- ! ! i 一 毒，“ 囊器i 乒亏 l u ( 2 0 0 3 ) + c a n c e r c e l l 4 ：1 7 5 1 8 0 图卜5p i n l 在细胞信号转导中对细胞周期素d 1 的调节途径 f i g u r e l - s r o l e so f p i n l i n t h er e g u l a t i o no f c y e l i n d l i nc e l l p r o l i f e r a t i o na n d o n e o g e n e s i s p i n l 蛋白家族的结构研究 p i n l 通过胆船途径增强c y c l i n d l 的转录。n f - k b 信号由i k k 介导核转录因子 n f - r , b ( n u d e a rf a c t o r - r , b ) 磷酸化和随后n f - k b 抑制因子i k b 0 【降解而激活p 2 1 。使 n f - k b 转移到核内激活转录。n f - k b 的目的基因之一就是i k b a ，它能使核n f - k b 转 移到胞质中并抑制它的活性 3 2 1 。在细胞因子刺激下，p i n l 与n f - k b 的p 6 5 r e l a 亚 基的p t h r 2 5 4 - - p r o 序列结合，阻止了n f - k b 与其抑制物i k b o 【的结合及n f - k b 的核外 转运和泛素介导的蛋白水解。这样便增强了n f - k b 蛋白的稳定性及其在核内的聚 集，并增强了它的耙基因c ”l i l l d l 等的转录活性【3 3 】。 信号转导通路由癌基因n e u r a s 活化的多种脯氨酸蛋白激酶激活，最终有多 种转录因子，包括e 2 f ，c - j u r e a p 1 ，f l - c a t e n i n ，n f - k b 而加强z y c l i n d l 的转录， c y c l i n d l 的稳定性由后转录磷酸化位点t h r 2 8 6 p r o 调控【3 4 1 。c y c l i n d l 是p i n l 重要 的耙基因之一，p i n l 不仅可以从转录水平促进! c y c l i n o l 的转录，而且还可以通过 诱导c y c l i n d l 的构象改变阻止其从胞核内迁移至胞浆降解，从而引起c y c l i n d l 的 过表达，促进细胞的转化增值【3 1 1 。上调p i n l 能够通过激活c - j u n a p 1 ， 1 3 - c a t e n i n t c f ，和n f - k b 转录因子从而提高c y c l i n d l 的表达水平【3 5 1 。p i n l 也可直 接结合c y c l i n d l 磷酸化的t h r 2 8 6 p r o 序列，并通过抑制其入浆而稳定核 c y c l i n d l l 3 6 】。p i n l 的表达被： n e u r a s 经由e 2 f 上调，p i n l 上调正反馈加强n e u r a s 的下游信号和c y c l i n d l 的稳定性【2 5 】。 1 4 2p i n l 与c d c 2 5 磷酸酶是一种重要的有丝分裂调节因子。在有丝分裂期间，它的活性由其定 位及磷酸化状态调节。在间期，c d c 2 5 以一种低磷酸化的状态存在，与1 4 3 3 蛋白共定位于细胞质中，阻止其过早的进入分裂期，活性较低。进入分裂期后， 其活性以一种未知机制迅猛增加，这一机制至少包括四个不同的反应过程：