（生物化学与分子生物学专业论文）gmsark基因的cdna克隆、体外表达和活性分析.pdf

ab s t r a c t ab s t r a c t s e n e s c e n c e o f p l a n t i s n o t o n l y i n d u c e d b y s t r e s s e s i n c i r c u m s t a n c e s b u t a l s o c o n s i d e r e d a s a p r o c e s s c a l l e d p r o g r a m m e d c e l l d e a t h . s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y o f s e n e s c e n c e i s t h e k e y p o i n t o f t h i s p r o c e s s . r e v e r s i b l e p r o t e in p h o s p h o ry l a t i o n i s t h e e s s e n t i a l a n d m a i n m e c h a n i s m f o r s i g n a l t r a n s d u c t i o n i n c e l l s . a d v a n c e d r e s e a r c h o n s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f p r o t e i n k i n a s e s in v o lv e d in s i g n a l t r a n s d u c t i o n w i l l l e a d u s t o k n o w m o r e a b o u t t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m i n r e g u l a t i o n o f p l a n t gr o w t h a n d d e v e l o p m e n t . a gre a t a m o u n t o f w o r k h a s b e e n d o n e t o d e m o n s t r a t e t h e c r u c i a l f u n c t i o n o f p l a n t r e c e p t o r - l i k e k i n a s e s ( r l k s ) i n r e g u l a t i o n o f p l a n t gr o w t h a n d d e v e l o p m e n t , r e s p o n s e t o a d v e r s i t y a n d s i g n a l h a n s d u c t i o n o f p l a n t h o r m o n e , a n d ma n y p l a n t r l k s h a v e b e e n s t u d i e d . h o w e v e r , t h e r e i s h a r d l y a n y s t u d y o n t h e s p e c i fi c r l k s i n v o lv e d i n p l a n t s e n e s c e n c e . d u r i n g s t u d 如 n g o n t h e m e c h a n i s m o f s o y b e a n l e a f s e n e s c e n c e , o u r l a b h a s c l o n e d a n e w r e c 印f o r - l i k e k i n a s e g e n e n a m e d g m s a r k ( g ly c i n e m a x s e n e s c e n c e - a s s o c i a t e d r e c e p t o r k i n a s e ) . g m s a r k m a y a c t a s a n u p s t r e a m c o m p o n e n t i n s e n e s c e n c e s i g n a l i n g p a t h w a y s v i a r e g u l a t i n g c h l o r o p h y l l a c c u m u l a t i o n . t h r o u g h t h e a n a l y s i s o f b i o i n f o r m a t i c s , w e h a v e i d e n t i fi e d t h e e x t r a c e l l u l a r d o m a i n , t r a n s m e m b r a n e d o m a i n , k i n a s e d o ma i n a n d a l l 1 1 s u b d o m a i n s o f g m s a r k . g m s a r k s h o w e d h i g h h o m o l o g y w it h m a n y r e c e p t o r - l i k e k i n a s e g e n e s , e s p e c i a l l y l r r ( l e u c i n e - r i c h r e p e a t s ) r e c e p t o r - t i k e k i n a s e g e n e s w h e n a l i g n e d w i t h t h e d a t a b a s e i n g e n e b a n k . g m s a r k i s a p u t a t i v e s e r / t h r r e c e p t o r - l i k e k i n a s e . b e s i d e s , w e h a v e d o n e p i l o t s t u d y o n t h e b i o c h e m i c a l a c t i v i ty o f g m s a r k . we c r e a t e d t w o p r o k a ryo t i c e x p r e s s i o n c o n s t r u c t s g s t g m s a r k - e d a n d g s tg m s a r k - k d d r i v e n b y i n d u c i b l e p r o m o t e r a n d f u s i n g w i t h g s t . we o b t a i n e d t h e s e t w o p r o t e i n s b y t h e p r o k a ry o t i c e x p r e s s i o n s y s t e m , a n d d e t e c t e d t h e a u t o p h o s p h o ry l a t i o n a n d k i n a s e a c t i v i ty o f g s t g m s a r k - k d w i t h f -t .3 z p a t p . w e f o u n d t h a t g s t g m s a r k - k d c o u l d a u t o p h o s p h o ry l a t e i n v i t r o a n d c a t a l y z e p h o s p h o ryl a t i o n o n h i s t o n e h l w h i c h i s a k i n d o f u n i v e r s a l s u b s t r a t e f o r k i n a s e . n ab s t r a c t f r o m t h e s e r e s u l t s , w e p r e l i m i n a r i l y i d e n t i f y g m s a r k a s a p l a n t p r o t e i n k i n a s e , a n d w e p r e s u m e t h a t i t s p h o s p h o ry l a t i o n s t a t u s m a y b e e s s e n t i a l f o r i t s i n v o l v e m e n t i n s e n e s c e n c e s i g n a l i n g p a t h w a y s . t h i s s t u d y h a s l a i d a g o o d f o u n d a t i o n f o r f o l l o w in g r e s e a r c h o n t h e b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r o f g m s a r k , a n d p ro v i d e d a t h e o r e t i c a l s u p p o rt f o r p r e v i o u s f u n c t i o n a l r e s u l t s fr o m p l a n t e x p e r i m e n t s . k e y w o r d s : l e a f s e n e s c e n c e , r e c e p t o r - l i k e k in a s e , g m s a r k , a u t o p h o s p h o ry l a t i o n , k i n a s e a v t i v i ty 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、 保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本;学校有权保存学位论文的印 刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、 数字化或其它手段保存论文; 学校有权提供目 录检索以 及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务; 学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版: 在不以 赢利为目 的的前 提下，. 学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学 位 论 文 储签 名 : i 炙 四年 ”西日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名:学位论文作者签名: 解密时间:年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下: 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文， 是本人在导师指导下， 进行 研究工作所取得的成果。 除文中己 经注明引用的内 容外， 本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、 已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体， 均已 在文中以明确方式标明。 本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学 位 论 文 作 者 签 名 :h h -k l q q 年s 月 z s 日 第一章 引言 第一章 引言 近年来随着植物分子生物学的发展，人们发现植物的衰老不仅仅是外界环 境 影 响 的 结 果 ， 而 是 一 种 程 序 性 死 亡( p r o g r a m m e d c e l l d e a t h , p c d ) 过 程 ill 。 所 谓程序性死亡是指，植物的死亡不是由于环境因子 ( 如物理、化学和生物等) 直接作用的结果，而是植物通过感受外界信号，经过一定的信号传递途径， 激 活与衰老相关的基因，再由 这些基因的蛋白 质产物使植物植株或器官发生衰老 死亡的过程。 这个过程最大的 特点是:自 主性和有序性。 在这个过程中，衰老 的信号转导途径是研究的重点。 生命信息的传递在应答环境刺激、调节基因表达和做出生理反应的同时， 不仅维持着细胞正常代谢，而且在细胞增殖、生长、分化、衰老和死亡等生命 的基本过程中起着重要作用。从分子生物学意义讲，细胞信息传递过程是以一 系列蛋白质的构象和功能改变为基础的级联反应，而蛋白 质磷酸化则是这一过 程中最基本的公共通路。也就是说，生物信号在细胞内传递的基本和主要方式 是通过蛋白质的可逆磷酸化作用实现的。 自 从e d m o n d h . f i s c h e r 和e d w i n g k r e b s 在5 0 年代发现蛋白 质可逆磷酸化 作用而获得1 9 9 2 年诺贝尔生物医学奖以来，对蛋白可逆磷酸化的研究有了突飞 猛进的发展，对种类繁多的蛋白 激酶和蛋白 磷酸酶的研究现已 扩展到整个分子 生物学和细胞生物学领域。各种蛋白 激酶和磷酸酶作用于多种功能蛋白，功能 蛋白通过磷酸化和脱磷酸化两种构象互变所产生的活性或性质的改变调节细胞 内的生命过程。 第一节 蛋白激酶活性的调节 蛋白激酶之所以具有如此重要的功能，是因为其激酶活性的调节机制非常 灵活，使得蛋白激酶可以成为生物体调节生命活动的开关与闸门。 1 . 1 . 1磷酸化对蛋白激酶活性的调节 蛋白 激酶可以 催化腺昔三磷酸( a t p ) 的1 磷酸转移到蛋白 质底物中的丝氨 第一章 引言 酸 ( s e r ) 、 苏氨酸( t h r ) 残基控基和酪氨酸( t y r ) 残基酚轻基， 或赖氨酸( l y s ) 残基的 一 氨基、 组氨 酸 ( h i s ) 残基的咪 哇 基 和 精氨酸( a r g ) 残基的 肌基。 磷 酸 化可以发生在分子内和分子间.根据磷酸化的蛋白底物氨基酸残基的不同，可 以分为酪氨酸蛋白激酶 ( t p k)和丝氨酸/ 苏氨酸蛋白 激酶。 1 . 1 . 1 . 1蛋白 激酶自 磷酸化 ( a u t o p h o s p h o r y l a t i o n ) 对激酶活性的调节 近年来研究发现几乎所有的蛋白激酶均能发生自 磷酸化，即激酶能通过分 子内机制催化自 磷酸化，自 身活性发生改变。自 磷酸化常常是很多信号转导途 径中的关键事件。 ( 1 )酪氨酸蛋白 激酶 ( t y r o s i n e p r o t e i n k i n a s e . t p k ) 酪 氨 酸 蛋白 激 酶自 磷 酸 化发 生 在 酪 氨 酸 残 基 而 激 活 激 酶。 大 多 致 生 长 因 子 ( 如e g f , p d g f , i g f 等) 受体具有内 在的酪氨酸蛋白 激酶活性2 1 。当生长因 子与这类受体结合后，受体所包含的酪氨酸激酶发生自磷酸化而被活化，进而 磷酸化细胞内的其他靶蛋白。 ( 2 )丝氨酸/ 苏氨酸蛋白 激酶 丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶的自磷酸化发生在丝氨酸/ 苏氨酸残基上而对激酶 活性和性质产生重要的调节作用。 c g mp 依赖的蛋白激酶 ( g激酶) 是同 源二聚体，每个亚基分子量为8 0 k d , 都能发生自 磷酸化。g激酶每个亚基在与c g mp结合时，自磷酸化能维持g激 酶催化区域底物位点的暴露，延长激酶活性;在 c g mp缺乏时，g激酶自 磷酸 化对激酶活性起抑制作用3 1 蛋白 激酶c ( p k c ) 是有多种亚型的蛋白 质家族， p k c的成员为一条单链。 p k c也能通过分子内 机制发生自 磷酸化， 磷酸化后的p k c对 c a z 和佛波醇醋 ( p k c的激活剂)的亲和力增加，并对底物蛋白的k m值降低到十分之一而激 活。因 此， p k c自 磷酸化是各种刺激信号 传递、 放大的 必要步骤a ) 1 . 1 . 1 . 2蛋白激酶之间的磷酸化作用对激酶活性的调节 许多受体蛋白 ( 如e g f受体、白介素2 受体)等不仅有酪氨酸激酶活性能 自 磷酸化，而且也能被其他的丝氨酸/ 苏氨酸激酶 ( 如 p k c )磷酸化，导致了受 体亲和力与酪氨酸激酶活性下降。有些酪氨酸激酶也能催化某些丝氨酸/ 苏氨酸 蛋白激酶的酪氨酸残基磷酸化而激活丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶，如胰岛素 ( i n s ) 第一章 引言 受体激酶能催化高密度微粒体蛋白 激酶( h d m激酶) 和微管结合蛋白 一 2 ( m a p - 2 ) 激酶( 即m a p k ) 的 酪 氨 酸( 珍 ) 残基 磷酸 化 而激 活h d m激 酶 和m a p k激 酶。 此外，蛋白 激酶之间也能相互磷酸化而彼此调节激酶活性，如 ins受体激酶与 c a t / c a m激酶之间的 相互磷酸化 ( 分子间 机制) 而使两类激酶活性、 性质发生 重要改变。这是激酶的一种重要的调节方式。 1 . 1 . 2调节剂对蛋白 激酶的活性调节 蛋白激酶活性还受到许多物质的调节。在生物体内，有许多小分子物质可 以作为第二信使来执行功能， 使机体对信号的反应更加精确且广泛。 如: c a m p 能激活蛋白 激酶a , c g m p 能激活蛋白 激酶g , c a z + / c a m激酶的 激活需要c a + 和c a m， 蛋白 激 酶c的 激活需 要c 犷 + 和 磷脂， 特别是磷 脂 酞丝 氨酸 ( p s ) 。 另 外 很多 金 属离 子 对蛋白 激 酶的 激活 是 必 需的 ， 如组 氨酸 激 酶 需要m i 十 ， 许多 核 内 蛋白 激酶需要c e或m n z + e 蛋白磷酸酶通过去磷酸化作用对蛋白激酶的活性也起着很重要的调节作 用。如 c d 4 5是位于白 细胞表面的白细胞共同抗原，它可以发挥磷酸酶活性使 s r c 家族蛋白酪氨酸激酶的抑制位点磷酸化，激酶区内自 磷酸化位点去磷酸化， 而 s r c家族蛋白酪氨酸激酶的这两个主要的磷酸化位点的磷酸化状态决定了激 酶的活性。因此，c d 4 5 分子既可对s i c 家族蛋白酪氨酸进行正向调节，又可对 其进行负向调节。 此外，人们已经认识到许多对蛋白激酶有特异性抑制作用的抑制剂，如氛 化高铁血红素能抑制染色质结合的蛋白 激酶，蛹虫草菌素 ( 3 一 脱氧腺昔) 是核内 蛋白激酶的抑制剂。 第二节 植物类受体激酶 植物类受体激酶 ( r e c e p t o r - l i k e k i n a s e s , r l k s ) 是一类包含胞外受体域、 单 次跨膜域和胞内 激酶域的蛋白分子。它们通过受体域与胞外信号分子的特异结 合来激活胞内激酶域的自 磷酸化和互磷酸化活性，完成跨膜传递信号的功能。 因为这类蛋白 激酶的分子结构和功能酷似动物中发现的受体蛋白 激酶 ( r e c e p t o r p r o t e in k i n a s e s , r p k s ) ， 但绝大多数配基尚 未被鉴定出 来， 故称为类受体激酶(5 -7 j 第一章 引言 从玉米u 中发 现第一 个 植 物r l k以 来，己 在2 0 多 种开花植 物中 发 现了 大 量的 r l k基因。近几年，随着各种植物基因组序列的解读完成， 在植物 r l k的研 究方面取得了巨大的进展。 1 . 2 . 1 植物类受 体激酶的 分类 已鉴定出来的植物类受体激酶的数量十分庞大，对它的分类有多种方法， 可以根据激酶域序列的系统发生分析进行分类，也可以根据胞外域的结构进行 分类。常见的几种胞外域结构有: s - 结构域 ( s - d o m a i n )型 植物中最早发现的玉米类受体激酶 z m p k i s 就属于这个家族.该类 r l k 的结构特点是其胞外结构域与决定十字花科植物花粉自 交不亲和的 s 一 糖蛋白 ( s - l o c u s g ly c o p r o t e m , s l g ) 氨 基 酸 序 列 同 源 9 , 1 0 。 其 胞 外 结 构 域 有 一 部 份 较 为 保守，同源性大约为 2 0 2 5 %。目前已发现的该类 r l k均在特定位置具有保 守的十个半肤氨酸，其余部份差异很大，估计不同 r l k与不同配基结合的特 异性就由这差异很大的胞外区域决定。 类 表 皮生 长因 子( e p id e r m a l g ro w t h f a c t o r li k e , e g f - li k e ) 型 这种r l k的胞外结构域具有类似动物细胞表皮生长因子的结构。 e g f 重复 序列是目 前发现的唯一同时存在于植物和动物r l k的一类胞外受体域基序。 在 动物中的研究证明， e g f重复序列与c a t 十 结合后可以 形成一种立体结构直接参 与蛋白 间的 相互作用。 但是植物中 这种非c a 2 + 结 合型的e g f - l i k e 基序是不是 具 有相似的结构和功能还有待于进一步验证。 类肿 瘤 坏 死因 子受 体 ( t u m o r n e c r o s i s f a c t o r r e c e p t o r l ik e , t n f r - l ik e ) 型 t n f r基序存在于一些调节细胞增殖和细胞死亡的动物受体中， 可以直接与 t n f r 类配基结合。 目 前在所有植物蛋白 中， 只有从玉米分离出的c r i n k l y 4 1 1 , 1 2 1 的胞外域具有一个 t n f r基序，可能参与与蛋白配基的结合。c r i n k l y 4基 因编码一个含 9 0 1个氨基酸残基的蛋白 质，其胞外富含半耽氨酸的结构域与 t n f r基序的氨基酸序列极为相似。 第一章 引言 富 含亮 氨 酸重 复 序列( l e n c i n e - r i c h r e p e a t l r r ) 型 这类植物类受体激酶的结构特点是胞外结构域中具有重复出 现的 亮氨酸， 在这一保守结构域以 外， 不同的r l k的 一级结构差异很大。 现己 发现多种蛋白 质具有l r r结构，由于这一结构有利于蛋白 质之间的相互作用，暗示具有这种 结构的r l k可能与胞外的蛋白 质因子发生相互作用。 l r r型类受体激酶可能是 拟南芥中最大的一类类受体激酶。根据l r r基序在胞外结构域中的组织情况和 激酶域序列的系统发生，可将 l r r型类受体激酶分成 1 3个亚家族 ( l r r i - x i ii ) 1 3 1 . 研 究 表明l r r型r l k 广 泛 参与 多 种植 物 发 育 过 程的 调 控， 因此进一步确定它们在信号转导途径中的 地位和功能， 对于深入了解高等植物 的信号转导分子机制具有重要意义。 . 1 . 2 . 2 l r r 型植物类受体激酶的结构与 功能 目 前， 在植物中已鉴定的类受体激酶绝大多数属于l r r型， 其结构如图1 . 1 所示。 大部 分l r r型类受体激酶的n - 末端 有 信号 肤 ( s i g n a l p e p t i d e ) 和亮 氨酸 拉链 基序 ( l e u c i n e z ip p e r m o t i f ) . 胞外 域包 含多 个l r r 基序， 激酶 域 靠近c 末 端。 n - t e r mi n u s l r r m o t i f 介t e r m i n u s 至 .至 .至 . s i g n a l p e p t i d e l e u c i n e z i p p e r m o t i f 匕 :一，u “ d o m ai n t r a n s m e m b r a n d o m a i n p r o t ei n ki n a s c a t a l y t i c d o m ai n 图1 . 1 l r r型类受体蛋白 激酶结构示意图 f i g . 1 . 1 s t r u c t u r e o f t h er e p e a t c l a s s o f r e c e p t o r - l i k e k i n a s e s 1 . 2 . 2 . 1胞外域的结构与功能 l r r型类受体激酶是迄今为止在植物中研究得最多的类受体激酶。具有代 表 性的 n 种 类受 体 激酶 基因 如r l k s t a i , x a 2 1 1 5 1 , c f - 9 1 b l , i i a e s a ; 1和c l v i t s l 等。l r r结构有利于蛋白质间的相互作用，暗示其可能是特异信号转导的关键 第一章 引言 表1 . l r r型类受体激酶的 生物学功能 t a b l e l s u m m a ry o f t h e r e p o r t e d b i o l o g i c a l fu n c t i o n s o f l r r re c e p t o r - l i k e k i n a s e s 生物学 功能 激酶名称 存在 物种 功能简介 应答逆境f l s 2 xa 2 1 c al r r1 拟南芥 水稻 辣椒 调节植物 发育 os r l ki cl a v a t a1 水稻 拟南芥 e ms i / e xs tm kl1 c r i nkl y4 ( c r 4 ) i nrpk1 拟南芥 拟南芥 拟南芥 大豆 拟南芥 玉米 玉米 植物防御，病原体的识别 病原防御: 抵抗多种水稻白叶枯病 高盐、脱落酸，和伤害等条件下表 达 抗低温胁迫 与拟南芥芽和花的分生组织增殖 和分化相关。 影响器官伸长 影响胚乳和花粉的发育 调控长角果的成熟发育 控制大豆的结瘤自 动调节 调控卵子形成、早期胚胎发育、体 细胞的胚胎发生 与表皮生长分化相关 日本牵 牛 拟南芥 矮牵牛 胡萝 卜 gmrl p ki - 2大豆 f lor1拟南芥 在短日照光周期诱导开花中起作 用 与叶脉形成相关 与配子体发育相关 在细胞去分化和植物增殖胞间信 号传递中起作用 可能参与了对大豆叶片衰老或细 胞分裂素延缓衰老过程的调节机 制。 花器宫发育 第一章 引言 生物学 功能 激酶名称 续表 存在 物种 功能简介 参与激素的 信号传递 bri 1 / b ak1 s r1 6 0 / t b ri 拟南芥 水稻 番茄 b a k i / b r i l 的相互作用， 应答油菜 素类固醇，参与其信号转导途径 应答油菜素类固醇与系统素 1 . 2 . 4植物类受体激酶介导信号转导的分子机制 l r r 型r l k 在各种生理生化反应中发挥重要作用， 一些信号通过受体激酶传 递到胞内分子，从而产生了一系列细胞应答反应。r l k 如何与配基结合，又如 何 将信号进行级联放大传递等问 题引起了 关注。 许多l r r 型r l k 的结构同 源性很 高， 但 其配基结构是多 样的， 从 类固 醇 ( 油 菜素内 脂) 到 肤 ( p h y to s u l f o ld n e 和 系统素)以 及分泌蛋白 ( c l v 3 )。目 前多数l r r 型r l k 的配基结合的精确位点 仍然不清楚。 l r r 型r l k 与下游成分的相互作用及r l k 复合物之间相互作用调节 信号传递的研究己取得了一些重要进展，如下文所述。 1 . 2 . 4 . 1复合物相互作用与信号识别 类受体蛋白 激酶复合物之间相互作用从而传递信号。如前文所述，受体激 酶聚合成为二聚体或寡聚体是其激活的必要条件，以单体形式存在的类受体激 酶是不具活性的. 二聚化的 形式大致分为 两 类:同 源二 聚化和异源二聚化。 类 受体激酶 的激活绝大部分是异源二聚 ，例如植物激素油菜 素类 固醉 ( b r a s s i n o s t e r o i d , b r ) 的 信号转导就需要 b r i t 和 b a k i 之间 相互作用组成受体复 合物才能完成。 b r i i 是含有 2 5 个l r r 的 l r r 型r l k w 1 ，它 通过胞外域感知b r 信 号，并通过胞质激酶活性进行下游信号转导3 3 1 . b a k 1 是b r 受体复合物的另一 成分。 它包含5 个l r r 基序， 缺少第二个半肌氨酸对和7 0 个氨基酸长的岛状结构， 是一个比 b r i t 小的 受体 激酶 。 。 b a k 1 与 b r i i 在体内 和体外 都可以 相互作 用， 尤其是在体外可以 相互磷 酸化4 i -4 3 1 。 最近的 研究表明 两 个受 体激酶之间的 异二 聚化可能是植物感知类固醇激素和信号转导的 关键步骤4 1 1 。 此外，也有研究者 发现:拟南芥的c l v i 在体内 通过二硫键互相结合而形成多聚体，这是其激活的 必 要条 件 4 4 1 除拟南芥外，b r 的信号转导机制在水稻、大麦和番茄等植物中也有较为深 第一章 引言 入的 研究。 有趣的是， 番茄的t b r i i 不仅对 b r 应答，同 时也是系统素的受体 ( 系 统素是一个短肤激素，它能通过诱导茉莉酸合成局部调节番茄系统的受伤应答) 1 4 5 a s ) . t b r i i 在发育和防 御应答中的 双重功能与果蝇的 t o l l 信号途径相似， 但不 同的是， 后者由 相同的 s p a e t z l e 配基激活， t b r i i 却能感受b r 和系统素两种信号 1 4 a t b r i 1 显然是目 前己 报告的唯一可以由 两种信号 激活 并分别导致两种不同 应 答反应的类受体激酶。 这一方面揭示了l r r 型r l k调控植物生长发育与防御应答 的 分子机制， 为阐明 l r r 型 类受体蛋白 激酶复合物相互作 用与 信号识别的关系奠 定 了 基 础; 另一 方 面暗示 了 在l r r 型r l k 参与 植 物信号 转 导过程中， 可 能有一些 与 动物中 相似的 分子机制发挥作用， 这为 进一步了 解l r r 型 r l k 的 信号转导机制 开辟了一个新的视角。 1 . 2 . 4 . 2下游成分: 激酶结合的蛋白 磷酸酶 l r r型r 工 k最 典型 的下游信 号成分是 与激酶结合的蛋白磷酸酶 ( k i n a s e - a s s o c i a t e d p r o t e i n p h o s p h a t a s e , k a p p ) . 几乎 所有k a p p 分子都具有氮末 端 i 型膜定位信号域 ( n - t e r m i n a l t y p e i m e m b r a n e a n c h o r )、 激酶互作域 ( k i n a s e i n t e r a c t i o n d o m a i n , k i ) 和 p p 2 c 型催化域 ( p r o t e i n p h o s p h a t a s e t y p e - 2 c , p p 2 c ) 三 个区 域。 其中 激酶 互作域( k i ) 包含一 个“ 叉状结构”基序 ( f o r k h e a d - a s s o c i a t e d , f h a ) ， 因此 这个 激酶 作用 域又 被称为 k i - f h a ( k i n a s e i n te ra c t in g f h a ) 14 1 1 . f h a 基 序上 保守的 氨基酸g l y , s e r , h i s 和a s n 是 k a p p 与r l k 相互结 合所必需的 1 4 1 1 拟南芥h a e s a 激酶 ( 早期用的名称是r l k 5 )与k a p p 结合时需要h a e s a 处 于自 磷酸化状态。 h a e s a自 磷酸化的位点为丝氨酸或苏氨酸， 表明 k a p p 可能识 别 h a e s a 上被 磷酸化的 丝氨酸或苏氨酸或两者都识别并与 之结合im . k a p p 在 体外也可以 与c l v i 结合，结合与否取决于 c l v 1 的 磷酸 化状态15 0- 5 2 1 。另外， 拟 南芥的k a p p 可以通过其自身的f h a 域对类受体激酶信号路径进行负调控，这在 植物的发育中尤为重要【5 3 1 .研究结果表明，k a p p 与拟南芥的h a e s a is 0 1 , r l k 4 5 51 , t m k 1 5 5 1 , c l a v a t a 1 52 1 , w a k i 5 6 1 , f l s 2 5 7 1, s e r k 1 ( 32 1 , b r i t 和 b a k i 等多 种 r l k 相互作 用 5 3 1 ， 这表明 k a p p 在植物多 种r l k 介导的 信 号转导 途 径中发挥重要的作用。 第一章 引言 第三节 植物衰老的分子遗传学研究 植物叶 片衰老是一种器官水 平上的 程 序 化死亡过程 1 . 1 8 1 ， 包括了 大 量 有序事 件的发生，如在亚细胞结构上的叶绿体和其它细胞器的有序衰退;代谢水平上 的细胞内大分子的降解、动员;基因水平上的一系列与衰老相关基因的激活和 表达， 最终保证叶片内 养分最大程度的高效利用。随着植物分子生物学技术的 迅速发展， 人们在用植物绿叶和衰老叶片m r n a 构建c d n a 文库的基础上，通过 采用差别筛选和减法杂交等方法分离、克隆到3 0 多个与叶片衰老相关的基因。 1 . 3 . 1叶片衰老相关基因 ( s e n e s c e n c e - a s s o c i a t e d g e n e , s a g ) 及其表 达调控 在叶片衰老过程中 有许多基因的表达水平发生变化。其中仅在衰老特定发 育 阶 段 表 达的 基因 称为 衰 老 特 异 基因( s e n e s c e n c e - s p e c i fi c g e n e s , s s g s ) 。 其中 被 衰老诱导 表 达的 基因， 称衰 老相关基因 ( s e n e s c e n c e - a s s o c i a t e d g e n e s , s a g s ) ， 或者 说 其表 达是衰老上 调的( u p - r e g u l a t e d ) ， 另 一 种是衰老下调 基因( d o w n - r e g u l a t e d ) . 这些衰老特异基因主要包括参与转录和代谢调节、生物大分子 ( 蛋白 质、核酸、 脂 类等 ) 降 解、 氮碳等营养元 素再 动员以 及 防 御反 应相关 基因 等。 目前对s a g s 表达调控机制有比较一致的看法，即认为叶片可能存在一个有 多个调控途径组成的级联反应调节网。有些基因可能被任何一个调控途径调节， 而有些基因可能只被特定的调节途径所调节。一般情况下，对一个、甚至几个 调控途径的改变可能对叶片衰老过程不会造成明显影响。有人称叶片的这种特 性为 叶片 衰老的 可塑 性( t h e p l a s t i c i t y o f l e a f s e n e s c e n c e ) 5 8 l . 以 拟南 芥 和番茄为 材料的研究结果表明，在植物体内似乎至少存在4 个调控叶片衰老过程中基因表 达的信号途径:( 1 )细胞分裂素 ( c t k)的作用，即避免由于叶片中c t k 含量 降到某一阐值时叶片开始衰老，而叶片中c t k 的含量保持在闽值之上则可在转 录水平上抑制s a g s 的表达，以致衰老推迟;( 2 )来自 生殖库的信号，如摘除大 豆发育花或物理限制其籽粒的发育，可以 延缓大豆叶片衰老; ( 3 )乙 烯 ( e t ) 的作用似乎不是直接激活，很可能通过与其它信号协同起作用;( 4 )光合产物 和其它代谢产物水平。也可能上述信号共同调控s a g s 的表达。 第一章 引言 1 . 3 . 2叶片衰老与细胞信号转导 植物叶片细胞的程序性死亡是整个植株发育大环境和叶片器官小环境相互 作用的结果，可以想象这种有序的主动的相互作用过程必然要通过某种发育信 号来实现。植物体相关控制进程中产生的某种发育信号，尤其是叶片衰老过程 中信号转导途径的研究是揭示叶片衰老的分子调控机制的关键所在。 在叶片衰老的启动阶段，己糖激酶 ( h x k )可能作为一个搪信号的感受分 子， 通过催化糖的 磷酸化， 介导了 糖类的 信号转导 5 9 1 。 过表达h x k 增加了 对糖 类的敏感度，从而诱导了早衰。幼叶在发育过程中，一直是作为一种 “ 库”器 官直到成熟，而老叶则作为一种 “ 源” 器官提供糖类，当幼叶发育出自己成熟 的光合作用系统时，对糖的要求降低，糖需求减少就导致了老叶中糖的积累， 诱导 老叶的 衰老6 0 1 . 实际 上， 糖分子除了 作为 细胞能 源外， 很可能 是启 动叶 片 衰老的信号分子6 1 , 6 2 1 植物的叶片衰老过程是一种程序性的 细胞死亡过程， 有其固有的调控元件 及信号转导途径。可以 想象，担当细胞信号转导重任的大分子必须能够接受外 界信号， 然后通过跨膜作用把发育信号传递到胞内 并引发一系列的生物学反应。 如前文所述，植物类受体激酶 ( r i ,k ) 是一类包含胞外域、单次跨膜域和胞内 激酶域的蛋白 分子，它们可以通过受体域与胞外信号分子的特异结合来激活胞 内激酶域的自 磷酸化和磷酸化活性，完成跨膜传递信号的功能。植物类受体激 酶的这种特殊结构暗示了其可能是植物发育和环境因子信号传递途径的重要元 件。 第四节 课题的提出及其意义 大豆是全球农业的一种重要经济作物。 在其个体发育过程中，随着营养生 长向生殖生长的转变，源一 库矛盾变得十分突出，根系、叶片的衰老使花和籽粒 的营养受到极大限制， 导 致大量的落花落荚现象， 严重地影响大豆的产量6 3 , 6 4 1 有实验证明，减缓种子发育过程中植株的衰老可以有效地提高大豆的品质和产 量。 目前，对植物衰老机制已有较为深入的研究，对各种衰老过程中的生理现 象、生化代谢途径以及相关基因都有大量文献报道。但是对于衰老是如何启动 第一章 引言 的，衰老的信号是如何被特异传递的却鲜有报道。植物细胞通过感受与叶片衰 老相关的信号因子，调节衰老相关基因的表达水平，最终导致衰老过程中的生 化、生理以 及形态上的变化。 植物类受体激酶的结构暗示了其可能是植物发育和环境因子信号传递途径 中的重要元件。最近的研究也已表明，一些类受体激酶具有调控植物不同发育 过程、参与植物抗性作用的功能。我们在研究大豆叶片衰老和外源细胞分裂素 延缓衰老过程中也发现，质膜上一些蛋白 激酶的自 身磷酸化状态和催化活性发 生了很大变化，推测可能有特殊的蛋白 激酶参与细胞分裂素对大豆叶片衰老的 调控过程16 5 1 。 在此基础上， 我们进一步 利 用分 子生 物学手段克隆了4 个新的 类 受体激酶基因 部分c d n a片段 ( g e n b a n k 登录号: n o .a f 3 3 8 8 1 3 , a f 3 3 8 8 1 4 , a f 3 3 8 8 1 5 和a f 4 9 3 9 7 7 ) 166 1 。 经 过在国 际 数 据 库中 搜 索 检 测， 这4 个 基因 均为 尚未在国际国内发表的新基因，分别命名为大豆r l p k 1 - 4 o 通过 c d n a 末 端序列快速扩 增 ( r a p i d a m p l i fi c a t i o n o f c d n a e n d s , r a c e ) 的方法，木实验室成功扩增了r l p k 2 c g e n b a n k n o .a y 6 8 7 3 9 1 )和r l p k 3 ( g e n b a n k n o .a y 6 8 7 3 9 0 ) 基因 全长c d n a 序列，并根据其功能或分类分别重新 命名为。 n s a r k ( g ly c i n e m a x s e n e s c e n c e - a s s o c i a t e d r e c e p t o r k i n a s e ) 和g m r l c k ( g ly c i n e m a x r e c e p t o r - l i k e c y to p l a s m i c k i n a s e ) 。 基因表达分析发现， g m s a r k 基 因 可能 参与 外 源细胞分裂素延缓大豆叶片 衰 老 进程6 6 1 。 此外， 在大 豆子叶自 然衰 老以及大豆成花后叶片衰老两个系统中， g m s a r k 4因表达都呈现出s a g 的典型 特征上调表达，暗示该基因很有可能直接参与调控大豆叶片衰老进程。我 们分别利用r n a 干扰技术来敲减g m s a r k a因表达和利用组成型启动子 ( c a mv 3 5 s )驱动过表达该基因，结果发现:敲减g m s a r k 基因表达明显延缓大豆叶片 衰老进程而该基因的过表达则加速了大豆叶片甚至整个植株的衰老，说明该基 因很可能是大豆叶片衰老信号的上游组份， 直接参与了 大豆叶片衰老进程的调 控， 其所介导的 信号转导可能是通过调节叶 绿素等大分子的 代谢来发挥功能6 7 1 但是目 前尚没有直接的生化实验证明g m s a r k 具有激酶活性，它的自 磷酸 化状态和催化活性是否参与了大豆叶片的 衰老调控过程。因此，本文对类受体 激酶g m s a r k的生化性质进行了初步研究:利用原核表达系统获得了 g s t g m s a r k 激酶域( k i n a s e d o m a i n , k d ) 和g s tg m s a r k 胞外域(