（生物化学与分子生物学专业论文）d海因酶的体外分子定向进化和定点突变.pdf

摘要 光学活性d 一氨基酸常作为一种中间体被广泛应用于半合成抗生素、 多肽激素、拟除虫菊脂、杀虫剂等的合成。目前，工业范围的d 一氨基酸 生产大都采用酶法转化，首先是在d 一海因酶的作用下，催化5 一单替 代海因形成氨甲酰类氨基酸，后者再在酶或酸催化下，生成相应的光学 活性氨基酸或其衍生物，因此，d 一海因酶是生物转化d 一氨基酸的关键催 化剂。 众所周知，酶是一种生物大分子，易受诸如p h 、温度、氧化剂等因 素的影响而导致酶活性降低或丧失；因此，我们利用体外定向进化技术 对本室保存的d 一海因酶基因进行了改造，试图获得性能更为优良的产酶 菌株。利用易错p c r 技术使d 一海因酶基因引入随机突变，经反复优化， 将p c r 条件确立为0 1 5 m m o l lm n ”+ 3 m m o l lm g ”；0 3 m m o l lm n ”+ 3 m m o l lm g ”；0 5 m m o l lm n 2 + + 2 5 m m o l lm 9 2 + 三个离子浓度梯度。将 p c r 扩增产物克隆到p e t - 3 a 载体，转化叵c o i lb l 2 1 ( d e 3 ) ，利用9 6 孔 板初筛阳性克隆，经两轮筛选了近i ，0 0 0 个菌落，最终获得较高活性的 产酶菌株：叵c o l i b l 2 1 p e h d t ；，( a ) 和ec o l i b l 2 i p e h d t 。5 ( b ) 。 以对羟基苯海因为底物，前者酶活性为初始菌株c o l ib l 2 i p e h d ? ) 的2 7 倍，为野生菌株( p s e u d o m o n a sp u t i d ay z 一2 6 ) 的2 0 倍，若以海 因为底物，则分别为1 4 倍和1 5 倍。后者以对羟基苯海因为底物，则 分别为2 0 倍和1 5 倍。d n a 序列分析表明，突变株a 中海因酶基因为内 源突变：即编码氨基酸序列第1 4 位的谷氨酸的密码子由g a a g a g ，第 2 5 位的天冬氨酸的密码子由g a t g a c ，两个酸性氨基酸密码子的突变 均为使用频率高的密码子变为使用频率低的密码子。而突变株b 中产生 一个残基突变，即a l a 4 4 9 g l y 。 我们还对该基因进行了定点突变。将其活性中心的2 3 9 位的组氨酸 残基分别突变为h 2 3 9 y 和h 2 3 9 l ，3 1 6 位的天冬氨酸残基突变为d 3 1 6 e ， 但突变株酶活性丧失殆尽；若将4 0 9 位的组氨酸残基变为h 4 0 9 t ，活力 剩余4 0 经( n h 4 ) ：s o 。分级沉淀、p h e n y ls e p h a r o s e 疏水层析纯化，p a g e 天然胶分析，该酶分子仍然为二聚体，未发生解离现象；将4 1 0 位的组 中文摘要 氨酸残基变为h 4 1 0 a ，活力基本丧失，仅剩余1 3 ，表明相邻二个组氨 酸残基在酶分子构象形成过程中所起的作用不同。 关键词：d 海因酶；体外定向进化；易错p c r ；定点突变；酶活性 英文摘要 a b s t r a c t d - a m i n oa c i d sa r ew i d e l yu s e da si n t e r m e d i a t e sf o rt h es y n t h e s i so f s e m i s y n t h e t i ca n t i b i o t i c s ，p e p t i d eh o r m o n e s ，p y r e t h r o i d sa n dp e s t i c i d e se t c n o w a d a y s ，t h ep r o d u c t i o no fd a m i n o a c i d sm o s t l yr e l i e so ne n z y m a t i c c o n v e r s i o ni nt h ei n d u s t r i a lf i e l d t h ep r o c e s si st h a t5 - m o n o s u b s t i t u t e d h y d a n t o i n i s f i r s t l y t r a n s f e r r e di n t ot h e r e l e v a n ti n t e r m e d i a t e ， n - - c a r b a m y - d a m i n o a c i d b yd - - h y d a n t o i n a s e a n dt h e r e s u l t i n g n - - c a r b a m y - d - a m i n o a c i di sf u r t h e rc o n v e r t e dt ot h ec o r r e s p o n d i n gd - - a m i n oa c i db yn c a r b a m y o l a s eo ri n o r g a n i ca c i d t h e r e f o r e ，d h y d a n t o i n a s e i sr e g a r d e da sa k e yc a t a l y s ti nt h eb i o c o n v e r s i o no f d a m i n oa c i d s i n d e e d ，a l lo fe n z y m e sa r es e n s i b l eb yp h ，t e m p e r a t u r e ，o x i d a n ta n ds o o n ，r e s u l t i n gi nd e c r e a s i n go rl o s i n gt h e i ra c t i v i t y t oe x p l o r et h eb e t t e r c h a r a c t e ro f d h y d a n t o i n a s e - p r o d u c i n g s t r a i n ，a m e t h o do ft h e m o l e c u l e d i r e c t e de v o l u t i o ni nv i t r ow a su n d e r t a k e n t h er a n d o mm u t a t i o n o fd - h y d a n t o i n a s eg e n ew a si n t r o d u c e db ye r r o r - p r o n ep c r b a s e do n c o n d i t i o n a lt e s t s ，t h r e ep a i r so fi o n sw e r ec h o s e n ，i e 1 5 m m o l lm n 2 + + 3 m m o l lm 9 2 + ；0 3 m m o l l7 m n 2 + + 3 m m o l lm 9 2 + ；0 5 m m o l lm n 2 + + 2 5 m m o l lm 9 2 + p c rp r o d u c t sw e r es e p a r a t e l yc l o n e di n t ov e c t o rp e t - 3 a a n dc o n s t r u c t sw e r et r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t h ep o s i t i v e m u t a n tw a ss c r e e n e do na9 6 一w e l lm i c r o t i t e rp l a t eb yu s i n ge n z y m ea c t i v i t y t w om u t a n t sw i t hh i g h e ra c t i v i t y , e c o l ib l 2l p e - h d t 4 1 ( a ) a n de c o l i b l 2 1 p e h d t 4 5 ( b ) ，w e r ea c h i e v e di na b o u t1 0 0 0c o l o n y i tw a ss h o w n f r o mt h ee n z y m a t i ca c t i v i t yt h a tt h es t r a i naw a s2 7 - f o l da n d2 0 - - f o l da s w e l la st h es t r a i n ( b ) w a s2 0 一f o l da n d15 一f o l d ，c o m p a r e dw i t ht h es t a r t i n g r e c o m b i n a n t s t r a i n ( e c o l ib l 2 1 p e h d t ) a n dw i l d t y p e s t r a i n ( p s e u d o m o n a sp u t i d ay z 一2 6 ) w i t hp h y d r o x y o p h e n y l h y d a n t o i n a st h e s u b s t r a t er e s p e c t i v e l y d n as e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e st h a tt h ee n z y m e g e n ei nt h es t r a i n ( a ) b e l o n g st ot h ei n t e r n a lm u t a t i o nb yc h a n g i n gt h eg l u c o d o n ( g a a g a g ) a n d t h ea s pc o d o n ( g a t g a c ) ，w h i l s tt h eg e n ei n i l i 英文摘要 t h es t r a i n ( b ) p r o d u c e sar e s i d u em u t a t i o n ，a l a 4 4 9 g l y i n a d d i t i o n ，t h e s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i so ft h eg e n e w a sa l s o c o n d u c t e d f i r s t l y , t h es i t e sw e r ea th i s 2 3 9 ( h 2 3 9 y ，h 2 3 9 l ) a n da s p 31 6 ( 0 3 l6 e ) u n f o r t u n a t e l y , t h e r ew a sn oa n ya c t i v i t yf o rt h r e em u t a n ts t r a i n s d e s c r i b e da b o v e s e c o n d l y , h i s 4 0 9a n dh i s 4 1 0w e r ec h a n g e dt oh 4 0 9 ta n d h 410 a t h e a c t i v i t yo ft w om u t a n te n z y m e sr e v e a l e d4 0 a n d1 3 r e s p e c t i v e l y , c o m p a r e dw i t ht h es t a r t i n gs t r a i n ，s u g g e s t i n gt h a tt h ef u n c t i o n o ft w oc l o s eh i s t i d i n e si sq u i t ed i f f e r e n ti nm a i n t a i n i n gt h ec o n f o r m a t i o no f t h ee n z y m e i tw a sa l s os h o w nt h a tt h ep u r i f i e dd - h y d a n t o i n a s ef r o mt h e m u t a n ts t r a i ne c o l ib l 2 1 p e h d t ( h 4 0 9 t ) w a ss t i l lad i m e ra n dn o d i s s o c i a t i o ni so c c u r r e d ，a sd e t e r m i n e db yn a t i v e p a g e k e y w o r d s ：d h y d a n t o i n a s e ；d i r e c t e de v o l u t i o ni nv i t r o ；e r r o r - p r o n e p c r ；s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ；e n z y m a t i ca c t i v i t y 第一章文献综述 第一章文献综述 l 项目研究意义 b 一内酰胺类抗菌素是世界范围最广泛使用的抗菌药物之一，如青霉素，以高效 低毒等优越性成为临床使用的一类主要抗菌素，自四十年代发现以来，一直作为首 选的抗感染类药物使用。但由于在长期使用过程中，致病菌的耐药性不断增强，使 得青霉素的剂量也不断加大，从而对人类导致一些意想不到的副作用。后来人们在 此基础上发展了半合成抗菌素，即对b 一内酰胺类抗菌素进行结构改造，使其既具有 b 内酰胺类抗菌素的杀菌作用，又对致病菌的耐药性有一定缓解作用，称之谓新型 抗菌素或半合成抗菌素，以阿莫西林和欧意最为常见。d 一型氨基酸中的d 苯甘氨酸 ( d - p g ) 和d 一对羟基苯甘氨酸( d p h p g ) 是这些半合成抗菌素生产中重要的侧链 原料之一“1 。如阿莫西林( a m o x i c i l i i n ) 是由d p h p g 和青霉素( p e n i c i l l i n ) 母 核( 6 - a p a ) 两部分组成，欧意( c e f a d r o i l ) 是由d p h p g 和头孢菌素c ( c e p h a l o s p r i n ) 母核( ? - a c a ) 两部分组成( 图1 1 ) 。阿莫西林和欧意以其溶血性好，抗菌作用强， 易口服，使用方便等优点，迅速得到患者和医药部门的肯定，国内销售量逐年成倍 增长，己成为临床常规使用的半合成抗菌类药物之一。我国是青霉素生产大国，6 - a p a 和7 - a c a 的来源十分富足，然而侧链d - h p g 却主要依赖进口，因此发展我国自主原 料d h p g 有着极其深远的现实意义。 d 一型氨基酸广泛应用于医药、食品、添加剂及化妆品行业。如医药行业：多肽 激素、抗菌素、抗病毒剂、抗癌剂、代谢改良剂等产品；食品行业：食品调味剂、 营养添加剂、甜味剂、保鲜剂、防腐剂、食品发色剂、食品香料等产品；化妆品行 业：化妆品添加剂、护发剂、染发剂、永久型烫发剂等产品；还有农用除草剂、防 腐剂、杀虫剂等产品，d 一型氨基酸是这些诸多产品生产的重要中间物。随着生物工 程技术产业逐渐成为2 l 世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种 变更越来越快，工艺改革越来越新。目前，全世界氨基酸产量每年约1 0 0 万吨，而 需求总量是8 0 0 万吨，因此，氨基酸产业有着十分广阔的市场前景。中国白2 0 世纪 6 0 年代起，食品工业的氨基酸用量占6 1 ，饮料工业的氨基酸用量占3 0 ，医药、 日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例呈逐年递增 的趋势。运用基因工程手段生产氨基酸，特别是用于生物转化d 一型氨基酸已成为世 界氨基酸产业的新潮流。 虽然d 一型氨基酸可用化学方法合成，但由于缺乏构型选择性，工艺复杂而产率 旦：塑塑堕堕堡! ! 坌! 塞塑苎些翌塞皇壅壅 一c h ：一c o ! c ；8 h _ = c h 器 ”7 q h 5 一 一 一n h 一 一 ，c r _ l s d ec h a l n p e n i c i l l i n h o + 2 5 m m o l lm 【g “三个离子浓度梯度。将p c r 扩增 产物克隆到p e t 3 a 载体，转化e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，利用9 6 孔板筛选了近1 , 0 0 0 个阳 性克隆，最终获得较高活性的的产酶菌株：e c o l i b l 2 1 p e h d t 4 l ( a ) 和e c o l i b l 2 1 p e h d t 4 5 ( b ) 。以对羟基苯海因为底物，前者酶活性为初始菌株汜c o l i b l 2 1 p e h d t ) 的2 7 倍，为野生菌株( p s e u d o m o n a s p u t i d a y z 一2 6 ) 的2 0 倍；若以海因为底物，则分 别为1 4 倍和1 5 倍。后者以对羟基苯海因为底物，则分别为2 0 倍和1 5 倍。d n a 序列分析表明，突变株a 中海因酶基因为内源突变：即编码氨基酸序列第1 4 位的谷 氨酸的密码子由g a a g a g ，第2 5 位的天冬氨酸的密码子由g a t g a c ，两个酸 性氨基酸密码子的突变均为使用频率高的密码子变为使用频率低的密码子。而突变 株b 中产生一个残基突变，即a l a 4 4 9 g l y 。进行1 0 s d s p a g e 分析，发现e c o l i b l 2 1 p e h d t 4 l 酶的表达量比重组酶的提高了1 4 。 第二章以易错p c r 研究海因酶的分子定向进化 d 海因酶突变体分子文库的构建 1 材料 1 1 菌株、质粒 亲本菌株e c o l ib l 2 1 p e h d t 宿主菌株f c o i lb l 2 1 ( d e 3 ) ：基因型为h s d sg a l ( c i t s 8 5 7i n d ls a m 7n i n 5l a c u v - 5 t 7 基因1 ) 质粒p e t - 3 a ：4 6 k b p ，含抗氨苄青霉素基因、多克隆位点及t 7 启动子，属于 i p t g ( 异丙基硫代一b d 半乳糖苷) 诱导型。 1 2 主要的酶和化学试剂 t a q d n a 聚合酶大连t a k a r a 公司 n d e i , b a m h i 限制性内切酶美国n e b 公司 t a q d n a 聚合酶 大连t a k a r a 公司 t 4 d n a 连接酶 大连t a k a r a 公司 d n a m a r k e r n e b 公司有限公司 p c r 产物快速胶回收试剂盒 北京博大泰克生物基因技术公司 小量质粒抽提试剂盒 北京博大泰克生物基因技术公司 p c r 引物 北京奥科生物技术公司合成， 1 3 寡聚核苷酸 f w ( 1 1 6 ) ：5 - c c c g a a t t c 筮 丛鱼t c c c t g t t g a t c c g t - 3 n d e i r v ( 1 1 6 ) ：5 - c c c 鱼鱼! g t c a g c gc t g a a ct g g 3 b n m h i 2 方法 2 1 易错p c r 法扩增d 一海因酶基因 易错p c r 反应体系：5 0 ul 体系中含1 t a qd n a 聚合酶缓冲液、0 n 7 m m o l l m g “、0 0 5 0 5 0 m m o l l m n 2 + 、0 2 m m o l l d a t p 和d g t p 、1 0 n u n o l l d c t p 和d t t p 、 1p m o l ul 上下游引物、模板d n a 从质粒扩增获得。 望：童望堕塑堡丛坌塞塑垄些塑塞生窭窭 表2 1 易错p c r 反应体系中m n 2 一m 9 2 + 浓度梯度比 m n 2 + 离子浓度 ( m m o l l ) o0 5 01 0 01 5 o 3 0 o 5 0 m 9 2 + 离子浓度 ( r e t o o l l ) 7 0 5 0 30 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 0 ，o5 ，1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 6 0 7 0 0 ，0 , 5 ，1 0 ，2 0 ，2 5 ，3 0 ，3 5 ，4 0 p c r 反应体系： 1 0 b u f f e r 5 0g l m n 2 + 根据上述离子浓度表加入相应的体积 m g ”根据上述离子浓度表加入相应的体积 d n t p ( 1 ：5 ) 5 0g l f w ( 1 1 6 ) 5 0p a l r v ( 1 1 6 ) 5 0p , l 模板2 0u l t a q d n a 聚合酶 o - 3u l 用d d h 2 0 补足体积至5 0 0u l 扩增条件：于9 5 预变性5 m i n ，使模板d n a 彻底变性，9 4 。c - 3 芝性1m i n ，6 0 退火l m i n ，7 2 延伸1 5m i n ，3 0 个循环，7 2 延伸1 0 m i n ，置4 。c 保存。 2 2 重组质粒的构建 上述易错p c r 产物经l 琼脂糖凝胶电泳、胶回收纯化，利用n d e l - b a m h l y o t 酶 切，3 7 。c 酶切4 h ，利用无水乙醇- 醋酸钠共沉淀法与同样双酶切的载体p e t 3 a 连接， 3 7o c , 温育l h ，1 6 过夜，转化宿主菌株e c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) ，构建重组质粒( 图2 1 ) 。 所有操作均按分子生物学手册。 4 第二章以易错p c r 研究海因酶的分子定向进化 p c r 回收产物双酶切体系：d d h 2 0 1 0 b a m h l b u f f e r p c r 回收产物 b a m h i n d e i 总计 质粒双酶切体系 连接体系 d d h 2 0 1 0 b a m 月7 b u f f j r p e t - 3 a 空质粒 b a m h i n d e i 总计 d d h 2 0 1 0 b u f f e r l i g a s e 总计 3 易错p c r 条件的优化 易错p c r 是一种简便快速地在d n a 序列中随机制造突变的方法。通过改变 p c r 反应体系的条件，在新链d n a 聚合过程中随机引入错配碱基，构建序列多种 多样的突变体文库。 在易错p c r 反应体系中，起关键作用的是m n 2 十，引入不同浓度的m n 2 + ，用以 降低t a qd n a 聚合酶对模板的特异性，可导致目的基因密码子的参入频率改变或相 应的氨基酸残基变异，d c t p 和d t t p 浓度的增加是为了提高碱基的错误掺入率。为 了得到不同突变频率的片段多样性文库，摸索了不同m n ”浓度，选择2 5 儿反应体 系，加入相应体积的m n 2 + 和m g ”，p c r 产物取3 l a l 进行1 琼脂糖凝胶电泳分析， 电泳结果如图2 2 。 呲呲眦眦 m 眦眦 龇眦眦 里：童旦竺塑堡丛坌王星空垄些塑塞皇窭壅 g e n e m i c ) l t ao fp s e d o n f o n jp h d ny z i l 6 d i g e s t e db yh d e lm n db a m h ：皿： 卜m 州m 一w 5 。1 皿皿 、 j ，1 8 8 8 6 6 7 4m 。1 5 3 5 6 图2 1 重组质粒p e 。h d t 的构建 6 辫 a h 盯釜 噜 第二章以易错p c r 研究海因酶的分子定向进化 m r ：分子量标记 a ：l a n e l ：i e 常的p c r 扩增基阏： l a n e 2 l a n e 4 为不同的浓度梯度比，依次为m n 2 + 00 5 m m o l l m 9 2 + 7m m o l l 、 m n ”01 0 m m o l l m g ”5m m 0 1 l 、m n ”0 1 5 m m o l l m 9 2 + 3m m o l l bl a n e l l a n e 5m n 2 + 的浓度为01 5 m m o l l ，m 9 2 + 的浓度依次为3 , 4 ，5 ，6 ，7m m o l l c ：l a n e l l a n e 9m n 2 + 的浓度为03 r e t o o l l , m 9 2 + 的浓度依次为0 , 0 5 ，1 ，2 , 3 ，4 ，5 ，6 ，7m m o l l d ：l a n e l l a n e 5m n 2 + 的浓度为05 m m o l l ，m 9 2 + 的浓度依次为2 , 25