（微生物学专业论文）bacillus+subtilis自然感受态建成相关蛋白质研究.pdf

摘要 本研究以感受态正常的b a c i l l u ss u b t i l i sb r l 5 1 p 与其同源的感受态组成型缺陷的 b a c i l l u s s u b t i l i s b r l 5 1 p m 为研究材料，运用蛋白质组学研究中的双向电泳技术研究了这 一对感受态表型差异菌株在感受态建成时期细胞内外蛋白差异表达情况，采用 l m a g e m a s t e r 2 d 软件对电泳图谱进行分析，找出表达差异的蛋白。再从中选出重要蛋白 进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术，确定蛋自的性质与功能。据此建立了 2 - d e 结合质谱技术分离与分析感受态建成相关蛋白的方法。 分别采用一步培养法和两步培养法获得最s u b t i l i sb r l 5 1 p 和且s u b t i l i sb r l 5 1 p m 的 感受态细胞，经过细胞破碎、离心和提取等步骤得到处于感受态时期的缒内和胞外全蛋 白，经过等电聚焦、胶条平衡后，进行s d s - - p a g e 电泳，获得感受态时期胞内和胞外 全蛋白的2 - d e 图谱。比较这两种培养方法制备蛋白的2 - d e 图谱，二步培养法制备全 蛋白的双向电泳图谱效果优于一步法。 采用两步法制备口s u b t i l i sb r l 5 1 p 和b s u b t i l i sb r l 5 1 p m 感受态建 成期胞内和胞外全蛋白，然后进行双向电泳。其中，且s u b t i l i sb r l 5 1 p 感受态 建成期胞内全蛋自双向窀泳有2 9 5 个蛋白点，覆s u b t i l i sb r l 5 1 p m 有2 6 3 个蛋白点。重 点考察且s u b t i l i sb r l 5 1 p m 感受态建成期胞内全蛋白点中的下调点和缺失点，经过 l m a g e m a s t e r2 d 软件计算和三维图谱分析，最后从中筛选出两个缺失点p m 2 6 9 和 p m 2 4 9 ，两个下调点p r a 8 5 和p m l 8 8 。从丑s u b t i l i sb r l 5 1 p 电泳胶上找出它们的对应点 p 2 6 9 、p 2 4 9 、p 8 5 和p 1 8 8 蛋白点，利用基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱技术 对这4 个蛋白点进行肽指纹图谱分析。结果发现其中的p 2 4 9 蛋白点为n i n 蛋白，是枯 草芽孢杆菌感受态建成的重要蛋白。n i n 蛋白的缺失可能是最s u b t i l i sb r l 5 1 p m 菌株感 受态缺陷的主要原因。p 8 5 蛋白点为r e c a 蛋白，其可能与感受态的建成有一定的联系。 其它两种蛋白的性质和功能还未知。 n i n 蛋白通过调节n u c a 核酸酶活性而影响细胞的转化能力，n i n 蛋白的缺失能使 n u c a 核酸酶活性提高，从而导致单链d n a 通过细胞膜通道时容易被降解，造成转化成 功率下降。n i n 基因产物的缺失，可使转化频率降低约1 0 倍。丑s u b t i l i sb r l 5 1 p m 菌株 自然转化能力比正常菌株低2 3 个数量级，表明且s u b t i l i sb r l 5 1 p m 菌株的感受态缺 陷除与n i n 基因产物缺失有关外，还与其它的感受态建成相关基因的变异有关，很可能 是与n i n 基因上游调控基因突变相关。 关键词：枯草芽孢杆菌，感受态相关蛋白，感受态缺陷，双向电泳， 质谱 l l a b s t r a c t t h ec o m p e t e n c e o f b a c i l l u ss u b t i l i $ b r l 5 1 p i sn o n n a l a n d i t s h o m o l o g y b a c i l l u ss u b t i l i s b r l 5 1 p m i sc o m p e t e n c e - d e f i c i e n t $ 1 r a m t h e s et w os t r a i n sw e r eu s e da se x p e r i m e n tm a t e r i a lt os t u d yt h ed i f f e r e n t i a l e x p r e s s o fc o m p e t e n c ep i 。把i n so fe x t r a c e l l u l a ra n di n t r a c e l i n a r d u r i n gt h ep e r i o da f m p c 岫1 d e v o i n p m e n tw i t hn v o d i m e n s i o n a le l e c t m p h o r e s i s ( 2 - d e ) m e t h o d , w h i c hw a st h eb a s i ct e c h n i q u ei nt h e s m d yo fp r o t c o m l e s t h em a p so ft w o - d i r r 屺n s l o n a le l e c t r e p h o r e s i sg e lw e r ea n a l y s e dw i t hi m a g e m a s t e r 2 d n w a m ，a n dt h ec o m p e t e n c ep 1 0 t c 血o fd i f f e r e n t i a le x p r e s sw e r ed e t e c t e d s o m ei m p o r t a n tp i o t c j n s w e r es e l e c t e da n da n a l y du s i n gm a t r i xa s i s t e dl a s e rd c s o r p b i o n i z a t i o n - l i m eo ff l i g h tm a s s s p e c t r o m e t r y ( m a l d l - t o f - m s ) s ot h em e t h o do f2 - d ec o m b i n i n gm s t h a ts e p a r a l i n ga n da n a l y s i n gt h e r e l a t e d p r o t e i n s o f t h en a t u r a lc o m p e t e n c e d e v e l o p m e n t o f b a c i l l u ss u b t s w r s f o u n d t o b e a p p l y i n g c o m p e t e n c ec e l l so f b s u b n l sb r l 5 1 pa n d8 - s u 蜥bb r l 5 1 p mw e r ec o l l e c t e db yo n es t e p - c u l t u r e m e t h o do ft w o - s t e pc u l t u r em e t h o d a f t e rc e l l b r o k e n ，c e n t r i f u g e ，a n de x t r a c t i o n , t h ew h o l ec e l lp r o t e i n so f e x a e c l i n l a ra n di n t t a c e i n a rw e r eg a i n c d ，a n dt h e ns e p a r a t e db yi s c e l e a d ef o c u s i n g ( m 功e q u i l i b r a t e d a n dm o i ls d s p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( s d s - p a g e ) s t a i n e db ys i l v e rs t a i n i n g , a n dt h ei n l a g e w a ss c a n n e d c o m p a r i n gt h e2 - d ei m a g eo fw h o l e 训p r o t e i n so fo n as t e pc u l t u r ea n dt w o - s t e pc o l t u r c w e d i s c o v e r e d t h a t t h ee f f e c t o f 2 - d e i n a a g e o f t w o - s t e p c u l t u r e w a s b e t t e r t h a n t h a t o f o n as t e p c u l t u r e s ot h ew h o l ei n t r a c e l l u a rp r o t e i n so fb s u b f sb r l 5 1 pa n db ：s u b 埘sb r l 5 1 p m 缸c m n p e t e n c o d e v e l o p i n gp e r i o dw e r el n e p a r e d , a n dt h e ns e p a r a t e db y2 - d eg e l t h e r ew e r e2 9 5p r o t e i ns p o t so rt h e 2 - d ei m a g eo tb s u b t sb r l 5 1 ea n d2 6 3s p o t sf o rb ，s u b t i l i sb r l 5 1 p m ，t h ea b s e n ts p o t sa n dt h e l o w - e x p r e s s e ds p o t sw e r ea n a l y s e dp a r t i c u l a r l yw i t hi m a g e m a s t e r2 ds o f t w a r e ，a n dt h et w oa b s e n ls p o t s ， p m 2 6 9a n dp m 2 4 9 ，a n dt h et w o l o w - e x p r e s s e ds p o l s ，p r 0 8 5a n df m l 8 8w e r es e l e c t e d t h e i rc o r r e s p o n d i n g i h s p o t so nt h e7 - d eg c lo f 且s u b t i l i sb r l 5 1 p , i 2 6 9 , p 2 4 9 , p 8 5a n dp 1 8 8w e r ec u td o w na n dt h e i rp e p t i d e m a s s f m g e r p r i n t i n g sw 6 r ea n a l y s e dw i t hm a s ss p e c t r o m e t r y t h er e s u l t ss h e wt h a tf 2 4 9p r o t e i nw a sn i n p r o t e i nt h a tw a sa l li m p o r t a n tc o m p e t e n c ep r o t e i n t h ea b s e n c eo fn i np t o t e i nm a yb et h ec r u c i a l 矗t c t o r w h i c hc a u s e dt h ec o m p e t e n c e - d e f i c i e n t p r o t e i np 8 5w a sr e c a t h ec h a r a c t e ra n df o u n c t i o no ft h eo t h e r t w op r o t e i n s ，p 2 6 9a n dp 1 8 8 ，w c i e 毗【n mt ol i s n i np r o t e i nc o u l di m p a c tt h et r a n s f o r m a t i o na c t i v i t yo fc e l lb yr e g u l a t i n gt h ed n a d e g r a d i n ga c t i v i t y o fn u c a w h e nt h en i nw a sa b s e n t , d e o x y t i b o n u c l e a s ea c t i v i t yo fn u c aw 骢e n h a n c e d a n dt h es s d n a w a sd e c o m p o s e dm o r ee a s i l yw h e ni t g o ta c r o s st h ec h a n n e l s0 0c y t o p l a s m i cm e m b r a n e ，s ot h e t r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c er e d u c e dt ot e n t h t h en a t u r a lt r a n s f o r m a t i o n 丘。q u e n o f b s u b t l sb r l 5 1 p mi s l o w e r2 3o r d e r so fm a g n i t u d et h a n & s a b 矗l sb r i s i p , i ts h o w st h a tc o m p e t e n c e - d e f i c i e n ti sn o th o l y r e l a t e dt ot h ea b s e n c eo ft h ep r o d u c t i o no fn ng e n e , b u ta l s oa s s o c i a t e dw i t ho t h e rc o m p e t e n c eg e n e d e f i c i e n t , m a y b e a s s o c i a t e d w i t h t h e m u t a t i o n o f t h er e g u l a t i o n g e n e u p s t r e a m o f n n g e n e k e yw o r d s ：b a c i l l u ss u b t i l i s ，c o m p e t e n c e - r e l a t e dp r o t e i n , c o m p e t e n c e - d e f i c i e n t , t w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s t s ( 2 - d e ) , m a s ss p e c t r o m e t r y ( m s ) 缩略语表 c s p c o m p e t e n c e - s i m l i l a t i l l gp e p t i d e g m o s g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m s l g tl a t e r a lg e n et r a n s f e r m a t r i xa s s i s t e dl a s e r d e s o l p t i o ni o n i z a t i o n - t i m eo fn i g h tm a 璐 s p e c t r o m e t r y s d s - p a g e s d s - p o l y a c r y l a r n i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 2 d e l 独创性声明和论文使用授权说明 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名：庭蝠日期 关于论文使用授权的说明 0 1 7 ：6 1 5 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师 范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 签名 导师签名：墨i ! 堕日期：1 2 ，笸：! 前言 1 1 细菌的遗传转化 1 前言 随着生物技术的发展，尤其是分子生物学手段的广泛应用，使人们可以直接或间接 的对动物、植物和微生物的生命活动进行人为的操纵和改造，甚至是创造出新的生命个 体，这不仅极大的改善了人们的生存状况和生活方式，也使地球上的生物种群变的更加 丰富多彩1 1 。基因工程正在对现代农业、医药、卫生、食品、能源、环保等领域掀起 场新的革命，基因工程产品也正在走向我们生活的每个角落。正是由于此，一种生物的 遗传物质可以轻易的从一个机体转移到另一个机体，从而产生一系列的深远影响【即l 。例 如外源基因的获得可以提高细菌致病能力或者使其具有某种抗性，如对抗生素的抗性， 这是临床医学中细菌抗药性产生的原因之一【4 】。从另一方面讲，由于越来越多的基因工 程生物( g e n e t i c a l l ym o & f i e do r g a n i s m s ，g m o s ) 已经或将被释放于环境中，从而g m o s 中经 改造后的遗传物质及其产物对人类造成了潜在的影响，而且g m o s 释放于环境中改变了 原有基因库的结构和组成，对生物多样性和生物进化也造成了不同程度和方式的影响， 这也成为人 ! 】所忧虑的基因工程生物的安全性问题【5 , 6 1 。基因工程是职决人类所面临的生 存压力的有效手段之一，关键是如何将基因工程应用所造成的负面影响控制在允许的范 围内n 对水平基因转移的系统研究将有助于对此问题的深刻理解。水平基因转移 ( h o r i z o n t a lg e n tt r a n s f e r ，h g t ) ，又称侧向基因转移( 1 a t e r a lg e n et r a n s f e r ，l g t ) ，是指在 差异生物个体之间，或单个细胞内部细胞器之间所进行的遗传物质的交流【0 1 。差异生 物个体可以是同种而含有不同的遗传信息的生物个体，也可以是远缘的、甚至没有亲缘 关系的生物个体。单个细胞内部细胞器主要指的是叶绿体、线粒体及细胞核。水平基因 转移是相对于垂直基因转移( 亲代传递给子代) 而提出的，它打破了亲缘关系的界限，使 基因流动的可能变得更为复杂【1 1 , 1 2 。细菌中有三种水平基因转移机制，即转化 ( t r a n s f o r m a t i o n ) 、接合( c o n j u g a t i o n ) 和转导( t r a n s d u c t i o n ) ，其中转化是细菌中最为普遍存 在的一种水平基因转移方式，也是目前研究比较深入透彻的一种途径【1 3 1 6 1 。 早在1 9 2 8 年，g r i f f i t h 在研究关于致病肺炎链球菌的转化试验中第次发现外源遗 传物质可进入受体细胞并改变其遗传形状耻7 1 。1 9 7 3 年c o h e n 成功的将重组d n a 导入受 体细胞则揭开了基因工程的序幕【1 8 l ，基因的这种转移方式一直作为基因工程的重要手 段，涉及到供体d n a 来源、受体细胞和环境条件等多种因素的共同影响，大量细胞衰 老死亡后释放出的d n a 和细胞主动向环境中分泌的d n a 以及试验室人工构建的重组 d n a 都可作为水平基因转移的d n a 供体来源。受体细胞能否建立感受态以及建立感受 态的条件则决定了受体菌参与基因转移的频度【”- 2 2 1 。革兰氏阴性菌的典型代表大肠杆菌 依赖外界条件，在人为诱导时可以建立感受态，属于诱导型感受态的代表。随着大肠杆 菌基因组计划的完成，对其研究已近成熟，因此大肠杆菌已是进行基因克隆和表达的重 要受体菌1 2 3 , 2 4 1 。1 9 9 7 年，枯草芽孢杆菌基因组全序列测序完成1 2 5 1 ，人们对革兰氏阳性 菌的典型代表枯草芽孢杆菌的感受态的建立及形成机制有了更进一步的研究，并发现了 其与大肠杆菌感受态的不同之处，枯草芽孢杆菌在特定条件下能够建立自然感受态，参 与感受态建成的相关蛋白和各种功能蛋白正在进一步的被发现与研究中i 簿獬。 1 2 细菌感受态的研究进展 感受态( c o m p e t e n c e ) 是指细胞具有从周围环境中吸取d n a 并发生遗传改变的能力， 是细胞的一种特殊的生理状态【矧。根据细菌感受态建立的方式不同，可分为人工感受态 和自然感受态。人工感受态是人为地利用物理或化学的手段，如利用高剂量的二价阳离 子( c a 2 + 、m ，+ 、m n 2 + 等) 、原生质体诱导形成以及电穿孔等方法处理细胞，使其获得 摄取外源d n a 的能力1 3 0 , 3 1 1 。自然感受态是细胞一定生长阶段的生理特性，这种生理状 态由细菌本身基因控制，并在外界条件诱导下实现。许多细菌如链球菌属、芽孢杆菌属、 嗜血抒菌属等中的细菌都具有形成自然感受态的能力。自然晃中，细菌建立感受态后可 以主动吸取环境中的d n a ，即发生自然遗传转化1 3 2 1 ，以获得营养和新的遗传信息，不 利生长条件可能是细菌形成感受态的生理基础。 在链球菌和芽孢杆菌中，感受态是由一种胞外蛋i 刍( c o m p e t e n c e - s i m u l a t i n gp e t i d e , c s p ) 所诱导的，这种小的蛋白分子称为感受态因子，在细菌生长过程中，感受态因子分 泌到胞外，以调控其它细胞的感受态相关基因的表达，从而控制d n a 的摄取、转化和 整合过袒，3 l 。纯化的感受态因子可以转化低浓度的非感受态细胞成为感受态细胞，但感 受态因子必需积累到一定的浓度才能起作用【刈。 革兰氏阴性菌感受态的研究主要集中在流感嗜血杆菌( h e m o p h i l u si n f l u e n z a e ) 和副 流感嗜血杆菌( h e m o p h i l u s p a r a t i n f l u e n z a e ) 1 3 s l 。在这些细菌中，感受态是其内部调控的， 没有感受态因子的存在。流感嗜血杆菌感受态基因受细胞内的c a m p c r p 的紧密调节， 2 但许多环境条件变化也能引发感受态的建立。饥饿可能是其感受态形成的第二大调节因 素i 鲴。例如对数生长期的细菌培养物转入到不能支持其生长的环境中后，往往1 0 0 的 细胞都能变成感受态，一些阻止细胞分裂但是允许蛋白质继续合成的因子也能引发感受 态的建立。- 1 3 枯草芽孢杆菌感受态的研究进展 生长到对数后期的枯草芽孢杆菌由于受至4 各种外界和生理条件的制约，进入到一个 重要而复杂的生理阶段，伴随着许多生理进程，如可高表达细胞表面的附属结构如鞭毛， 以增加菌体的趋化性来获取营养；可向胞外分泌抗菌类物质如枯草菌溶血素( s u r f a c t i n ) ， 以抵御环境中的不利因素；还可以分化形成孢予，以增强其生存能力：最为典型的是它 能达到一种能够接受外源d n a 的特殊的生理状态，即遗传感受态1 3 7 , 3 8 1 。 遗传感受态的形成是菌体适应环境的有效应答。外源d n a 的介入，是细菌在营养 胁迫条件下获碍营养物质的方式，并且通过遗传重组，不仅使菌体获绲新的遗传信息， 而且可以修复受损伤的d n a 。枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 在工业生产中广泛应用于 蛋白酶、淀粉酶、多种药用蛋白的发酵生产；在科学研究中，是微生物学、遗传学及分 子生物学研究的模式菌种1 3 9 删。因此枯草芽孢杆菌感受态的研究具有重要韵理论意义和 应用价值。 1 3 1 枯草芽孢杆菌感受态的形成机制 枯草芽孢杆菌是研究自然遗传转化的模式菌之一，依据生长条件的不同，它的自然 感受态是在对数生长后期或稳定期前期开始形成的，其中培养物中感受态细胞约占 5 1 5 1 4 。感受态细胞与菲感受态细胞相比，其浮力密度及某些结构发生改变，d n a 、 r n a 和蛋白质合成减少，代谢活性下降，涉及相应基因的关闭或激活，这种生理状态的 形成受到感受态信息素的调节，只有当细胞达到一定的数目( 一般在对数后期) 而由细 胞所分泌到培养基中的感受态信息素的浓度达到一定犒界值时才能诱导感受态的形成。 这种机制是种法定数感应( q u o r u ms e n s i n g ) 机制或浓度感应( d e n s i t ys e n s i n g ) 女l l , $ 1 1 4 “。 处于感受态的枯草芽孢杆菌可以进行自然遗传转化，即具有吸收重组外界d n a 的能 力，其过程主要分三步迸行 4 7 - s 3 1 。1 吸附。这一过程发生在感受态细胞的表面，是一个 非共价结合的过程。在枯草芽孢杆菌的感受态细胞表面平均约有5 阶d n a 吸附位点忙， 3 这些位点对双链d n a 有非常大的亲和力。与嗜血流感菌和淋病双球菌不同的是枯草芽孢 杆菌对外源d n a 的吸附并没有序列特异性。2 双链d n a 的断裂。在吸附发生后的3 0 秒 内，d n a 被核酸酶所断裂。早期在以1 7 噬菌体d n a 为外源d n a 的研究中表明，双链d n a 可以在任意位点断裂，断裂后形成的片段仍然被吸附在细胞表面，其平均长度约为7 k b 。 断裂后产生的末端很可能为细胞提供了d n a 进入胞内的识别位点。3 d n a 的降解和吸 收。在断裂发生之后，双链d n a 的一条链被完全降解成磷酸化的酸溶性产物并被释放到 胞外的基质中，另一条链穿过细胞壁和细胞膜后进入细胞内，与肺炎链球菌不同的是细 胞对d n a 单链的吸收没有极性，既可从5 一3 的方向吸收，也可从相反的方向吸收，而 前者只能从3 端吸收单链d n a 。在嗜血流感菌和淋病双球菌等革兰氏阴性菌中，d n a 的吸收是指一条d n a 单链进入外周胞质的过程1 5 5 阐。进入细胞后的d n a 可以和染色体 d n a 发生重组而产生重组子，如果外源d n a 含有独立的复制子，则也可以产生转染子 或质粒转化子。 1 3 2 枯草芽孢杆菌感受态相关蛋白 枯草芽孢杆菌感受态的形成与d n a 遗传重组的完成是由多种感受态蛋白参与表达 调控的网络结构【5 7 - 6 0 1 ，根据表达时间和行使功能的不同，分为早期感受态蛋白和晚期感 受态蛋白，早期感受态蛋白表达在前，又称调控蛋白，对晚期感受态蛋白的表达起主要 的调控作用。晚期感受态蛋白是类组成型蛋白，直接参与d n a 的吸附、吸收和整合的 全过程，又称功能蛋白【6 。表1 列举了一些感受态相关蛋白及其功能。 表1 枯草芽孢杆菌感受态相关蛋白 蛋白质位置功能 蛋白质位置功能 膜内 感受态因子，诱导感受 c o m e r c o m x 态形成 蛋白酶 c o m f a 膜内d n a 解旋酶，供给能 c o m q 量 c o m p 跨膜组氨酸激酶 c o m f b c o m a 蛋白酶 c o m f c c o r n s 蛋白酶 c i n a 感受态受损诱导蛋白 4 c o m k 感受态转录因子 c l p c 蛋白水解酶 跨膜d n a 接受器并将其传 d l e g q 参与降解酶的合成控 c o m e a 给运输器制 c o m c跨膜 蛋白酶 m e c a 蛋白酶 膜内 转运d n a 进入细胞壁 o p p a寡蛋白，诱导感受态的 c o m g a 形成 膜内 转运d 1 q a 进入细胞壁 o p p b透性酶，诱导感受态的 c o m g b 形成 o p p c 透性酶，诱导感受态的 c o m g c 形成 转运d n f 气进入细胞壁o p p da t p 结合蛋白，诱导感 c o m g d 受态的形成 转运d n 砖基入细胞壁o p p fa t p 结合蛋白，诱导感 c o m g e 受态的形成 c o m g f膜内 转运d n 砖 入细胞壁n u p c介导d n a 转运 c o m g g c s f 感受态刺激因子 c o m e c膜内d n 运输器 r a p a 磷酸酶 ( “一”：表示未知) 在枯草芽孢杆菌中有两种与感受态有关的信息素，一种是c o m x ，即感受态因子； 另一种是c s f ，即感受态刺激因子1 6 2 - 6 4 1 。c o m x 编码含有5 5 个氨基酸残基的信息素c o m x 前体物，经过c o m o 的编码产物c o m q 蛋白的修饰处理后，产生了由1 0 个氨基酸残基组成 的具有活性的信息素c o m x 。细胞通过一种特殊的转运系统将c o m x 分泌到胞外，随后 c o m x 与跨膜的信号感应蛋白，一种组氨酸激酶( 由c o m p 编码) 发生相互作用而激活了 该酶，使其发生自磷酸化，随后该酶将相应的应答调节蛋白c o m a ( 由c o m a 编码) 磷酸 化，磷酸化的c o m a 和s r a 操纵子结合，激活该操纵子的转录而产生t c o m s 蛋白f 6 5 , 6 6 1 。 在枯草芽孢杆菌中有一种同c o m s 、o p c 蛋白和感受态转录因子c o m k 特异结合的m e c a 蛋白，m e c a 同c o m l c 减c o m s 结合后进一步和蛋白水解复合体c i p c 2 c l p p 结合而使c o m k 或c o m s 被水解。当m e c a 和c o m s 结合后，其构象发生改变而不能有效地和c o m k 结合， 从而避免c o m k 被进一步降解。因此当胞内c o r n s 的浓度高时就可以显著降低c o m k 被水 5 解的速度，c o m k 可以进一步激活自身的转录而大幅度提高其浓度并使晚期感受态基因 ( 包括与d n a 吸附、吸收和重组有关的基因) 开始转录 6 7 , 6 s l 。感受态的消失就是因c o m s 被降解后浓度下降而使c o m k 被蛋白酶水解而造成的，因此c o m k 在胞内的稳定性是感 受态晚期基因表达与否的关键所在i 叫。另外在感受态消失的过程中，c o m k 的合成也受 到一定程度的抑制，但其机理还不清楚。 c o m k 是枯草芽孢杆菌建立感受态过程中的一个关节剧删，其被称作感受态转录因 子( c o m p e t e n c et r a n s c r i p t i o nf a c t o r ) ，它能激活编码涉及d n a 加工和摄取的所有已知基 因。c o m k 能提高f 。c a 基因的表达，可能借此提高摄取的d n a 和染色体的重组活性。 最后，作为一种快速调节方式，c o m k 可以提高其自身的转录水平p 1 ，7 御。 c o m k 能被许多控制感受态形成的细胞间信号( c e l l c e l ls i g n a l s ) 所激活，如细胞密度 信号或营养信号等1 。细胞密度调节是通过c o m x 和c s f 这两种不同的肽类信息素 ( p h e r o m o n e ) 介导的，而转录因子c o m k 控制细胞是否进入感受态。c o m k 可自身构成 一个正向自调节回路( a u t o g c n o u sr e g u l a t o r y1 0 0 p ) 7 4 , 7 5 1 。细胞在对数生长时c o m k 活性受 m e c a 和m e c b 抑制，而c o m s 可以解除这种对c o m k 的抑制作用。此外s i n r 、d e g u 、 a b t b 和c o d y 等蛋白质也可影响c o m k 的表达或活性，其中s i n r 还可影响c o m s 基因 的表达，c o r n s 基因的表达是对胞外信息素应答的结果。 磷酸化的c o m a 是一种调节子，它不仅对感受态的形成起着调节作用，还参与调节 其他一些与菌体晚期生长过程有关的基因如d e g q 、r a p a 和r a p c 的表达，d e g q 匾 降解酶 的合成控制有关，糟p a 和r a p c 编码与感受态形成和孢子形成控制有关的磷酸酶【7 6 朋。值 得注意的是缺失c o m p 的菌株仍然具有将c o m a e * 酸化的能力，当培养基中含有葡萄糖或 果糖时，磷酸转乙酰酶p t a 被激活而使乙酸磷酸化成乙酰磷酸，这种小分子的磷酸供体 也可以使c o m a 磷酸化而进一步形成感受态1 7 s , 7 9 1 。 c s f 是一种含有5 个氨基酸残基的寡肽，它由p h r 基因家族中的p h 疋编码。该基因家 族编码一类胞外肽因子，这类因予通过抑制天冬胺酰基磷酸磷酸酶( g h r a p 基因家族编 码) 的活性来参与对包括孢子生成、感受态形成等枯草芽孢杆菌晚期生长特性的调节 8 0 - s 3 。与孢子形成早期有关的基因s p o o h 所编码的oh 参与启动p h 把的转录，c s f 的合 成还在转录水平上受到另外两个孢子形成早期基因s p o o a 和a b r b 的调节：a b r b 对p h r c 的 转录起着负调节的作用，而它的合成又受到s p o o a 的负调节 弘删。c s f 通过一种未知的 转运系统被运出细胞并转变成具有活性的形式，随后它在一种由s p o o k 所编码的寡肽透 6 性酶的作用下重新进入胞内【明。c _ s f 可能使磷酸酶r a p c 失活，阻止了后者对c o m a 的脱 磷酸化作用从而使c o m a t 果持磷酸化的活性状态，这样就保证了s f r a 操纵子的持续转录。 因此在c 0 m x 和c s f 这两种感受态信息素的共同参与下，通过一个多级的信号转导系统 的作用激活了晚期感受态基因的表达。 目前，已发现的枯草芽孢杆菌晚期感受态蛋白的编码基因分别属于c o m c 、c o m g 、 c o m e 和c o m f 这四个转录单位中【髓捌，这些蛋白质可以分为以下几类。第一类是c o m e a ， 它是种c 末端在膜外，n 末端在膜内的跨膜蛋白，对双链d n a 的亲和力远大于单链 d n a ，但这种亲和力没有序列特异性。因此c o m e a 可被看作是d n a 的接受器，它吸附 外源双链d n a 并将其中一条单链传送给d n 膳输器f 叫。第二类是c o m g 操纵子中的7 个 结构基因和c o m c 的编码产物。这8 种蛋白质都是同细胞膜相连的膜蛋白，同分泌系统聋 自相类似，也和革兰氏阴性菌的型鞭毛装配蛋白类似。与鞭毛的形成、分泌系统、颤 动性和感受态有关1 9 1 捌。c o m g c 、c o m g d 、c o m g e 和c o m g g 的n 末端序列同型鞭毛 蛋白前体类似，它们经过专一性蛋白酶c o m c 的处理后将改变其在细胞膜中所处的位置， 即位于膜外并同细胞壁发生交联，参与改变细胞壁的结构，能够在壁上形成一个小孔或 通道而使得d n a n - i 以穿过细胞壁同跨膜受体c o m e a 的c 端相结合。c o m g a 和c o m g b 与 一对执行鞭毛装配和拆卸功能的蛋白质相类似，推测其与前述的几种c o m g 蛋白发挥着 类似的功能。第三类蛋白质是c o m e c ，这种蛋白质主要参与d n a 的转运，是将d n j 选 入膜内的运输器【9 3 1 。其具有复杂的拓扑结构，可形成一个亲水性通道而使d n a j 挂入胞 内。第四类蛋白质是c o m f a ，这种蛋白质可能具有一个a t p 结合位点。参与d n a i 云输过 程中的能量供给。第五类蛋白质是两种核酸酶，分别起着断裂双链d n a 和降解单链d n a 的作用1 9 4 - ! 。和d n a 断裂有关的核酸酶可能和c o m g 蛋白在一起，位于细胞的表面或细 胞壁的小孔内。另种核酸酶可能在c o m f a 的参与下和c o m e c 形成一个转运复合体。 7 1 4 蛋白质组研究 图1 枯草芽孢杆菌感受态调节机制 生命科学是2 1 世纪的带头学科，在现代生命科学最前沿的研究领域中，以研究人类 基因组结构和功能为主的“蛋白质组计划”已经成为分子生物学的重要课题，并带动了 整个生命科学的发展，蛋白质组( p r o t 咖e ) 的概念是1 9 9 4 年由w i l k i n s 首先提出，指“一 个细胞或一种组织基因组所表达的全部蛋白质”1 9 7 1 。蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 是从整体 水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律。目前，蛋白质组学的研究前沿大致分为 3 个方面：一是针对有关基因组或转录组数据库的生物体或组织细胞，建立其蛋白质组 或亚蛋白质组和蛋白质表达谱及其蛋白质组连锁群，即组成性蛋白质组学研究 ( c o m p o s i t i o n a lp r o t e o m i c s ) ；二是以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理 和病理体系或过程的局部蛋白质组或比较蛋白质组学( c o m p a r a t i v ep r o t e o m i c s ) ；三是蛋 白质组学支撑技术平台和生物信息学的研究1 9 8 】。本质上蛋白质组学是由技术推动、同时 也受技术限制的一门发现性学科，其实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行 分离和分析。因此发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一 段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。蛋白质组研究最常用的技术之一的蛋白质双向 电泳技术，是将各种蛋白质区分开来的一种很有效的手段，而质谱技术则可实现对蛋白 质逐一进行鉴定i 9 9 , 1 删。双向电泳技术是指第一向为等电聚焦电泳，第二向为连续变性 8 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 的一种新型的二维凝胶电泳技术，蛋白样品经过电荷 和质量两次分离后，得到许多相互分离的圆形和椭圆形的蛋白质斑点的电泳图谱，这种 独特的电泳图谱比起传统的仅借助一种参量将蛋白进行分离的一维凝胶电泳技术( 等电 聚焦电泳技术、连续变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和非连续变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技 术) 有着更高的分辨率和科研应用前景，自1 9 7 2 年由o f a r r e l 9 4 建以来，已广泛的应 用于蛋白质组学的研究中【1 0 “1 0 5 】。质谱分析技术是以蛋白样品的质量和带电量为分析参 量，依据核质比分析蛋白样品，以达到最终确定样品蛋白的一种更为精确的蛋白质组学 研究技术【1 睢1 0 8 l 。本论文拟采用功能蛋白质组学的方法与手段对枯草芽孢杆菌感受态建 成相关蛋白进行分离与功能分析。 1 5 选题的依据及意义 自然遗传转化是细菌通过水平基因转移获得新的遗传信息的一种普遍途径。随着基 因工程的发展及其所带来的影响，近几年来，自然遗传转化已成为分子生物学研究中的 热点。感受态的建成是自然遗传转化的重要环节，它的形成及遗传转化的完成是由多种 基因参与表达调控的网络结构，因此感受态相关蛋白及其功能的研究又成为这一研究领 域的关键。桔草芽胞杆菌是分子生物学和生物工程研究领域中广泛使用的菌种，对于桔 草芽胞杆菌自然感受态建成相关蛋白及其功能的研究不仅是研究自然遗传转化机制的 基础，同时对于基因工程微生物的构建、工程微生物应用的生物安全评价都具有重要意 义 1 0 9 u o 。在前期的研究中，我们获得了置s u b t i l i sb r l 5 1 p 菌株和其 司源感受态组成型 缺陷菌株且s u b t i l i sb r l 5 1 p m ，这为感受态相关蛋白质组的研究奠定了基础。且s u b t i l i s b r l 5 1 p m 是以且s u b t i l i sb r l 5 1 p 为出发菌株，经少量的亚硝基胍( n r g ) 诱变而产生和确 证的一株感受态组成型缺陷的菌株，其自然转化能力比野生菌株低2 个数量级，这是很 好的研究枯草芽孢杆菌感受态建成机制的遗传学材料【1 1 1 4 1 3 1 。采用双向电泳技术对生长 到感受态期的感受态正常的且s u b t i l i sb r l 5 1 p 和其同源感受态缺陷菌株且s u b t i l i s b r l 5 1 p m 的菌体全蛋白进行双向电泳，可得到感受态期的全蛋白表达图谱，通过对比分 析感受态正常菌株与缺陷菌株全蛋白的双向电泳图谱，有可能快速找到与感受态建成有 关的蛋白质，进一步利用质谱分析技术对所得的特异蛋白进行分析，可初步确定蛋白质 的性质与功能，为进一步在基因表达与调控水平上研究感受态建成机制奠定基础。 9 材料和方法 2 1实验材料 2 1 1 菌株及来源 2 材料和方法 b a d