（生物化学与分子生物学专业论文）两种酸性耐热α淀粉酶的表达研究.pdf

摘要 * 淀粉酶( 1 ，4 一n d 葡萄糖苷葡萄糖苷水解酶，e c3 2 11 ) 能够以淀粉为底物，从淀粉内部 水解1 4 q d 葡萄糖苷键，广泛应用在淀粉糖生产、发酵、纺织、造纸等许多行业，具有巨人的 经济价值。本研究尝试利用巴斯德毕赤酵母p f c 蛔p f 括作为生物反廊器表达两种极具应用潜 力的极端n 淀粉酶，并研究了重组淀粉酶的酶学性质。 从嗜酸耐热的酸热脂环酸杆菌彳f f c 弦f 。6 口c “f “sw f 如c d z 出r 协中克隆到一种一淀粉酶的基冈 口y ，基因y 全长3 9 0 3 b p ，编码1 3 们个氨基酸，理论分子量约1 4 0 k d 。基冈日州，被分别克隆 到质粒表达载体p e t 2 2 b ( + ) 和p p i c 9 ，并分别在人肠杆菌点如厅p r 耙 缸c d f fb l 2 1 ( d e 3 ) 和巴斯德毕 赤酵母pp 肋r 括g s l l 5 中得到表达，表达产物具有淀粉酶的活性。 纯化酵母中表达的重绸* 淀粉酶r a m y ，并研究了它的酶学性质。以可溶性淀粉为底物， r a m y 作用最适p h3 2 ，在p h2 5 4 6 范围内，酶活性保留5 0 以上，它的最适温度6 5 ，在7 0 下处理3 0 分钟，酶活性维持5 0 以上。重绸淀粉酶r a m y 基本保留了天然酶蛋向的耐热性 和嗜酸性特点。 根据对d 淀粉酶a m y 的氨基酸序列分析肃l 同螈建模，去除基阕口，掣的+ 1 + 1 1 7 4 b p 年 + 3 2 8 8 3 9 0 3 b p 的核酸序列，获得全长2 1 1 5 b p 的基闪片断a m y ，y 编码7 0 5 个氨基酸，理论 分子量约7 9 k d 。2 y 被克隆到质粒表达载体p e t 一2 2 b ( 十) ，并在大肠杆菌ec 。打b l 2 1 ( d e 3 ) 获得 表达，表达产物具有淀粉酶的活性，证明该截断肽链包含能折叠形成淀粉酶催化结构域所需的 氨基酸序列。 来源于嗜热球菌聃p m o c o s p 的酸性高温d - 淀粉酶b d 5 0 6 3 理论分子量约4 9 k d ，不存在 潜在n 连接糖基化位点，编码基因肋j d 卯全k = 1 2 9 9 b p 。根据巴斯德毕赤酵母高效表达基冈的 密码子使用偏好性，对肋j 0 甜进行密码子优化井全基因合成获得新基冈肋5 0 6 打。巴斯德毕赤 酵母能高效表达基因肋5 0 6 j r ，表达量达到6 0 m g l ，表达产物r b d 5 0 6 3 水解可溶性淀粉土要产 物是单糖和低聚寡糖，结合活性染色结果证明r b d 5 0 6 3 具有a 淀粉酶的活性。 纯化r b d 5 0 6 3 ，获得纯度人于9 0 的样品，并研究了r b d 5 0 6 3 酶学性质。以可溶性淀粉为底 物，r b d 5 0 6 3 作州晶适p h 5 o ，在p h35 1 0 o 范嗣内处理3 0 分钟，酶活性保留5 0 以r ；作川 撮适温度1 0 0 1 1 0 ，在9 0 下酶活性半衰删约3 0 分钟。低浓度c a ”对激活r b d 5 0 6 3 活性利维 持稳定性是必需的，而且在一定浓度范同内c a ”浓度对活性影响不显并，m + 、s d s 平t r i t i o n x 1 0 0 都能够部分抑制r b d 5 0 6 3 活性，c u ”羽le d t a 严重抑制r b d 5 0 6 3 活性。 研究了r b d 5 0 6 3 的多组分情况，表达产物包括j 种分子量分别是6 4 、5 7 、4 4 k d 的活性组分， 在通常情况f 主要以大分子颦活性多聚体的形式存在。r b d 5 0 6 3 不存在n 连接的糖基化，但是存 在o 。连接的糖基化现象，o 连接对r b d 5 0 6 3 的热稳定性和最适温度没有显著影响。 本研究利h j 巴斯德毕赤酵母成功表达两种不同米源和性质的酸性耐热一淀粉酶通过对这两 种淀粉酶异源表达情况分析，证实了巴斯德毕赤酵母作为表达极端n 一淀粉酶的生物反应器的可 行性。 关键词：酸性耐热淀粉酶，酸热脂环酸杆菌，嗜热球菌，巴斯德毕赤酵母，基冈表达，牯基化 修饰 l a b s t r a c t a l p h a a m y l a s e s ( 1 ，4 - a l p h a - d - g l u c a l l 唱l u c a n o b y d r o l a s e ，e c3 2 1 1 ) h y d r o l y z ea i p h a 1 ，4 _ l i n k a g e si ns t a r c h t h ea c t l o no f a l p h a - a m y l a s e so ns t a r c hl e a d st oaf a p i dd e c r e a s eo f t h es t a r c hs o l u t i o n v i s c o s 时a l p h a - a m y l a s e sa r ew i d e l y 印p l i e di nn u m e r o u sa r e a s ，s u c ha si ns t a r c hs a c c h a r i f i c a t i o n ， f e l t n e n t a t i o n ，s p i n ，p 叩盯t h u sa n yr e s e a r c ho na l p h a a m y l a s ei sp a n i c u l a r l ys i g n 讯c a n tj nb o t h i n d u s t o r ia 1p r o d u c t i o n 柚ds c i e n t m ci n v e s 廿g a t i o n 1 nt h i sp r o j e c i no r d e rt oe x p l o r et h ew a yo fu s i n gp p 甜f d r 扫嬲b j o r c a c t o rt oe x p r e s se x 仃e m o p h i l i ca l p h a _ a m y i a s e s ，t w on o n c o i n c i d e n ta c i d o t h e n n o p h i l i c a l p h a a m y l a s e s w e r ee x p r e s s e di n 西曲p 曲曲c d 矗a 1 1 dp f c 蛔p 甜r o r 如，r e s p e c t i v e l y ，a f l dt h e n c h a r a c t e r i z a t i o no f t h er e c o m b i n a n ta l p h a a m y l a s e sw e r ed e s cr i b e d a l p h a - a r l l y i a s ea m yf 而mt h eg r 啪一p o s i t i v e 一“母，0 6 d c i f ，蚶口c 油c 口删丑m 圩i so n ek i n d o f a c i d o t l l e r m o p h i i i ce n z y m e ，w t ht h eo p t i m a lt e m p e r a t i l r e 锄dp ho f7 5 a n d3 t h en u c l e o t i d e s e q u e n c eo ft h eg e n e 口叼，w a sc l o n e db yp c r t h eg e n e 册叫w a s3 9 0 3 b pi o n 岛c o m p f i s i n go n eo p e n r e a d i n gf r 锄ee n c o d i n gap o l y p 印t i d eo f1 3 0 l a m i n oa c i d s t hc a l c u l a t e dm o l e c u l a rw e i g h to fa m y w a sa b o u t1 4 0 k d t h eg e n e 册w 鹅e x p r e s s e di nec o 疗b l 2 1 ( d e 3 ) a n dp p 娜幻胁g s l l 5 r e s p e c t i v e l y ，柚db o t ho f t h er e c o m b i n a n tp r o t e j n sh a db i o a c t i v i t y r a m ye x p r e s s e di np p 哪向r 捃w 粥m r t l l e rp u r 强e da n dc h a f a c t e r i z e d t h e 印p a r c n tm o l e c u l a r w e i g h to fr a m yw 粥a b o u t1 6 0 l ( da c c o r d i n gt os d s p a g e w h e nr a m yh y d r o l y z e ds o l u b l es t a r c h ， t h eo p t i m a lp hv a i u ew a s3 2 ，w h i c hi st h es a m ea st h a to f t h en a t i v ee n 纠m e h o w e v e r ，t h eo p t i m u mo f t e m p e r a t u r ew a s6 5 ，al m l el o w e rt h a l lt h a to ft h en a t i v ee n z y m e a b o v e5 0 o fr e l a t i v ea c t i v i t y 俐n a i n e da f t e ri n c u b a t i o nf o r3 0m i n m e sa t7 0 a n y w a yr a m ye x p r e s s e d i n 尸p 甜f d ，抽i s a c i d o t h e n n o p h i l i c b a s e do na r i a l y s i so f a m ya m i n oa c i ds e q u e n c ea n dh o m o i o g ym o d e lo fi t sc a t a l y t i cd o m a i n ，t h e m i d d l es e g m e n to ft h eg e n e 册，w h i c hr a n g e d 舶m + 1 1 7 4b pt o + 3 2 8 8b p ，w a sc l o n e db yp c r t h e t r u n c a t e dg e n e 盘w e n c o d e d7 0 5a r n i n oa c i d sw i t ht h ec a l c u l a t c dm o i e c u l a rw e i 曲to f7 9 n 州w a s e x p r e s s e di ne 川b l 2 1 ( d e 3 ) i n d u c e db y1 m m o 忆i p t g ，a n dt h ee x p r e s s e de n z y m ea l s or e t a i n e d 旺- a m y l a s ea c t i v i 母。s ot h et r u n c a t e dp 印t i d ea m y s h o u l di n c l u d ee s s e m i a la m i n oa c 撼s e q u e n c e s w h i c hc a nf o l dc a t a l y t i cd o m a i n a c i d o h e r n l o p h l i ca l p h a _ a m y i a s eb d 5 0 6 3i sf o u n di n 砌p m d c o c c 蚶s p t h ee n c o d i n gg e n e b 历佻，jw a sr e c o n s 仉l c t e df o r t h eo p t i m a le x p r e s s i o ni n 尸p 田幻，妇m o d 访c a t i o nw a sb a s e do nu n e q u a l u s a g eo fs y n o n y m o u sc o d o no f h i 曲一1 e v e le x p 他s s e dg e n e sj npp 傩f 肿组t h eg e n eb h d 卯，c o n s i s t e d o f1 2 9 9 b p ，e n c o d i n g4 3 3 锄i n oa c i d sw i t ht h ec a l c u i a t e dm 0 1 e c u l a rm a s s4 9 k d t h er e c o m b i n a n t 甜a m y l a s er b d 5 0 6 3w a ss e c r e t e db yj p p 船f 0 ，打u pt oay i e l do f6 0 m g l t l cr e s u l t sf o rt h ev a r i o u s h y d r o l y s i sp r o d u c t so fs o l u b l es t a r c hs h o w e dt h a tr b d 5 0 6 3c l e “e da l p h a - 1 ，4 一9 1 u c o s i d i cl i n k a g e s ，a n d m o s tp r o d u c t sw e r e g i u c o s e ，m a l t o s e ，a n do t h e ro i j g o s a c c h a r i d e s r b d 5 0 6 3w a sp u r i f i e da n dc h a r a c t e r i z e d w h e nr b d 5 0 6 3h y d r o l y z e ds o l u b l es t a r c h ，t h eo p l i m a l i i p hw a s5 oa n dm o r et h a n5 0 o fi t sm a x i m a la c t i v i t yr e m a i n e da f t e rn a t m e n ti nt h eb u f 诧r sr a n g e d f r o mp h3 5 - l o of o r3 0m i n u t e s t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ew a s1 0 0 - 1 1 0 ，a n dt h eh a l 仁l i f ea l9 0 、 p h5 ow a s3 0m i n u t e s l o wc o n t e n to f c 一+ i se n o u g ht oa c t i v a t ea n ds t a b j l i z ei t sa c t i v i t y ，a n de v e nu p t 02 0 m m o l l ，c a po n l ya f 诧c t e di t sa c t i v i t ys l i g h t l y m g h ，s d sa n dt r i t i o nx - 1 0 0p a r t i a l l yj n h b i l e di t s a c t i v i t y ，w h i l ec u na n de d t at h o m u 曲i yi n h i b i t e di t sa c t i v i t y m o s tr b d 5 0 6 3w a si n c i j n e dt o a 鹊r e g a c e i n t ob i o a c t i v o p o i y m e r sf o r m ，w h j c hw o u l db e d i s a g g r e g a t e di n t ot h r e eb i o a c t i v ep r o t e i n sw i t hm o i e c u l a rw e i g h to f6 4 ，5 7 ，4 4 k d ，r e s p e c t j v e i y r b d 5 0 6 3i sn o tm o d 讯e db yn l i n k e dg l y c o s y i a l i o nb u tb yo l i n k e d 剖y c o s y l a t i o n t h eo l i n k e d 9 1 y c o s y l a t i o nh a dl i n l ei n n u e n c eo nt h e r m o s t a b i l i t ya n dt h eo p t i m a it e m p e r a t u r eo f r b d 5 0 6 3 i nc o n c l u s i o n ，t w oa c i d o t h e r m o p h i l i ca l p h a - a m y l a s e sw e r eh i g h l e v e l e x p r e s s e di nj pp 甜f 。r 括 t h o s er e c o m b i n a n ta l p h a _ a m y l a s e se x p r e s s e di npp 娜f o 胁h e l de s s e n t i a lc h a r a c t e r i z a t i o no fn a t j v e a l p h a a m y l a s e s a sar e s u i t ，尸p 甜向r 括h a sb e e no fg r e a tv a l u ea st h eb i o r e a c t o rt o p r o d u c e e x t r e m o p h i l i ca i p h a - a m y l a s e s k e yw o r d s ：a c d o t h e r m o p h i l i ca l p h a - a m y l a s e ，j d 把矗妇p 口向m ，爿矗钟肠6 口c f ， 坫日c 胁c 。z 出r i 附 强e r 州d c o c 口w ，g e n ee x p r e s s i o n ，g i y c o s y l a t i o n 英文缩略表 英文缩写英文全称 中文名称 c g t 船e c y c l o d e x t r i ng l u c a n o 协m s f c r 船e d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d h c a h y d m p h o b i c - c l u s t e ra n a l y s i s p e g p o l y e t h y l e n e g l y c o l c d s c o d i n gs o q u e n c e e d t a e t h y l e n ed i 锄i n e t e 打蛆c e t a t e d t td i t h i o t h r e i t o l x - g a l5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l d g a l a c t o p y r a n o s i d e i p t g i s 叩r o p y l b - d - t h i o g a l a c t o p ”a 1 1 0 s i d e t r i s t r i s ( h y d r o x y m e 廿1 y 1 ) a m i n o m e m a n e a t pa d e n o s i n et r i p h o s 曲a t e b s a b o v i n es e r 眦a 1 b u m i n s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e t r i c o nx 一1 0 0p o l y o x y e t h y l e n e p t o c t y l p h e n o l 环状糊精葡萄糖转移酶 脱氧核糖核酸 疏水基团分析 聚乙二醇 编码区序列 乙二胺四乙酸( 钠盐) 二硫苏糖醇 5 溴4 氧3 吲哚d ，半乳糖苷 异丙基b d 硫代半乳糖苷 三羧甲基氨基甲烷 三磷酸腺苷 牛血清白蛋白 十二烷基硫酸钠 s d s - p a g es o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l 砌i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 变性s d s 一聚雨烯胺凝胶电泳 i e fi s o e l e c t r i cf o c u s i n g 等电聚焦 t l c t h i n - l a y e rc i l r o m a t o g r 印h 薄层层析 f p l c h i g hp e r f o r n l a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱 e cn u m b e ro f e n z y m e1 ne n 纠m ec o m m i s s i o n ss y s t e m 国际生物化学联合会酶委员会 m w k d g b m o l e c u l a rw e i g h t k i l o - d a l t o n ( i ( i 1 0 9 r ，m 0 1 ) g u o b i a 0 用于酶的系统命名和编号系统 分子量 千克摩尔 中华人民共和国国家标准 v i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名孝钦暂 时间：2 0 0 6 年5 月”日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：菇弩笑 ；争 新签名：枷 时间：2 0 0 6 年5 月衫日 时间：2 0 0 6 年5 月订日 中国农业科学院硕士学位论文第一章综述 是薯类、稻谷和小麦，2 0 0 4 年我国粮食总产量达到4 6 9 4 7 2 万吨，而这四种粮食作物年产量占我 国粮食作物总产量9 0 以上，所以仅在我国淀粉资源是相当丰富的。( 表l ，表2 ) 我国淀粉年产量已达8 6 8 7 万吨( 2 0 0 3 年) ，占世界淀粉总产量的1 5 。以淀粉为工业原料 还可以加工生产出许多衍生产品，在发酵行业含淀粉的原材料常常作为培养基的重要组分，实际 上围绕着淀粉加工形成一个巨大的产业网络。 表l ；各种淀粉的直链淀粉含量 t a b l e1t h ec o n t to f m y l o s ei np 1 ts t a r c h 种类淀粉含量( 干重。w m )我国年产量( 万吨)淀粉产量”( 万吨) 此为2 0 0 4 年数据数据来自中国农业统计资料( 2 0 0 4 ) ) 。 此为2 0 0 3 年数据数据来自中国食品工业年鉴( 2 0 0 4 ) ，。 指薯类年产量包括木薯、马铃薯和红薯等。 1 1 2 淀粉酶 淀粉酶( a r r i y l e ) 是能水解淀粉和糖原的一类酶的总称。在多种淀粉酶作用下能完全水解淀 粉，一般水解淀粉过程是* 淀粉酶和d 一淀粉酶切断糖链中的a 1 ，4 d 键，水解释放出麦芽糖，但 分解不完全而生成极限糊精；在支链淀粉酶、异淀粉酶等脱支酶的作用下切断1 ，6 一d 键，剪下 整个侧支，形成长短不一的直链淀粉：糖化酶能切断糖链中的d 1 ，4 d 键和m 1 ，6 d 键，生成葡萄 糖( 图2 ) 。 由于淀粉酶来源不同，作用方式比较复杂，因此对其分类和命名还不尽统一。根据攻击糖营 键的方式有所不同，淀粉酶又分为水解a 1 ，4 d 糖苷键和水解* 1 ，6 。d 糖苷键或同时能够水解这两 个键的三类淀粉酶，而实际中最常用主要是* 淀粉酶 a m y l a s e ) 、d 淀粉酶( p a m y l a s e ) 、葡萄糖 淀粉酶( g 1 u c o a r n y l e ) 、支链淀粉酶( p u l l u i a l l a s e ) 这四种。( 表3 ) 糖原( g l y c o g e n ) 的结构与淀粉相似，只是糖链分支更多，而且结构更紧密。下文如果不作特别说明，淀粉酶 的水解底物都指的是淀粉。 2 中国农业科学院硕士学位论文 第一章综述 1 1 3 旷淀粉酶 从催化专一性上看，把淀粉酶归为糖苷水解酶类( 9 1 y c o s y lh y d r a s e s ) 的第1 3 家族1 ，属于 o 葡萄糖苷水解酶( o g i y c o s y lh y d r 0 1 船e s ，e c 3 2 1 _ 一) 2 ，- 淀粉酶( 旺锄y l a s e ) 系统名为q - 1 ，4 葡萄糖苷葡聚糖水解酶 1 ，4 唱l u c a n - 4 - g l u c a n h y d r o l a s e ，e c3 2 1 1 ) ，从淀粉内部任意水解q 一1 ，4 一 葡萄糖苷键液化淀粉或糖原的一类内切酶，产物的末端葡萄糖残基c ，碳原子为。【- 构型，故称a 一 淀粉酶。 * 淀粉酶水解淀粉机制在上个世纪5 0 年代后逐渐得到阐述：a - 淀粉酶对于直链淀粉的作用第 一步是将直链淀粉任意地迅速地降解成小分子糊精、麦芽糖和麦芽三糖，第二步缓慢地将低聚糖 水解为葡萄糖和麦芽糖。水解终产物有极限糊精、部分低聚寡糖、麦芽糖和葡萄糖。在q l ，4 糖苷键水解过程中，葡萄糖单位间的c 1 o c 4 键的c 1 - o 键间断裂( 图3 ) 。 a n 、y i 蝴 x 中国农业科学院硕士学位论文第一章综述 淀粉酶。大部分* 淀粉酶在水解淀粉时，天然淀粉必须经过糊化1 处理，否则达不到最高活性，一 般高温* 淀粉酶水解未糊化的淀粉颗粒，水解速度下降2 0 0 0 0 倍。有些俚_ 淀粉酶水解生淀粉时， 也能保持较高的活性，这一特点在洗涤剂、食品添加剂中的使用尤其重要。 1 。2 妒淀粉酶应用进展 1 2 1 旷淀粉酶的来源与生产 * 淀粉酶广泛存在于包括人、动物、植物、真菌和细菌等各种生物体中。从1 9 5 6 年首次报道 分离淀粉酶开始( m a 此o v i t z “以，1 9 5 6 ) ，目前已经分离并鉴定的超过1 2 0 种淀粉酶 ( a n t j e ，2 0 0 3 ) ，从数量上看微生物来源的* 淀粉酶占大部分，目前已经从芽孢杆菌属肪c 讲w 、曲 霉一印明 珊m 、链霉菌属跏印幻叼e e s 、酵母等接近9 0 种微生物中分离到大量的* 淀粉酶。早在 1 8 9 4 ，人们开始工业生产淀粉酶，淀粉酶是迄今为止用途最广产量最大的一个酶制剂品种，目前 在工业上大量使用的d 淀粉酶主要来源于枯草芽孢杆菌跏肼j “6 “胁、地衣芽孢杆菌肋c f 抛 如 p 哟铷m 妇、解淀粉芽孢杆菌b d c w 础妇“p ，砸f b m 、黑曲霉“印p 删眦确弘r 和米曲霉 a s p e r g m t so r y z d e 。 目前我国4 0 多家酶制剂厂中，淀粉酶是相当一部分厂家的主要的酶制剂产品。国内生产其 中适用于不同用途的一淀粉酶有1 0 余种剂型，但以吸附型居多，包被型或高纯度剂型较少。在 我国，淀粉酶主要生产菌是枯草芽孢杆菌和黑曲霉，其中中温型0 1 淀粉酶的发酵单位 5 0 0 - 6 0 0 u m l ，高温型q 淀粉酶的发酵单位5 0 0 0 7 0 0 0 u m l ，这些生产用菌株儿乎都是从自然筛选 得到或经过人上诱变的菌株，酶的性质并不十分优良，加之酶的后处理工艺落后，产品利润普遍 不高在我国具有自主知识产权的基因工程菌株实现工业化生产“淀粉酶的报道极少。2 1 2 2 酶法加工淀粉 淀粉是工业上常用的生产原料，目前加工淀粉的生产工艺主要有酸法、酸酶法、酶酸法、双 酶法和全酶法等。酸法是最早应用的工艺，相比较之下，酶法条件温和，具有不需要高压高温， 设备投资省，糖液质量好，原料利用率高等优点，利用酶法对淀粉原料进行深加工，已经逐渐取 代酸法生产。 酶法生产是首先利用淀粉酶液化淀粉生成糊精，然后再根据获得的不同产物，配合使用不 同的酶制剂对糊精进行进一步的处理。目前“淀粉酶已经广泛应用于食品、发酵、粮食加工、纺 织、造纸、医药、轻化工业以至石油开采等领域，其最大的用途是生产淀粉糖品和食品发酵。 。糊化：将淀粉乳加热，淀粉颗粒随着温度升高开始膨胀，晶体结构消失，体积膨大，相互接触，变成糊状液体， 即使停止搅拌，淀粉也不会沉淀，这一现象称为淀粉的糊化。淀粉的糊化温度范围与来源的不同有关，一般在 5 l - 7 4 之间。 2 在我国叶淀粉酶、糖化酶、蛋白酶的产量占酶制剂产量9 0 以上，2 0 0 2 年我国酶制剂总产量3 20 万吨。2 0 0 3 年总产量达到3 8 ，0 万吨，实现工业总产值1 54 亿元，2 0 0 4 年酶制剂总产量再增加到5 0 万吨，但是实现丁业总 产值下降却为1 3 亿元，全行业4 0 的酶制剂厂亏损。( 数据来自中国食品工业年鉴( 2 0 0 4 ) 和中国生 物技术产业发展报告( 2 0 0 5 ) ) 。 5 中国农业科学院坝一l 学位论文 第一希综述 9 0 、7 6 、5 8 和3 8 ，m e t 5 3 t y r 或m e 5 3 t r p 的残留活性分剐为o 9 和o 1 ，转换数，降 低，突变体儿乎失活。如果以淀粉d p l 7 ( 聚台度= 1 7 ) 或低聚糖c 1 p n p g 7 为底物，突变体觑。俄m 只相当丁野生型的t 椭5 5 一o 川或1 7 - 0 0 2 ，但突变体岛”增加了1 0 2 0 倍。c y s 9 5 位 ：结构 域b 内部s u b s j t e 一5 - 6 的内部，c y s 9 5 空间上与t y r l 0 5 邻近( t y r l 0 5 恰好位丁底物结合佗点的底 部) ，c y s 9 5 突变体与野生型比较，以蓝色可溶性淀粉为底物，发现突变体c v s 9 5 a l a 、c v s 9 5 t h r 的比活分别是野生型的1 7 6 、1 3 1 ；如果以淀粉d p l 7 ( 聚合度= 1 7 ) 为底物，突变体c v s 9 5 a l a 、 c y s 9 5 t h r 的k m 分别增加5 倍平2 倍：如果以低聚糖c i p n p g 7 为底物，突变体c v s 9 5 a i a 、c v s 9 5 t h r 的k m 分别增加1 8 倍和4 倍。m e t 2 9 8 位丁结构域cs u b s i t e + 1 + 2 的一个d 螺旋内部，将这个氨基 酸突变，与野生型比较，以蓝色可溶性淀粉为底物，发现突变体m e t 2 9 8 a l a 、m e t 2 9 8 a s n 、m e t 2 9 8 s e r 的比活分别1 7 9 、1 0 0 、1 4 8 ；如果以淀粉d p l 7 ( 聚合度= 1 7 ) 为底物，突变体的鼢略有增 加；如果以低聚糖c | p n p g 7 为底物，突变体的分别增加4 倍、3 倍和8 倍。这些数据表明这 j l 个关键氨基酸残基的突变能够影响催化部侮与底物糖链的接触，影响对底物的亲和性以及结合 方式。 来源于b 口c f ，淞j f p 吖。折p 删哪f ，淞的甜淀粉酶b s a 二个保与催化活性守的氨基酸残基 ( t a k a s e ，1 9 9 3 ) 分别是a s p 2 3 4 、g l u 2 6 4 和a s p 3 3 l ，a s n 3 2 9 在空间上与a s p 3 3 l ，点突变证实突 变体n 3 2 9 d 和n 3 2 9 v 在6 0 条件下丘勘都有不同程度卜降，突变体n 3 2 9 kj l 乎丧火活性： 在非碱性p h 条件下突变体n 3 2 9 v 与野生型表现山的活性著别不人，但是在碱性条什r 突变体 n 3 2 9 d 和n 3 2 9 v 活性分别显著降低和增加，这说明a s n 3 2 9 能影响b s a 的晟适温度和最适p h 。 r v e r a ( r i v e r a “以，2 0 0 3 ) 对来源于勘c f 蛐抛 p 帕白r m 括的a 淀粉酶b l a ( g e n b a n k t m ，e m b l 登录号p 0 6 2 7 8 ) 进行点突变发现在催化部位附近的一个能够影响催化活性的氨基酸残基v a 】2 8 6 ， 突变体v a 】2 8 6 t y r 对可溶性淀粉水解能力提高5 倍突变体v a l 2 8 6 p h e 对可溶性淀粉水解能力r 降3 倍，但这个突变体的转糖基作用和水解作州有所增加，说明v a l 2 8 6 能够影响b l a 对底物转 糖基作j ；_ 种1 水解作用i 突变体va 1 2 8 6 t y r - t r p 2 6 3 乙e u 与野生型对可溶性淀粉水解能力相著无几， 说明v a l 2 8 6 与t r p 2 6 3 可能存在相互作用影响b l a 的催化活性。 另外催化部位附近的h j s 也可以影响m 淀粉酶的催化活性，通过对催化氨基酸残基的附近h i s 的修饰平突变可以影响底物结合专一性。研究证实人胰腺来源的* 淀粉酶h p a 氨基酸序列中 h i s l 2 2 、h i s 2 1 0 和h i s 2 9 6 虽然不参与催化反廊，但是与底物结合以及保证转移过祥的稳定性有 关( 1 s h i k a w a 甜以，1 9 9 2 ；i s h i k a w ap ，以，1 9 9 3 ) 。来源丁爿即p r 砌so ，) 理d p 的淀粉酶t a a 的h i s 2 1 0 和相同位置的来源丁二占d c i ws ，e 口r 0 腩p 册印向，f 埘、占d c 珊瑚s “6 f f 矗坩的旺淀粉酶的h s 都是与催化 专一性以及热稳定性有关( t a k a s e ，1 9 9 4 ；v i h i n e n “d ，1 9 9 0 1 。 对与酶分子结合c a ”有关的氨基酸残基也进行了研究。m a t s u i ( m a t s u ip f 口f ，1 9 9 7 ) 对米源丁人 麦的。【- 淀粉酶同：酶a m y l 进行点突变发现a 曜1 8 3 - g i y l 8 4 一t y r l 8 5 与酶分子结合c a ”有关。通 过突变g l y l 8 4 两侧氨基酸残基a 唱1 8 3 s e r 和t y r l 8 5 m e t ，发现突变体对c a ”亲和力降低，突变体 对麦芽低聚糖水解活性f 降，对低聚糖活性水解增加，对淀粉水解活性增加两倍。通过对高级结 构模型分析，这三个氨基酸残基位于结构域a 内部第4 个b 折稿，a 嘤18 3 位丁s l l b s i t e + 1 + 2 ， g l v l 8 4 通过羰基上的氧原子与c a ”形成化学键。 7 中国农业科学院硕士学位论文第一章综述 1 3 4o r 淀粉酶的高级结构 随着越来越多的* 淀粉酶三级结构被解析，同时结合对淀粉酶与底物和抑制剂结合的研究， 研究人员总结出淀粉酶一般的结构特征，酶的活性部位的共同特征和差异。在q 一淀粉酶中，最早 被解析三级结构的是来源于4 华口辔f f h 口口曙p 的淀粉酶1 a a ，含有a 、b 和c 三个结构域， 这也是绝大多数已经解析三级结构d 一淀粉酶的所共有的。一淀粉酶t a a 多肽n 端构成( “b ) 8 桶 形结构域，称为结构域a ，这是淀粉酶的催化域；结构域b 位于第3 个b 折叠和第3 个d - 螺旋 之间，是个不规则的环( 1 0 0 p ) ，般需要与c a 2 + 结合才能稳定，是c a 2 + 结合结构域；结构域c 末 端是羧基，由5 个反向平行韵折叠构成。( m a s u u r a “矗，1 9 8 0 ) 结构域b 结构域a 结构域c 图6 ：。【- 淀粉酶t a a 的三级结构 f 唔6s t c n 工r eo f a - 衄y l 蠲et 从i n 爿甲8 愕池拮o e 不过一些淀粉酶高级结构中除了结构域a 、b 、c ，有的在肽链的c 端还形成结构域d 和 结构域e 。还有许多d - 淀粉酶蛋白质肽链n - 端或c 端不参与形成结构域a 、b 、c ，而且这部分 序列在不同淀粉酶之间保守性较差。 结构域a a - 淀粉酶的( 。【b ) 8 桶形结构一般是由多肽的n 端3 5 0 - 4 0 0 个氨基酸折番形成的，除了一些诸 如糖基合成葡萄糖转移酶等，组成大部分螺旋的氨基酸残基处于保守区域之外一般b 一折叠要 比空间上相对应的q 一螺旋的氨基酸序列保守一些，这也是大部分( “b ) 8 桶形结构蛋白的一个特 征。d 一螺旋的长度和氨基酸差异和构成结构域b 的氨基酸序列差异可能是导致催化活性差异的一 个重要原因。而且b 一折叠与那些真正保守的区段还有所不同，它们几何特征和侧链的堆积对酶与 底物结合和催化很重要，构成活性部位的氨基酸残基一般位于桶形结构b 折叠的c 端，这一点 与其它已知能够形成桶形结构域的蛋白质是一致的。 1 8 中国农业科学院硕士学位论文 第一章综述 结构域b 虽然结位于( “b ) 8 桶形结构第3 个b - 折叠和第3 个“- 螺旋之间结构域b 是淀粉酶家族所 有酶的共有特征，但是构成结构域b 的氨基酸序列保守性很差，不同来源的a - 淀粉酶组成结构域 b 的氨基酸序列在长度和序列上差别比较大，目前对它的功能还知之不多，推测结构域b 有助于 维持结构域a 的稳定性，对植物来源的淀粉酶的研究也支持这一推测。 大麦( b a r l e y ) 中分离到两种* 淀粉酶同工酶a m y l 和a m y 2 ，氨基酸序列相似性达到8 0 ， 酶学性质略有差异通过结构域互换构建杂合酶，发现结构域b 的改变影响a m y l 的酸性条件 下稳定性和a m y 2 对抑制剂的敏感性。( j u g e “口f ，1 9 9 5 ；r o d e n b u r g 甜硝，1 9 9 4 ) 水稻中分离到两种一淀粉酶同工酶a m y l a 和a m y 3 d ，氨基酸序列相似性达到7 0 ，通过 结构域互换构建杂合酶，杂合酶的_ n 端氨基酸来自a m y l a 的结构域a 的氪基酸和结构域b 的 部分氨基酸，c 端来自a m y 3 d 余下的部分氨基酸序列，发现杂合酶的热稳定性下降，这表明结 构域b 可能有助于维持分子一定结构，保持高效率水解淀粉的能力。f r e r a s h i m a “以，1 9 9 4 ) 结构域c 和结构域d 、结构域e 构成淀粉酶的结构域c 氨基酸序列包含有形成“g r e e kk e ym o t i r 超二级结构的序列。，氏 度略有不同。根据目前得到的研究结果，认为结构域c 不决定d 一淀粉酶的催化专一性但能影响 a 淀粉酶的比活。 对来源于小鼠胰腺a 淀粉酶的结构域c 的部分氨基酸突变甚至将c 端6 5 个氨基酸残基删除， 对催化活性没有显著影响但是影响蛋白质翻译后折叠和蛋白质的分泌。 来源于嗜热脂肪芽孢杆菌口5 据口r 。腩e m d 砌f 船的“淀粉酶b s t a 有a 、b 、c 三个结构域， v i h i n e n 等( v i h i n e n “以，1 9 9 4 ) 首先研究c 端部分氨基酸缺失对0 【淀粉酶功能的影响，以可溶性淀 粉为底物，氨基酸缺失越多比活降低越快( 表1 1 ) 。 表l l ：c 端部分氨基酸缺失对d - 淀粉酶b s l a 功能的影响 t a b l e1 1e 虢c to fr 锄0 v “o fc 妇m i n a lp a n s0 n 绷y l a s cb s t a 有的d 淀粉酶由肽链c 一端形成结构域d 和结构域e ，根据目前的一些研究认为这些结构域不 包括“淀粉酶的活性中心，有助于维持热稳定性，可能还包括淀粉结合结构域。 通过对来源于肋o f