（预防兽医学专业论文）黑曲霉植酸酶高产菌株的选育及phya基因的克隆与序列分析.pdf

摘要 本研究对实验室保存和购买的9 株黑曲霉菌株进行了产植酸酶酶活测定，并对产酶培养基 和培养时间等条件进行优化，结果表明在麦麸半合成培养基中3 0 发酵培养9 6 h ，产植酸酶活 性最高，筛选出一株产植酸酶较高的3 9 2 8 菌株酶活可达6 9 3 咤( 昌m i n ) ：该菌株产生的粗酶 液经6 0 高温处理后，酶活保存率大于8 5 ，适用于作饲料添加剂。该菌株经紫外线诱变处理， 可得到一株产植酸酶较高的2 号菌株，酶活达到2 0 5 0 g ，( g - m i 】1 ) 。 为了获得高产菌株的p h y a 基因，以便比较其序列与网上报道标准菌株序列的同源性，为 后期的表达提供材料，我们采用文献报道的中性裂解法提a s p e 嘻i l u sn i g e r 3 9 2 8 的基因组d n a ， 并根据g e n b a l l l ( 中报道的黑曲霉基因序列，应用d n a s l s 和d n a s t a r 设计、筛选出一对引物， 并分别加入了e c o ri 和n o ti 的内切酶位点。经p c r 扩增后，得到一条长度约为1 5 0 0 b p 的 d n a 片段，与试验设计相符。同时对p c r 反应条件进行优化，确定最佳反应条件。 对p c r 产物采用胶回收试剂盒进行回收，根据已报道的黑曲霉植酸酶曲y a 基因的酶切图 谱，对目的片段进行酶切，该基因能被s a ci 、p s ti 和s a ii 三种内切酶酶切，酶切片段大小与 报道的相一致，鉴定了p c r 扩增片段的正确性。该基因产物定向克隆到p m 阻1 8 t 载体的多克 隆位点上，构建了含有目的片段的重组质粒，并转化大肠杆菌j m l 0 9 ，获得两株阳性克隆菌株， 分别称之为1 # 和2 桴。阳性菌株的序列测定表明，扩增片段中含有完整的真菌植酸酶p h y a 基因， 扩增片段的长度为1 5 0 6 b p ，其中在+ 4 5 b p + 1 4 6 b p 的1 0 2 个核苷酸序列是一典型的真菌内含子 序列，基因内含有真菌内含子的特征保守序列，并且转录起始密码子均为a 1 1 g 。该基因编码4 6 7 个氨基酸，分子量大约是5 1 3 7 k d a ，包含有1 3 个潜在的糖基化位点n 一端的1 9 个氨基酸为信 号肽序列，其余的4 4 8 个氨基酸为成熟植酸酶的氨基酸序列。从氨基酸序列上还找到了植酸酶 的活性位点序列：c r v t f a p v l s r h g a r y p t d s k g k ，它位于氨基酸序列的+ 7 l b p + 9 3 b p 。其 中r h g a r y p t 是微生物来源的植酸酶活性位点中最保守的序列。 序列比较结果显示：本研究克隆的p h y a 基因与a y 5 1 3 7 4 9 和a f 2 1 s 8 1 3 的p 崎a 基因的同 源性分别是9 8 8 7 和9 2 6 2 ，编码的氮基酸序列同源性分别为9 7 4 3 和9 2 9 3 。 关键词：黑曲霉，酶活，筛选，p h y a 基因，p c r ，序列分析 i i a b s t r a c t n i n es 仃a m sa n i g e r sw h i c hw e r ep r e s e r v e di nl a ba l l dp u r c h a s e dw e r ed e t e m “1 1 a t e dp h ”a s e a c b v i 母，a n ds e l e c tt h em e d i u m 柚d 也et i m eo fc u l 6 v a t i o n 1 飞er e s u l t ss h o w e d ：p f d 忆s ea c 6 v i 船i sb e s t “g h e s t 油w h e a tb r a i lm e d i u ma n dc u l t i v a t e9 6 h w es c r e e n e do u tam g hp r o d u c t i o o n s t r a i n - 3 9 2 8 ，p h y t a s ea c 蛀v 畸c o u l dg e tt o6 9 3 鸺，( g m i n ) p h y t a s ew a s 订e a 把db yh i g ht e m p r a n l f eo f 6 0 ，p r e s e r v 撕o nc o e f n c i e n to fp h y t a s ea c t i v 时e x c e e d8 5 t h es 廿面nw a sm u 诅g e n e s i s 订a t e db y “t r a v i o l e tr a d i a 廿o n a n d 雪0 tah i g h e rp m d u c n o ns t f 伍n - 2 ，p h y t a s ea c t i v i t yc o u l dg e tt o20 5 0 蚓 ( g m i n ) n e 恤is p i i t 曲gw e r eu s e df 打e ) 【i l 矗n gg e n o m i cd n ao fa s p e 喀i 1 1 u s n i g e r3 9 2 8 a b o u t 1 5 k b s p e c i f i c 疗a g m e mw 船o b t a i n e d 丘o mg e n o m i cd n a o fa s p e r 酉1 l u sn i g e r3 9 2 8b yp c r a m p l c a t i o nw mp 血n e r sw h i c hh a v ep o s j t i o ne i l 巧m eo fe c o ri 锄dn o tid e s i g n e da c c o r d i n gt o t h e1 ( i l o 、v i ls e q u e n c e so f m ep h y t a s eg e n ei i lt 1 1 eg e n eb a n kb yd n a s i sa n dd n a s t a 凡w es e i e c tm e b e s tc o n d i t i o no f r e a c 廿o n p c rp m d u c t u i o nw 韪p u r i e da n dr e c o v e r e db yp c r f r a g r n e n tr e c o v e r yk i t a c c o r d i n gt 0n 忙 c i i z y m e - c u 仕i n gm a po fp h y ag e n ew h i c hh a dt i i ep o s 协0 n so fs a ci 、p s ti 柚ds a li ，w ec u t 曲e p 嘶e da i l dr e c o v e r e da m p l 饷e df h 舯e n t ，l ee n 巧m ed i g e s t i o no f t l ep r o v e dt 1 1 ew a sp h y ag e n e t m s 劬g m e n tw a sc l o n e di n t op m d 一1 8 tm u l 婶l ec l o n 抽gs i t ea n d 订姐s f o m a e di n t oec o “s 仃a i n j m l 0 9 a c q u i r e 锕or e c o m b i n 跏p l a s m i d sw h i c hw ec a l l e dl 拌和2 撑i n c l u d i i l ga l t l p l m e d 舳g m e n t n u d e o t i d es e q u e n c ea n a l y s i so f _ l h ec l o n e d 丹a g m e n t 坞v e a l e dm ep r e s e n c eo f 廿l ew h 0 1 e p h y ag e n ep r o d u c t 1 1 1 el e i 蜉ho f t l l i sp h y 忱i s eg ei s1 5 0 6 b pi n t e m l p t e d0 n c eb y 柚i 咖no f l 0 2 b p i n 廿1 e5p a no ft i eg e n e ，“si n 打0 nc o r l t a i n sd o n o rs e q i l e n c e - g t a t g c ，l a r i a 士s e q u e n c e 如c t g a c a n d a c c e p t o rs e q u e n c e c a gw h i c ha r et y p i c a l l yc o n s e r v e ds e q u e n c eo f t l l ei n t r o no f m g a lp h ”a s e g e n e t h es t a m n gc o d o ni sa t g l h sg e n ee n c o d e sap e 两d eo f 4 6 7 锄i n oa c i dr e s i d e sw i m m o l e c u l a r w e 蚰to f 5 1 3 7 k d a c o n t a i n i l l g1 3p o 劬t 瑚n g l y c o s y l a t i o ns n e sa t l das i 印a lp e p t i d es e q u e n c em a d e u po f1 9a i l l i n oa c i d er e s i d e s 砒nt e m m a lo f 廿l ep e p t i d e t h es e q u e c eo fa c t i v e s i t eo f p h y i a s e ( c r v t f a q v l s r h o a m ，m s k g k ) i sl o c a t e d a t + 7 l + 9 3s i t e so f l ep e p t i d e r h g a r ：y p t i st h eb e s tc o n v e r e do fa c t i v es n eo fp h y t a s ec o m e 厅o mt i l em j c r o o i g a n i s md n a a i i 印m e n tr e v e a l e d 9 8 8 7 a n d9 2 6 2 h o m o l o g y t o 也e 曲y ag e n co fa y 5 1 3 7 4 9 锄da f 2 1 8 8 1 3e s p e c t e l y t h e d e d u c e da l l l i n oa c i ds e q u e n c es h o w e d9 7 4 3 a n d9 2 9 3 h o m o l o 斟t ot l l o s eo fa y 5 13 7 4 9 如d a f 2 1 8 8 1 3r e s p e 嘶v e l y k e y w o r d ：a n i g e r ，p h y t a s ea c t i v i t y ，s c r e e n i n g ，p h y ag e n e ，p c r ，s e q u e n c ea n a l y s i s i i 】 英文缩写词表 v 独创性声明 y8 8 2 二2 0 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 石蓐硼时间：如吐年g 月士日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不同方式 在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 石，多胡 时间：栅圣年占月，f 日 新签矧秀；i 砂1 时间滂帅，年月炳 学性质的研究也比较深入。我国学者也开展了这方面的研究，郑常文“于1 9 9 3 年筛选出一株 米曲霉( a s p e 曙i l l i l so r y z a e ) ，并对其产生的植酸酶进行了分离纯化及酶学性质的研究。赵允麟 “丁1 9 9 6 年将自己分离的黑曲霉a s n 7 0 菌株的产酶特性与n r r l 3 1 3 s 菌株进行了比较研究。 苗雪霞“等于1 9 9 7 年筛选出一株产植酸酶较强的根霉，并对其产酶条件进行了研究。四川农 业大学的王红宁教授”4 。也筛选到四株产植酸酶较高的菌株：黑曲霉9 7 0 l ( a n i g e l 9 7 0 1 ) 1 4 2 4 3 p 1 1 g ( m n o 垤) 、根霉9 7 0 2 ( r 如z o p 9 7 0 2 i l s ) 3 4 9 8 4p u 幢( m o 垤m ) 、米曲霉9 7 0 3 ( a 。o r y z a e 9 7 0 3 ) 8 5 2 3p u 毽( n m o 垤m ) 及构巢曲霉( a c l a v a ：t u s 9 7 1 2 ) 9 8 1 4p u ，g ( 啦。垤- m ) ，并 进行了培养条件筛选及产酶活性的测定。中国农业科学院的姚宾博士”“已经将p h y a 基因进行 了克隆、序列分析和表达，并且王红宁已经在国际基因库中申请了注册号。 1 3 檀酸酶的活性测定方法 植酸酶活性的高低是植酸酶质量的评定依据。但由于国内外对植酸酶的研究都比较晚，因 此有关植酸酶酶活的定义和测定方法比较混乱，到目前为止没有一个统一的、得到大家公认的 酶活定义和酶活测定方法。目前酶活主要有下列几种定义方法：( 1 ) 酶活定义为每分钟从一定 浓度的植酸钠溶液中释放l “m o l 的无机磷为一个酶活单位”“。( 2 ) 酶活定义为每分钟从一定 浓度的植酸钠溶液中释放l n m 0 1 的无机磷为一个酶括单位“”。( 3 ) 酶活定义为每秒钟从一定 浓度的植酸钠溶液中释放1 o l 的无机磷作为一个酶活单位”。( 4 ) 酶活定义为每小时从一 定浓度的植酸钠溶液中释放l m g 的无机磷作为一个酶活单位”。第一种的酶活单位最大，国 内外采用此种单位的较多，我们称之为国际单位：第一种酶活单位是第二种的l 0 0 0 倍；为第三 种酶活单位的1 7 倍，第四种酶活单位的表示法与第一种大小相近。 植酸酶酶活测定的机理都是利用酶水解植酸钠底物形成无机磷，然后测定无机磷的释放量。 目前普遍采用的无机磷测定方法主要有以下几种： 1 丙酮一磷钼酸铵法，依据的原理是磷酸盐与过量的铝酸铵在酸性条件下混合后，可慢慢生 成黄色的磷钼酸铵，加入丙酮后使黄色物质抽提出来，使灵敏度增加1 0 倍，生成的黄色物质 在3 5 5 n r n 有最大的吸收峰。 2 b a s f 和g i s t _ b m c a d e s 公司采用的方法“，该方法主要是利用植酸酶可咀水解植酸钠释放 无机磷的原理，通过加入酸性钼钒试剂，使水解反应停止，同时与水解释放出来的无机磷产生 颜色反应，形成黄色的钒钼磷络合物，在4 1 5 啪波长下测定磷的含量，以标准植酸酶为参照物， 间接计算被测定样品中檀酸酶的含量。植酸酶的含量以酶活性单位表示。该方法1 9 9 4 年被列入 美国官方分析化学师协会( a o a c ) ，我国已将此法的测定结果作为审批商品植酸酶注册许可证和 验收进口新产品的法定商检依据。 3 维生素c - 钼蓝法”“，它的原理是在酸性的条件下，测定磷试剂中的钼酸铵以钼酸的形 式与样品中的磷酸反应，当有还原剂存在时，磷铝酸立即变成蓝色的还原物质，铝蓝，形成的蓝 色物质最大吸收峰在6 5 0 i 】m 6 6 0n m ，在此波长下测定无机磷的含量。 4 四j | 农业大学提出的方法”“，该方法主要是对以上的方法进行对比，提出的检测方法 与斯夫公司的检测方法原理相同，所不同的是以磷标准曲线作为参照物，计 对比，提出的检测方法 为f e s o d 钼蓝法。 国内有不少学者就植酸酶酶活性的测定进行了研究，但对各种测定方法的精确度、灵敏度、 稳定性、抗干扰能力等方面众说纷纭。 本研究主要采用f e s 毡一钼蓝法，并对该种方法进行了改进，以标准磷溶液的吸光度及磷溶 液对应的酶活单位建立直线回归方程，最后以待测样品吸光度代入方程，计算出酶活性。 1 4 植酸酶高产菌株的研究进展 自8 0 年代中期，欧洲就全面致力于解决无机磷污染的问题，并且治理的核心内容之一是限 制养殖业磷的排放量。天然产植酸酶菌株产酶水平一般都较低，不能广泛应用于单胃动物的饲 料中，没有商业开发价值。8 0 年代后期，各国公司认识到了植酸酶的发展潜力，开始共同集中 研究，进行商品化开发，主要是对天然产酶菌株进行改良获得高产的改良菌或者通过基因工程 技术获得基因工程菌，进而获得大量的植酸酶。w 嘶i n g e n 大学首先克隆植酸酶基因获得突破， 率先利用转基因技术，于1 9 9 0 年首次成功地用a s p e 毽川l l sl l i g e r 工业化规模生产商品植酸酶， 从此以后各国大学、研究所及商业机构都投入了大量的力量进行研究虽然国外的植酸酶商业 化水平很高，但其研究的重点是筛选能耐低p h 值、耐高温而在低温条件下酶活又很高的菌株。 e d w 删。分离到一株最适p h 值为4 ，最适温度为7 0 的霉菌。我国这方面的研究始于1 9 9 0 年，在高产菌株方面，山西大学生命科学系首次分离到一种产植酸酶的青酶菌，此菌产酶效果 较好，植酸酶酶活可达3 1 2 u 幢( 干曲) ；赵允麟“等分离出一株黑曲霉( a s p i l i g e r 7 0 ) ，发 酵5 6 天即可达到产酶高峰，固态发酵产酶水平为4 5u 艟( 干曲) ，陈红歌”“以黑曲霉 ( a s p n i g e r 认0 2 1 ) 为出发菌株，经紫外线、亚硝基胍单独处理和复合处理，获得一株植酸酶 高产菌株，其植酸酶酶活力达到2 9 5 0 3 0 1 5u g ，刘德忠”以无花果曲霉2 1 2 1 1 5 为出发菌 株，用钴照射诱变，获得两株产植酸酶活力较高的菌株，在最适液态培养条件下产酶活力均在 1 1 ou 幢。黄遵锡”等选育到一株液态发酵可产1 3 5u 艋l 的植酸酶菌株，姚斌等脚1 筛选到 一株黑曲霉，摇瓶发酵可达1 6 5u m l 。g o l o v 柚等利用基因重组技术构建了3 组重组a n i g e r 菌株，植酸酶产量分别达到1 1 1 0 5u m l 、0 5 1 0 5u m l 、2 8 x 1 0 5u m l ，姚斌等也通过p c r 对植酸酶基因进行了扩增，并将该基因进行改造，去掉原p h y a 基因中的内含子和信号肽序列， 优化了此基因在酵母中高效表达起关键作用的密码子，获得了高效表达植酸酶的基因工程酵母， 经过改造获得的基因工程菌的产酶量达到5 1 0 5u ，m l ，比原始菌株的表达量约高3 0 0 0 倍。 1 5 植酸酶的分子结构与空间构象 1 5 1 植酸酶的分子构象 早在2 0 世纪6 0 8 0 年代对植酸酶已有较系统的研究，但研究的热点主要集中在酶的分离纯化 及性质方面的研究，对其高级结构研究的较少。h a m n 擎v e l d t 1 等利用基因工程技术，根据d n a 碱基序列推断出氨基酸序列，首次列出植酸酶的一级完整结构。m 1 i a l l 等1 用断裂无花果曲霉植 酸酶的方法，从多肽的重叠区推断出植酸酶的氨基酸组成及二级结构。研究发现去糖基化的植酸 4 催化环境。在对b a c i l l u s 植酸酶活一陛和稳定性的研究中发现，c a 2 + 对其起了很重要的作用，s h i n 等1 在2 0 0 1 年发现b a n r y l 0 1 i q u e 两e n s 植酸酶的活性部位不仅有4 个c a 2 十，而且还有两个磷 酸根离子结合位点，一个是“切割位点”负责对底物的水解，另一个是“亲和位点”，可提高底物 对酶的亲和性。该酶的4 个c a 2 + 与结合在切割位点的磷酸根离子发生螯合，在亲和位点的l y s 7 6 、 曙1 2 2 、y r l 5 9 、y s l 7 9 残基侧链与结合在亲和位点的磷酸根离子发生相互作用，从而提高酶的活 性和稳定性。 1 6 真菌植酸酶p h y a 基因的结构特点 有关植酸酶的研究已有9 0 多年的历史。8 0 年代末，荷兰w a g n i n g e n 大学就克隆了第一个 植酸酶基因，从此以后，植酸酶的研究进入了分子水平，这为解决植酸酶的产量及耐热性问题 奠定了基础。后来研究发现，植物、反刍动物、许多微生物包括酵母、曲霉、细菌等都能产生 植酸酶。目前研究最多的是微生物产生的植酸酶，它们可能是饲用植酸酶的最佳来源。 到目前为止国内外学者“j o “3 共获得了十余条植酸酶编码基因( 见表1 ) ，其中绝大多 数是微生物植酸酶基因仅有一个植物植酸酶基因。最先分离出来的植酸酶基因是 a 6 c u u m n r r i ，3 1 3 5 的p h y a 基因，该基因全长1 5 0 6 b p ，其中+ 4 6 + 1 4 7 的1 0 2 b p 核苷酸序列 是一典型的真菌内含子序列，但是不同学者“9 ，2 4 0 ”4 2 5 2 1 报道的真菌内含子长度有所不同，其上 存有真菌内含子的特征保守序列：d o n o r 序列缶n 盯g c ，l 撕a t 序列一g c t g a c ，a c c e p t o r 序列 c a g 。不同菌株的植酸酶基因序列上游大多数同时含有t a t a b o x 和c a a t b o x ，少数含有一个 或一个也没有。这种富含a t 而缺乏g c 的保守序列结构，有利于d n a 双链的解开和r n a 聚 合酶的挤入，有助于转录的正确起始。密码子中g + c 的含量超过5 0 ，密码子第三位碱基的 o l c 含量超过7 0 ，这是曲霉中高效表达蛋白编码序列所具有的特征之一”“。不同菌株来源 的植酸酶，其结构基因长度及核苷酸组成有所不同，但是同种菌株的同源性可达9 0 以上。 a f i c u 啪n r r i3 1 3 5 的p h y a 基因编码4 6 7 个氨基酸，n 端的1 9 个氨基酸为信号肽 闹酸酶是一种糖基化蛋白。不同菌株 来源的植酸酶基因编码的成熟肽的氨基酸数目也不尽相同。多数报道的植酸酶基因编码的成熟 肽是4 6 7 个氨基酸1 7 1 8 - 的多肽，也有4 6 3 5 ”、4 6 5 ”、4 6 6 ”“和4 8 7 ”“个氨基酸 的报道。在p h y a 编码的氨基酸序列上，发现了1 0 个潜在的n 糖基化位点。从氨基酸推断出该植酸酶 的理论分子量为5 1 4 k d ，氨基酸序列上存在组氨酸酸性磷酸酶的活性位点保守序列：s r h g a r y p t ，它位于氨基酸序列的+ 5 2 + 7 4 。r u d y ”“等报道了植酸酶的活性位点序列( a c n v e s i t es s e q u e n c e ) ：r h g x r x p ( x 为可变氮基酸) ，这是微生物来源植酸酶活性位点中最保守的序列。根据v b n h e i j i n g ”“的信号肽序列结构规则，可以推断出真菌植酸酶基因成熟肽的分泌性信 号肽的切割位点及长度。现在报道最多的是1 9 个氨基酸“。，也有18、22、23、2 的成熟酶。m g m i n g h a l l 1 等研究发现，糖基化能改变蛋白的一级结构，从而能增强酶的疏 水性和钢韧性，提高耐热性因此糖基化对表达的p h y a 的生物合成和热稳定性至关重要。但 是不同程度的糖基化也可能对蛋白质结构的稳定性及其功能产生一定的影响。因此超糖基化也 可能是提高植酸酶耐热性的一个原因。 1 7 植酸酶的基因工程研究进展 虽然植酸酶广泛存在于植物、动物器官及其微生物中，但是有两方面的原因束缚植酸酶的 应用，其一就是含量极低，难以获得大量产品，且价格极其昂贵；其二是天然植酸酶的性质不 稳定，我们必须对其进行政造使之满足饲料加1 = 业和养殖业的要求。近年来随着分子生物学 的发展，国内外的学者已经应用分子生物学手段对植酸酶的基因进行改造，然后利用生物反应 器使其表达量高于原菌株，植酸酶的一些生物学特性也得到改善。 1 7 1 在微生物中克隆植酸酶基因 p i d d i i l 群o n 怕叫等于1 9 9 3 年对a n i g e rv a r a w a r n o 以l k 0 2 4 3 株植酸酶( p h y a ) 基因进行了克 隆和序列测定。为了筛选到植酸酶的基因文库他们根据己知植酸酶的一段多肽氨基酸设计了 一个特异性很强的探针，并且对基因组d n a 进行消化，得到了预期大小的d n a 片断，然后将 其连接到x d a s h u 上，转化到e “对蚀斑进行筛选，经内切酶消化后与探针杂交，得到个 杂交片断，并将该杂交片断亚克隆 x 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章引言 中表达，在家蚕的蚕体和蚕蛹中表达活性分别为4 6 7 1 0 5 u m l 血淋巴液和5 9 7 7 1 0 5 u ，m l 血 淋巴液，酶活性的最适温度范围是5 0 6 0 ，最适p h 值为5 o 5 5 和2 5 ，适合用做饲料添加 剂。 1 8 植酸酶研究的重要意义及应用 1 8 1 植酸酶研究的重要意义 植酸酶主要应用于猪、鸡、鸭等单胃动物和水产养殖类动物，应用范围广、需求量大，但 因产品活性较低，价格昂贵，应用受到限制。近年来，对环保认识的提高，世界各国认识到了 植酸酶的重要性，使植酸酶的研究已成为世界性的研究热点。植酸酶在欧洲使用较广泛，我国 的国情也决定了植酸酶在国内的推广有着极为重要的意义。第一，植酸酶可提高磷的利用率， 预防动物磷缺乏病。大量的动物饲喂试验表明，植酸酶在饲料中添加可提高动物的增重和饲料 效率，对骨骼的生长也有一定的促进作用。第二，植酸酶的使用能减轻江河、水域等环境的磷 污染。第二，植酸酶的使用能缓解我国磷资源缺乏、磷供应不足的局面。第四，解除植酸的抗 营养作用。植酸酶的使用能提高矿物质营养的有效性和蛋白质的消化率，同时可使一些酶如淀 粉酶等恢复其原有的活性提高了食品和饲料的能量有效率。 目前植酸酶产量的提高主要受两个因素的限制，一个是底物浓度的抑制，二是产物的抑制。 对真菌植酸酶而言，当植酸酶浓度高于7 5 0 岫0 1 时，酶活性开始受到抑制；较高浓度的无机磷 酸盐的存在或产生会严重抑制植酸酶的活性。针对这两个问题研究者们以植酸酶的基因序列、 蛋白序列为基础，从基因工程、蛋白质工程两个不同的方面着手改善植酸酶的性能而提高产量。 以基因工程为手段，筛选酶活性高的基因，选择更为合适的表达系统，更换( 或改造) 磷酸抑 制的启动子成为非磷酸抑制的启动子来降低产物抑制；以蛋白质工程为手段，定点突变酶催化 区域的关键氨基酸残基以缓解底物抑制或获得耐热性好的突变菌株。 随着植酸酶研究的不断深入，我们期望在不久的将来，将会有活力高、产量高、耐热性好 的饲用植酸酶乃至食品级植酸酶制剂问世，促进世界的畜牧业和食品工业的进一步发展。 l _ 8 2 微生物植酸酶的应用 1 8 2 1 植酸酶在单胃动物上的应用 植酸酶对单胃动物的饲喂效果已在全世界范围内得到确认。n e l s o n “等首次报道了添加 植酸酶能提高禽类对植酸磷的利用率，提高禽类的生长速度。c 锄p b e u 用猪的生长试验对植酸 酶在不同的磷水平下促生长性能进行了研究。试验组和对照组的个体分别饲喂含有四种不同可 利用磷水平的日粮，试验组日粮中添加有植酸酶( 仔猪5 0 0 f r u ，生长猪3 0 0 刖) 。仔猪和生 长猪的试验结果显示，植酸酶有促进生长的作用。相同剂量的植酸酶在不同的磷水平下促生长 效果不同。仔猪在低磷水平下的促生长效果最显著，达1 7 ；当日粮中可利用磷水平达到0 5 4 时，这一作用降为7 8 。而生长猪当日粮中可利用磷水平高达o 5 8 时，植酸酶的促生长作 用消失。w 砒d r o u p 3 等报道，在以豆饼为基础日粮的肉鸡饲料中添加植酸酶大约有5 0 植酸 磷被释放。c r o m w e u 等“在生长猪的豆粕和玉米一豆粕日粮中添加植酸酶进行试验表明，植酸 酶水平为1 0 0 0 u l 唔时，豆粕中植酸磷的吸收利用率从2 5 提高到5 7 ，而玉米一豆粕中则从1 5 1 0 提高到4 3 。由此上可知，在猪禽饲料中添加植酸酶可提高植酸磷的吸收和利用率，植酸磷的 利用率提高了，那么在相应粪便中磷的含量就有所降低，试验证明能使粪便中磷的排泄量减少 3 4 5 4 。s 蚰o n s 等o ”1 在肉鸡的玉米一豆粕型日粮中添加植酸酶，粪便中磷的排出量减少了 5 0 。饲料中植酸酶的添加减少了粪便中磷的排泄量，大大降低了磷对环境的污染程度。我国 学者”1 也有关于植酸酶能促进单胃动物生长和提高饲料利用率的报道。 1 8 2 2 植酸酶在水产养殖上的应用 植酸酶在水产养殖中也有很广阔的应用前景。早在1 9 7 5 年k e t o l a 就认为以豆饼为主要原 料的饲料比以鱼粉为主要原料的饲料需要添加更多的矿物质，部分原因是由于豆饼中的植酸降 低了矿物质的利用率。r j c l a r d o n 等发现植酸与饲料中高浓度的钙一起可以引起大马哈鱼缺锌。 r o d e h u t s c o r d 和p f e 骶r 以虹鳟为试验对象。饵料以大豆为基础，只含有植物性磷源，磷含量低 于最适含量，并在饲料中添加1 0 0 0 u ，蛀的植酸酶，结果在水温为1 5 时，磷的利用率从1 7 提高到4 9 ，在水温为1 0 时，从6 提高到2 5 。j a c l 【s o n 等在斑点叉尾鱼饵料中用喷涂法添 加植酸酶能促进鱼体增重和骨骼中磷沉积，粪便中磷含量降低了3 ；并认为每千克饲料中添 加5 0 0u 的酶制剂即可获得最大的鱼体增熏和骨骼中磷的沉积。 1 8 2 - 3 植酸酶的其它功用 植酸酶除了能有效分解饲料中的植酸，释放无机磷，提高动物对植酸磷的利用率以外同 时可以减低植酸的抗营养作用”1 ，具体效果表现在咀下几个方面： 1 植酸酶可提高猪禽对蛋白质及矿物元素的利用率。植酸酶水解植酸释放无机磷的同时， 也释放了被植酸螯合的各种矿物元素，如c 一+ 、z 一+ 、f e ”、m n ”、c u ”等，从而提高其利用 率o7 。“，同时由于植酸酶水解了植酸，破坏了植酸蛋白质键，也使蛋白质被释放出来。因此， 猪、禽饲料中添加植酸酶可提高猪禽对矿物元素和蛋白质的消化利用率。v i v e m s 等“发现植 酸酶能提高钙利用率另有报道。”。，猪日粮中添加植酸酶能使z n ”、f e ”、m + 、c 一+ 的表观 利用率分别提高1 3 、1 3 、7 、9 。肉鸡日粮中添加植酸酶还能改善锌的沉积量。实验证 明在猪禽饲料中添加植酸酶能提高蛋白质和氨基酸的利用率。m u l l a i l e y 等“报道，添加植酸 酶能改善猪回肠氮和氨基酸消化率以及氮存留。诺丁汉大学研究表明，植酸酶使回肠的氮消化 率从5 5 提高到6 8 ，整个消化道氮的消化率从8 l 提高到8 6 。国外的一些研究结果”“表 明，在肉鸡的豆饼饲料中添加微生物植酸酶对1 5 种氨基酸的回肠消化率提高幅度为8 5 5 。而 且当考虑个别氨基酸的影响时发现t h r 和的回肠消化率增加幅度最大。 2 植酸酶可改善猪禽的生产性能。许多实验都证明，在猪禽饲料中添加植酸酶可提高猪禽 的生产性能。a d e 0 1 a 等“向断奶仔猪饲料中添加植酸酶( 5 0 0 u k g ) 的实验结果表明，添加植 酸酶组猪的日增重、饲料报酬率和采食量分别提高6 0 3 、5 8 6 和o 3 。许多试验表明，添 加植酸酶可改善蛋鸡的蛋壳强度、蛋重、蛋比重和哈氏单位等指标“”1 ，同时还可以提高产 蛋率，降低破蛋率”“。植酸酶取代磷酸氢钙明显提高孵化性能”“。h a l l ”“研究表明，生长猪 日增重、采食量和饲料报酬与一定范围内植酸酶的添加量呈线性提高。另有资料报道“，植酸 酶对畜禽的影响首先表现为生长性能的影响，其次表现为代替无机磷的作用及潜在的营养价值。 3 节省磷源，预防磷缺乏病，减少环境污染。磷是各种畜禽不可少的矿物元素之一，如果 饲粮中缺乏磷，会导致菖禽生长发育缓慢，出现骨病，产蛋率下降，体重下降，饲料转化率降 低等一系列变化，严重者可引起死亡。为满足畜禽对饲料中磷的需求，不得不在饲料中添加无 机磷酸盐，结果大量未被利用的植酸态磷和残留的未被消化的磷酸盐随粪尿排出体外，既导致 磷源的浪费，又对环境造成严重的污染。 大量研究”1 表明，目粮植酸酶可显著降低粪磷排出量。一蛋鸡试验”“表明，饲料中 添加4 0 0 u 嘻植酸酶后中磷日粮组不表现症状，低磷日粮组发病率显著降低，添加8 0 0 u ，g 植酸酶后以上两个磷水平的日粮组中腿病均得以消除。添加植酸酶还可以显著提高肉仔鸡的成 活率并减少腿病的发生。综上所述，饲料中添加植酸酶，不仅可以节省磷源，预防由缺磷引起 的各种疾病，更重要的是减少粪便中磷的排放量，从而保护了生态环境。 1 9 植酸酶研究存在的问题与展望 植酸酶现已广泛应用于饲料工业、食品工业和医药工业，显示出具有广阔的应用前景和潜 在的商业价值。近年来，国内对植酸酶的开发应用研究十分重视，并取得了较大的成绩。但是 植酸酶研究和开发的总体水平而言，我国植酸酶的研究开发仍处于起步阶段植酸酶生产仍处 于工业化的初级阶段，主要产品仍以植酸酶产生菌固体发酵为主，在生产菌株、酶活以及酶的 剂型上还有一定的差距，尤其在耐高温和广泛作用p h 值的工程菌株的开发上还存在很大的缺 陷。因此，国内今后植酸酶研究的热点主要集中在以下两个方面： 1 植酸酶的空间结构研究将是今后研究的一个热点。 植酸酶的结构是其发挥功能所倚赖的基础，它的许多性质和功能不仅要在表达水平及一级 结构序列的差异上予以解释，而且还必须从其空间结构及动态变化给予阐明。对植酸酶的高级 结构研究较多的是来源于a f i c u u i n n r r l 3 1 3 5 的p h y a 基因编码的植酸酶，已用x 射线衍射技 术等方法分析了其晶体结构。 2 工程技术在分子水平上对植酸酶基因进行改造，构建能高效表达植酸酶的基因工程菌。 国内外研究的主要思路集中在通过基因工程这一手段解决两个问题：一是植酸酶在天然材 料中表达水平太低，难以大量生产及生产成本过高；另一个是天然植酸酶的一些性质不能完全 适合饲料加工和养殖业的要求，如抗逆性、在动物体内的有效性等，尤其是热稳定性。利用基 因工程的手段筛选酶活性高的基因，选择更为合适的表达系统，更换( 或改造) 磷酸抑制的启 动子成为非磷酸抑制启动子来降低产物抑制；以蛋白质工程为手段，定点突变酶催化区域的关 键氨基酸残基以缓解底物抑制或获得耐热性好的突变菌株。 2 g 。i 冀鬟 霪一鬟羹雾 嚣嚣萤登萎荔委蠡羹纂羹羹霉蠹霪j 耋薹下堪南遴薹等塞善委戛；荔霪萋雾奏雾耋壤雾塞 冀望。萎羔妻主j 薹萋蠢萋嚣鏊囊型墓耋量? 窆奏萋耄萋毒蒸彭园鐾跨魏椭芝商嚣： 熟蘩孺 屠馒誊刎蛰雪蓥氍琵罄；琵两譬碧；囊晦释明蹦叶孑争 薹靠p 掘晷? 叠菪茁徐幕。薹舅 划群摹墨渭毪国：娶妫鲫霉雏骟时矗i ： 融萼耋职：尘得乒h 酬墓孺羹蓐：疆壁研? 舞j 缈面雄鹰霹篁掣。国嶝强南蠹若釜l g 一 目 蓥薹幽望潲淆鑫霉点幕二弘笋；甚珏颦萋黎尹；薹鹗鞋掣瓣誊孙驰”强熏0 准夔出色善蟹拳； 襄l 霎鬻葛矧鍪戮筹i g 鬃；裂羹基誊；e 9 霎? 萋羹鹜蠢潆篓嚣薹孵翻誊曼鼋；嚣。警 髫l j 蕾黧黎彗割量邕k 誊婪攀? 囊曩；一氆两霎岔蛩型；望盐嚣毽羹霉向露紊蕾淫；蓍肇肖臻。 羟餐露j 喇强脊氮甜猫蒂含：爨湃翟辣籍蕊强氇垂灌 奏墨霸；剖誊囊硒蟛蔫秘篓呈玉翦坐 妄斧婴葡篱星羹黝嚣。莲氇纂萨手浏器擎簿惑 i 藉囊篓鞫篓磬影。囊筒冉餮。n ：水掭 液嚣需岔野醑夔潮僳诺耋氰接善耄! 任 争戴謇醐姐薹q 秘鼬麓塞二萄瘸塑节疑喜巍篷霪漤； 妻檗q 搿囊囊幕魏垡基薹j 颟燃羹4 ；j 焘写盆誊锄颦铺瑶馏滗；繁霄最o o # 妊蠢= 谣薹 i ；蓦薹金丞爨擎b 型套。一墓稽囊薹鋈塑囊垂霹囊薷囊善羹羹鬟谭。誊羹聋涵搿身羹履鞠隘 莆淄l l i 孺茗霉薷莉i 未量目；t 量争囊孵翮聃辫蛋磬暾塑；笺爨嚣j 羹嘎嚣篓蓑划纂鞋囊蟛冀 荔羹嚣囊蠢塑颡捌。誉国疆瑚薹薹簿癸蓦国踺妒裂幕霉遣谨世墅# 掣；在：接。强。光朗耗鞭鬟 萋蠢弦乖气旃甥；管甄囊拦粲攀铒赫鞋蒋氰 x 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第三章黑曲霉3 9 2 8 植酸酶p h y a 基因的克隆及全序列分析 ! ! ! ! ! ! ! ! ! 目! ! ! ! ! ! ! 曼! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 自! ! ! ! ! ! ! ! ! ! e 皇e e ! ! ! ! ! ! ! ! ! e ! ! ! ! ! ! ! ! ! | ! ! 篁! 寡! 植酸酶活力单位 i 倒( g m i n ) 掰o f 式中：6 一从标准曲线上查得的磷含量( p g ) ；，r 一酶液稀释倍数：* 一称取酶固体培养物质量( g ) 一反应时间( m i n ) 。 2 2 3 产酶条件的筛选 2 2 3 i 最佳培养基的选择 将菌株接种于马铃薯培养基内，3 0 培养3 5 d ，产孢后刮去孢子制成浓度约为1 1 0 7 个m l 的孢子悬液，取l m l 接种于以下四种培养基( 玉米半合成培养基、大米粉半合成培养基、麦麸 半合成培养基、合成培养基) 内，1 5 0 r p m 3 0 振荡培养9 6 h ，然后按照1 2 1 1 中粗酶液的制备 方法制各粗酶液，分别测定每种培养基内植酸酶的活性。 2 2 3 2 最佳培养时间的选择 确定最佳培养基后，将制成的孢子悬液接种到最佳培养基内，分别培养3 6 、4 8 、7 2 、9 6 、 1 0 8 h ，然后按照1 2 1 1 中粗酶液的制备方法制各粗酶液，测定不同培养时间的植酸酶活性。 2 2 4 高温处理后的酶活测定 将所选出的3 个黑曲霉菌株的粗酶液用等体积的o 】m l 儿p h 值2 5 的乙酸一乙酸钠缓冲溶 液于5 0 、5 5 、6 0 分别处理3 0 m i n 后，测剩余后的酶活力。 2 2 5 遗传稳定性的测定 经高温处理后酶活较高的菌株连续传3 代，测定酶活，以检验酶活的稳定性。 2 2 6 诱变菌株的选育 2 2 6 i 诱变时间的选择 用无菌生理盐水将筛选出的黑曲霉菌株从斜面洗下曲霉孢子，倒入盛有玻璃珠的三角瓶中， 2 6 振荡3 0 m i n ，然后用脱脂棉滤去菌丝片段，血球记数调整孢子浓度为l 5 x 1 0 6 个m l 。把 孢乎悬液用灭菌的玻璃棒均匀涂布于马铃薯平板培养基上，进行紫外线诱变。在紫外灯下，距 离紫外灯3 0 c m 分别照射4 m i n 、5 m i n 、7 m i n 和9 m m ，将紫外线诱变后的培养板置于恒温培养 箱内培养，直至有菌落出现。 2 2 6 2 诱变高产菌株的选育 将在马铃薯培养基上出现的菌落，转接入装有5 0 m l 麸皮半台成培养基的2 5 0 m l 三角锥形 瓶内，置于恒温培养箱内，3 0 培养9 6 h ，发酵液滤去菌丝，3 5 0 0 r p m 离心弃去沉淀取上清液， 得到粗酶液，然后分别测定其酶活。 2 26 3 诱变菌株遗传稳定性的测定 1 6 黑；缘吲吗罐崔宴呷基磊蹲球 荽；l i ! 唁i i ；= l g ；譬0 ；i “? 女g = 1 1 日l ” 璺j l h 彗l 莓j ； 基女巷 ! ：耋i 要毫j 自“i 髫鸡毒扛j 1 蔷舅警妻目重； 蕈 ! 日莹j i i r 4卓；| 薹 自i i i ；主| 主j ；_ ；_ 蠹目； l l 霉州 l ? 熏目j i l 旧 孽 ? ? ；i 董 i i i i 羹 鹱i j j ； 薹； j i i * 毒s ；gi i 匿寸 蠢女；“g g i ；i 弭j 日建羔鲁! ! ； ；1 i n h | | l l ； 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第三章黑曲霉3 9 2 8 植酸酶p h y a 基因的克隆及全序列分析 第三章黑曲霉3 9 2 8 植酸酶p h y a 基因的克隆及全序列分析 3 1 材料 3 1 1 菌种 大肠杆菌j m l 0 9 菌株由生理研究室李十泽博士惠赠；黑曲霉3 9 2 8 是从本研究室保存和购 买的菌株中选育的。 3 1 2 主要化学试剂及其工具酶 胰蛋白胨和酵母提取物为t l k 出a 公司产品；琼脂糖为s p a l l i s h 产品：e d l a 、t r i s 碱、s d s 、 i p l g 、x - g a l 、平衡酚、氨苄青霉素等均为s i g m a 公司产品；t 4 d n a 连接酶、l a 咖d