（野生动植物保护与利用专业论文）多疣狭口蛙皮肤分泌物分析及其在繁殖生理中的作用.pdf

摘要：两栖类属于一类可持续利用的自然资源。由于长期进化，使得具有复杂多 样生态类型的两栖类有了广泛的生态适应性，以及形态、生理、生化和行为的多样性。 在适应和进化的过程中，两栖类皮肤分泌液中含有的生物活性分子具有特殊分子结 构，且功能亦复杂多样。已有几百种的生物活性分子从两栖类的皮肤分泌液中分离获 得，并对其进行了结构和功能的研究。两栖动物皮肤分泌物中由于贮存有不同生理和 药理活性的生物活性多肽，在动物药物的开发上尤为备受关注。如果在动物体内能找 到较有效的可提高和控制动物繁殖性能的生物活性物质，并了解其结构、功能、药理 作用及其应用对象和方法，将为解决野生动物的养殖和繁育的许多困难提供物质和技 术的支持。就此，本文通过对两栖动物皮肤结构及皮肤分泌物的分离纯化，作用机理， 以及在不同繁殖期皮肤分泌物中对其繁殖生理的作用等方面的研究工作，为进一步深 入研究其分泌物所含有的促繁殖活性物质分子结构以及功能特性提供基础依据，同时 为今后两栖类动物繁殖生理调节，人工饲养和繁殖能力的提高等提供基础资料。 据观察发现多疣狭口蛙( k a l o u l av e r r u c o s a ) 无论雌雄，其皮肤分泌物比其他的蛙 类要多，尤其是背部皮肤更为明显；在蛙的繁殖前期，繁殖期较繁殖后期更容易分泌。 其雌体在抱对前就有较多分泌物产生，在抱对期间及抱对后都有不同量分泌物产生， 而且雌雄成体并非一抱对就排卵、受精。我们推测在此过程中，雌性和雄性的皮肤分 泌物可能有两个作用，一是加固雄性抱住雌性，二是由于激素的传递或信息的交流， 使雌雄繁殖同步。由此推测它们的皮肤分泌物在发情、抱对、排卵及交配中可能会起 到一定的作用，并且在整个繁殖过程中其皮肤分泌物中某些物质的量和成分可能会有 变化。 为了解不同繁殖时期多疣狭口蛙皮肤分泌物的分泌与皮肤结构的关系及多疣狭 口蛙与其它蛙类皮肤结构的差异，本研究分别对多疣狭口蛙不同繁殖时期，非繁殖期 的黑斑蛙、昭觉林蛙的皮肤显微结构进行了观察比较。从皮肤显微结构观察表明：多 疣狭口蛙三个不同繁殖时期皮肤结构无变化，其背部腺体要比腹部发达。尤其是颗粒 腺，比腹部丰富。背部皮肤的色素层也比腹部发达。繁殖前期、繁殖中期粘液腺含量 ； 比繁殖后期略微多。而对三种蛙皮肤显微结构的对比显示：多疣狭口蛙皮肤比昭觉林 蛙及黑斑蛙皮肤含有更多的腺体，尤其是颗粒腺比后两者含量更为丰富，并且在皮下 存在许多腺体团，背腹皮肤较后两者厚。昭觉林蛙皮肤较黑斑蛙的含有更多的颗粒腺 和粘液腺。三种蛙的背部皮肤都含有色素细胞，除了在多疣狭口蛙雌性腹部观察到少 i 量色素细胞外，另两种蛙在腹部皮肤中均未见色素层。相比之下，昭觉林蛙和黑斑蛙 皮肤结构较相似，两者同多疣狭口蛙在皮肤腺体分布及数量上差别较大，这也体现了 三者不同的生态适应机制。 。另外应用聚丙烯酰胺凝胶电泳，葡聚糖凝胶层析，酶联免疫等实验方法对多疣狭 口蛙繁殖前、繁殖期、繁殖后三个生理时期的皮肤分泌物进行了初步的成分分离，以 及主要对其不同时期皮肤分泌物及分离成分中f s h 及l h 进行了免疫检测和定量比 较。实验结果表明：多疣狭口蛙皮肤分泌物中f s h 的量在其繁殖前期处于三个时期 中的最高水平，繁殖期有所下降，而繁殖后期降至最低。对l h 而言，则是在繁殖期 含量最高，在繁殖前期含量略微偏低，同样是到繁殖后期含量最低。这和其它动物不 同繁殖时期此两种激素出现峰的高低是吻合的，符合这两种激素的生理作用。同时结 果显示多疣狭口蛙皮肤分泌物中f s h ( 2 8 k d a ) 和l h ( 2 9 k d a ) 的分子量与其它物 种的差异不大。 最后将多疣狭口蛙不同浓度的皮肤分泌物作用于小鼠。从其繁殖活动及发情状况 的观察结果来看，稀释8 倍的雄性多疣狭口蛙繁殖前期和繁殖中期的皮肤分泌物对小 鼠存在促进发情的作用，而且繁殖前期分泌物作用小鼠出现的现象要比繁殖期更明 显。前期分泌物的促发情现象明显与f s h 在繁殖前期的量较多是相吻合的，这也突 出了f s h 在动物发情中的重要作用，用不同繁殖时期多疣狭口蛙皮肤分泌物对黑斑 蛙进行作用，刺激发情的现象不是很显著。 关键词：多疣狭口蛙，皮肤分泌物，f s h ，l h ，繁殖生物学 i i a b s t r a c t ：t h es k i nm i c r o s t r u c t u r eo ft h ek a l o u l av e r r u c o s a ，r a n ae h a o e h i a o e n s ia n d r a n an i g r o m a c u l a t aw a so b s e r v e da n dc o m p a r e d ，e s p e c i a l l yo nt h et y p ea n df u n c t i o no f t h e i rs k i ng l a n d s t h er e s u l t ss h o wt h a tt h es k i ns t r u c t u r eo fk a l o u l av e r r u c o s ai nt h r e e d i f f e r e n tb r e e d i n gp e r i o d si s u n c h a n g e d ；t h eb a c kg l a n d sa r ew e l ld e v e l o p e dt h a n a b d o m i n a lo n e i np a r t i c u l a rt h ep a r t i c l e sa b d o m i n a la r er i c h p i g m e n t a t i o nl a y e ro f b a c k s k i ni sw e l ld e v e l o p e dt h a nt h ea b d o m i n a lo n e n u m b e r so ft h em u c u sg l a n di ne a r l y b r e e d i n ga n dm i d - b r e e d i n ga r es l i g h t l ym o r et h a nt h o s ei nl a t e b r e e d i n gp e r i o d c o m p a r i s o no fs k i n sm i c r o s t r u c t u r ei nt h r e et y p e so ff r o gs h o w st h a tk a l o u l a v e r r u c o s ac o n t a i n sm o r eg l a n d s ，e s p e c i a l l yt h eg r a n u l a rg l a n d s ，i nt h es k i n ，c o m p a r e dw i t h r a n ac h a o c h i a o e n s i sa n dr a n an i g r o m a c u l a t a t h e r ea r em a n yg l a n d si nt h es u b c u t a n e o u s g r o u p ；d o r s a l - v e n t r a ls k i ni st h i c k n e s st h a nr a n ac h a o c h a o e n s i sa n dr a n an i g r o m a c u l a t a ， w h i l er a n ac h a o c h i a o e n s i sh a v em o r ep a r t i c l e sg l a n d sa n dm u c o u sg l a n d st h a nr a n a n i g r o m a c u l a t a a l lt h r e et y p e so ff r o g sb a c ks k i nc o n t a i np i g m e n tc e l l s i nc o n t r a s tt ot h e f e m a l ek a l o u l av e r r u c o s a sa b d o m i n a lp i g m e n tc e l l s ，t h e r ei sn op i g m e n ti nt h ea b d o m e n o ft h e o t h e rt w o 舶g s m o r e o v e r , r a n ac h a o c h i a o e n s i sa n dr a n an i g r o m a c u l a t as k i n s t r u c t u r ea r em u c hs i m i l a re a c ho t h e r , b o t ha r el a r g l ed i f f e r e n tf r o mk a l o u l av e r r u c o s ai n t h eg l a n d s ，w h i c ha l s oe m b o d i e st h ed i f f e r e n t e c o l o g i c a la d a p t a t i o nm e c h a n i s m s i na d d i t i o n , b ys d s p a g e ，d e x t r a ng e lc h r o m a t o g r a p h y , a n de l i s a ，t h es k i n s e c r e t i o n so ft h r e ed i f f e r e n t b r e e d i n gs e a s o n s nk a l o u l av e r r u c o s aw e r ea n a l y s i s d i f f e r e n ts t a g e so ft h e i rm a i ns k i ns e c r e t i o no ff s ha n dl hi nt h eq u a n t i t a t i v ec o m p a r i s o n f s ho fk a l o u l av e r r u c o s a ，ss k i ns e c r e t i o ni nt h ee a r l ys t a g eo fi t sb r e e d i n gs h o w e dt h e h i g l l e s tl e v e la n dt h e nd e c l i n e da f t e r w a r d s i nt h el a t t e rp a r to fb r e e d i n g , t h ef s hs e c r e t i o n d e c r e a s e dt oi t sm i n i m a ll e v e l f o rl h ，i ti st h eh i g h e s ti nt h es k i ns e c r e t i o ni nt h eb r e e d i n g s e a s o n ，w h i l es l i g h t l yl o wi nt h ee a r l yb r e e d i n gp e r i o d s i m i l a rt of s h ，l hs e c r e t i o ni n l a t ep e r i o dd e c r e a s e dt oi t sm i n i m a ll e v e l t h i si ss i m i l a rw i t hs t u d i e si no t h e ra n i m a l se gt h ep e a k so ft h e s et w or e p r o d u c t i v e h o r m o n e si n c r e a s e di nb r e e d i n gp e r i o d a tt h es a m et i m e ，t h er e s u l ts h o w st h a tt h e m o l e c u l a rw e i g h to ff s h ( 2 8 k d a ) a n dl h ( 2 9 k d a ) i nk a l o u l av e r r u c o s a s 。s k i n s e c r e t i o n sh a sn od i f f e r e n c et oo t h e rs p e c i e s f i n a l l y ，t h es k i ns e c r e t i o n so fk a l o u l av e r r u c o s aa r ea p p l i e di nm i c ew i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s f r o mt h e i rb r e e d i n ga c t i v i t i e sa n dt h es t a t eo fe s t r u so b s e r v a t i o n s ，if o u n d t h a tt h ed i l u t e d ( 8 x ) s k i ns e c r e t i o n st ot h ep r e - b r e e d i n ga n db r e e d i n gp e r i o dh a sa f f e c t s t i l p r o m o t i o no ft h ee s t r u si nm i c e , a n dt h ep h e n o m e n o ni np r e - b r e e d i n gp e r i o do nm i c ei s m o r eo b v i o u st h a nb r e e d i n gp e r i o d t h ea f f e c to ff s hi si m p o r t a n ti na n i m a le s t r u s ，a n d t h ep h e n o m e n o ni np r e - b r e e d i n gp e r i o do nm i c ei sm o r eo b v i o u si si n o s c u l a t ew i t ht h a t f s hi sm o r ei nt h ep r e - b r e e d i n gp e r i o d o ff s ha n dc l e a ri nt h ep r e b r e e d i n gi sm o r eo f t h em a t c h u s i n gt h es k i ns e c r e t i o n sf r o mk a l o u l av e r r u c o s ai nd i f f e r e n tb r e e d i n gp e r i o d s t or a n an i g r o m a c u l a t ，n os i g n i f i c a n te f f e c tw a sf o u n d f o rk a l o u l av e r r u c o s a ，t h er e p r o d u c t i v ee c o l o g y , t h em i c r o s t r u c t u r eo ft h es k i n ， a c t i v es u b s t a n c ec a na c c e l e r a t er e p r o d u c t i v ei ns k i ns e c r e t i o n s t h er e p r o d u c t i v eb i o l o g y e x p e r i m e n to fd i f f e r e n ts p e c i e sa n do t h e ra s p e c t sa l ee x a m i n e di n t h i sa r t i c l e i tm a y c o n s t r u et h es t a t u so fs k i ns e c r e t i o n s ，t h em i c r o s t r u c t u r eo ft h es k i n ，t h er e p r o d u c t i v e p h y s i o l o g ya n dt h ee f f e c to f t h eg o n a d o t r o p i ni ns k i ns e c r e t i o n so fd i f f e r e n ts p e c i e s b yk e e p i n ge c o l o g i c a lo b s e r v a t i o na n dl a b o r a t o r yo b s e r v a t i o n s ，k a l o u l av e r r u c o s a ， b o t hm a l ea n df e m a l e ，h a v em o r es k i ns e c r e t i o n st h a no t h e rf l o g s ，p a r t i c u l a r l yt h eb a c k s k i nb e c o m e sm o r ea p p a r e n t k a l o u l av e r r u c o s ab ef o u n dt h a ti nt h ep r e - b r e e d i n ga n d b r e e dt i m ee x c r e t es k i ns e c r e t i o n sm o r ee a s i l yt h a nt h el a t eb r e e d i n g k e y w o r d s ：k a l o u l av e r r u c o s a ，s k i ns e c r e t i o n ，f s h ，l h ，r e p r o d u c t i v eb i o l o g y i v 声明尸明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南林学院或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。 签名：叠圣垒日期：遣盟鳖：当! ! ，至 关于论文使用授权的说明 本人同意：西南林学院有权保留论文的复印件，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文；提交论文一年后，允许论文被查阅和借阅，学校可以公布论文的全部 或部分内容。 1 绪论 1 绪论 1 1 两栖类生态习性的研究 在生产实践中，可为蛙类的繁殖、资源保护与利用提供理论依据。在此方面研究 虽然取得了一定的成就，而要深入研究两栖动物的生殖生理学，对其繁殖生态及行为 应有最基本的了解和观察。一直以来，两栖类繁殖生态研究引起众多国内外学者的兴 趣，大量研究集中于幼期生活史特征的比较，繁殖类型与方式，繁殖与气候的变化等 【l - 5 】 o 多疣狭口蛙k a l o u l av e r r u c o s a 由b o u l e n g e r l 9 0 4 年命名，系两栖纲a m p h i b i a 无 尾目a n u r a 姬蛙科m i c r o h y l i d a e 狭口蛙属k a l o u l a ，其模式产地为昆明，、区系属西南 区，为普通种- 9 ) 。多疣狭口蛙主要以陆栖为主，分布广，在云南昆明、丽江、邓川、 大理、下关、沧源、盈江、河口有分布；省外见于四川越西、西昌、会理、及贵州威 宁、兴义等地。一般生活在海拔4 0 0 2 3 0 0 r n 的阔叶林、针阔混交林、针阔混交林和稀 疏灌丛等地区，所在地灌丛杂草繁茂7 。9 1 。繁殖期在临时形成的水坑里产卵繁殖，而 非繁殖期多分散栖息于灌丛和杂草丛中，很少到繁殖地活动10 1 。 多疣狭口蛙基本鉴别特征为中小型个体，雄蛙体长小于雌蛙；前肢较长，指端钝 圆而不膨大，后之短，胫跗关节前达腋部，左右眼部不相遇；皮肤较为粗糙，背部有 些多小疣，背中部常有一条细棱，由吻部端至肛部，肛门周围有些多疣粒；生活时体 色变异大1 6 。雌雄外形鉴别特征表现为雄蛙蹼发达，蹼成圆扇状，除第1 、5 趾外i 蹼的缘膜均达趾端，而雌蛙约1 3 蹼。雄蛙咽部布满紫灰和绿黄色斑点，而雌蛙明部 为灰白色。雄蛙腹部有油状黄色腺体，有两条明显的雄性腺，而雌蛙怀卵时腹部呈透 明状，可见腹内的卵【l o 】。 多疣狭口蛙在4 月出眠，经过大约一个半月左右时间进入繁殖期。繁殖前期的多 疣狭口蛙大都在夜间活动，而且喜欢栖息于安静处。八九点天黑之后就可以观察到多 疣狭口蛙活动，晚上1 1 点至1 2 点比其它观察时间段观察到更多的蛙。采样时间集中 在晚上1 0 点左右。五月底进入繁殖期。在繁殖期由几个产卵高峰期。之后，直到八 月底，没有抱对现象。进入九月蛙的数量会逐渐减少。随着气温的降低，蛙也逐步进 入冬眠期，直到第二年春天，出眠【l o j 。 l 多疣狭口蛙( 肠“肠u e r m c o s a ) 皮肤分泌物分析及其在繁殖生理中的作用 根据野外观察所得的结果基本符合贺佳飞在2 0 0 3 年、2 0 0 4 年对多疣狭口蛙的生 态观察结果i l 。多疣狭口蛙大多在夜问抱对，通常雄蛙在上，雌蛙在下。雄蛙后肢漂 浮于水中，躲避或是移动都由雌蛙来控制。有时会发现雄蛙抱雌蛙并不是抱的很紧， 雄蛙右上肢是插入雌蛙右上肢的腋下，并且雄蛙左上肢并未抱着雌蛙。后来发现雄蛙 双上肢抱住雌蛙。雌蛙对于敌情采取向水底潜入及向阴暗处躲避的方式。雄蛙和雌蛙 相接处之地在雄蛙“肚兜”之上。大部分时间两蛙是浮于水面的，也有停留于水底或是 找个地方可以攀爬，休憩。雄蛙后腿有意向上翘起，比其浮于水中的姿势要更向上翘。 大部分雄蛙通过在繁殖场水域边呜叫来吸引雌蛙。也有少部分不呜叫。两蛙抱对后很 难分开，结合面结合很紧密。人为干扰也不分开。人为强行干扰下，两蛙挣扎分开。 如果水域较小，人为分开的两只蛙可以再一次抱对。抱对时间可长达2 0 个小时左右。 抱对接近尾声时雌蛙开始排卵，两蛙一起用力蹬后肢。多疣狭口蛙的卵有小米大小， 刚排的卵成片的漂浮在水面上，经过一天后，发育成长条状，悬浮于水中【1 0 1 。关于繁 殖生态部分的拟对多疣狭口蛙不同繁殖时期皮肤分泌物的分泌情况，及室内外不同生 活行为作出观察比较。 1 2 两栖类皮肤结构 两栖类由于长期进化，使得具有复杂多样生态类型的两栖类有了广泛的生态适应 性，以及形态、生理、生化和行为的多样性。在适应和进化的过程中，两栖类的皮肤 在维持它们的生存，开拓和适应广阔的栖息地及多样的生态条件的过程中起着重要的 用途。两栖类的皮肤担任了呼吸、调节水平衡、抵抗猎食者、抗细菌、抗真菌、外分 泌、调节温度、繁殖、逃避和掩饰等多方面的功能【1 1 】。 两栖动物皮肤主要包括两大层，即表皮( e p i d e r m i s ) 和真皮( d e r m i s ) 。成体皮肤腺 主要有两种：粘液腺( m u c u s # a n d ) 和颗粒腺( g r a n u l a r 舀a n d ) 。颗粒腺又叫毒腺( p o i s o n o rv e n o m # a n d ) 、浆液腺( s e r o u s 酉a 1 1 d ) 或浆液颗粒腺( s e r o u sg r a n u l a rg l a n d ) 。粘液腺： 外形比颗粒腺小，数量则远较颗粒腺多，大概是颗粒腺数目的十倍，周身体表都有分 布，尤其背部分布很密。粘液腺分泌出清澈粘液，覆盖在身体表面形成一层湿润的薄 膜，具有防御、繁殖、保湿、皮肤呼吸、温度调节、p h 调节等作用，粘液的主要成分 是糖胺聚糖和蛋白聚糖。粘液腺的分泌机制属于局部分泌【1 2 】。多疣狭口蛙不同繁殖时 2 1 绪论 期其皮肤分泌物呈现不同分泌状态，其皮肤中分泌生物活性物质的腺体等结构也可能 存在一定变化。部分无脊椎动物和脊椎动物的体内具有能分泌毒液功能的腺体，称为 毒腺。毒腺属浆液腺，内腔满布颗粒状分泌物，也称颗粒腺。毒腺主要分布在背侧的 躯干部和后肢，毒腺周围毛细血管丰富。 多疣狭口蛙、昭觉林蛙( r a n ac h a o c h i a o e n s i s ) 及黑斑蛙( r a n an i g r o m a c u l a t a ) 三 者同域分布于云南昆明。在对多疣狭口蛙进行生态观察时发现其皮肤在繁殖期分泌大 量粘液，或在受到外界刺激后也会泌出大量分泌物，而与其同域分布的昭觉林蛙和黑 斑蛙的分泌情况则没有如此明显。据此本研究试图观察它们的皮肤结构，以及皮肤当 中分布腺体的种类数量和分布位置等是否存在差异。而关于多疣狭口蛙、昭觉林蛙皮 肤及黑斑蛙的显微结构，以及分布的腺体种类的相关报道未曾见到。此部分研究拟对 昆明地区的多疣狭口蛙不同繁殖时期背腹皮肤的显微结构进行观察和比较，为探讨三 者各自的结构特征及与适应生态的机理方面的研究提供参考。 1 3 两栖类促性腺激素的研究 两栖动物是脊椎动物进化史上的过渡类型，在动物的进化中处于一个特殊的位 置。两栖类动物在其性腺构造，繁殖季节、繁殖行为以及生活习性都存在很大差异。 如有尾目和无尾目在精巢构造和生殖方式上有所不刚1 3 】。中国林蛙在繁殖时间看一般 在每年的4 月上旬至中刨1 4 1 ，昭觉林蛙通常是在9 、1 0 月份抱对产卵，而多疣狭1 ：3 蛙 繁殖盛期则在6 、7 月份。从繁殖期行为和特性来看，多疣狭口蛙在繁殖期和非繁殖 期的皮肤分泌物分泌状态有所不同，由此引起的繁殖习性也不同于其他蛙类。在这些 分泌物中对繁殖有影响的物质一般认为主要是g n r h ，f s h 以及l h 。两栖类不同的 繁殖行为和其自身的神经调控关系紧密。其生殖过程主要受“下丘脑脑垂体性腺” 功能轴控制完成【l5 1 。促性腺激素释放激素( g n r h ) 是脊椎动物脑垂体促性激素( g t h ) 合成和释放的主要调节者，在生殖功能神经激素调控中起关键作用。下丘脑分泌促性 腺激素释放激素( g n r h ) ，激发脑垂体分泌促性腺激素作用于性腺，并促使性腺分泌 性类固醇激素，以促使性腺发育成熟与排出精子和卵子【1 6 】。这其中受关注最为广泛， 研究最为集中，作用最为明显的是两种糖蛋白激素即f s h 和l h 。 糖蛋白激素有4 种，它们形成糖蛋白激素家族，包括在垂体前叶内合成的促滤 3 多疣狭口蛙( 勋，d “，口u e r r u c o s a ) 皮肤分泌物分析及其在繁殖生理中的作用 泡素( 又称f o l l i t r o p i n ，简称f s h ) 、促黄体生成激素( 又称l u t r o p i n ，简称l h ) 和胸腺 生成激素( 简称t s h ) ，以及在胎盘内合成的绒毛膜促性腺激素( 简称c g ) 7 1 。f s h 、 l h 与c g 又合称为促性腺激素( g o n a d o t r o p i n ) i i 7 。f s h 和l h 这类糖蛋白激素有相 同的q 亚基和各自特异性的d 亚基组成【8 - 2 0 。f s h 和l h 在不同的生物当中分子量稍 有差异，但他们都具有高度的保守性。在哺乳动物当中f s h 和l h 的分子量约在 2 8 5 k d a 和2 9 k d a ，在鸟类中两种激素的分子量也在2 8 k d a 和2 9 k d a 左右，而在鱼 中发现西伯利亚鲟鱼的f s h 的分子量为2 7 4 k d a 。在两栖类当中f s h 和l h 的分子 量分别在2 7 2 k d a 和2 9 1 k d a 左右【2 2 之3 1 。 f s h 和l h 的分泌是脉冲式的，主要受下丘脑g n r h 、性腺分泌的抑制素、激动 素等的直接调节，以及性腺类固醇激素的反馈调节。雄性动物体内的f s h 主要作用 是促进生精上皮发育和精子的形成。在雌性动物中，f s h 的主要作用是促进卵泡内膜 细胞分化，颗粒细胞增生和卵泡液的分泌，以及刺激卵泡内膜细胞上l h 受体的产生。 生产的f s h 主要用于动物的超数排卵【2 4 】。 l h 在雄性动物中是存在一定量，其主要的作用是维持性腺发育，平衡体内激素 水平。而l h 在雌性动物繁殖领域中的应用主要是促进卵泡的成熟，引发排卵，促进 黄体形成，并维持黄体细胞分泌孕酮，以防止孕畜流产。l h 的作用机制是通过与靶 细胞膜上的l h 受体结合激活腺苷酸环化酶系统，引起甾体激素的合成与分泌，从而 参与受精卵的着床，卵巢发育及功能活动的调节。研究发现颗粒细胞中l h 受体的出 现可使优势卵泡在外周血液f s h 下降的情况下，能够通过l h 的作用途径弥补并支 持卵泡的继续发育，并且随着优势卵泡的发育，卵泡对l h 受体的敏感性逐渐增强。 在哺乳类，一般认为促性腺激素释放激素( g n r h ) 从下丘脑以脉冲式释放后，促进 脑垂体l h 的间歇性分泌【2 5 1 。对于蛙类从已有的研究结果来看，其g n r h 的种类、分 布及其在垂体促性腺功能中的作用至今还未完全弄清楚。不同的蛙类，得到的结果不 尽相同；即使在同一蛙类中，有的结果也并不完全一到2 6 1 。但通过一些研究表明，连 续的激素刺激可能是蛙类生殖系统调节的种主要方式【2 7 1 。o c o n n o r 曾用生物测定 法测得豹蛙脑垂体g t h 含量的同变化【2 引，李远友等也利用具有高度特异性的放射免 疫测定法，研究了虎纹蛙成蛙脑和脑垂体g n r h ，以及脑垂体和血浆g t h 含量的r 变 化。其研究发现雌蛙脑和脑垂体m g t r h 含量存在明显的同变化，雄蛙脑垂体和血浆 中的l h 水平，以及雌雄蛙血浆f s h 水平也存在明显只变化【2 9 1 。 4 1 绪论 多疣狭口蛙皮肤较粗糙背部小疣多，腹面及四肢腹面光滑，疣粒极少【3 2 】。因此， 本研究准备通过一系列的实验，对多疣狭口蛙在非繁殖期和繁殖期的各阶段所收集到 的分泌物进行分离纯化，旨在找出和它的繁殖生理和繁殖行为相关的物质的同时，由 于在野外观察多疣狭口蛙皮肤分泌物随繁殖时期不同存而在变化，为了探究其皮肤分 泌物中的生物活性物质与繁殖生理的关系。本研究将对两栖类动物的卵泡发育、成熟、 排卵及受精繁殖生理中有重要作用的f s h 和l h 在不同繁殖时期的表达量进行检测。 在应用层析分离和酶联免疫反应( e l l s a ) 鉴定f s h 和l h 的存在及含量的同时，根 据蛋白质电泳和w e s t e r nb l o t t i n g 等实验方法进一步确定f s h 和l h 的分子量，并对 不同繁殖时期的表达进行分析。为今后两栖类动物繁殖生理调节，f s h 和l h 的分离 纯化以及人工饲养和繁殖能力的提高提供基础资料。 1 4 两栖类皮肤分泌物和繁殖生物学关系 两栖类皮肤分泌液中含有的生物活性分子具有特殊分子结构，而且功能复杂多 样。已有几百种的生物活性分子从两栖类的皮肤分泌液中分离获得，并对其进行了结 构和功能的研究。两栖动物皮肤分泌物中由于贮存有不同生理和药理活性的生物活性 多肽，在动物药物的开发上尤为备受关注。而在野生哺乳动物中，很多动物具有刺激 发情困难，排卵少，时问短和胚胎潜伏期长等生物学特性，这种特性限制了人工受精 技术的应用，以致使妊娠期拖延很长，对繁殖影响很大【3 l 】。根据此性质人们可以用能 促进成熟，刺激发情和排卵的这样一些生物活性物质，用于繁殖困难的野生动物，以 改变其发情、排卵的时间和频率，或缩短胚胎潜伏期。如果在动物体内能找到较有效 的可提高和控制动物繁殖性能的生物活性物质，并了解其结构、功能、药理作用及其 应用对象和方法，将为解决野生动物的养殖和繁育的许多困难提供物质和技术的支 持。 低等动物中，有一些动物能分泌不同的化学物质形成外激素，作为种群个体之间 的通讯工具【3 3 】。性外激素是由动物体释放至体外，并可引起同类动物行为和生理反应 的一种化学物质；它的腺体分布很广泛，遍及身体各处靠近体表；很多试验说明性外 激素通过嗅觉刺激在控制哺乳动物的生殖活动方面起着重要作用。在硬骨鱼类，性外 激素几乎都是性激素及其代谢产物，这些物质除了作为内部的化学信号作用于身体的 5 多疣狭口蛙( ，d “肠u e r r u c o s a ) 皮肤分泌物分析及其在繁殖生理中的作用 靶器官外，还释放到水体中作为外部的化学信号，对释放者本身和同种其他个体的生 理和行为起作用。这些性外激素在雌雄个体之间的求偶、交配和诱发异性产卵或排精 等生殖行为方面发挥重要的作用。在畜牧业生产上可有效地利用外激素，能降低生产 成本，提高母畜的受胎率、产仔率和成活率等，从而提高经济效益【3 4 1 。 6 2 多疣狭口蛙繁殖生态及习性的观察 2 多疣狭口蛙繁殖生态及习性的观察 2 1 材料与方法 本实验观察的对象为分布于昆明西南林学院校园及周边地区的多疣狭口蛙。 2 1 2 研究方法 多疣狭口蛙出眠的时间和当年的气候有关，这也进一步影响了其繁殖生态习性。 因此对多疣狭口蛀进行了两年的繁殖生态观察。 野外工作观察时间为2 0 0 6 年5 月至8 月和2 0 0 7 年4 月至9 月。具体时间为晚 上9 点至1 1 点。地点为西南林学院内多个观察点、昆明理工大学生化学院附近等地。 第一年的研究主要目的是以繁殖生态的观察为主，同时对观察其间的多疣狭口蛙雌雄 个体皮肤分泌物进行样品采集，以用于分离分析实验。第二年工作完善观察数据，进 一步确认其繁殖前、中、后时期繁殖生理特征并补充收集样品，以作为繁殖生物学实 验。 野外观察内容重点为多疣狭口蛙生活习性，生活环境，不同繁殖时期野外出没 多疣狭口蛙雌雄性比，繁殖时期的繁殖行为，抱对现象、产卵行为特点，以及多疣狭 口蛙不同繁殖时期皮肤分泌物的分泌情况。 。野外观察也是为人工饲养多疣狭口蛙提供一些基础数据，所以在野外观察的同 时，捕捉一部分多疣狭口蛙进行室内饲养及繁殖行为特征的观察对比。 从野外捉回2 0 只多疣狭口蛙进行室内饲养，雌雄各半。饲养箱长宽高分别约为 9 0 c m 、4 0 c m 、4 5 c m 。人工模拟野外生存环境。箱底覆盖细砂，水盆中水深4 - 6 c m 。 室内观察和野外观察时问相同，并且在白天做不定期观察。室内观察重点同样为多疣 狭口蛙生活习性，繁殖时期的繁殖行为，抱对现象、产卵行为特点。除此之外，还对 多疣狭口蛙卵的发育进行了观察及皮肤分泌物进行收集。 7 多疣狭口蛙( f d “，口u e r r u c o s a ) 皮肤分泌物分析及其在繁殖生理中的作用 2 2 结果 2 2 1 多疣狭口蛙野外繁殖时问和繁殖期 根据观察，2 0 0 6 年多疣狭口蛙繁殖开始日期为5 月底，结束于7 月中旬，繁殖 期约为4 5 天。6 月2 日以前有少数蛙抱对。6 月2 日至1 0 同之间，雨量充沛，大量 蛙抱对。在6 月2 日和6 月1 0 同是抱对产卵的高峰期。8 月下旬可以看到有蛙出没， 但没观察到抱对产卵的。多疣狭口蛙2 0 0 7 年繁殖开始同期为6 月初，结束于7 月下 旬，繁殖期为5 0 天左右。6 月2 4 曰以前有少数蛙抱对。在6 月2 4 日和6 月2 9 日是 抱对产卵的高峰期。6 月2 4 日至2 9 日，降水增加，大量蛙抱对。9 月初可以看到有 少数蛙活动，但没观察到抱对产卵的。 2 2 2 野外雌雄多疣狭口蛙不同时期性比 多疣狭口蛙的雌雄性比变化在不同繁殖时期有所变化，雌雄性比变化的规律见 表2 1 。 表2 12 0 0 6 年、2 0 0 7 年不同活动时期雌雄性比 t a b 2 1s e xr a t i oc o m p a r i s o n so fd i f f e r e n ta c t i v ep e r i o d si n2 0 0 6 2 0 0 7 2 2 3 野外多疣狭口蛙产卵时间及产卵场 ， 多疣狭口蛙多在晚间抱对，抱对时间有时可长达2 0 个小时左右，所以在次同中 午或午后产卵。有些也在凌晨产卵。产卵时间也长达3 0 分钟左右。观察所有的野外 抱对蛀都是在排水渠中进行产卵。 8 2 多疣狭口蛙繁殖生态及习性的观察 2 2 4 野外多疣狭口蛙皮肤分泌物 多疣狭口蛙无论雌雄都可以分泌粘性物质。尤其到繁殖季节受到刺激后大量分泌 分泌物。其分泌物为白色液体，分泌后2 0 3 0 秒后凝结成白色粘液。粘液粘合力极强。 人手一旦接触到很难清洗干净。繁殖期对多疣狭口蛙性成熟个体完整皮肤一次性分泌 最大量进行粗略测量。雄性平均分泌量为0 3 m l 只左右；雌性皮肤分泌物平均分泌量 为0 4 m v 只左右。分泌物大多数情况是在蛙受到刺激后分泌的。捕捉时有少量分泌， 用牙签等尖锐物体刺激后大量分泌。雌雄分泌物都是背部皮肤分泌的，腹部极少分泌， 用牙签刮其腹部，有少量透明装胶质物质。 其皮肤分泌物具有一定保护作用，除此之外，其皮肤分泌物可能和繁殖抱对有关， 可以促进排卵受精，还可以促使抱对的雌雄蛙紧贴在一起。 2 2 5 室内饲养 在室内抱对的蛀时间较长，但没有排卵。室内饲养的蛙在抱对的时候雌蛙仍然取 食，但雄蛙在抱对期间没有发现摄食。室内饲养蛙抱对开始的时间和野外相差不多， 在野外第一次观察到的抱对现象后两天即在室内观察到多疣狭口蛙雌雄抱对。室内抱 对的多疣狭口蛙抱对时间要比野外抱对的多疣狭口蛙的抱对时间长，但并不排卵。野 外多疣狭口蛙产卵高峰期后2 0 天左右室内多疣狭口蛙才出现产卵行为，产卵量少， 卵的成活率为零。室内抱对蛙大部分也是在水盆中产卵。唯一一只雌蛙例外。没有进 行抱对，自行在陆地产卵。但产卵极少量。 对室内饲养多疣狭口蛙皮肤分泌物分泌情况观察发现：多疣狭口蛙在繁殖期随饲 养时间变长其皮肤分泌物量减少，并且对刺激的敏感度降低。但其皮肤分泌物的性质 并没有改变。 在卵的发育研究中，对雌蛙，从繁殖期前捕捉日开始每隔l 星期对3 只雌性多疣 狭口蛙测腹围，共测3 次。繁殖期每隔5 天对5 只雌性多疣狭口蛙测腹围，共测5 次。繁殖后期对3 只雌性多疣狭口蛙测腹围，共测2 次。( 见表2 2 ) 9 多疣狭口蛙( ，d ”肠u e r r u c o s a ) 皮肤分泌物分析及其在繁殖生理中的作用 表2 2 不同时期雌蛙腹围平均值( n u l l ) t a b 2 - 2t h ea v e r a g ea b d o m i n a lc i r c u m f e r e n c eo ff e m a l ef r o g si nd i f f e r e n tp e r i o d s ( m l t l ) 2 3 讨论 2 3 1 活动规律及习性 多疣狭口蛙的活动规律及习性主要是由环境所影响。年活动规律是选择多雨的春 夏季会活动，而且活动期和繁殖期也受每年雨季来临的早晚影响。一方面作为蛙类 主要食物的昆虫是在每年的春夏季节大量繁殖，这是蛙类春夏季出没的原因之一，而 蝌蚪离不开水生活，所以蛙类产卵也必须在有水的地方，而夏天的雨季也正是大量提 供这样条件的季节。多疣狭口蛙正是选择这样多虫、多雨的季节活动最频繁r i o 。 2 3 2 繁殖时间和繁殖期 多疣狭口蛙每年几个月的活动期的主要任务是取食补充能量和抱对产卵繁殖下 一代，因此其繁殖时间也选择有水且食物充足的时候。多疣狭口蛙对繁殖时间主要受 当年气候的影响。根据两年的观察，多疣狭口蛙对繁殖时间出现差别主要因为0 7 年 雨季来临的时间迟于0 6 年，因而，0 7 年表现出繁殖时间比0 6 年滞后的现象。 2 3 3 野外出没多疣狭口蛙雌雄性比 1 0 2 多疣狭口蛙繁殖生态及习性的观察 从观察来看，刚出眠的一段时间，雌蛙比例较高，可能是因为雌蛙在适宜天气状 况下比雄蛙出眠早，可以较早蓄积能量，便于卵发育。 繁殖期，未成熟的雌蛙极少进入繁殖场，不参加繁殖的雄蛙则进入繁殖场，而成 熟的雄蛙为获得更高的抱对机会，也频繁进入繁殖场。这些原因都导致繁殖期雄蛙远 远多于雌蛙。 繁殖后，雌蛙可能消耗大量能量，所以要花多一些的时间来补充能量准备过冬， 而雄蛙则较早进入冬眠期【3 2 3 5 - 3 6 1 。 2 3 4 产卵时间及产卵场 长时间的产卵可以使受精更充分，受精率更高。而且雌蛙腹中卵量逐渐减少对雌 蛙也是一个保护的作用【。 2 3 5 抱对( 配对) 及产卵行为 抱对及产卵是蛙类最为重要的活动行为，也密切的关系到种群的繁衍。长时间的 抱对可能使卵得到充分发育，但是过长时间的抱对会使成体疲惫，且有一定危险性【3 2 】。 根据对多疣狭e l 蛙抱对及产卵行为的观察发现，多疣狭口蛙大都在深夜抱对 3 5 - 3 6 。 2 3 6 室内饲养和野外多疣狭口蛙行为的差别 多疣狭口蛙皮肤分泌粘液有时属于一种应激反应，当长时间在人为干扰情况下生 活，这种应激反应会变弱，因此室内饲养一段时间的多疣狭口蛙皮肤分泌物量减少， 并且受到刺激的敏感度下降。 从不同时期多疣狭口蛙雌蛙腹围平均值数据看出：在繁殖前期多疣狭口蛙雌蛙腹 中的卵已经发育具有一定的规模，在繁殖时期卵发育成熟，当产完卵之后腹围大幅度 。 减小，这些符合其繁殖行为。 通过两年对多疣狭口蛙生态的习性的观察发现其皮肤分泌物非常丰富，而且繁殖 期尤为多。此现象可能与其皮肤结构以及皮肤内的腺体有着密切的联系。因此在以后 的研究中将对其皮肤的显微结构作观察比较，以弄清是否皮肤分泌物与皮肤结构的特