（野生动植物保护与利用专业论文）2kga连续发酵工艺及其产物的抗氧化效果研究.pdf

摘要 2 酮基d 葡萄糖酸( 2 k e t o d g l u c o n i ca c i d ，2 k g a ) 是采用细菌发酵工业化大 规模生产的有机酸之一，主要用于食品抗氧化剂d 异抗坏血酸( e r y t h o r b i ca c i d ，e a ) 及d 异抗坏血酸钠( s o d i u me r y t h o r b a t e ，e n ) 的合成。2 0 世纪9 0 年代以来，国际 市场对食品抗氧化剂e n 及e a 的需求量不断增加，对其生产过程中的中间体2 k g a 的需求量也越来越大。 e a ，又名赤藻糖酸或阿拉伯抗坏血酸，是l 抗坏血酸( 维生素c ，v c ) 的旋光 异构体。在f a o w h o 联合食品添加剂专家委员会第3 3 届会议上，异抗坏血酸的英 文名称被规范为e r y t h o r b i ca c i d 。e a ( e n ) 与v c 具有相似的化学结构，但其生产成 本相对低廉，不及v c 的1 2 ，被f d a ( 1 9 8 0 ) 认定为“公认安全”( g r a s ) 的食品 抗氧化剂。e a ( e n ) 不仅仅是水溶性抗氧化剂，而且是一种强还原性有机酸( 盐) 和有特定环化结构的多羟基化合物，具有广泛的应用范围。 2 k g a 连续发酵工艺及其产物的应用研究必将对相关产品的工业化生产和应用 带来重大的影响，譬如降低生产成本和扩大应用领域等。 为此，本课题进行2 k g a 连续发酵工艺及其产物在饲料中抗氧化作用效果的研 究。结果如下： l 通过对发酵过程中葡萄糖消耗量、2 k g a 生成量和菌体生长量等相关因素之间 的关系研究建立了2 k g a 发酵的模型。m a t l a b 软件运行结果表明：在9 5 的置信区 间内，葡萄糖消耗量与2 k g a 生成量之间以及葡萄糖消耗量与菌体生长量之间表现 出良好的线性回归关系，其决定系数r 2 分别为：0 9 9 6 、0 9 8 9 ，说明该模型可靠性高。 因此，2 k g a 发酵属于生长联系型，为连续发酵工艺在2 k g a 发酵中的应用提供了依 据。 2 通过研究同一稀释率下不同浓度的补料葡萄糖对2 k g a 连续发酵的影响，确 定最佳补料葡萄糖浓度。结果表明，在实验的葡萄糖浓度范围内，同一稀释率下，随 着补料葡萄糖浓度的提高，连续发酵达到平衡时产物浓度呈现递减趋势。实验条件 下，在补料葡萄糖浓度9 时的2 k g a 产率和发酵转化率均为最高。 3 通过研究同一补料葡萄糖浓度下不同稀释率对2 k g a 连续发酵的影响，确定 最佳稀释率。结果表明：稀释率为0 0 6 2 5 h 1 时，发酵转化率为最高，但2 k g a 产率 处于中间位置；稀释率为0 1 2 5 0 h 1 时，2 k g a 产率最高，但发酵转化率处于中间位 置；稀释率为0 1 8 7 5 h _ 时，发酵转化率和2 k g a 产率都处于最低位置。 4 通过研究连续发酵过程中稀释率改变对连续发酵的影响，探讨如何进行稀释 率的转换。结果表明：加上连续发酵准备时间，连续发酵持续了1 1 5 h 左右，整个发 酵过程中先后出现两次平衡。这两次平衡与两种稀释率相对应，同时展示出由一个连 续发酵的平衡点向另一个连续发酵的平衡点过渡的全部过程，充分证明了在连续发酵 过程中适当改变稀释率的可行性和可操作性，也证明了连续发酵工艺适合于2 k g a 发酵工业化生产。 5 通过对2 k g a 半连续发酵的研究为2 k g a 连续发酵的工业化应用提供对照。 结果表明：随着补料速率的提高，半连续发酵的2 k g a 产率和发酵转化率均逐步下 降。该结果有利于进一步了解不同发酵方式对2 k g a 发酵的影响，有利于优化连续 发酵操作方式，降低生产成本，提高生产效益。 6 本研究对不同发酵方式下2 k g a 发酵的结果进行了比较。研究结果表明： 6 1 稀释率0 1 2 5 0 h ，葡萄糖浓度分别为9 、1 2 、1 5 和1 8 ，在实验浓度范 围内，随着葡萄糖浓度的提高，2 k g a 产率、发酵转化率和产物浓度逐步下降。葡萄 糖浓度9 时，其2 k g a 产率、发酵转化率和产物浓度为最高，分别为7 1 9 7g l h 、 5 9 3 6 、5 7 5 8 ；其2 k g a 产率高于分批发酵和补料分批发酵，但发酵转化率和产 物浓度低于后者。 6 2 稀释率分别为0 0 6 2 5 h 1 、0 1 2 5 0 h 一、o 1 8 7 5 h ，在实验稀释率范围内，随着 稀释率的升高，发酵转化率和产物浓度逐渐降低，2 k g a 产率以0 1 2 5 0 h - 1 时最高。 稀释率o 0 6 2 5 h 。1 时，2 k g a 产率和发酵转化率分别为5 7 7 4g l h 、9 5 2 4 ，均高于分 批发酵和补料分批发酵。 6 3 半连续发酵与连续发酵表现出类似的结果。但在同样的补料速率下，半连续 发酵的效果显然低于连续发酵。 7 通过乙氧基喹啉( e t y o x y q u i n ，e m q ) 、e n 、二丁基羟基甲苯( b u t y l a t e dh y d r o x y t o l u e u e ，b h t ) 、2 k g a 钙盐( 2 k g c a ) 、2 k g a 发酵液( 2 k g c a f ) 等几种抗氧化 剂在预混合饲料中抗氧化能力的研究表明：添加量为1 0 0 m g k g 时，与实验组的其它 抗氧化剂相比较，e n 的抗氧化能力最好，其添加量最低，且效果更显著；其次是e m q 、 b h t 。虽然2 k g c a f 、2 k g c a 具有一定的抗氧化能力，但因其添加成本相对较高， 目前还不能直接用作饲料中的抗氧化剂。 i i 本项研究建立了实验室条件下的2 k g a 连续发酵工艺，同时证明了该工艺应用 于2 k g a 发酵工业化生产的可行性和可操作性。2 k g a 发酵相关产品应用于饲料抗氧 化剂的研究初步证明了e n 用做饲料添加剂的可行性，同时确定了其最佳添加量，为 e n 相关产品扩大应用领域奠定了基础。 关键词：连续发酵2 k g a 抗氧化剂e n 饲料 i i i a b s t r a c t 2 - k e t o - d g l u c o n i ca c i d ( 2 k g a ) i sak i n do fo r g a n i ca c i dm a n u f a c t u r e db yb a c t e r i a l f e r m e n t a t i o n , w h i c hm a i n l yu t i l i z e di ne r y t h o r b i ca c i d ( e a ) o rs o d i u me r y t h o r b a t e ( e n ) m a n u f a c t u r i n g s i n c et h e9 0 si nt h e2 0 t hc e n t u r y ，a sa ni n t e r m e d i a t e ，i t sd e m a n df o re a ( o re n ) s y n t h e s i z i n gi n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t ht h ei n c r e a s i n gd e m a n df o rf o o da n t i o x i d a l l t s i ni n t e m a t i o n a lm a r k e t e a ( s y n ：i s o a s c o r b i ca c i d ，d - a r a b o a s c o r b i ca c i d ) i sas t e r e o i s o m e ro fa s c o r b i ca c i d ( v c ) a n dh a ss i m i l a rt e c h n o l o g i c a la p p l i c a t i o n sa saw a t e r - s o l u b l ea n t i o x i d a m n l en 锄e w a s c h a n g e dt oe r y t h o r b i ca c i di na c c o r d a n c ew i t ht h e ”g u i d e l i n e sf o rd e s i g n a t i n gt i t l e sf o r s p e c i f i c a t i o n sm o n o g r a p h s ”a d o p t e da tt h et h i r t y - t h i r dm e e t i n go ft h ec o m m i t t e e ( a n n e x1 r e f e r e n c e8 3 ) e a ( o re n ) h a sal o w e rc o s ti nm a n u f a c t u r i n g ，w h i c hi sn o tm o r et h a n1 2o fm a to f a s c o r b i ca c i d t h e yh a v eb e e nc l a r i f i e da s g r a s ”b yf d ai n19 8 0 e x c e p tf o rt h e i r a p p l i c a t i o ni nw a t e r - s o l u b l ea n t i o x i d a n t s ，t h e ya r ep o w e r f u lr e d u c i b l eo r g a n i ca c i d s ( o r s a l t s ) a n dp o l y h y d r o x y lc o m p o u n d sw i t hs p e c i a lc y l i z a t i o ns t r u c t u r e ，w h i c hr e a s o nt ot h e i r e x t e n s i v eu t i l i z a t i o n b e c a u s e2 k g ai st h em a i nm a t e r i a li ne a ( o re n ) m a n u f a c t u r i n g ，t h es t u d ya n d a p p l i c a t i o no f2 k g ac o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o ns h o u l da f f e c te a ( o re n ) m a n n f a c t u r i n go r e l s e ，s u c ha sc u t t i n gd o w nt h ec o s t so fm a n u f a c t u r i n g ，e x p a n d i n ga p p l i c a t i o ns c o p eo f t h e s ep r o d u c t sa n ds oo n t h u s ，o u rp r o j e c t sw e r ec a r r i e do u to n2 k g ac o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o na n dt 1 1 e a p p l i c a t i o no fi t sr e l a t i v ep r o d u c t sa sa d d i t i v e si nf e e d s o m er e s u l t sa r ef o l i o w i n g ： 1p e r f o r m i n gt h a t2 k g a g r o w i n gt y p eb e l o n g st oc o u p l i n gm o d e l r e s u l t sb ym a t l a b s o f t w a r ea r ef o l l o w i n g ：i n9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a l ，p r e s e n t i n gar e g r e s s i o nr e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h ec o n s u m p t i o no fg l u c o s ea n dt h ey i e l do f2 k g a ( o r t h eo d v a l u e ) c o e f f i c i e n t o fd e t e r m i n a t i o nr 2 = 0 9 9 6 ( o r0 9 8 9 ) ，w h i c hc o n f i r mt h a tt h er e l i a b i l i t yo f2 k g a c o u p l i n g m o d e l t h e s ea r eh e l p f u lt ot h ea p p l i c a t i o no f2 k g a c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n 2s t u d y i n gt h ee f f e c t so ft h ef e d - g l u c o s eo n2 k g ac o n t i n u o u sf e m e n t a t i o na n d f i n d i n go u tt h eo p t i m u mf e d - g l u c o s ec o n c e n t r a t i o na ts a m ed i l u t i o nr a t ea n dd i 伍：r e m c o n c e n t r a t i o n s o m ed a t ad i s p l a yt h a tt h e2 k g ac o n c e n t r a t i o n p r e s e n tad e c r e a s i n g t e n d e n c yw i t ha ni n c r e a s i n gf e d g l u c o s ec o n c e n t r a t i o na tt h ee q u i l i b r i u mo fc o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n t h ee x p e r i m e n ta c h i e v e do p t i m u mc o n v e r s i o nr a t ea n d y i e l du n d e rt h e g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n9 i v 3s t u d y i n gt h ee f f e c t so ft h ef e d g l u c o s eo n2 k g ac o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o na n d f i n d i n go u tt h eo p t i m u md i l u t i o nr a t ea ts a m ec o n c e n t r a t i o na n dd i f f e r e n td i l u t i o nr a t e s o m ed a t ad i s p l a yt h a t2 k g ac o n v e r s i o nr a t es h o u l db eb e s ta td i l u t i o nr a t e0 0 6 2 5 h 1 ，b u t 、) l ，i t hal o w e ry i e l d ；t h ey i e l ds h o u l db eb e s ta td i l u t i o nr a t eo 12 5 0 h 1 ，b u t 嘶mal o w e r c o n v e r s i o nr a t e ；b o t ha r el o w e s ta td i l u t i o nr a t e0 18 7 5 h 1 4s t u d y i n gt h ee f f e c t so fc h a n g i n gd i l u t i o nr a t ef r o mo n et oa n o t h e ro n2 k g a c o m i n u o u sf e r m e n t a t i o na n di n v e s t i g a t i n gh o wt o f i n i s hi ti no n l yo n ec o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o np r o c e s s s o m ed a t as h o wt h a tc o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o ns u s t a i n e d115h o u r so r s o ，w h i c hh a v et w oe q u i l i b r i u mp o i n t sa tt w od i f f e r e n td i l u t i o nr a t e sr e s p e c t i v e l y t h e e x p e r i m e n tc o n f n t n st h ef e a s i b i l i t ya n dm a n e u v e r a b i l i t yo fc h a n g i n gd i l u t i o nr a t ef r o mo n e t oa n o t h e ri nt h ep r o c e s s 5s t u d y i n g2 k g as e m i - c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n t h e s ep r o v i d ec o m p a r i s o n 、析t h 2 k g ac o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n s o m ed a t as h o wt h a tt h ey i e l d sa n dc o n v e r s i o nr a t e s d e c r e a s ew i t ht h ei n c r e a s i n gf e d - r a t e t h er e s u l ti sh e l p f u lt ou n d e r s t a n dt h ee f f e c t so f d i f f e r e n tm e t h o d so ff e r m e n t a t i o no n2 k g af e r m e n t a t i o n ，t oo p t i m i z et h eo p e r a t i o no f 2 k g ac o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o na n dt oi n c r e a s et h eb e n e f i t so f2 k g am a n u f a c t u r i n ga t l o w e rc o s t s 6t h ep r o j e c t sc a r r i e do u tt h ec o m p a r i s o nb e t w e e nd i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nm e t h o d s t h er e s u l t sa r ef o l l o w i n g ： 6 1s o m ed a t as h o wt h a tt h ey i e l d ，t h ec o n v e r s i o nr a t ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no f2 k g a d e c r e a s ew i t ht h ei n c r e a s i n gg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n ( 9 ，12 ，15 a n dl8 ) t h e ya r e b e s ta tg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n9 ，s u c ha s7 19 7g l 1 l ，5 9 3 6 ，5 7 5 8 r e s p e c t i v e l y c o m p a r e dt ob a t c hf e r m e n t a t i o na n df e d b a t c hf e r m e n t a t i o n , t h ey i e l di sb e t t e r , b u tw i t ha l o w e rc o n v e r s i o nr a t ea n d2 k g ac o n c e n t r a t i o n 6 2s o m ed a t as h o wt h a tt h ec o n v e r s i o nr a t ea n d2 k g ac o n c e n t r a t i o nd e c r e a s ew i t h t h ei n c r e a s i n gd i l u t i o nr a t e ( o 0 6 2 5 h 一，0 1 2 5 0 h - 1 ，0 1 8 7 5 h 1 ) ，b u tt h ey i e l di sb e s ta tt h e d i l u t i o nr a t e0 1 2 5 0 h 1 t h ey i e l da n dc o n v e r s i o nr a t ea r eb e s ta td i l u t i o nr a t e0 0 6 2 5 h ， s u c ha s5 7 7 4g l h ，9 5 2 4 r e s p e c t i v e l y t h e ya r eb e t t e rt h a nt h a to fb a t c hf e r m e n t a t i o n a n df e d b a t c hf e r m e n t a t i o n 6 3s o m ed a t as h o wt h a ts e m i c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o nh a sas i m i l a rr e s u l ta l o n gw i t h c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n b u t s e m i c o n t i n u o u sf e r m e n i a t i o ni sn o tb e t t e rt h a nc o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o na tas a m ef e d r a t e 7c l a r i f y i n gt h ef e a s i b i l i t yo fe n ，2 k g c aa n d2 k g c a fs e r v e da sa n t i o x i d a n t sa n d v f i n d i n go u tt h eo p t i m u ma d d i t i o nb yt e s t i n gt h e i ra n t i o x i d a n tc a p a c i t yi np r e m i xf e e d n l e r e s u l t ss h o wt h a te ni sb e s ta tt h ea d d i t i o n10 0 m g k g ，n e x te m qa n db h t , l a s t2 k g c a f a n d2 k g c a r e s p e c t i v e l y 2 k g c a fa n d2 k g c ap r e s e n ts o m er e d u c t i o nb u tc a nn o tb eu s e d a sa n t i o x i d a n t so ff e e dd i r e c t l y t h es t u d i e so n2 k g ac o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o nh a v ep r o v e dt h e f e a s i b i l i t ya n d m a n e u v e r a b i l i t yo fi t sa p p l i c a t i o ni n2 k g am a n u f a c t u r i n g h e r e ，t h eo p t i m i z a t i o no fi t s p r o d u c t i o nc o n d i t i o n sh a sl a i daf o u n d a t i o nf o rc a r r y i n go u taw i n w i nf o rb o t hb e n e f i t s a n de n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n o nt h eo t h e rh a n d ，t h e s es t u d i e so nt h ea p p l i c a t i o no f2 k g a a n di t sr e l a t i v ep r o d u c t sa sa n t i o x i d a n t si nf e e dh a v eo f f e r e dap r e l i m i n a r yp r o o ff o ri t s f e a s i b i l i t ya n da l s oh a v eo p t i m i z e dt h ea d d i t i o n t h e s ea r eb a s i sf o rb r o a d e n i n gt h e a p p l i c a t i o nf i e l do fe nr e l a t i v ep r o d u c t s k e yw o r d s ： c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n2 k g aa n t i o x i d a n t se nf e e d v i 声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南林学院或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：邀日期：之型：乏：! 参 关于论文使用授权的说明 本人同意：诬南林学院有权保留论文的复印件，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文：提交论文四年后，允许论文被查阅和借阅，学校可以公布论 文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 日期：也! i ：堑 1 绪论 1 绪论 1 1 前言 2 酮基d 葡萄糖酸( 2 k e t o d g l u c o n i ca c i d ，2 k g a ) 是目前工业生产食品抗氧化 剂d 异抗坏血酸( e r y t h o r b i ca c i d ，e a ) 及其钠盐咖异抗坏血酸钠( s o d i u m e r y t h o r b a t e ，e n ) 的关键中间体，通常采用细菌发酵的方法由d 葡萄糖转化而来。 e a 又名赤藻糖酸或阿拉伯抗坏血酸，是l 抗坏血酸( 维生素c ，v c ) 的旋光异 构体。e a ( e n ) 不仅仅是食品添加剂，而且是一种具有强烈还原性的有机酸( 盐) 和特定环化结构的多羟基化合物，应用范围十分广泛。e a ( e n ) 的用途大致可以归 纳为：作为食品抗氧化剂和肉制品的防腐助色剂；作为药品、药品或卫生用品的辅助 材料；作为化工原料的稳定剂；作为除氧、抗蚀、除垢溶剂的重要组分；作为油田地 层酸化处理的化学添加剂；作为电解、电镀中的电解质；用于金属微粉的生产和贵重 金属的回收；用于一些高分子聚合物的制取；作为影像记录材料的生产原料。此外， e a ( e n ) 在纺织、建材、军工和日用化工等方面也有应用( 阮健余，1 9 9 1 ) 。 目前市场上所有的e a ( e n ) 产品均为人工合成产品，其相关的生产技术主要有 两种，即直接发酵法( t a k a h a s h ie ta 1 ，1 9 6 0 ) 和间接发酵法( 也称半合成法) ( 蒋明 珠等，1 9 9 0 ；孙文敬等，1 9 9 9 ) 。本文仅详细介绍与本连续发酵工艺优化相关的间接 发酵法及其相关产品的产业化应用。 1 1 1 间接发酵法 间接发酵法的基本工艺过程为：首先利用细菌转化发酵培养基中的葡萄糖为 2 k g a ，然后对发酵液进行净化、浓缩，再经酯化、转化( 内酯化) 、精制等过程得 到e n 成品( 蒋明珠等，1 9 9 0 ) 。e n 经酸化后即变为e a 产品( 孙文敬等，1 9 9 9 ) 。 间接发酵法是目前工业生产e a ( e n ) 的方法，国际上所有的e a 或e n 生产企 业包括辉瑞( p f i z e r ) 公司、p m p 公司、藤泽( f u j i s a w a ) 公司、罗盖特( r o q u e t t e ) 公司、河南郑州拓洋公司和江西德兴百勤公司均采用此法进行生产。 2 k g a 连续发酵工艺及其产物的抗氧化效果研究 1 i 22 k g a 生产菌株的相关代谢途径 微生物中碳水化合物的主要代谢途径如下图1 1 所示。 e 期妇a 觏卜m 盼e f n 啊。融m a sp a u l w m 2 2 。 呈蟹唑”2 即3 一 譬h 3 y n o h9 h o hc h o h 9 曩o - 6 _ d 一2 幽2 渊 h o 。9 h - ! 幻9 h - j o 。9 h * c 嘞z - i 。6 0 0 h - i ，3 c 0 6 l i 。- u u o h 。c 。o hh 。( hh 。e to h 。s h o 。o o h - - 4t c - - o - - 2 ；h p h峰o hh c 。o h 峥h g o h 啼如+ 5c h 2 。o h c h 2 0 hc h 2 0 pc h 2 0 p c h 2 0 p 6 h 3 6e h 3 g i u c 0 6 0 w a r b u r g - d i c k e r t $ - h o r e c k e r h i 诵p p a t h w a y g 亍p f - 1 ，6 - b pd h a p + g a - 3 - pp y n a t ee t h a n o l + c 0 2 6 - p - g 毒 0 0 2 + r 孓p 掣3- 9 h 3-29 峋 c o o p b h o3 e h 夕h 。c h o c o o h4 c o o h h c p h - c - o 5h c o h c h 2 0 p c 。h 3 6c h 3 , a , c e t y t - pa c e t a l c l e l v d ec o 矿e b 随n o l + 1 - + g a - 3 - p p y r m 憾耄昼l a c t a 协 e 嬲n t n e r - 三f 一f 二静h三争 5 h 1 2 鼍。：h 9 0 h 譬的。乍h 2 0 h 5 9 h 型o h 6 c h 2 0 p c h 2 0 p 6 h 3一c 鸭 66 h ： 双3 d 6 陷p y 掣啪2 擘 图1 1 利用同位素标记的微生物中碳水化合物代谢的主要途径( a l b e r te t a l ，2 0 0 2 ) f i g 1 1i s o t o p e 1 a b e l i n gp a t t e r n si nc e n t r a lp a t h w a y so fc a r b o h y d r a t em e t a b o l i s mi nm l 。c r o o r g a m s m s c i n d i c a t e s1 4 c 1 a b e l e dc a r b o na t o m s ( a l b e r te ta 1 ，2 0 0 2 ) e n t n e r - d o u d o r o f f 途径( e dp a t h w a y ) ( e n t n e ra n dd o u d o r o f f , 1 9 5 2 ) 似乎是假单 胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 葡萄糖代谢的主要途径( s t e me ta 1 ，1 9 6 0 ；k e r s t e r sa n dd el e y ， 1 9 6 8 ) 。葡萄糖进入e d 途径有3 条可能的途径：第1 条途径包括葡萄糖的吸收及其 磷酸化、氧化过程，形成6 磷酸葡萄糖酸( 6 - p g ) ；第2 条途径包括葡萄糖的直接氧 化形成胞外葡萄糖酸的过程，随后的是葡萄糖酸的吸收和磷酸化产生6 - p g 的过程； 在第3 条途径中，葡萄糖氧化形成的葡萄糖酸被进一步氧化，在胞外形成2 k g a ，然 后胞外的2 k g a 被吸收、磷酸化和还原，产生6 - p g 。 2 1 绪论 荧光假单胞菌中葡萄糖的代谢途径如下图1 2 所示。 g l u c o s 譬kg l u c o n a t e 一 h l 幸 o l u c o s 毫一一 。璺l pk e t o g l u c o n a t e i 1 咖m 鸵o 夕僦聃 p 一 e f r u c t o s i - i o q - 幽- , 0 4 图1 2 荧光假单胞菌中葡萄糖的代谢途径( w o o d ，1 9 5 5 ) f i g 1 2p a t h w a y so fg l u c o s eo x i d a t i o ni np s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ( w o o d ，19 5 5 ) 某些假单胞菌属的细菌具有氧化葡萄糖为2 k g a 的能力。在适宜的培养条件下， 这些菌株缺乏进一步代谢2 k g a 的某些酶，使氧化葡萄糖并积累2 k g a 在葡萄糖代 谢中占有主导地位( l y n c he ta 1 ，1 9 7 5 a , b ) 。2 k g a 的生物合成途径( w h i t i n ge ta 1 ， 1 9 7 6 a ，b ；l y n c ha n df r a n k l i n ，1 9 7 8 ) 如图1 2 所示的非氧化磷酸化途径：在细胞外由 葡萄糖到葡萄糖酸，再到2 k g a 。 1 1 32 k g a 生产菌株 1 9 4 0 年，s t u b b s 等从5 酮基d 葡萄糖酸发酵液中分离出一株食爬虫假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sr e p t i l i v o r a ) ，它是2 k g a 高产菌株，对葡萄糖的转化率达8 2 左右。 1 9 4 1 年，l o c k w o o d 报道了其它具有2 k g a 高产能力的假单胞菌属的1 6 个菌株，分 别属于假单胞菌属的1 0 个种，其对葡萄糖的转化率可以达到8 0 以上。 此后，各国学者先后报道了许多具有2 k g a 生产能力的菌株( 孙文敬等，1 9 9 1 ) ， 它们分别属于假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、欧文氏菌属( e r w i n i a ) 、沙雷氏菌属 ( s e r r a r i a ) 、葡糖杆菌属( g l u c o n o b a c t e r ) 和醋杆菌属( a c e t o b a c t e r ) 。国外优良的 2 k g a 生产菌株主要为荧光假单胞菌( 风f l u o r e s c e n s ) 、粘质沙雷氏菌( sm a r c e s c e n s ) 1 p 咔 m；堇i 小黼 卜黼i e c憾 兀 肿_ 鸭磊 夸 二糕弼 2 k g a 连续发酵工艺及其产物的抗氧化效果研究 和鸡血藤欧文氏菌( em i l l e r i a ) 等。国内优良的2 k g a 产生菌主要有球状节杆菌 ( a r t h r o b a c t e rg t f f o r m i s ) k 1 0 2 2 、恶臭假单胞菌( 风p u t i d a ) e 3 0 1 、产酮产碱菌 ( a l c a l i g e n e sk e t o g e n e s ) e 5 4 和荧光假单胞菌( 风f l u o r e s c e n s ) k 1 0 0 5 等。这些菌 株都是未经诱变处理的野生型菌株，产酸稳定。2 0 世纪9 0 年代，国内工业化生产上 使用的菌株为经过毒理试验的荧光假单胞菌k 1 0 0 5 和球状节杆菌k 1 0 2 2 。2 0 世纪9 0 年代后期以来，为适应生产发展的要求，以荧光假单胞菌k 1 0 0 5 和球状节杆菌k 1 0 2 2 为出发菌株，国内学者又选育了一些抗噬菌体菌株( 沈淑瑜等，1 9 9 6 ；孙文敬等，2 0 0 1 ； 孙文敬等，2 0 0 2 ) 。 1 1 42 k g a 生产工艺的发展 2 0 世纪4 0 年代初，l o c k w o o d ( 1 9 4 2 ) 申请了关于在实验室规模上2 k g a 发酵生产 的专利。 2 0 世纪5 0 年代末，p f e i f e re ta 1 ( 1 9 5 8 ) 详细介绍了2 k g a 应用前景及其发酵生产工 艺。 此后，许多学者对2 k g a 的相关生产工艺进行了大量的改进( r o b e r t ，1 9 5 9 ； t h o m a se ta 1 ，1 9 6 6 ；g e r a l de ta 1 ，1 9 6 8 ；蒋明珠等，1 9 9 0 ；孙文敬等，1 9 9 9 ) ，为2 k g a 的 工业化生产奠定了基础。 目前，国内外2 k g a 工业生产多采用补料分批发酵工艺( 孙文敬等，2 0 0 4 ) 。为了 降低生产成本，提高生产效率，实现环保和企业发展的双赢，进行2 k g a 连续发酵工 艺的研究和应用开发迫在眉睫。 1 1 5 连续发酵的地位和意义 任何一项生物技术的研究成果从实验室走向产业化，都需要上、中、下游技术的 密切配合。发酵工程作为生物技术的支撑学科之一，是基因工程、酶工程和细胞工程 的具体应用和产业化必经之路。作为中游技术关键的发酵过程优化技术，不仅关系到 能否发挥菌种的最大生产性能，而且会影响下游处理的难易程度，因而在整个生物产 品的研发过程中具有相当重要的作用。 在工业实践中，成功地实现高产量( 便于下游处理) 、高底物转化率( 降低原料 成本) 和高生产强度( 缩短发酵周期) 的相对统一，是发酵过程优化的目的。国内外 4 1 绪论 普遍存在的问题是：传统的发酵工程技术由于历史上作坊式生产的影响而具有经验主 义的特点，缺乏对发酵过程的微生物生理学本质认识；以分子生物学为主要研究手段 的现代生物技术，虽然深入揭示了微生物的遗传机制和生理行为，但难以顾及微生物 生命活动过程所涉及的工程因素( 包括物理、化学和生物因素) 。 人们对发酵技术的认识起始于1 9 世纪末，发展于2 0 世纪4 0 年代。第二次世界大战 中，人们发明了大型的搅拌型发酵培养法，成功地进行了大规模的青霉素生产，才推 动了整个发酵工业的深入发展。发酵技术上也出现了通气搅拌深层培养技术和代谢控 制发酵技术。2 0 世纪7 0 年代，人们开始研究固定化菌体技术，为固定化酶法的发展奠 定了基础。比较而言，连续发酵技术起始于2 0 世纪4 0 年代，是一种比上述发酵技术更 高级的发酵技术，它不仅可以避免反馈调节或者产物消耗，还能缓解底物抑制，节约 营养，提高产率和降低成本。但由于各方面的原因，连续发酵的应用范围不如分批发 酵和补料分批发酵广泛。 另外，在发酵生产使用的设备方面，目前绝大部分生产厂仍然采用的是“第一代 生物反应器”，根据混合方式可以分为机械搅拌式、循环泵式和空气鼓泡式( 气升式) 三大类发酵设备。但这些设备的应用有其局限性，诸如能耗大，结构复杂，易污染， 容积不易放大，搅拌产生的过强剪切力影响培养物固有生理特性的表现，在深度较大 的培养液中气液接触不良等。虽然后来开发了气升式、自吸式、喷射式、筛板塔式等 一些新型发酵罐，但其实际应用范围并不十分广泛。 当今，发酵设备开发的目