临床用PCR检测常见的问题及科华PCR试剂特点.ppt

临床用PCR检测常见的问题及科华PCR试剂特点,曹玉峰上海科华生物工程股份有限公司,目前PCR的应用,核酸是最基本的生命物质，其贮存着生物体的全部遗传信息，直接或间接的参与所有生命过程。理论上任何疾病都能在核酸水平找到证据。随着对核酸功能认识的逐渐深入，核酸检测在医疗诊治过程中起着越来越重要的作用。核酸检测在临床上主要应用于：能用于遗传性疾病、肿瘤以及感染性疾病的筛查以及疗效监测等方面由于对基因功能认识的限制，国内主要进行病原体载量检测，用于疗效监测,核酸检测的特点,核酸检测相对于传统的生化、免疫检测有着不同的检测方法及生理意义。早期筛查：应用PCR进行早期筛查主要是因为PCR的高灵敏和短的窗口期。疗效监测：反映抗病毒治疗效果的最好指标。核酸是病毒存在的直接证据，用核酸定量作为监测指标更灵敏。而传统的血清标志物有滞后效应，效果不如核酸理想。与酶免检测互补：方法学互补，可以避免亚型或免疫沉寂引起的漏检临床作用互补,临床PCR检测的常见问题,假阳性问题方法学问题污染问题：样本污染、产物污染假阴性问题试剂因素、操作因素、仪器因素、标本因素定量问题外标定量与内标定量,假阳性问题及解决办法,方法学：PCR是特异性非常高的检测方法PCR引物决定了特异性靶基因序列的特异性、引物错配、非特异性扩增实时荧光（Real-time）：引物探针同时控制，几乎没有方法学假阳性问题污染：样本污染：应属于操作失误，所有技术都存在，但由于PCR高敏度轻微污染也能被检出。产物污染：最严重的问题PCR产物是极高浓度的，所以很可能产生污染解决办法：使用实时荧光技术严格分区及实验人员培训使用UNG技术,UNG/dUTP消除产物污染,原理：UNG酶是一种限制性水解酶，会将dUTP降解。在PCR体系中以dUTP代替dTTP，这样合成的产物就含有U，而模板只含T不含U，如果出现产物污染，UNG酶会降解掉产物，而对模板无影响。步骤：UNG酶反应，50UNG酶灭活，94开始扩增循环,UNG/dUTP消除产物污染,UNG/dUTP消除产物污染,UNG/dUTP消除产物污染,UNG/dUTP消除产物污染,假阴性问题及解决办法,试剂因素阳性对照可以监测和发现操作因素提高操作人员素质降低操作难度（柱提取、磁珠提取等）阳性对照监控仪器因素离心、温度控制精确度仪器故障、由阳性对照（或标准曲线）监控孔间因素，使用内对照监控标本因素使用抗干扰能力强的试剂（煮沸二步法、柱提取等）使用内对照,定量相关的问题,外标定量的前提：假设所有扩增的扩增效率一致所以能影响扩增效率的因素都能影响定量结果核酸定量没有决定性方法只有同类著名试剂（罗氏）作为参照标准PCR定量重复性不好，10倍以为大体都正确，不能同生化类比PCR标准品没有准确的定量值国家标准也是8倍左右的范围值,外标定量与内标定量,内标定量将标准品加入样本中一齐处理、检测优点：标准品和样本的反应完全一致，误差最小定量最准确缺点：只能一点定标，线性范围有限，定量是指数级范围，不适用标准与样本的信号区分要不同的检测信号，难度大，成本高外标定量标准同批，分管处理检测优点：能做标准曲线定量，线性范围宽成本低，易实现缺点：反应情况的同步性不如内标定量,科华PCR试剂盒特点及新进展,试剂盒三大特点：,提供负压纯化柱提取及磁珠提取方法使用双色荧光设计内标，避免假阴性标准品参与提取,PCR检测核酸提取是关键,自动化程度已经很高，操作难度已经降低,成为操作难点，是保证实验结果的关键。,核酸提取循环扩增结果检测与分析,PCR的新进展,酶的稳定性增强经过免疫或化学修饰后酶的稳定性有大幅度增强但配置后长期存放仍然不利提取方法的进步煮沸、柱提取、磁珠提取自动化半自动、全自动,常见的核酸提取方法,煮沸法提取核酸,第一步：加沉淀剂，离心弃上清去除小分子聚合酶抑制物浓缩病毒颗粒，提高灵敏度第二步：加裂解液，煮沸裂解病毒颗粒，游离核酸变性残留蛋白质第三步：取上清扩增去除大分子聚合酶抑制物,负压纯化柱抽提原理,原理：采用硅胶膜特异性吸附核酸，而对其他生化组分如蛋白质、多糖、脂类既不相亲也不吸附，因而可得到纯化的核酸,负压纯化柱抽提操作,裂解移入柱洗涤两次洗脱,负压纯化柱抽提的优点,操作难度低，易于掌握纯度高适应性强：能用于各种DNA、RNA病毒提取物可用于其他分子生物学检测对离心要求低对实验环境无污染,磁珠法提取原理,原理：标本中的病毒经裂解、消化后，释放出病毒核酸，核酸与磁珠结合(特异性的和非特异性的)利用磁珠分离仪器将病毒核酸提取纯化，作为PCR反应的模板。分类：亲和法：提取全核酸，特异性差杂交法：利用特异性探针捕获，提取目标核酸步骤：裂解、吸附、洗涤、洗脱,科华磁珠提取试剂,自动化模式：采用国内国外的相关的全自动或半自动核酸提取仪，实现了自动化抽提核酸高通量，时间短：一次可处理96份标本，仅需80分钟同步提取：RNA病毒、DNA病毒核酸同步提取；基于探针杂交原理,特异性捕获病毒的核酸；为目前FDA批准的血液核酸筛查试剂-Roche的“AmpliScreen”及Gen-probe的“TMA”均所采用的标本处理方法，代表当前最先进、最灵敏的标本提取方法灵敏度高：HBV,HIV均为25copies/ml,HCV为50IU/ml特异性强：基于杂交原理,特异性捕获病毒的核酸，抗干扰性能强重复性好：连续八次（不同日内）检测不同浓度的标本，结果CV不大于5%通用性强，适于各种磁珠提取核酸仪器。,灵敏度,灵敏度：HBV,HIV均为25copies/ml,HCV为50IU/ml梯度稀释的样本102能100%检出101能检出60%以上通过离心浓缩可以确保1020份样本POOL保持同等的检出率,重复性（批内）,孔间CV：试剂检测灵敏度以上、线性范围内的标本的孔间CV不大于5%,重复性（批间）,连续八次（不同日内）检测不同浓度的标本，结果CV不大于5%,抗污染性实验,按矩阵以1108copies/ml的血清包围中间一份阴性血清，以及阴性血清包围1份1108copies/ml的血清；重复三次，未见污染发生。,操作步骤,试剂准备取6块反应板，分别用排枪或滴瓶加入去抑制剂、磁珠、洗涤液A、洗涤液B、洗涤液C以及洗脱液量产后，可以将试剂封入板中不在需要准备在第一块板中加入待检血样跟据提取仪的不同，上机提取用排枪将洗脱液加入相应的扩增反应板中进行扩增检测,配套磁珠仪器,试剂通用性强绝大部分磁珠核酸提取仪器均能使用（有加热模块即可）自产配套磁珠提取仪器具有高效的加热模块、稳定的温控系统非板式混均系统程序预设控制预防污染设计体积小能放入生物安全柜操作很高的性价比,内标设计原理,内标为一已知低含量的与模板扩增效率相似的一段DNA片段，将它加入PCR反应液中，与模板共同扩增，以反应每管真实的扩增情况，如果内标和样品都未扩增出结果，则表示该管扩增无效，应重新做。,内标,内标：避免假阴性,内标的种类：同源、异源、竞争、非竞争使用竞争性内标真实反应扩增情况建立每管质控体系避免假阴性科华试剂不使用内标定量由于线性范围原因，仍用外标定量,标准品参与提取,标准品与标本同样处理结果更准确重复性更好定量更准确不需要额外的阳性对照实质上四个阳性对照降低了成本,FluocyclePCR实时荧光PCR仪,产品特点,全中文临床中文软件：界面友好，易于操作。采用空气加热系统，温度升降速度快：升温速度大于6S，降温速度大于5S。采用玻璃毛细管作反应管，表面积/容积比较高，确保管内温度与热室的迅速平衡标本用量少,每个样本量仅需20ul。寿命超高亮度的LED光源。PMT检测。完善的数据输出方式：列表形式以及报告形