（微生物学专业论文）优势菌处理含高浓度苯胺废水机理的研究.pdf

南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 中文摘受 摘要 苯胺是一种广泛应用于杀虫剂、染料、塑料和制药等化工工业生产的原料，它的大量 生产和广泛应用，对环境造成了污染。生物降解是消除环境中苯胺类污染物的重要方式之 本实验室从油田、炼油厂，排污河等多处受苯胺污染的区域采集水样、土样，通过富 集培养，分离初筛，纯化培养，复配试验和驯化培养等过程，获得了能降解高浓度苯胺的 复合菌n k s 。n k s 由两种单菌- - n k s l 和n k s 2 一组成，其中n k s l 经中科院微生物所鉴定 为假单胞菌。本文以复合菌n k s 为实验材料，研究了n k s 的一些生理生化特性，通过对苯 胺降解途径中关键酶活性的测定，确定了n k s 降解苯胺的途径，最后对n k s 中与苯胺降解 有关酶的基因进行了初步定位。 n k s 生理生化特性测定的结果表明： 随着接种量的增加，n k s 对苯胺的降解效率也提高；在降解过程中，苯胺浓度随游离 菌浓的增高而降低；n k s 能耐受苯胺的浓度最高为5 0 0 0m g l ，在苯胺浓度低于2 0 0 0m g l 时，n k s 能完全降解所试溶液中的苯胺，在苯胺浓度为3 0 0 0m g l 时，n k s 生长水平最高； n k s 生长和降解苯胺的最适温度为3 0 ，最适p h 值为7 ：5 种重金属离子对n k s 的生长及 降解苯胺均有不同的抑制作用，其中以a g + ，h 9 2 + 最为明显，它们能够完全抑制n k s 的生 长；n k s 除了可以利用苯胺作为其唯一的碳源、氮源和能源生长以外，还可以利用邻苯二 酚和邻甲苯胺，但不能利用对氯苯胺，间氯苯胺和对甲苯胺等取代类苯胺；对n k s 菌中的 苯胺代谢途径中的关键酶活性( 邻苯二酚双加氧酶) 测定结果表明：n k s 主要含有 邻苯二酚一2 ，3 一双加氧酶( c d 2 3 0 ) 活性，这表明n k s 降解苯胺主要是通过间位裂解 ( m e t a c l e a v a g e ) 途径，其酶的比活力高达2 9 0 ，说明n k s 降解苯胺的能力强；在不含苯 胺的其他基质中生长的n k s 的无细胞提取液中不含有邻苯二酚氧化酶的活性，说明n k s 中 的邻苯二酚一2 ，3 一双加氧酶是一种诱导酶；p c r 结果表明，n k s 中与苯胺降解有关酶的 基因位于细菌的染色体上。 关键词：复合菌n k s 邻苯二酚一2 ，3 一双加氧酶( c d 2 3 0 )质粒d n a染色体d n a p c r 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 英文摘磷 a b s t r a c t a n i l i n ei so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ti n d u s t r i a l l yp r o d u c e da m i n e s i ti sm o s t w i d e l yu s e df o rt h em a n u f a c t u r eo fp o l y u r e t h a n e s ，r u b b e ra n dp e s t i c i d e s ( i t a n a h a n ， 1 9 8 9 ) t h e yh a v eb e e nr e p o r t e dt oe x h i b i ts i g n i f i c a n tm a m m a l j a nt o x i c i t ya n da c u t e t o x i ce f f e c t so f f i s h ：t h u s ，t h e y a r ec o n s i d e r e d i m p o r t a n t e n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s a l t h o u g ha n i l i n e s a r ed e c o m p o s e db yav a r i e t yo fp h y s i c o c h e m i c a l p r o c e s s e ss u c ha se v a p o r a t i o n ，a u t o o x i d a t i o n ，p h o t o o x i d a t i o na n dc h e m i c a lb i n d i n g t h e m a j o rp a t h w a y f o rt h e i rr e m o v a if r o m a q u a t i c e n v i r o n m e n t si s t h r o u g h b i o d e g r a d a t i o n w ea t t a i n e dah i g h p e r f o r m a n c ea n i l i n e d e g r a d i n gb a c t e r i a lc o n s o r t i u mn k s i t c o n t a i n st w o a n i i i n e d e g r a d i n g b a c t e r i a l s p e c i e s ， n a m e dn k s la n dn k s 2 r e s p e c t i v e l y h e r e i n w e r e p o r t e d s o m e p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c so fn k 8 b yt e s t i n st h ek e ye n z y m ea c t i v i t yi nt h ep r o c e s so ft h e a n i l i n ed e g r a d a t i o n ，w eu n d e r s t a n dt h ep a t h w a yf o rn k st od e g r a d ea n i l i n e f i n a l l y w el o c a l i z e dt h eg e n e st h a ta r ei n v o l v e di nt h i sp r o c e s s t h er e s u l t so ft h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i t so fn k ss h o w e d t h a t ：ah i g h e ri n o c u l a t i o nr e s u l t e dab e t t e rd e g r a d a t i o ne f f e c t ，e s p e c i a l l yi n t h ef i r s th o u r so ft h ed e g r a d a t i o n a c c o r d i n gt ot h eg r o w t hc u r v eo fn k s ，a st h e r e d u c t i o no fa n il i n e ，t h ec o n c e n t r a t i o no ft h ed i s s o c i a t i v eb a c t e r i u mb e c a m ei o w e r t h eb a c t e r i a lc o n s o r t i u mw a sc a p a b l eo fg r o w i n go na n i l i n em e d i u mh i g h e rt h a n5 0 0 0 m g l i to n l yt o o k3 6h o u r st od e g r a d ea l lo ft h ea n i l i n ea b o u t2 0 0 0m g l t h e o p t i u mc o n e e n t r a t i o no fa n i l i n ew a s3 0 0 0m g l t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ef o rn k s g r o w t ha n da n i l i n ed e g r a d a t i o nw a s3 0 a n dt h eo p t i m u mp hf o rn k st og r o wa n d d e g r a d ea n i l i n ew a s7 f i v eh e a v ym e t a li o n sc o u l di n h i b i tt h eg r o w t ho fn k s a n d t h ed e g r a d a t i o na n da n i l i n e ，e s p e c i a l l ya g + a n dh g + n k sc o u l da l s ou s ec a t e c h o l 2 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 英文摘要 a n do t o l u i d i n ea sc a r b o n ，n i t r o g e na n de n e r g ys o u r c e s ，b u tc o u l dn o tu s eo t h e r s u b s t r a t ea n i l i n ec o m p o u n d s t h et e s to ft h ea c t i v i t yo ft h ek e y e n z y m ei nt h e d e g r a d a t i o no fa n i l i n es h o w e dt h a tt h e r ei sah i g h c a t e c h o l 一2 ，3 - d i o x y g e n a s e a c t i v i t yi nn k s ，w h i c ha l s od e m o n s t r a t e dt h a tn k sm a i n l yd e g r a d ec a t e c h o lv i a m e t a d e g r a d a t i o np a t h w a y t h e r ei sn op l a s m i di nn k sa n dp e rr e s u l t ss h o w e dt h a t t h eg e n e s d e g r a d ea n i i i n ei sl o c a t e do nc h r o m o s o m e k e y w o r d s ：a n i l i n eb a c t e r i a l c o n s o r t i u mn k s c a t e c h 0 1 c a t e c h o l 一2 ，3 - d i o x y g e n a s e ( c d 2 3 0 ) p l a s m i dd n a c h r o m o s o m ed n a p c r 3 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前育 第一部分前言 l 苯胺对环境的影响 苯胺是常用作染料、橡胶，制药、塑料和油漆生产的原料。“1 1 环境中的硝基芳香化 合物和苯胺类药物经微生物转化也可形成苯胺。”1 “4 1 抽1 此外，在印染废水的生物脱色处 理中也可能有苯胺的形成。“1 随着化工工业的发展，对苯胺类化学品的需求呈明显的上升 趋势，由此进入环境中的排放量也越来越多。目前，国内每年生产苯胺达8 0 0 0 0 0 吨以上， 其下游产品有1 5 0 余种。全世界每年排入环境中的苯胺类化合物约为3 0 0 0 0 吨。口3 苯胺是严重污染环境和危害人体健康的有害物质，具有致癌性。例如，它可以导致人 的膀胱癌等。苯胺对于哺乳类动物和鱼类也有毒害作用。阳盯“们由于苯胺及其衍生物对 生态生物的毒性，所以它已被列为环境优先控制污染物，在工业排水中要求严格控制。 处理环境污染物的常规方法主要有物理方法、化学方法和生物方法等。其中，物理方 法和化学方法由于投资大、占地面积广、又需要特殊设备而逐渐不受欢迎。利用生物方 法，主要是微生物的代谢活性处理环境中有机污染物的方法由于投资少、占地少、也不需 要特殊设备而倍受青睐。迄今为止，人们采用微生物来处理环境中的有机污染物已经取得 了一定的成功，同时，这一方面研究的不断深入也将为彻底治理环境污染指明出路。 2 国内外的研究概况 2 1 微生物处理有毒工业废水工艺的发展 国际上利用微生物来处理有毒工业废水的技术大都已经比较完善，尤其是日本、美国 和德国的技术尤为先进。目前世界上已经有许多商业性的生物制荆产品，他们主要是将一 些具有降解能力的微生物制成生物制剂，如做成粉末、片状、液体等形式投加到污水中来 处理污水。例如日本的e m 技术( e f f e c t i v em i c r o o r g a n i s m s 有效微生物菌群) 在环保上 就有着较广泛的应用。e m 技术是由日本琉球大学的比嘉照夫教授于2 0 世纪8 0 年代研制的。 它是以光合细菌、乳酸菌、酵母菌和放线细菌为主的1 0 个属8 0 余种微生物组成的复合菌 剂 1 1 o 而所谓的e m 技术，就是在“抗酸性物质”存在的情况下，将“厌氧性微生物”和 “需氧性微生物”共存培养后，再加以利用的技术。其精髓是将许多能共生、共容的微生 物混在一起，利用其生长过程中能迅速分解污水中的有机物，同时依靠相互问的共生繁 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 殖，抑制含硫、氮等恶臭物质产生的臭味，激活水中具有净化功能的原生动物，微生物及 水生植物，通过这些生物的综合效应从而达到净化水体的作用。其实，e m 技术等同于目前 刚刚兴起的“复合发酵”技术，这是值得我们借鉴的。然而由于这些国家的生产工艺及废 水的水质不同于我国，因此单纯依靠进口国外的先进处理技术设备是行不通的，必须根据 我国的实际情况在吸收和借鉴国外先进技术的基础上开发适合我国国情的微生物处理工 艺。例如，在处理含苯胺的工业废水方面，虽然国外已经有了成熟的处理工艺，但由于国 外的化工生产工艺先进，废水的排出量少、浓度低，苯胺浓度低于2 0 0 p p m ，而我国的一些 企业，排放的废水中苯胺浓度高于1 0 0 0p p m 。因此，国外的技术不适合我国的废水处理。 况且，一些小型企业根本无力支付国外技术的引进费用。“胡 六五以来，我国工业废水的微生物处理技术方面无论是在广度上还是在深度上都有了 很大的发展。我国从“六五”期间着手专用菌的分离选育，国内的科技工作者已经筛选出 了各类有毒化合物的降解菌株，并建起了个降解菌种库。如中科院土肥所程桂茹等分离 出的野油菜黄单胞菌及荧光假单胞菌均可以有效的降解水及土壤中的邻苯二甲酸二甲脂。 中科院微生物所分离选育出的脱色菌和p v a ( 聚乙烯醇) 降解菌则成功的解决了纺织印染 废水中难降解的污染物的治理问题。到“七五”末期已初步建成环境净化菌种库，选育出 的6 2 种高效菌种均是采用底物选择富集培养方法获得的。其中包括：染料脱色菌1 9 株， 表面活性荆降解菌6 株，p v a 降解菌2 株，睛降解菌6 株，五氯酚降解菌株3 株，多氯联 苯降解菌8 株，芳烃降解菌1 3 株，四环素降解菌l 株，重金属富集菌3 株，甲烷菌1 株。 罗国维等人从1 9 8 4 年开始研究红螺菌的分离培养技术，并于1 9 8 7 年将其成功的用于味精 废水的处理。此外，“七五”期间还对上述菌种分类地位和生理生化特性以及菌株降解或 转化污染物的机理进行了研究。但是，从目前国内的应用来看，还有许多需要完善的地方。 随着国家环保法力度的加强，人们在不断的追求那些降解效率更高，运行更加稳定，更经 济，操作更简便，投资更省的处理方法。因此，筛选降解效率更高，性能更稳定的优势菌 种就成为工业废水处理领域中一项较为迫切的工作。 利用优势复合菌来处理废水较单菌不但效率要高得多，而且要稳定得多，这是因为如 果只有一种降解菌，那么，微生物对有机物的降解途径只能是单线的，环境因素稍微改变， 就有可能将这条路线切断，从而使得降解效果消失。所以，我们在筛选出单一的高效降解 菌以后，尽可能使在降解条件上较一致，能够共生、共容的多种微生物组合在一起，形成 一个较为复杂的降解体系，使得降解路线呈网状结构。这样即使其中的几条路线被限制( 如 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前专 质粒丢失，菌浓被限制) ，依据其中另外的路线依旧能够高效降解有毒有机物。在将不同 的共生菌复配后，再将复合菌当成一个整体来研究最佳处理条件。 目前，工业应用主要是利用复合的优势菌群。在试验过程中，确定最佳的降解条件也 是把菌群当成一个整体来考虑。但分离纯化单茵，并对其性能作一定研究，对于充实我国 的降解菌种库，避免一些基础工作的重复性具有十分重要的意义。其次，只有对单菌性能 有一定的了解，才能确定如何进行互配，使互配不会太盲目。再次，只有对单菌的性能有 个较全面的了解，才能确定工程应用的安全性。例如，是否会对人畜的健康有影响，是 否会产生些对环境有污染的代谢物。另外，对单菌的一些遗传，生理性能了解后可为以 后构建工程菌创造条件。 从研究的角度来看，要研究一个菌群比研究一个单一的菌种复杂得多，因为复合菌群 中各细菌之间的相互作用是及其复杂的。但事实上从目前国内外的应用情况来看，大多数 研究者都避开这一问题，而把复合菌群当成一个菌来考虑，以此来确定处理条件。活性生 物体系都具有自我平衡，自我调节的能力，它对外界环境的变化具有较强的抵抗力。国内 外众多实践证明，在污水处理方面，复合菌群的处理效果无论是从处理时间还是稳定性上 来说都优于单一菌。总的来说，在进行菌种互配实验时，不必对复合菌群中的每一种单菌 进行细致的研究，只需考虑其中最关键的几种细菌的性能，再从整体观念上去研究菌群的 性能，就能取得较好的实验效果。 细菌的细胞固定在载体上，可以增加单位体积内的生物量，并且保证菌体不随废水流 失，从而在更小的空间内，更短的时间内达到好的处理效果。目前应用较广泛，技术比较 成熟的方法，是依靠细菌的粘附性将其固定在填料上面，形成生物膜来处理污水。 2 2 降解苯胺的微生物 国内外众多研究者通过富集培养等技术已经发现了许多能够降解苯胺的微生物( 见表 1 ) 。 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 表1 苯胺降解微生物 t a b l e1 a n i l i n e - d e g r a d i n g b a c t e r i u m 2 3 微生物降解苯胺的途径 苯胺的微生物降解可以在不同的条件下发生，不同的微生物降解苯胺的途径也各不相 同，使苯胺的微生物降解特征和代谢途径呈现多样性。 1 9 9 1 年，s c h n e l ls 等报道，“叫在厌氧条件下苯胺脱硫杆菌( d e s u l f o b a c t e r i u m a n i l i n i ) 首先使苯胺羧基化形成对氨基苯甲酸，然后进行还原脱氨作用。在好氧条件下 的情形与此不同，b a c h o f e r n 7 1 等证明了诺卡氏菌( n o c a r d i a ) 首先通过双加氧酶的催化 使苯胺形成邻苯二酚，进而通过邻苯二酚一l ，2 一双加氧酶n ”或邻苯二酚一2 ，3 一双加 氧酶“们的作用开环，形成可作为微生物碳，氮和能源的化合物。最近，h y u n g y e e lk a h n g 等又发现了一种新的苯胺降解菌h y9 9 ，这种细菌在有氧和无氧的条件下都能降解苯胺。 在有氧条件下，h y9 9 通过邻苯二酚( c a t c h 0 1 ) 和2 一羟基己二烯半醛酸( h m s ) 等 中间代谢产物降解苯胺，在无氧条件下，h y9 9 则通过对一氨基苯甲酸途径降解苯胺。 7 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 现在，人们对于苯胺降解菌途径已经有了比较清楚的认识。在氧气存在的条件下，微 生物先将苯胺氧化成邻苯二酚，3 “3 ”3 邻苯二酚进一步被邻苯二酚双加氧酶氧化， 最终导致其被酰化、汹3 ”1 州“1 。1 聚合6 0 1 和含氮产物。1 6 2 1 而在诸如自我氧化、 m 1 阳1 光氧化”1 ”m 7 3 和化学结合”1 等物化过程中，苯胺被降解的过程要更加复杂一些。 根据邻苯二酚开环机制的不同，苯胺的微生物代谢可以分为两条途径，即邻位( o r t h o ) 代 谢途径和间位( m e t a ) 代谢途径，2 6 1 1 ”1 这两条途径分别由邻苯二酚一1 ，2 一双加氧 酶和邻苯二酚一2 ，3 一双加氧酶催化。两条途径的前两步反应是相同的，都是由苯胺双加 氧酶将苯胺氧化成邻苯二酚。当苯胺通过邻位代谢途径时，在邻苯二酚一1 ，2 一双加氧酶 两个羟基之间切割邻苯二酚，再经过多步反应产生三羧酸循环的中间代谢物琥珀酸和乙酰 辅酶a 。当苯胺通过间位代谢途径时，邻苯二酚一2 ，3 一双加氧酶在其中的一个羟基的旁 侧切割儿茶酚，最后产生丙酮酸和乙醛，然后再进入三羧酸循环，最后生成h ：0 和c o , 。 在脱硫菌中，发现在无氧的条件下，苯胺被羧化形成4 一氨基苯，然后进行还原脱氨作用m 1 。 苯胺降解途径： 4567 顺，顺一粘康酸_ - 牯康酸内醋b 一酮己二烯醇内醋b 一酮己二麟乙酰辅酶a + 琥珀酸 12 苯胺邻苯二 3 2 一羟基己二烯半4 一烯戊嘲，4 一羟基一2 一酮戊酸e - 醛+ 丙酮酸 1 苯胺双加氧酶2 邻苯二酚i ，2 一双加氧酶3 邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶4 粘康酸环化异构酶5 粘康酸内酯异 构酶6b 一酮己二烯醇内酯水解酶7c o a s h ，b 一氧化82 一羟基己二烯半醛酸脱氢酶92 一羟基己二烯半醛酸 水合酶1 04 一草酰巴豆酸脱狻酶1 1 水台酶1 24 一羟基- - 2 酮戊酸醛羧酶 南开人学硕l 上研究生毕业( 学位) 论义 前 在分子的水平上，人们对于苯胺降解酶基因的研究也已经比较深入。1 9 8 3 年，日本的 k e n j ih o k i 等人在a g r i c b i 0 1 c h e m 杂志上报道，在兄e r y t h r o p o l i sa n 一1 3 菌中，每 摩尔邻苯二酚一l ，2 一双加氧酶蛋白中含有3 摩尔的巯基。1 9 8 4 年，他们又发现了在 另一株名为f r a t e u r i aa n a 一1 8 的细菌中含有两种邻苯二酚一1 ，2 一双加氧酶( c d i 与c d i i ) ，这两种酶为同功异构酶。虽然它们都能够将邻苯二酚氧化形成顺，顺一粘康酸， 但这两种酶在结构与性质上有很大的差异。例如：每摩尔c d i 中含有2 摩尔的巯基，但c d i i 中不含有巯基。c d i 比c d i i 的耐酸性和耐热性都要好。c d i 的酶活性受重金属离子a g + ， h g2 + 等的抑制，而c d i i 却没有这种性质。据他们推测，编码这两种酶的基因可能分别位于 f r a t e u r i aa n a 一1 8 细菌的染色体与大质粒上。” f u m i y a n s uf u k u m o r i 等报道，在假单胞菌只p u t i d ak t 2 4 4 2 中，编码苯胺降解的基 因位于细菌的质粒上。1 ”3 “1 1 这一系列降解苯胺的酶的d n a 片段编码六个开放阅 读框架，这些开放阅读框架以相同的方向排列着。h 7 3 “们m 1 其中的四个开放阅读框架与 以前所报道的在其他的芳香环降解途径中的酶蛋白的基因序列有很大的同源性。口们晦”口” s m t h o m a s 等报道在假单胞菌ps p c i t i 中，苯胺是将苯胺转化成t c a 循环中间产物 途径中的诱导物。编码苯胺降解的一系列酶的基因由一个启动子控制。口”但目前人们对 于苯胺双加氧酶的研究还不是很清楚，这是因为苯胺双加氧酶是一个多亚基酶，催化苯胺 加氧脱氨反应时，还要求有氨基转移蛋白的参与，在细胞破碎之后，破坏了该酶亚基之间 及亚基与氨基转移蛋白之间的有机结构，因此用粗酶液无法测定该酶活性，所以这一步的 皮应机理目前还不是很清楚。口“口们口2 1 口3 1 3 优势复合菌处理含高浓度苯胺废水的应用和发展前景 许多化工厂等已经开始应用具有降解性能的微生物来处理工业废水中的苯胺类化合 物，并且已经取得了显著的效果。但是还是不能完全满足实际的需要，这是因为在自然环 境中散在分布的污染物不能象工业废水一样进行集中统一的处理：受到污染的环境中的化 合物的成分变化大，p h 波动也比较大，有可能抑制降解菌的生长；降解菌对环境中污染 物的降解速度慢，达不到实际需要的要求或经常发生变异不能够继续降解污染物：受到污 染的环境不能有效的维持降解菌的生物量，在实际应用降解菌时常常会发生降解菌在总量 上的减少。为此，国内外许多学者都提出应用生物强化技术来提高降解菌对环境污染物的 降解效率，如：向环境中投加营养( 如投加葡萄糖以便能够共代谢硝基苯) ：或添加底物 9 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前击 类似物来刺激降解菌的生长或是提高其降解活性；或是通过遗传工程的手段来改良环境污 染物降解菌，其中最后一种方法是目前最有希望和前途的一种手段。通过遗传工程改良或 构建环境污染物降解菌有以下几种手段： ( 1 ) 构建“超级细菌”质粒可分为相容性质粒和非相容性质粒，可以把相容性的降解质 粒转化到同一种菌株里，赋予该菌株能够同时降解多种有机污染物的能力。当然，也可以 把不同的降解基因通过体外重组组建到同一个质粒或者载体上去，然后再把这个质粒转化 到特定的环境的优势菌株中去。这样，就可以构建“超级细菌”，从而扩大其对污染物的 降解范围，提高治理效果，增强其净化环境的作用。 ( 2 ) 原生质体融合原生质体融合技术在生物修复中的应用开始于8 0 年代初，但在短短的 几年里得到了较为广泛的应用。在有些情况下，两种或多种微生物在共同存在时才能够降 解苯胺，单独存在时不能降解该污染物，这可能是因为彼此为对方提供了生长所必须的条 件或为对方消除了生长的障碍，使得它们在共存的条件下能够顺利降解环境污染物。在这 种情况下，可以采用原生质体融合的技术融合这两种微生物，融合子就会具备两个亲本的 基因与优点：能够降解某种环境污染物，这也是目前污染物治理工程菌制备的一个主要途 径。 ( 3 ) 降解酶或降解基因的改良通常，人们从自然界筛选的降解菌其降解酶的活性比较低， 不能满足实际的需要。可以通过各种分子生物学技术来提高其活性，以增强降解菌对污染 物的降解能力，如可以通过定向诱变或随机突变等技术来筛选高活性的降解基因或降解 酶。d n a 一改组技术是1 9 9 4 年由美国的s t e m m e r 博士首先提出来的，是一种在试管内模拟 达尔文进化的过程。自d n a 改组技术诞生以来，得到了速猛的发展和广泛的应用，美国已 经开始应用该技术去去除环境污染物。 优势复合菌经长期驯化能形成稳定的含菌泥体系，菌泥的形成不但可使降解效率大大 提高，而且可使反应时间大大缩短，因而大幅度降低了废水处理工程的投资和运行成本。 利用高效菌作为添加剂或种源接种处理含有毒难降解化合物的工业废水是当今环保 领域中新兴的生物技术陆3 。目前许多领域已有菌种和装置商品出售，并获得了广泛的 工程应用。例如美国的r b c 由i n t e r b i o 公司代理，日本的e m ，韩国的裕守工程公司均在 世界各地推销其技术和产品，其中涉及的高效菌种不下数十种。日本的小林正泰于6 0 年 代开展用光合细菌p s b ( p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ) 处理有机废水的研究，随后，澳大 利亚，英国也相继进行了这方面的工作。据u d o dv m 报导，选育出1 2 种p s e u d o m o n a s 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 前言 及1 5 种b a c i l l u s 菌株，可用于分解对硝基苯胺。这些微生物酶的活力具有广谱作用，除 可以分解硝基苯胺外，还可以分解二氯苯胺，对甲苯胺等。对于易降解的高浓度苯胺废水 可用p s e u d o m o n a s 助f j d a ( s t r a i n7 3 6 ) 及a c h r o r m ob a c t e r a g l l e ( s t r a i n7 1 8 ) ， 在有磷化合物存在的条件下，使用0 1 - 0 2 克细菌升及1 7 2 0 毫克磷1 0 0 毫克，c o d 可得到令人满意的效果。1 9 7 6 年m cc o r m i c k 用v a l k a e s c e u s 转化t n t ，从中分离出5 个属共1 0 株菌在接触氧化生物滤池中混合接种，经处理后，废水中t n t 的可降低至 l m g l 以下，c o d 在9 0m g l 以下。m i r o s l a w s 的研究表明，当长期以对氨基苯磺酸作 为唯一的碳源氮源时，微生物的种类将减少，pp u t i d a , pe i s e n b e r g i is e p ，m p h l e i 及 f l a v o b a c t e r i u m s o a r e 将占优势，其中m p h l e i 对对氨基苯磺酸的分解水平可达1 0 0 。 t a k a i m i t s u g u 曾用驯化的f l a v o b a c t e r i a mc a p s u a n t a m ( f e r m - p 4 2 6 6 ) 处理过2 0 0 m g l 的2 一萘胺一1 磺酸( 吐氏酸) 。b a u m g a r t e n 将两种p s e u d o m o a a s 用萘一卜磺酸及萘一2 一磺 酸驯化，并将其固定在带正电荷的阳离子交换树脂上，用以处理1 ，6 一萘二磺酸，2 ，6 萘二 磺酸等萘磺酸中间体；能用于降解苯胺及g a m m a 酸的菌种，经混合接种后也可用于降解j 酸。 虽然优势复合菌技术在废水处理方面有着巨大的潜力，但由于废水组成的复杂性一 工业废水大都含有几种污染物，且成分比较复杂一限制了菌种的生存条件，因而也限制 了微生物体系的应用范围。目前，工业应用主要是利用复合的优势菌群。国内外众多的实 践证明，在污水处理方面，复合菌群的处理效果无论是在处理时间上还是稳定性上来说都 优于单一菌。例如，根据细菌降解染料，p v a ，l s a 的最适条件和原理，采用p v a 和l a s ( 十 二烷基璜酸钠) 混合菌，在好氧条件下可使1 0 0 0m g l 的p v a 获得8 5 以上的去除率，据 此建立了投加优良菌种的印染废水的处理方法。进一步研究表明，将p s b ( p h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i a ，光合细菌) 作为一种优势菌混合，并将其固定在载体上，可极大的扩展优势菌 技术的应用范围，而且明显的提高处理效果。例如，采用p s b 和氧化硫细菌联合作用，h r t ( 水力停留时间) 为2 5 至3 小时，脱硫效率即可达9 5 9 9 ：而用单一的氧化硫细 菌，在同样的水力条件下，脱硫效率仅是8 0 8 5 。利用混合菌培养还可以同时消除几 种污染物，因此，研究微生物的互配很有突出的价值，生物降解中混合菌株间的协同效应， 无论是在好氧菌还是在厌氧菌之间，细菌之间或真菌之间都是普遍存在的。 单一微生物对有机化合物的生物降解往往会产生有毒的终端产物，这种毒物对微生物 的生长有抑制作用，所以在有机物的生物降解过程中常常是多种微生物组成稳定的微生物 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前吉 群落，来消除有毒代谢产物对降解菌的影响。活性生物体系都具有自我平衡，自我调节的 能力，它对外界环境的变化具有较强的抵抗力。因为在整个微生物群落中，微生物之间构 成生物链的形式，一种微生物的有毒代谢产物往往是另一种微生物的生长基质，这样就可 以消除毒物的抑制作用，使代谢关系保持严格的平衡，使微生物的生长和有毒物质的降解 顺利进行。可见，筛选优势菌，探索不同优势菌的共生条件以及利用优势菌的方式，对于 提高优势菌的技术对有毒难降解的有机污染物的生物处理效果均是十分重要的。 由于污染物的结构的复杂性与种类的多样性，选择多种微生物组成一个生物体系，让 其中的各个细菌发挥其最佳功能，并利用微生物之间的协同作用来高效率的降解污染物符 合实践的需要，将成为今后研究的方向。但是从目前国内外现有的研究资料来看，混合菌 协同作用的机制研究尚不够深入。因此对于具有协同作用关系的菌株的筛选和组合还是一 个随机的过程，缺乏有效的理论指导，应该在现有的理论基础上对协同机制深入研究。 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 材料与方法 第二部分材料与方法 1 材料 1 1 培养基组成和培养条件 富集用培养基：k 2 h p o , 0 3 ：k h ：p o 。0 0 2 ：m g s o 。0 0 2 ： c a c l z0 0 1 ：苯胺 0 4 ：琼脂1 5 划线分离用培养基：酵母粉0 3 ：胰胨0 1 5 ：葡萄糖0 3 ： k 2 h p o a0 2 5 ：n a c 0 5 ：琼脂1 5 纯化培养基：n a 。h p 0 45 o g ；k 2 h p o , 2 o g ：( n h 。) 。s o a o g ；m g s 0 4 0 2 9 ：苯胺2 o g ： 自 来水1 0 0 0 m l1 2 1 灭菌2 5 分钟 无机盐液体培养基：k ：i p 仉0 4 ：k h ：p o 。0 6 ：( n h 4 ) ：s o 。0 2 ：m g s o t h 2 0 0 0 2 ： n a c l0 5 用n a o h 溶液调p h 至7 0 l b 液体培养基：蛋白胨1 0 o g ；酵母粉5 o g ：蒸馏水1 0 0 0 l ：用n a o h 溶液调p h 至 7 0 培养条件：3 0 ，1 2 0 转分振荡培养 1 2 试剂及仪器 l2 1 试剂 1 2 1 1 苯胺含量测定所需各类试剂 ( 1 ) 硫酸氢钾 ( 2 ) 无水碳酸钠 ( 3 ) 精密p h 试纸 ( 4 ) 5 ( m v ) 亚硝酸钠水溶液 ( 5 ) 2 5 ( m v ) 氨基磺酸铵水溶液 ( 6 ) 0 0 5m o ! l 硫酸溶液 ( 7 ) 2 ( m v ) n 一( 卜萘基) 已二胺盐酸盐 n 一( 1 一n a p h t h y l ) 一e t h y l e n d i a m i n e d i h y d r o c h l o r i d e ，简称n e d a 水 爵： l e 。 ( 8 ) 苯胺标准溶液：于2 5m 1 容量瓶中加入0 0 5m o l l 硫酸溶液l om l ( 准确称量) 。 南开大学碗f 研究生毕业( 学位) 论文 材料j 方法 然后加入3 5 滴苯胺( 再一次称量) 。用0 0 5m o l l 硫酸溶液稀释至刻度，摇匀。计算出 每毫升溶液中所含苯胺的量，作为贮备液，于冰箱内保存。使用时用0 0 5m o l l 硫酸溶 液稀释成每毫升含1 0 0ug 苯胺的标准溶液( 用时现配) 。 注：1 苯胺应为无色透明液体，如色泽变黄应重新蒸馏后使用。 2 萘已二胺盐酸盐的配制：用颜色很浅的2 级品，可直接配制，保存于冰箱中可稳 定较长时间。配制时在水浴上温热至溶液清亮并全部溶解，过滤后稀释至所要体积。贮存 于棕色瓶中，冰箱保存。此溶液不宜多配，当溶液混浊时应重新配制。 1 2 1 2p c r 反应所需的各类试剂 1 0 xp c rb u f f e r ，l o m md n t p 混合物，2 5 m mm g c l ：，t a qd n ap o l y m e r a s e ，d n am a r k e r ，购 自北京鼎国生物技术发展中心。 p r i m e r1 与p r i m e r2 由上海生物工程技术服务有限公司合成。 p r i m e r1c f ：5 一a c t t c g a a t t g t a t g c t g a c a a ( a g ) g a ( a g ) t a ( t c ) a c i g g i a a ( a g ) t g 一3 p r i m e r2c r ：5 一a c c t c g t t g c g g t t g c c g g a c t ( a g ) g g ( a g ) t c ( a g ) a a ( a g ) a a ( a g ) t a 1 a t i g t 一3 1 2 1 3 其他试剂 5 0xt a gb u f f e r ： t r i s 1 2 1 9 n a 2 e d t a 1 8 6 9 冰醋酸 2 8 5 5 m l 补蒸馏水至5 0 0 m l 加样b u f f e r ( 5 0m mt r i s ，0 2 5 溴甲酚紫，5 0 甘油) ： 0 6 1 9t r i s 溶于5 0 m l 蒸馏水，用冰醋酸调p h 至8 0 ，加5 0 m l 甘油，加0 2 5 9 溴甲酚 紫。 用量：加样液：样品液= 1 ：3 或1 ：4 南开人学硕上研兜生毕业( 学位) 论义材料ij 力法 2 0 s s c ： n a c l 1 7 5 9 柠檬酸三钠8 8 9 加水定容至l o o m l ，调p h 至7 0 ，灭菌备用。 溶液i ：5 0m m o l l 葡萄糖，2 5m m o l lt r i s c l ( p h8 0 ) ，i 0m m o l le d t a ( p h8 0 ) 灭菌，4 c 贮存备用。 溶液i i ：0 4m o l ln a o h ，2 s d s ，1 ：1 混合使用 溶液i i i ：5m o l l 乙酸钾6 0 m l ，冰乙酸1 1 5 m l ，水2 8 5 m l ，混合备用。 1 2 2 仪器 7 2 1 型分光光度计 离心机：c e n t r i f u g e5 4 1 7 r 。5 4 1 5 d p c r 仪：p t c i 0 0 ”p r o g r a m m a b l et h e r m a lc o n t r o l l e r 2 方法 2 1 高效复合菌的筛选 2 1 1 污泥样品的采集和菌种的分离纯化 从油田、炼油厂、排污河等多处受苯胺污染的区域采集水样，土样共9 7 个，各样品 以2 的接种量( 土样用无菌水处理，l 克土样加2m l 无菌水，充分震荡稍置后取上清液) ， 移接入装有5 0m l 已灭菌的培养基的三角瓶中，3 0 震荡培养7 2 小时。再根据以上的操 作方法重复富集培养两次，然后进行镜检，对降解效果显著的样品进行苯胺含量的测定。 将菌种生长良好，苯胺含量又明显降低的样品作为目标样品。 2 1 2 单一菌种的筛选 对目标样品进行多次平板化线分离，将样品中各单菌逐一分离出来。 将分离出来的单菌装入含有已灭过菌的纯化培养基的三角瓶内，于3 0 。c 震荡培养7 2 小时。培养液再以2 的接种量接入另一瓶装有已灭过菌的纯化培养基的三角瓶内，于 3 0 。c 震荡培养7 2 小时，重复接种一次。筛选在纯化培养基上生长明显，苯胺含量又明显 降低的细菌为降解菌株。 2 1 3 复配试验 南开大学硕上研究生毕业( 学位) 论文 材料1 j 方法 将筛选出来的四株苯胺降解单菌组合复配共形成1 1 种复配方法。分别用这1 1 种复配 方式接种，并经过4 次传代培养后获得结构较为稳定的复合菌株，最后再对这些复合菌的 降解效率进行检测，并分析它们的菌群结构( 平板计数法) ，确定出最佳的互配方式。 2 1 4 复合菌的驯化 对最佳复配方式下形成的复合菌株进行驯化培养。驯化反应是在一个容积为o 5 l 的玻 璃瓶内进行。首先在玻璃瓶内接入0 1 l 的菌液，再加入0 3 l 的纯化培养基，连续通入无 菌空气，在3 0 条件下培养1 2 小时：然后加入0 1 l 的排污河水继续培养4 0 小时后，放 掉0 4 l 反应液；将剩余的0 1 l 反应液作为接种液，再重复上述培养步骤。按上述步骤驯 化培养一个月后，开始监测反应器内混合液中苯胺的降解情况，借以确定高效降解菌群的 形成，并将该菌群的降解效率与单菌及复配菌液的降解效率进行比较。 2 2 细菌生长的测定和菌种的鉴定 细菌生长情况以波长九= 4 6 0 h m 处的吸光度( 0 d ) 表示。菌种鉴定由中科院微生物所进 行鉴定。 2 3 苯胺降解菌降解曲线的测定 ( 1 ) 苯胺标准曲线的绘制 于7 个2 5 m l 具塞比色管中分别加入0 ，0 2 5 ，0 5 0 ，1 0 0 ，2 o o ，3 o o m l 苯胺标 准溶液( 1 0 0 0 ug m 1 ) ，各加水至l o m l ，摇匀，用h c l 调p h 至l _ 5 2 0 ( 用精密p h 试纸 测试) 。加l 滴5 n a n o 。溶液，摇匀，放置3 分钟，加入2 5 氨基磺酸铵溶液0 5 m l ，充 分 振荡后，放置3 分钟，待气泡除尽后，加入2 n e d a ( 乙二胺盐酸盐) 溶液1 o m ，用水 稀释至刻度，摇匀。放置3 0 分钟，于5 4 5 n m 波长处，以水为参比，测定吸光度。 以苯胺含量( ug ) 为横坐标，溶液在5 4 5 n m 处的吸光度值为纵坐标，绘出苯胺的标 准曲线。 ( 2 ) 样品的测定 水样用中速滤纸过