基因转移及方法.ppt

1、在下述双链DNA序列（仅列出其中一条链序列）中不属于完全回文结构的是：,AGAATTCTTGAATTCAGGAATTCCCGTTAAGCAGATATCT,2、可识别并切割特异DNA序列的称,限制性核酸外切酶限制性核酸内切酶非限制性核酸外切酶非限制性核酸内切酶DNA酶,3、在重组DNA技术领域所说的分子克隆是指,建立单克隆抗体建立多克隆抗体构建重组DNA分子无性繁殖DNA有性繁殖DNA,4、在重组DNA技术中催化形成重组DNA分子的是DNA,聚合酶解链酶连接酶拓扑酶内切酶,5、在已知序列的情况下获得目的DNA最常用的方法是：,化学合成法筛选基因组文库筛选cDNA文库聚合酶链式反应DNA合成仪合成,6、某限制性内切酶切割5-GGGGGAATTCC-3序列后产生：,5突出末端3突出末端5及3突出末端5或3突出末端平末端,7、重组DNA技术领域常用的质粒DNA是：,细菌染色体DNA的一部分细菌染色体DNA外的独立遗传单位病毒基因组DNA的一部分真核细胞染色体DNA的一部分真核细胞染色体DNA外的独立遗传单位,8、直接针对目的DNA进行筛选的方法是：,青霉素抗药性氨苄青霉素抗药性分子杂交分子筛电泳,9、不能用作克隆载体的是,质粒DNA噬菌体DNA细菌基因组DNA腺病毒DNA逆转录病毒DNA,10、克隆某一目的DNA的过程不包括：,基因载体的选择与建立外源基因与载体的拼接重组DNA分子导入受体细胞筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞表达目的基因编码的蛋白质,名词解释：plasmid；vector；restrictionendonuclease；回文结构,基因工程方案：分、切、接、转、筛,一、分：目的基因的分离：从染色体DNA中分离；人工合成；反转录；基因文库二、切：限制性内切酶的应用：平端切口；粘端切口三、接：把载体和目的基因连接成重组体：DNA连接酶；“尾接法”；“人工连接器”四、转：重组体的转化五、筛：DNA重组体筛选与鉴定：表型，DNA限制酶酶切图谱,核酸杂交,表达产物鉴定等。,分目的基因的分离,目的基因的获得及方法,目的基因概念获得目的基因方法构建cDNA文库构建基因组文库人工合成目的基因PCR合成其他方法：差异显示，基因陷阱,目的基因的概念,基因是DNA分子上含特定遗传信息的核酸序列的总称，是遗传物质的最小功能单位。目的基因：对基因组中某个基因通过克隆扩增，获得该基因进行研究或应用称这种基因为目的基因。,目的基因的用途,研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、调控寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与治疗研究生物种系进化与相关同源性基因工程重组表达改造某些基因基因治疗,原理,原核目的基因获得：直接分离真核目的基因获得：(一)载体：宿主细胞内可独立复制的完整DNA分子。质粒(plasmid)噬菌体M13噬菌体逆转录病毒DNA昆虫病毒DNA（插入动物细胞）(二)目的基因的来源从cDNA中分离人工合成反转录基因文库PCR其他方法：差异显示，基因陷阱等,构建cDNA文库筛选目的基因,选材：mRNA丰富，目的基因表达活跃注意点：防止RNA酶污染,构建流程,组织细胞破碎细胞，除去DNA与蛋白质提取总RNAoligo（dT）纤维素亲合柱层析合成cDNA第一链反转录合成cDNA第二链插入载体重组DNA导入大肠杆菌扩增构建cDNA文库,mRNA的分离,10-5g/细胞，8085%为rRNA，15%小分子量RNA（tRNA等）1-5%mRNA，28S：18S=2：1提取总RNA：常规方法；Trizon提取纯化mRNA：oligo-dT柱,反转录合成cDNA,合成cDNA第一链：反转录酶合成cDNA第二链：置换合成法：RNA酶H；DNA聚合酶；T4DNA连接酶外加引物合成法：全长双链PCR,构建cDNA文库,cDNA两端加接头或衔接头cDNA与载体相连导入宿主细胞进行克隆,筛选目的基因,核酸杂交法：探针免疫结合法：抗体其他方法：双杂交；基因芯片,构建基因组文库筛选目的基因,要求：全流程：组织细胞温和破碎细胞DNA片段与载体的连接包装限制性内切酶消化，噬菌体或粘粒导入细胞核酸杂交筛选目的基因,人工合成目的基因片段,原理：DNA是由3，5-磷酸二酯键连接技术：DNA自动合成仪方法化学合成法：固相酶促合成法：需模板PCR,其他方法,构建差示文库（扣除文库）筛选特殊基因,差示文库：反映不同组织细胞或同一种细胞在不同功能状态下，基因表达差异的cDNA文库。用于研究细胞的发育、分化、细胞的分裂周期、细胞对药物和生长因子的诱导反应以及肿瘤等疾病的分子基础。方法：构建两个cDNA文库杂交羟基磷灰石柱分离构建cDNA文库,mRNA差示显示法获得目的基因,原理：一般15%基因表达，而且在不同状态表达的基因是不同的方法：PCR扩增（标记）测序电泳筛选差异优点：简便；灵敏度高；重复性好；多能性；快速,选择原则,根据获得目的基因的目的选择方法根据目的基因本身特点选择方法根据实验室条件选择方法,双杂交技术原理与应用,生物化学与分子生物学教研室王梁华,基本原理,转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DB)和转录激活结构域(AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。例子：酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。,双杂交系统工作原理示意图,a天然Gal4蛋白具有DNA结合域和转录激活域，诱导Gal1-LacZ转录；b只有DNA结合域（上）或转录激活域（下）的杂合蛋白不能激活报告基因的转录；c蛋白X和Y之间的相互作用使Gal4的两个结构域接近导致报告基因的转录,基本技术,诱饵融合表达质粒构建融合表达cDNA文库构建文库扩增，重组DNA收集共转染筛选假阳性剔除测序生物学功能验证,双杂交系统的发展,报告基因的多样化多报告基因系统：LacZ，酵母营养缺陷型Leu2和His3诱饵表达载体：两种Gal4和LexA，后者结合于E.coli的LexA操纵子且不具有核定位序列猎物表达载体：三种VP16来自于单纯疱疹病毒，它的转录激活活性高于下述两个酵母Gal4的转录激活域B42来自E.coli，转录激活活性弱，可以缓和有毒性的基因表达对细胞的影响，其后插入流感病毒HA抗原，易于将蛋白分离纯化,基于双杂交原理的其他方法,三杂交系统：两个蛋白之间通过第三者发生相互作用，第三物可以是蛋白质、小分子或RNA负选择系统：BD-X/AD-Y转录激活的报告基因在特定的条件下有毒性。如表达URA3基因的酵母在缺乏5-氟乳清酸的培养基上能够正常生长。在含5-氟乳清酸的培养基上该酶将5-氟乳清酸转变成毒性复合物，使细胞停止生长或死亡双诱饵系统：使用两种不同的诱饵激活选择性和负选择两种报告基因的转录哺乳动物的双杂交系统：高等生物中发现蛋白相互作用单杂交系统：确定识别特异DNA结合蛋白的方法SOS恢复系统：研究膜受体、细胞外分泌蛋白等非核蛋白相互作用泛素专一性蛋白酶系统：检测蛋白相互作用中的动力学大规模双杂交筛选：蛋白组学中的应用,蛋白质三杂交系统,a：蛋白Z稳定了蛋白A和B之间的作用；B：蛋白质A和B通过蛋白Z相互作用；C：蛋白Z改变了A的结构，使得B能与之作用,通过小分子的三杂交系统,利用FK506与地塞米松杂合分子，将与LexA-BD融合的糖皮质激素受体及杂合分子作为诱饵，用于筛选与AD融合的JurkatcDNA文库，分离了与FK506结合的蛋白FKBP12,RNA介导的三杂交系统,与AD融合的蛋白是具有RNA结合域的蛋白（如细菌MS2），能够与RNA分子的臂-环结构结合；RNA除具有臂-环结构外，还有诱饵序列（test）。这样RNA分子与DB-蛋白复合物构成了双杂交系统中的诱饵，它结合于报告基因的上游；第3个分子是AD-蛋白，如果该蛋白识别诱饵序列test并结合，则报告基因转录。,三杂交系统应用,分析确定RNA-蛋白作用的精确结构域，甚至单个核苷酸或氨基酸残基鉴定和克隆识别结合有重要生理功能RNA(如转录、定位、RNA病毒包装和感染等)的蛋白质，可用于调控的机理研究、疾病的防治以及抗病毒药物的研制开发通过构建杂交RNA库，可筛选与特定蛋白结合的RNA有可能在此基础上发展四杂交系统研究RNA-RNA间的相互作用,负选择系统,a报告基因不转录，细胞生长；b报告基因转录，细胞不生长或死亡（在含5-氟乳清酸的培养基上，URA3基因表达产物降解5-氟乳清酸为有毒物质）,反向双杂交系统应用,可更有效地蛋白间作用的关键位点或起决定作用的个别氨基酸，进而分析蛋白结构和功能的关系可筛选能阻止某些蛋白间相互作用的肽或小分子物质用作临床治疗制剂研究相互作用的蛋白间的结构特征筛选蛋白突变体确定能够打破特异的蛋白相互作用的试剂,双诱饵系统,使用两种不同的诱饵激活选择性和负选择两种报告基因的转录用于区分桥蛋白与识别蛋白还可以区分野生型蛋白和病理条件下的蛋白变种,哺乳动物的双杂交系统,酵母毕竟是一种较低等的生物，蛋白的翻译后修饰（糖基化、二硫键的形成等）程度很低要进一步研究蛋白产物的生物学功能，还必须建立高等生物体系的双杂交系统系统采用单纯疱疹病毒VP16的AD区段用氯霉素乙酰转移酶为报告基因，其活性可以在细胞提取物中检测采用磷酸钙共沉淀转化入Hela细胞培养该方法主要用于检验已知蛋白的相互作用,单杂交系统,用于确定识别特异DNA结合蛋白的方法在系统中诱饵是报告基因一段特定的上游序列将DNA复制起始序列ACS与报告基因LacZ连接，用来筛选杂交表达文库（即与AD融合的蛋白文库）应用：发现并分离了酵母ORC6DNA复制复合物蛋白之一,SOS恢复系统,上述反应都是在核中进行的，对于研究膜蛋白，分泌蛋白，膜受体及胞质蛋白有很大的局限性SOS恢复系统是针对于膜受体、细胞外分泌蛋白的一种方法原理：酵母温度敏感株是由于在ras信号途径中存在突变体，不能将外来信号传递给膜上的RAS蛋白，在36不能存活将野生性SOS与X融合，豆蔻酰化信号与Y融合，使Y定位于膜上。若X与Y结合，则SOS蛋白定位于膜上，与RAS接近，激活ras途径，完成SOS过程，36下生长,SOS恢复系统,泛素专一性蛋白酶系统,泛素与蛋白质形成的融合蛋白可以被泛素专一性蛋白酶（UBPS）分解，并且需要泛素正确折叠泛素的两个结构域分别表达时就能够正确折叠，当N端发生错义突变时不能正确折叠当两个蛋白（A、B）分别与泛素的N端、C端融合，若A、B相互作用，则N端错义突变引起的不正确折叠能够得到纠正，C端和N端能够正确折叠，UBPS水解使得二氢叶酸还原酶释放该系统可检测蛋白相互作用中的动力学性质,大规模双杂交筛选1,a矩阵法：以横向方式生长的是含有诱饵的单倍体酵母，竖线方式生长的是猎物库的单倍体酵母复印膜,单倍体接合后，在交叉处的酵母则融合成二倍体将二倍体分别在含X-Gal和Leu-培养基上进行筛选,大规模双杂交筛选2,B一一对应方法：诱饵与猎物相对应，接合于丰富培养基上，拷贝膜在选择培养基上进行筛选,大规模双杂交筛选3,C文库对文库的接合：即单倍体诱饵文库与单倍体猎物文库接合，直接筛选二倍体,细菌双杂交系统1,利用百日咳博代杆菌中cya基因编码的钙调蛋白(CaM)依赖性腺苷酸环化酶，其激活区可以分成T18和T25两个相对独立的功能片段将这两种片段引入大肠杆菌DHP1(cya-)中独立表达，它们不能彼此识别与作用，因此不能互补大肠杆菌DHP1的cya-缺陷型性状，表现为半乳糖苷酶活性很低，生长在MacConkey/麦芽糖平板上的菌落呈白色若这两个功能区分别与一对可相互作用的蛋白质融合表达，它们可形成有功能的腺苷酸环化酶，互补大肠杆菌DHP1的cya-缺陷型，使菌株半乳糖苷酶活性上升，生长在MacConkey/麦芽糖平板上菌落显红色因此应用这个双杂交系统研究蛋白质间的相互作用即可根据半乳糖苷酶和麦芽糖酶的活力来检测,细菌双杂交系统2,假阳性：只产生T18NifL或T25NifL的对照组大肠杆菌DHP1(cya-)菌株，也可导致菌株半乳糖苷酶活性的上升或生长在MacConkey/麦芽糖平板上菌落呈浅红色的假阳性结果改用阴沟肠杆菌，由于腺苷酸环化酶性质不同：其不依赖于CaM，在加入CaM后cAMP的量并不增加，通过薄层层析法直接检测cAMP形成的量，可以将二者区别检测生成的cAMP，反应中必须加入适量的NaF和咖啡因：NaF可抑制ATPase的活性，防止ATP被ATPase降解，确保反应过程中底物ATP的浓度始终维持在较高的水平；咖啡因能抑制3-5-cAMP磷酸二酯酶对cAMP的降解，保证生成的cAMP的积累,细菌双杂交优点,细菌的生长速度快，大大缩短了实验周期两种蛋白质是否相互作用是通过形成有活性腺苷酸环化酶来判断的，如将与T18或T25片段融合的蛋白纯化出来，检测其混合液的腺苷酸环化酶活性，即从体外研究蛋白质间相互作用，并可直接研究环境因子或其他分子等的影响如研究的两种蛋白质具有腺苷酸环化酶活性(非CaM依赖型特性)，在应用时就会产生假阳性，可利用上述方法排除假阳性的干扰应用细菌双杂交系统研究原核生物蛋白质间相互作用时，会得到一些用酵母双杂交系统研究时无法得到的结果,STRATAGENE的细菌双杂交系统,诱饵蛋白与全长cI融合表达（cIN端是DNA结合区，可使融合蛋白定位于报告基因的上游；cIC端是二聚化区）靶蛋白与RNA聚合酶亚单位的N端融合表达诱饵蛋白与靶蛋白结合后，RNA聚合酶亚单位与启动子结合与启动第一个报告基因抗Amp基因转录；第二个报告基因半乳糖苷酶基因受同一启动子调控表达由于抑制蛋白和RNA聚合酶都可形成二具体，对测试蛋白自我聚合是不合适的,诱饵质粒的构建与鉴定,设计引物，PCR得到诱饵蛋白编码序列酶切，连接，MCF：Not,EcoR,Sma,BamH,Xho,Bgl转化：选择宿主菌降低诱饵蛋白表达，含lacIq基因对氯霉素敏感的细菌筛选氯霉素抗性菌落以诱饵蛋白插入位点两端序列为引物PCR扩增IPTG诱导表达诱饵蛋白注意点：pBT是低拷贝质粒；抗性与我们通常所用的不同,靶cDNA文库构建流程,组织细胞破碎细胞，除去DNA与蛋白质提取总RNAoligo（dT）纤维素亲合柱层析制备mRNA反转录合成cDNA第一链两头外加接头：EcoR和Xho合成cDNA第二链插入载体(pTRGXR)重组DNA导入大肠杆菌扩增(XL1-Blue)构建cDNA文库,商品化cDNA文库的扩增,查询文库滴度和细菌浓度：决定扩增的规模与工作量铺板：LB-四环素琼脂平板：15cm或25cm培养17-30小时：长插入序列菌落充分生长从平板收集所有菌落，抽提质粒注意点低拷贝抗性含文库菌种的保存,相互作用蛋白的筛选,筛选条件：LB-CTCK琼脂平板C：氯霉素pBT质粒的筛选抗性T：四环素pTRG质粒的筛选抗性C：羧苄青霉素报告基因的抗性K：卡那霉素宿主菌的抗性共转化：各10ng质粒；卡那霉素抗性宿主菌XL1-BlueMRF生长条件：30注意点转化效率（-巯基乙醇提高转化效率）转化密度（5104/15cm平板）转化总量（所筛选文库滴度决定，20快平板）羧苄青霉素浓度（由诱饵蛋白和靶蛋白作用亲和力决定）对照（试剂盒提供阳性对照）,靶蛋白的确定,假阳性消除抽提阳性克隆的pTRG-靶蛋白，与pBT共转染，LB-CTCK平板再次筛选利用第二个报告基因筛选靶蛋白的确定测序与GenBank库序列比对核酸杂交确定基因全序列注意点所有阳性菌落扩增时应在LB-TCK平板或试管中进行X-gal筛选时使用PETG而不是IPTG,应用,研究蛋白-蛋白间的相互作用蛋白与其它分子相互作用筛选未知蛋白研究蛋白的功能蛋白质组学,切、接、转,目的基因的转移重组体的构成、导入和筛选,载体：概念；筛选标志和方法；多克隆位点；用途连接方法：平末端；粘性末端；定向克隆、T-A克隆导入：转化、转染、转导、感受态菌鉴定,接入的工具载体,载体,载体：携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和/或表达的工具。载体类型：质粒；噬菌体；病毒。大多经过人工改造载体特征在细胞内能自主复制，即必须具备复制原点（必需）具备适合的酶切位点（必需）通常有筛选标记，如对抗菌素的抗性，某些基因产物的显色反应等拷贝数高,质粒载体,质粒：细菌染色体外小型双链环状DNA，对细菌的某些代谢活动和抗药性的表型均有一定的作用。质粒复制的类型严紧型：1-5拷贝，与细菌复制密切相关松弛型：10-200拷贝以上常用载体：pBR322：4.36kb；人工构建；Tetr和Ampr；多克隆位点pUC系列质粒：2.674kb；Ampr；蓝白斑筛选（lacZ）用途：保存与扩增2kb的目的基因构建cDNA文库测序制备探针,噬菌体载体,噬菌体载体的分子生物学基因组：50kb双链DNA分子，末端12bp为互补单链（cos位点，又称粘端）两种生长方式：裂菌性生长（组装噬菌体）溶源性生长（整合入细菌DNA内）两个启动子：PR和PL几种蛋白：N；cro；C；C；C,噬菌体载体,噬菌体载体应用,生长方式：裂菌性生长用途：cDNA文库；基因组文库应用形式插入载体：直接插入酶切位点（EcoR）容量：几个kb代表载体：gt10；gt11用途：构建cDNA文库替代载体：替代非必需基因酶切位点：EcoR；BamH；Sal容量：9-22kb代表载体：EMBL4用途：构建基因组文库,噬菌体电镜照片,粘粒载体,粘粒：质粒与噬菌体联合构成基因组组成：质粒复制起始位点；酶切位点；抗药性基因；噬菌体cos位点大小：4-6kb容量：29-45kb代表载体：pGEM-3Zf（-）工作方式：噬粒可像一般质粒一样操作，但当需要制备单链DNA时，就需要在培养时加入辅助噬菌体。培养好的菌液在离心除去菌体后，上清中加入PEG即可沉出含有单链DNA的颗粒。,M13噬菌体载体,一类雄性特异的大肠杆菌噬菌体基因组：64kb单链闭环DNA分子生长方式：溶源性生长代表载体：M13mp系列：插入了多克隆位点和LacZ基因，可作蓝白斑筛选工作方式：复制型（上百拷贝）；分泌型M13感染大肠杆菌后，在菌体内酶的作用下，以感染性单链DNA（正链）为模板，转变为双链DNA，称作复制型DNA（RFDNA）。一般当有100-200个RFDNA拷贝/细胞时，即停止复制，产生有感染性的完整的单链丝状噬菌体并分泌离开菌体。可从菌体中提取RFDNA，供限制酶切割等分子克隆操作之用；从离心后的上清液中，可用聚乙二醇（PEG）沉淀出噬菌体颗粒，提取单链DNA（ssDNA）供DNA序列分析，体外定位突变等使用。,目的基因插入载体,作用酶：T4DNA连接酶连接方式粘性末端连接平末端连接人工接头连接,切形式与方法,粘端连接,全同源粘端：高背景；双向插入定向克隆：外源DNA定向插入载体不同粘端：连接效率高粘-平端,平端连接,是连接反应的基础缺点连接效率效低需大量T4DNA连接酶（5-10u/20ul反应）易串联,人工接头连接,人工接头：人工合成的短DNA连接子：带有一个或几个酶切位点平端连接（与目的DNA）酶切粘端连接（与载体）普适子：直接带有粘端,T-A克隆,原理：TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3末端加一个碱基，所加碱基几乎全是腺苷。据此，在质粒DNA3端突出一个胸苷来克隆PCR产物，其克隆效率比平端的连接至少高出100倍。应用：PCR产物克隆代表商品化载体：pCRTM；pGEM-T,无连接酶亚克隆法(LFS),无连接酶克隆法（ligase-freesubcloning，LFS）是利用引物5附加修饰的碱基与某一质粒两端分别互补的碱基。两引物的3约20-25bp分别与待扩增DNA两翼互补，5各有约24bp分别与线性化质粒的3相同的附加序列。由于线性化质粒的3序列各不相同，PCR片段通过选择各引物的合适5附加序列与引物3端定向杂交。注意点第一次PCR时两引物的5附加序列不应太短（24bp）以免影响第二次PCR时异源双链的形成扩增时若形成引物二聚体，一定要去除，否则会严重影响转化率优点可用于常规方法无法进行亚克隆的片段适于任何PCR产物和任何质粒可亚克隆特殊目的（如含点突变、缺失或插入等）片段在某些情况下，对已构建了启动子或增强子等序列的载体，可使待表达片段插入定向合适位置较快，可在1d内完成，较常规方法可靠，不需DNA连接酶,连接反应条件,成分：目的DNA片段；载体；连接缓冲液；T4DNA连接酶；水反应时间：1-16h温度：粘端：12-15；平端：30DNA量：载体：目的DNA=1：13酶量：定义单位不同（Weiss单位；粘端单位；外切核酸酶耐受实验定义单位等）；粘端连接：平端连接=1：10100,转方法,重组子导入受体菌,转化：特指将质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程转染：病毒及其重组子导入受体细胞转导：噬菌体及其重组子导入受体细胞,氯化钙法,感受态菌的制备：细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态试剂：冰浴低渗0.1mol/LCaCl2转化反应：热休克（42）转化效率：105-106/ugDNA;环状DNA高与线状DNA1000倍,电穿孔法,仪器：电穿孔仪参数：电场强度；电脉冲长度