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双特异分子探针技术的建立及对十二种常见赤潮藻的检测 摘要 赤潮的发生、发展和消亡等是当前海洋生态学研究的热点之一，而对赤潮藻 种类和数量的分析是其中的基础内容。除了传统的显微镜观察外，越来越多的新 兴技术正被引入这一领域并发挥着越来越重要的作用。 本研究利用s 1 酶能够保护完全匹配的双链核酸的性质，将分子生物学中的 酶保护分析技术和夹心杂交技术融合在一起，创立了双特异分子探针技术以实现 对赤潮藻的检测。该技术将酶保护分析探针( n p ! a 探针) 与细胞裂解液中的r r n a 进行杂交，再用s l 酶处理( 降解) 不匹配的双链杂合体和单链分子，然后采用 微孔板夹心杂交技术测定保留下来的与r r n a 分子等量匹配的n p a 探针及其数 量，从而实现对微藻种类和数量的鉴定。本研究还从细胞破碎程度、酶保护分 析和夹心杂交三个方面对诸多影响因素进行条件优化，最终建立了针对裸甲 藻、红色赤潮藻、海洋原甲藻、微小原甲藻、东海原甲藻、链状亚历山大藻、锥 状斯氏藻、旋链角毛藻、中肋骨条藻、尖刺拟菱形藻、圆海链藻和球形棕囊藻等 7 种甲藻、4 种硅藻和1 种定鞭藻的相关检测曲线和方法，获得了良好的特异性 和灵敏度。将双特异分子探针技术应用于模拟样品和现场样品分析，取得了理想 的检测结果。 双特异分子探针技术避免了核酸定量检测技术一般需要的核酸纯化步骤，将 目标生物的r r n a 转化为等量的互补d n a 探针，既解决了r n a 不稳定易于降 解的难题，又利用s 1 酶能够降解单链d n a 、r n a 或不完全匹配的双链核酸分 子的特性，将探针的专一性从d n a 探针与藻类的r n a 杂交一个层次，提高到 对杂交真实性进行校验的第二个层次( 也就是说特异结合的探针被保留，其它探 针被分解) ，从根本上解决了探针种属特异性的难题。本技术方法简单，条件易 于控制，不但满足了微藻分析技术鉴定到种并且定量的要求，而且降低了关键探 针的设计难度，使研发针对多种微藻并行分析的技术成为可能，为海洋微藻、特 别是赤潮藻的快速、准确、连续大面积观测研究开辟了一条新路。 。 关键词：赤潮藻；核糖体r n a ；s 1 酶；双特异分子探针技术 e s t a b l i s h m e n to fs a n d w i c h h y b r i d i z a t i o ni n t e g r a t e dw i t h n u c l e a s ep r o t e c t i o na s s a ya n dd e t e c t i o no fs e v e r a lh a b s p e c i e sw i t hi t a b s t r a c t i t i so n eo ft h er e s e a r c hf o c u s e sf o rm a r i n ee c o l o g yt h a tt h ee m e r g e n c e , d e v e l o p m e n ta n d v a n i s h m e n to f h a r m f u la l g a eb l o o m s ( h a b 0a tp r e s e n t a m o n gt h e m ，q u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v e d e t e c t i o nf o rh a bs p e c i e si st h eb a s i ct a s k b e s i d e st r a d i t i o n a lm i c r o s c o p yt e c h n o l o g y , m o l ea n d m o l en e wt e c h n o l o g i e sa r ei n t r o d u c e di n t ot h i sf i e l d i nt h i ss t u d y , c o m b i n i n gt r a d i t i o n a ls 1 e n z y m ea n a l y s i sw i t hs a n d w i c hh y b r i d i z a t i o n , s a n d w i c hh y b r i d i z a t i o nj i l t e 掣砒e dw i t hn u c l e a s e p r o t e c t i o na s s a y 州p a s h ow a sd e v e l o p e d t h ea s s a yc o n s i s t so f t h r e es t e p s ：f i r s t l y ，c e l l - d e r i v e d r r n as a m p l ew a sh y b r i d i z e dw i t ht h en u c l e a s e - p r o t e e t i o n - a s s a yp r o b e0 0 ap r o b e ) a n d s u b j e c t e dt 0d i g e s t i o nw i t hs ln u c l e a s et oc l e a ra l lm i s m a t c h e dp r o b e sa n dp r e s e r v ep e r f e c t l y m a t c h e dp r o b e ss t o i c h i o m e t r i e a l l y ；s e c o n d l y , t h e r e m a i n i n gn p ap r o b e sw e r os a n d w i c h h y b r i d i z e dw i t ht h ec o r r e s p o n d i n gc a p t u r ed n ap r o b e si m m o b i l i z e do nam i e r o p l a t ca n dt h e nt h e c o r r e s p o n d i n gs i pp r o b e sw e l eh y b r i d i z e dw i t ht h en p ap r o b e s ；f i n a l l y , t h ep r o b e s a n d w i c h w a sq u a n t i f i e dw i t he n z y m e - m e d i a t e dc o l o rr e a c t i o n t h es i g n a li n t e n s i t yc o r r e l a t e dt ot h e a b u n d a n c e o f t h e t a r g e ts p e c i e s i n t h e o r i g i n a ls a m p l e s o n t h e b a s i so f f e a s i b i l i t y , t h i s m e t h o d w a s o p t i m i z e df r o mc e l l ss p l i t t i n g , n u c l e a s ep r o t e c t i o na s s a ya n ds a n d w i c hh y b r i d i z a t i o n f i n a l l y , t w e l v es p e c i e s - s p e c i f i cn p ap r o b e sw e r er e s p e c t i v e l yd e s i g n e d ，t h es t a n d a r dc n l 、，e sf o re a c ha l g a w e r ee s t a b l i s h e da n dt h ee q u a t i o n sw e r ed e d u c t e d g o o ds p e c i f i c i t ya n ds e n s i t i v i t yh a da c h i e v e d m o r e o v e r , t h e r ew e r eg o o dr e s u l t sw h e nc u l t u r e ds a m p l e sa n df i e l do n e sw e r ea n a l y z e dw i t ht h i s m e t h o d n p a s ha v o i d e dc o m p l i c a t e dp r e - t r e a t m e n t so fp u r i f i c a t i o no fn u c l e i ca c i d t r a n s f o r m e dt h e t a r g e t e dr r n ai n t ot h ec o m p l e m e n t a ld n ap r o b e se q u a l l y t h i sm e t h o ds o l v e dt h ep r o b l e mo f r n ae a s yt od e g r a d ea n du p g r a d e dt h ep r o b es p c o i f i c i t yf r o md n ap r o b e sh y b r i d i z i n gw i t hr n a o fm i c r o a l g n et oc h e c kr e a l i t yo fh y b r i d i z a t i o n , u s i n gt h ea b i l i t yo f s in u c l e e s e 。w h i c hd e g r a d e s s i n g l e - s t r a n d e dn u c l e i ca c i d st oy i e l d5 p h o s p h o r y lm o n oo ro l i g o n u c l e o t i d e st ol e a v ed o u b l e s t r a n d e dd n a ，r n aa n dd n a r n ah y b r i d si n t a c tm a li st os a y , t h es p e c i f i cp r o b e sw e r gk e p t a n dt h eo t h e r sw e r ed e g r a d e d ) t h i sm e t h o di ss i m p l ea n dt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sa r ee a s yt o c o n t r 0 1 i tn o to n l ys a t i s f i e sw i t i iq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no f m i c r o a l g a es p e c i e sb u ta l s or e d u c e st h e s t r a n d e dd n a ，r n aa n dd n a r n ah y b r i d si n t a c t ( t h a ti st os a y , t h es p e c i f i cp r o b e sw e r ek e p t a n dt h eo t h e r sw e r ed e g r a d e d ) t h i sm e t h o di ss i m p l ea n dt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sa 托e a s yt o c o n t r 0 1 i tn o to n l ys a t i s f i e sw i t hq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no f m i c r o a l g a es p e c i e sb u ta l s or e d u c e st h e d i f f i c u l t yo fd e s i g n i n gp r o b e s ，w h i c hl e a d st oa n a l y s i sp r o b a b i l i t yo fs e v e r a lm i c r o a l g a ea tt h e s a m et i m e n p a - s hp a v e san o ww a yf o rq u i c k l ya n da c c u r a t e l ya n a l y z i n gl a r g eq u a n t i t yo f m a r i n em i e r o a l g a es a m p l e s ，e s p e c i a l l yh a r m f u la l g a eo n e s , f r o ml o n g - t e r mm o n i t o r i n ga n d h i g h - t h r o u g h p u ts a m p l i n gp r o j e 出 k e yw o r d s ：h a r m f u la l g a e ；r i b o s o m a lr n a ；s ie f l z y m e ；s a n d w i c hh y b r i d i z a t i o ni n t e g r a t e dw i t h n u e l e a s ep r o t e c t i o na s s a yf f a a - s 1 0 m 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含未获得 注i 垫遗直基丝益墨挂别直盟 的：查拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：甑兢 签字日期：，阳绰，月岁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：铴钪 签字日期：细f 年，月岁日 学位论文作者毕业后去向：蜜核7 笙数 工作单位：中固琦薛太挈 通讯地址：山怎售青岛糙4 黠鳄 新弹锄 签字日期：缸名年乡月7 日 电话：归5 基饧彩侈 邮编：，f 螂 双特异分子探针技术的建立及对十二种常见赤潮藻的检测 第一章文献综述 1 1 赤潮的产生及其危害 ， 赤潮( r e d 瓢d e ) 指海洋中某种藻类或其他微型生物可能在一定环境条件下爆 发性增殖或聚集达到某一水平，引起水色变化或其它海洋环境异常，并对海洋中其 他生物产生危害，如引起鱼虾贝类的死亡或在海洋生物体内蓄积毒素，最终对摄食 这些有毒种类的其他生物包括人类产生毒害作用的一种生态异常现象( 郭皓等， 2 0 0 4 ) 。 近年来随着河口、内湾和沿岸水域污染不断加剧，水体富营养化程度日趋严重， 赤潮发生的频率和危害程度明显上升。赤潮对海洋生态环境，水产养殖业和人类的 健康安全具有直接危害性，可引起包括水产养殖业、渔业、旅游等行业的经济损失 并影响到环境和人类健康，赤潮已成为沿海地区重要的环境问题。我国是赤潮发生 较多的国家之一，其中广东、浙江、山东、辽宁和上海近海，长江i ：1 、珠江口、辽 东湾、渤海湾、莱州湾、杭州湾、大亚湾等海域都是赤潮的多发区。1 9 3 3 1 9 8 9 中 国海域有记载的赤潮4 0 余次，其中危害性赤潮七十年代3 次，八十年代2 9 次。九 十年代赤潮发生频率和危害性迅速增加，仅1 9 9 0 就记载了3 4 起赤潮事件；渤海1 9 9 8 年9 月发生有史以来最大的一次赤潮，面积达6 0 0 0 平方公里，造成各种经济损失 达6 5 亿元( 郭皓等，2 0 0 4 ) 。进入2 l 世纪后中国赤潮发生的频率明显增加，2 0 0 1 年2 0 0 5 年，中国全海域共发生赤潮4 5 3 起，累计面积9 3 2 6 0 平方公里，全海域共 发生面积超过1 0 0 平方公里的赤潮1 3 2 次，累计面积约8 6 5 2 0 平方公里。其中，超 过1 0 0 0 平方公里的大面积赤潮3 3 次，累计面积约5 7 7 7 0 平方公里，分别占赤潮发 生总次数和总面积的7 和6 2 。赤潮呈现出发生频率高，发生时间提前，受害面 积扩大等特点( 中国海洋环境质量公报，2 0 0 5 ) 。 赤潮的爆发会对海洋生态系统造成严重破坏，给海水养殖和捕捞业带来巨大 损失。在过去的1 0 年间，我国近海因赤潮造成的直接经济损失已超过2 0 亿元人 民币。另外赤潮毒素对无脊椎动物、野生生物种群和养殖鱼类的物理性刺激作用或 降低溶解氧或通过毒素对机体产生的伤害可以引起海洋生物的大量死亡，同时也可 能通过鱼类和贝类的富集最终对人类产生毒害作用由赤潮生物分泌产生或分解产 生的危害性较大的几种毒素分别是麻痹性贝毒( p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，p s p ) 、 双特异分子探针技术的建立及对十二种常见赤潮藻的检测 腹泻性贝毒( d i a r r h e t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，d s p ) 、神经性贝毒( n e u r o t o x i cs h e l l f i s h p o i s o n i n g ，n s p ) 、西加鱼毒素( c i g u a t e r af i s hp o i s o n i n g ，c f p ) 、记忆缺失性贝毒 ( a m n e s i cs h e l l f i s h p o i s o n i n g ，a s p ) 和蓝细菌毒素( c y a n o b a c t e r i at o x i np o i s o n i n g ， ：c t p ) 等( 郭皓等，2 0 0 4 ；李淑冰等，2 0 0 0 ；刘仁沿等，2 0 0 4 ；卫玮等，2 0 0 4 ) 。赤 潮毒素具有毒性大、反应快，防治困难等特点，1 9 8 3 1 9 9 2 年因麻痹性贝毒引起的 中毒人数达1 1 2 7 人，死亡3 4 人，世界各地也发生多起因食用受污海产品而引起大 范围中毒的事件( 郭皓等，2 0 0 4 ) 。 一般而言，能够大量繁殖并引发赤潮的生物称之为赤潮生物。赤潮生物包括浮 游生物、原生动物和细菌等，其中有毒，有害赤潮生物以甲藻类居多，其次为硅藻， 绿色鞭毛藻、定鞭藻和原生动物等。世界范围内可引发赤潮的生物约9 0 多个属， 3 3 0 余种。其中细菌有5 个属，包括色菌属、绿菌属，囊硫菌属、红假单孢菌属和 多硫菌属；浮游植物1 1 个纲，9 l 属，包括硅藻纲2 3 属，甲藻纲3 4 属，蓝藻纲6 属，金藻纲3 属，隐藻纲2 属，黄藻纲l 属，绿色鞭毛藻纲3 属，定鞭藻纲5 属， 绿藻钢5 属，青绿藻纲5 属，眼藻纲4 属；原生动物l 纲l 属1 种( 郭皓等，2 0 0 4 ) 。 据全球的统计分析，海洋浮游植物是引发赤潮的主要生物。大约在4 0 0 0 多 种海洋浮游植物中，有2 6 0 多种能够形成赤潮，其中有7 0 多种可以产生毒素( 表1 ) 。 实际上，由于营养盐状态和气候条件的不同，在不同国家或地区引发赤潮的 浮游植物种类并不完全相同。我国海域跨越热带，亚热带和温带海区，海岸线长 达1 8 0 0 0 公里，沿海海域赤潮生物有3 0 多个属，1 5 0 余种，除属于原生动物的红 色中缢虫外其余均为浮游植物，其中硅藻近7 0 余种，甲藻4 0 余种，蓝藻9 种， 裸藻4 种，金藻3 种，黄藻1 种，隐藻1 种( 郭皓等，2 0 0 4 ) 。在我国曾经引发过 赤潮的浮游植物共有4 3 种，其中2 8 种有毒( 邹景忠，2 0 0 4 ) 。最常见的赤潮种主 要包括：夜光藻( n o c t i l u c as c i n t i l l a n s ( m a c a r t n e y ) k o f o i d & s w e z y ) 、米氏凯伦 藻( k a r e n i am i k i m o t o i ( m i y a k e & k o m i n a m ie xo d a ) ) ，塔玛亚历山大藻 ( a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ( l c b o u r ) b a l e c h ) 、海洋原甲藻( p r o r o c e n t r u mm i c a n s e h r e n b e r g ) 、微小原甲藻( p r o r o c e n t r u mm i n i m u m ( p a v i l a r d ) s c h i l l e r ) 、中肋骨 条藻( s k e l e t o n e m ac o s t a t u m ( o r e v i l l e ) c l e v e ) 、多边膝沟藻( g o n y a u l a xp o l y e d r a ) 、 束毛藻( t r i c h o d e s m i u ms p ) 、海洋卡盾藻( c h a t t o n e l l a m a r i n a ( s u b r a h m a n y a n ) h a r a & c h i h a r a ) 和棕囊藻( p h a e o c y s t i ss p ) 等( 邹景忠，1 9 9 2 ) 。 2 双特异分子探针技术的建立及对十二种常见赤潮藻的检测 表1 海洋中各类浮游植物的总数以及其中赤潮种、有毒种的数量( s o u r n i a , 1 9 9 5 ) i ) s o u m i a 等( 1 9 9 1 ) 估计羽纹硅藻包括大量偶生性浮游种类，在海洋中有5 0 0 7 8 9 种。表中3 0 0 种全属真性浮游种类。 2 ) 此处所引种类( 4 5 种) 稍多于s t e i d i n t g e r ( 1 9 9 6 ) 的数字( 4 3 ) 赤潮的频发和带来的巨大经济损失受到了全世界的关注，为此联合国政府问 海洋学委员会( i o c ) 和海洋研究科学委员会( s c o r ) 组织了赤潮联合工作组， 并于1 9 9 8 年在丹麦联合发起了全球有害藻华生态学与海洋学研究计划“g l o b a l e c o l o g ya n do c e a n o g r a p h yo f h a r m f u la l g a lb l o o m s ( g e o h a b ) ”，协调世界各国 相关的研究活动。我国也专门成立了相应的组织( c e o h a b ) ，对赤潮的产生、 监测和防治进行研究 1 2 赤潮藻种类和数量分析的主要方法 传统用于鉴别和定量计数赤潮藻类的方法主要以形态学特征为基础，在光学 显微镜下对赤潮藻类进行分类并分别计数各种的数量( h a l l e g r a e f f , e t a l ，1 9 9 5 ) 。 这种方法需要富有经验的专家；速度慢，耗时长；并且对形态相似的种类区分不易， 如甲藻门的亚历山大藻属的一些种类，仅细胞壁上个别甲片的结构有细微差别， 双特异分子探针技术的建立及对十二种常见赤潮藻的检测 一_ _ - 一 但在能否形成赤潮以及形成赤潮后所造成的危害方面却差异很大；再如裸甲藻， 其形态高度多样化。而且某些形态特征又具有可变性，其野生种和培养种在形态 上也有较大差异。对于这些浮游植物仅凭光学显微镜鉴定到种非常困难，通常必 须借助于电子显微镜才能完成。传统的形态学分析方法工作量极大，尤其当需要 分析的样本较大时，其缺陷更是显而易见( s c h o l i n , e ta ，1 9 9 6 a , 1 9 9 6 b ) 而大 量、连续甚至实时的观测数据是当前研究赤潮生物种群变迁、构建生态动力学模 型和对其进行监测、预报的需要，显然这种以形态学为基础的研究方法不能满足 这种需要。 现代生物学技术的迅速发展为赤潮生物的鉴定提供了新的思路，也使得研制 赤潮生物的快速定量检测方法成为可能。近几年，为了解决传统分析方法的困难， 研究者们相继从不同角度出发，利用细胞化学、免疫学、分子生物学及遥感技术、 计算机技术、激光电子技术等多门新技术，探索对赤潮生物的种类鉴定和数量计 数，取得了丰富的研究成果，形成了许多新的分析检测技术( m e d l i n ，甜a ，2 0 0 2 ； 米铁柱等，2 0 0 3 ) 。根据其分析的标准可以分为以形态学特征为基础的分析方法、 以小分子化学物质特征为基础的分析方法和以生物大分子特征为基础的分析方 法三大类。 1 2 1 以形态学特征为基础的分析方法 细胞技术与计算机图像处理技术相结合的f l o wc y t o m e t e ra n dm i c r o s c o p e ( f l o w c a m ) 技术，是在传统形态学分类的基础上，采用流式细胞技术使藻细胞逐 个通过显微镜头，以c c d 抓捕照片，然后结合图像专家系统，利用计算机技术对 抓捕的图像进行自动识别从而实现分类和计数( j o i l k e l , e ta 1 ，1 9 9 5 ；l a n g e ，e ta 1 ， 1 9 9 6 ；s i e r a c k i ，e t a l ，1 9 9 8 ；b i e g a l a , e t a l ，2 0 0 3 ) 。相对传统技术，这一技术使图像获 取和识别过程实现了自动化，减轻了人工识别和计数的工作强度。但是形态相似的 种类同样无法区分，由于受光学分辨率的限制，几何尺度微小的藻图像会不清楚， 不能准确识别；同时海水中的大量悬浮颗粒、气泡等更在一定程度上影响了识别的 准确度；另外仪器成本较高，对工作环境要求严格，需要良好训练的专业技术人员 等因素也限制了其应用。( m a r i e ，e ta 1 ，1 9 9 7 ；l i ，e ta l ，2 0 0 1 ；b e c k e r , e ta 1 ，2 0 0 2 ； s t a u b c r , e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 4 双特异分子探针技术的建立及对十二种常见赤潮藻的检测 ： 1 2 2 以小分子化学物质特征为基础的分析方法 浮游藻中含有多种色素，不同种类的浮游藻类具有不同的色素组成和特征色素 比值。许多色素之间都有很强的化学分类学联系，可以用来确定浮游藻群落组成和 丰度。比如，已发现19 一己酰氧基岩藻黄素是定鞭金藻的生物标志物，甲藻中的 多甲藻素和隐藻中的别黄素也是其独一无二的标志物( g i b b , e t a l ，2 0 0 1 ) 。化学分类 学方法就是藉由检测样品中各种色素的含量及特征色素比值进行特征藻的识别和 定量。同样，各种色素有着不同的化学结构，其吸收光谱、荧光光谱也各自不同， 因此不同藻类的吸收光谱、荧光光谱也会存在或多或少的差别，由此则产生了现场 荧光等检测方法。 1 2 2 1 基于藻类色素分析的化学分类学方法 ，一 ， 化学分类法是以分类对象各类群中化学成分的特征为依据，在传统分类方法的 基础上，研究物种和各类群间的亲缘关系与演化规律，并应用于分类对象的定性和 定量的鉴定方法( 姚鹏等，2 0 0 3 ) 。它是随着近代分析科学特别是仪器分析手段的 发展而迅速发展起来的。随着仪器分析技术的不断发展，陆续发现与鉴定了越来越 多的海洋浮游藻类的“特征性化学成分”即生物标志化合物( b i o m a r k e r s ) 。迄今为 止，人们发现能够用于化学分类的“特征性化学成分”有甾醇、醛类、脂肪酸、碳 水化合物( 糖类) 、色素和氨基酸等。如前所述，其中色素以其特征性显著和相应 分析手段易于实现而迅速发展为最理想的浮游藻类的化学生物标志物( j e r s e y , e t a l ， 1 9 9 7 ；m e y e r , e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 随着高效液相色谱色素分离方法的发展，特别是反相色谱的发展，色素的高效 液相色谱分析在二十世纪八十年代获得了快速进步，使可分离的色素种类数大大增 加，一次操作可以分离超过5 0 种色素( 叶绿素、类胡萝卜素及它们的衍生物) ( l a t a s a , e ta l ，1 9 9 6 ) ；同时二极管阵列检测器( d i o d ea r r a yd e t e c t o r ) 的广泛应用使得色素 的鉴定更加方便和准确( w d g h t e t a l ，1 9 9 1 ) 。原来野外样品的显微分析中由于过滤 损失或预处理破坏而丢失的微藻种类现在也能从它们的h p l c 色素信号峰中分辨出 来( b r o t a s ，e t a l ，1 9 9 6 , 2 0 0 3 ) 。i t p l c 方法还使得每个航次分析几百个样品成为可能 ( k w a t he ta 1 ，2 0 0 3 ) 。由此奠定了运用色素化学分类法来描述浮游藻类群落组成和 双特异分子探针技术的建立及对十二种常见赤潮藻的检测 丰度特征的技术基础。 。 化学分类法可以在藻纲一级进行较准确的分类，甚至对于某些形态学上十分相 近的种类在标志化合物上也有着差异，可以借助这一方法区分鉴定( w r i g h t , 甜a l 2 0 0 0 ) 但在属或种之间的分类还不能完全实现。同时，由于环境因素的变化、不 同的生长周期，浮游植物的色素含量会发生变化，基于这一方法的结果也会受到影 响所以这个方法仍处于研究的起步阶段，目前对浮游植物定性和定量分析很难准 确实现。 1 2 2 2 现场荧光检测法 在光源的激发下，藻类中的色素发出荧光，通过荧光检测器检测，可以获得荧 光光谱图，不同的藻类含有不同的色素组成，其荧光谱图也有差别，根据荧光的强 度和图谱反演计算各种色素含量，继而推算相关浮游植物的数量( k o e h n e , 。ta 1 1 9 9 9 ) 。借助光谱的差异可以区分不同的浮游植物类群，目前一些解析方法可以细 分至5 个类群。 这一方法可以迅速测定，并可以在水下等现场环境连续测定。但此方法只能将 浮游植物根据其色素分为几个类群，并易受到浮游藻类色素组成变化的影响。 1 2 2 3 基于水色遥感的浮游植物总量的反演 二十世纪八十年代以来，随着卫星水色遥感器的发展与应用，许多学者进行了 利用遥感数据对海域叶绿素含量进行测量的研究工作( g a r r e t , e t a l ，1 9 9 7 ) 。我国沿 海属于高浓度泥沙含量的大陆架海水，在这类海水中，由于含有大量的泥沙，海表 面的向上反射光的信息中以泥沙信息为主，由叶绿素吸收和反射的特征波长的信息 被淡化。因此，通常在大洋使用的蓝，绿光比值法遥感海表面叶绿素浓度往往失效。 采用类似于f l i 的s e a w i f s 通道，以波长为5 5 5l i r a 和7 6 5n m 为基线，测量波长为 6 7 0a m 的向上反射强度的高度遥感沿海海表面叶绿素浓度来代替荧光高度法，可以 由s e a w i f s 卫星资料得到海表面叶绿素浓度分布图( 潘德炉等，2 0 0 0 ) 。 这一方法可以迅速提供广大区域的数据，但往往只能反演叶绿素含量，估算浮 游植物总量，难以进一步提供浮游植物的类群等信息。如果获得了单种藻的吸收光 谱特征，并建立光谱信息与藻浓度的数学模型，就可以用遥感技术对藻进行分类， 6 双特异分子探针技术的建立及对十二种常见赤潮藻的检测 及定量计算各藻的浓度。目前已有一些研究者对淡水浮游藻的光谱特征加以研究， 并建立了数学解析模型( 刘堂友等，2 0 0 2 ) 。卫星光谱通道窗1 ：3 过窄是这一方法的 限制性因素。如何解决这些困难，借助卫星遥感的优势，实现对广大海域浮游藻快 速实时的种类区分( 即使是分为几个类群) 和浓度计算，对于海洋生态学研究和赤 潮监测预警有着重要意义。 ， 1 2 3 以生物大分子的特征为基础的方法 1 2 3 1 基于抗体探针的方法 利用免疫学手段，制备浮游植物的特异性抗体，然后以这些抗体作为探针，选 择合适的免疫测定方法即可实现对目标物种的检测。免疫学应用于浮游植物研究已 经有3 0 多年的历史了，早期的研究者只是利用抗体鉴别目标藻，将其作为常规分 类手段的补充方法使用，研究涉及的浮游植物种类也非常少近l o 年来，随着其 它相关技术的发展，利用抗体探针检测浮游植物的报道逐年增多，已渐渐成为浮游 植物监测领域的研究热点之一( k e i j i r o ，“a 1 ，1 9 9 6 ；x i n , e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。在浮游植物 检测中，应用抗体探针的免疫测定方法包括放射免疫、荧光免疫、酶联免疫( e l i s a ) 等，这些方法都可以定性和( 或) 定量地检测相关的浮游植物，其中应用荧光免疫 的报道最多也最为成功( d e l a p o r t e ，e t a l ，2 0 0 3 ) 。 抗体技术的优势在于不需要对样品进行预处理，若采用e l i s a 方法，所需的仪 器设备普及度高，也易于制成试剂盒推广和商品化。但抗体技术的制约因素在于特 异性不易解决( r h o d e s ，e la 1 ，1 9 9 8 ) ，需要制备高度专一性的抗体才能实现，特别是 要实现同一种属的区分，需要制备针对各种微藻的单克隆抗体。而传统制备单抗的 方法往往需要杂交瘤细胞技术，实验复杂，成本高昂，成功率低，严重制约了特异 性抗体的开发。 1 2 3 2 针对核酸分子的检测技术 核酸分子探针技术在环境领域日益受到重视，它的加速发展将在水产养殖和环 境监测中发挥越来越重要的作用。分子探针技术能够用于物种鉴定的基本原理是任 何物种都有着不同的核酸序列区域，即特异性的d n a 或r n a 序列，根据目标生物 7 双特异分子探针技术的建立及对十二种常见赤潮藻的检测 特征序列设计的探针具有高度专一性和较高的稳定性因此，核酸分子探针技术已 广泛的应用于临床检测、生物分类研究等领域( 加衄d n ，e ta l ，2 0 0 0 ) 。 ( 1 ) 荧光原位杂交技术：分子杂交技术与显微镜技术相结合 荧光原位杂交需要首先将细胞进行化学固定以保持细胞结构的完整性，然后将 标记的探针以特异性结合的方式渗透并结合到细胞内部，通过荧光显微镜或流式细 胞仪检测标记探针发出的信号以显示出细胞形态，从而达到识别和定量分析的目的 ( a m a n n ，e ta 1 ，1 9 9 0 ，1 9 9 6 ；v r i e l i n g , e la 1 ，1 9 9 6 ；m i k “s k i , e ta 1 ，2 0 0 5 ；梁君荣等， 2 0 0 5 张宝玉等，2 0 0 5 ) 。采用荧光原位杂交有几个优点：首先，被标记的细胞在 野外样品中易于识别；其次，如果设置一个通用的阳性标准，可以对整个群落进行 研究( l i n ，e t a l ，2 0 0 3 ) ；此外，可以将形态学特征用于特异性验证( m i l l e r , e t 以，1 9 9 6 ， 1 9 9 8 ，2 0 0 0 ) 。当然这种方法也存在着一些缺陷。比如说对以链状形式聚生的细胞( 拟 菱形藻属的种类等) 和在保存过程中聚集成簇的细胞，准确的记数就比较困难；易 碎的藻细胞( r a p h i d o p h y t e s 等) 很难保存；即使保存下来，一些细胞( h e t e r o s i g m a 等) 也可能聚集在一起而影响探针和藻细胞的杂交效率。同时，样品预处理时间长、 步骤多，探针结合特异性没有充分的实验数据验证也是该技术的不足之处 ( n a n d a k u m a r ，e l 以，2 0 0 3 ) 。 ( 2 ) p c r 技术与夹心杂交技术 荧光原位杂交是对全细胞形式进行检测，同时核酸探针还可以用于细胞匀浆形 式的检测。细胞匀浆形式就是首先利用化学溶剂破裂细胞以释放细胞内容物，然后 将特异性核酸分子探针和这些释放出来的物质进行结合。由于探针进行了标记，所 以这些分子物质可以通过检测标记信号而进行识别与定量。如果在藻细胞数目和破 裂细胞释放出的内容物间建立数量关系，就可以对该种的生物量进行估算。 目前对细胞匀浆的检测方法主要有两种：先将特异性片段扩增，然后检测标 记信号和将核酸探针直接与细胞匀浆杂交检验。前者可以采用p c r 技术；后者 可以采用斑点印迹法和夹心杂交技术两种检测方式( s i m o n ，e t a l ，2 0 0 0 ) 。 p c r 技术 双特异分子探针技术的建立及对十二种常见赤潮藻的检测 p c r 技术在浮游植物定性定量的检测中有一个发展的过程。最开始是对藻类的 某些基因片段进行扩增( 如1 8 sr d n a 、2 8 sr d n a 和转录间隔区等) ，通过系统分析 揭示它们之间的亲缘关系，同时也为物种鉴定提供依据( 张宝玉等，2 0 0 4 ) 另外 在提取浮游植物的d n a 后，采用特异的p c r 引物扩增，然后进行电泳鉴定或者采 用微孔板杂交和酶联反应技术对其进行定量( z a m m a t t e o ，e t a l ，1 9 9 7 ；c a s a d e m o m ，p t a 1 ，2 0 0 0 ) 。由于普通p c r 半定量技术很不准确，很难在实际中得到应用之后有研 究人员采用t i m es t e pp c r 技术进行分析，最近几年出现了将真正的定量p c 砭技术 应用于海洋浮游植物鉴定的几个例子( b o w e r s ，e t a l ，2 0 0 0 ；t e n g s ，e t a l ，2 0 0 1 ；苟万 里，2 0 0 3 ；何闪英等，2 0 0 6 ) 该技术在浮游植物分类鉴定的发展历程大致为：p c r 、 p c r - e l i s a 、p c r - s h a 、t n n es t e pp c r 和r e a lt a m ep c r 。该技术的最大优点是灵 敏度很好，每个反应只需要0 2 个细胞的d n a 量就可以扩增出阳性信号。定量p c r 技术分析特异性较好，经过实验条件的优化可以分开比较接近的藻( p e n n a , e ta 。 1 9 9 9 ，2 0 0 0 ；g a l l u z z i ，e ta 1 ，2 0 0 4 ；z h a n g ，e f 口f ，2 0 0 2 ) 。但该技术的最大问题在于需 要样品d n a 的高质量纯化，这个问题是该技术的瓶颈。因为很多浮游生物的d n a 纯化效率低，甚至根本就无法进行纯化。另外，定量p c r 技术对实验人员和实验 控制的要求比较高，因此重复性不是很好。由于这些限制，该技术对大规模采样的 分析很难实现，即使实现了其可信度也不会很高。 夹心杂交技术( s h a ) 夹心杂交是d u m a 在1 9 7 7 首次介绍( d u n n , e ta 1 ，1 9 7 7 ) ，并且由r a n k i 在1 9 8 3 年迸一步改进而形成的主要应用于微生物检测的分子生物学方法( r a n k i ，e t a l ，1 9 8 3 ； j a r i ，e la 1 ，2 0 0 3 ) 。目前已成为微藻分析方面的常用方法之一( p a r s o n s ，甜a ，1 9 9 9 ； b r i n k m e y e r ，e l a l ，2 0 0 0 ；o r o b e n , e t a l ，2 0 0 0 ；l a n g e , e t a l ，2 0 0 2 ) 。 1 9 9 6 年，s c h o l i n 等发展夹心杂交技术用于菱形藻的快速检测( s e h o l i n , 甜a ， 1 9 9 6 b ) 。该技术利用生物细胞核糖体r n a 的种属相关性和高拷贝性，根据目标藻 核糖体r n a 序列设计捕获探针和信号探针，将捕获探针固定在固相支持物( 酶标 板，磁珠等) 上，然后在常温条件下与r n a 杂交，接着再与信号探针相结合，最 后通过检测信号探针上的标记信号来达到定性定量分析的目的( 图1 ) ( s e h o f i n , e t a l ， 1 9 9 6 b ) 。夹心杂交技术无需r n a 样品的纯化，操作简单，恒温杂交，所需设备成 本较低，容易实现自动化到目前为止，该研究小组共报道了针对p s e u d o - n i t z s c h i a ， 9 双特异分子探针技术的建立及对十二种常见赤潮藻的检测 h e t e r o s i g r a aa k a s h i w o 和f i b r o c a p s a j a p o n i c a 三种微藻的分析探针，并获得了良好的 实验室和现场检测结果( s e h o l i n , e ta ，1 9 9 6 a , 1 9 9 7 , 1 9 9 9 , 2 0 0 0 ；b a t e s , e ta ，1 9 9 9 ； t y r r