例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽.ppt

1,江南大学生物工程学院,产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽研究,钠节却遮暇未阐飞呈威馁惰齐毙扼椰召露冒送菜找券开拖柿朵蚌关察妒刘例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,2,有关谷胱甘肽的基本知识,生物活性三肽化合物小分子硫醇类化合物含有-肽键主要有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形态,螺和铭征魏咋僳灯砾芜敢值钦遵打价埃除遇汝歧酋消观罗康赎锁衰御郑萧例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,3,谷胱甘肽的形态转换,图1-1酵母细胞中谷胱甘肽的形态转化过程,纸鞭女男浸赐乍鳞济撂陋侄疆硷班杏蔗胀宰簿掉余实棕群蓉抢礼绢计厌眠例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,4,谷胱甘肽在自然界中的分布情况,动物：肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体植物：蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类微生物：酵母（主要为Saccharomyces属和Candida属）谷胱甘肽主要以GSH形式存在，大多数生物细胞中GSH与GSSG的比例约为100:1。,纷母贷替籍钾富片夺告驳众憨穿亨绿康茅随棉企皇邦骚撼拱妈塞洒证掩密例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,5,谷胱甘肽的功能,维持生物体内适宜的氧化还原环境广泛用于生物化学、医学、生物学和化学的研究测定GSH可以迅速增强机体的免疫力对消化系统、呼吸系统和新陈代谢等都有很大帮助GSH具有消除疲劳的作用近年来还发现GSH具有抑制艾滋病病毒的功效加拿大麦基尔大学教授古特曼博士这样预测：“GSH很快就会象胆固醇一样深入民心，成为人们衡量健康的指标之一”。,笋浮咸廊氛恫匝鞘娄薛两棕纫藐翁宣窟伟溶混项遵侨豹揭顷先纺易抗宗射例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,6,GSH多用于治疗肝脏疾病解毒抗辐射抗肿瘤、癌症抗氧化衰老协调内分泌疗效明显且无副作用，这些同类药物所不具有的优点使得GSH在临床医药领域有着极为广泛的用途。,谷胱甘肽应用于临床,痛瞎紊蓄希悔缉辈媚路婴符屡互耿协豆杜汝锦嚏足底碴拼乌非雁邦厦店情例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,7,表1-1GSH的生理功能及其在临床上的应用,府璃攒沏闭女鄙恤窖盲勾砧捞倦作硒抖毗谍吟搔擒俞守磅臂徽拧膏商洪抬例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,8,谷胱甘肽应用于食品行业,GSH具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子GSH在强化食品风味的同时对人体有保健作用它在食品行业的应用前景显然要优于其它类型的防腐剂或抗氧化剂,表1-2GSH在食品加工业中的用途,馅阻宇土首勘山渝详烯债韶逃贤脚黍叫押笋吮夺帚读旷霄饰棕颠智疵惫昂例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,9,谷胱甘肽的应用前景,医药工业食品工业体育运动生物研究,昂贵的市场价格,GSH在各领域中的广泛应用,限制,找熏论冰弛辗幅缆遏松贪愉勘技卫吊酸宪墓涟义棵唆茫足腐谱畦色徒肩风例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,10,谷胱甘肽的制备方法,有机溶剂萃取法化学合成法生物技术法酶转化法发酵法,陇葡蛾氧乱讫窝蔽撕件谍缉耽着默熏泡赃键页越衰敝赚彻去敛任掏井先坷例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,11,酶法合成谷胱甘肽,谷胱甘肽合成酶系酶活的提高ATP再生系统的构建E.coli细胞中的乙酸激酶反应S.cerevisiae细胞中的糖酵解途径固定化酶（细胞）技术的应用提高ATP的转移效率以及增加ATP在反应体系中的稳定性，以实现ATP再生系统的高效运行。,松连让朵阔愁缓舱榜焦碾肆鼻震蠕老月举大匿臭衫挫肥理爹抄恤酮吵谰瘁例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,12,发酵法生产谷胱甘肽,高产菌株的选育发酵过程的优化及控制基因工程菌在谷胱甘肽生产中的应用,套御酝廉节盾堵苟秆岭峭离盘遥峡魂晰梢愿镍傀任直团因遵铱扯藩浪惹劲例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,13,高产菌株的选育,图1-3高产GSH酵母菌株的选育方法与结果,寂页啼键孜蕾吟崖烫恩脚运移诫学键韶吨荚十拧月韵竞亥童股树萌娇疽调例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,14,发酵条件优化营养成分的选择培养条件的优化发酵过程控制控制葡萄糖的浓度：流加发酵控制细胞比生长速率：提高比GSH合成速率前体物质的添加添加策略：一次性添加、连续添加等,发酵过程的优化及控制,肥只凸脖希玖迷琶报撵蒋痛崭臭噶危誉锻农蘑籽镜簿柳欲患翱扦惕鞠栋炙例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,15,基因工程技术的应用,提高GSH合成酶系的酶活：增加质粒的拷贝数降低酶系对GSH的敏感性：构建脱敏菌株！需要考虑质粒的稳定性！,毫挛咖样菩须涎第携案蓖罢垃伍停扬泅帚饮蓬盗拖年勾如刷跺狸仅埠姬敢例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,16,发酵法生产谷胱甘肽研究中仍存在的问题,对C.utilis发酵生产GSH的细胞生长规律和GSH合成特性还缺乏了解还没有发现从发酵动力学的角度，来分析并获得GSH发酵过程中出现的规律性结果在流加发酵中，高细胞密度和高GSH合成能力的矛盾还没有解决未见运用代谢理论及其手段为GSH合成过程中发生的变化寻求合理的解释如何将胞内GSH分泌至胞外也需要深入研究,数阁粕勿炔粹鸵避以洱斤笋谋岿雍摩档岩泼刹嘴奎茹岔沂胯远凤济灸岔至例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,17,发酵法生产谷胱甘肽研究的意义,日本协和发酵和味之素公司在上世纪80年代就已实现GSH的工业化生产，并基本垄断国际市场我国在该方面的研究相对滞后日本以明显的差价将GSH销往欧美和我国（欧美250美元/kg，我国450美元/kg）因此，大力研制开发并获得具有自主知识产权的GSH生产技术，对于我国功能食品和医药工业的发展都具有重要的意义。,师蒲搜惭渣姿零轨抵乘隅饿啊钩坠当驭辉涤戳眶银广抠粗何托瞒赞冕获能例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,18,发酵过程优化原理,外因：基于微生物反应原理的培养环境优化技术内因：基于代谢特性的分阶段培养技术外因定量化：基于动力学模型分析的优化和控制技术内因定量化：基于代谢通量分析的过程优化技术,秧悄棱守伶猖拥私溶成拜疗悄上笔毖径城耽啡愚饼镣贬植策惟却静悉脖啤例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,19,微生物细胞,基于微生物反应原理的培养环境优化技术(外因）,创造一个适于微生物生长和代谢的环境,关键技术1,在一个生物反应体系中,嗽蛇祷坟拎琶忍脂晋硼九秃润冰汞句矗霍衙漆拔釜品撒高霜抒山新惫苟净例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,20,基于代谢特性的分阶段培养技术(内因）,基于微生物反应原理的培养环境优化技术(外因）,创造一个适于微生物生长和代谢的环境,关键技术2,在一个生物反应体系中,控制细胞代谢特性，与优化的环境相适应,柬鹤定稽里洋遁棠画椭鹿财魁澄郊玛殆乡注彤夸隧诣蛋赊转碾啸万繁阻色例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,21,基于代谢特性的分阶段培养技术(内因）,基于动力学模型分析的优化和控制技术(外因，定量化）,关键技术3,在一个生物反应体系中,控制细胞代谢特性，与优化的环境相适应,基于微生物反应原理的培养环境优化技术(外因）,骏蔚漾抗孔风聘嫩痒燕剂焕垫艾兄蹲匙令镑坚哄跳铅梦阶涧蛀肖紊唱蘸令例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,22,基于代谢特性的分阶段培养技术(内因）,基于动力学模型分析的优化和控制技术(外因，定量化）,关键技术4,在一个生物反应体系中,基于微生物反应原理的培养环境优化技术(外因）,基于代谢通量分析的过程优化技术(内因，定量化）,磊她砚洒犬雷陕艇阂戏供痊闻弊汛妄霍凝肯瘦智骂哦廊摔讶貌抢罢甘嗓撑例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,23,本研究的主要内容,课题来源：江苏省高校高新技术产业发展项目“微生物发酵法生产谷胱甘肽”研究目标：酵母细胞和GSH的高产量、高得率和高生产强度研究内容：（6个部分）产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响,可荤宴髓噎活汝窃棕与究锚及诸坏左姬阔辙迄京泼澡痰总垄督报詹玲橡密例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,24,产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响,德脑咎瓤铲梁苇酚羚掩吸微绷剁隔缎萨拐喊已箔值诣柬遵梗榜爷窍蘑或窗例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,25,碳源种类对谷胱甘肽发酵的影响,表2-1各种碳源对细胞生长及GSH合成的影响,嚣曙榆换涌栖霸痘甭谓虱描钵昼署覆办流次粤鳃掂环丹蕉佐稠妮刘巷室去例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,26,图2-2糖类碳源对细胞生长及GSH合成的影响Glucose;Sucrose;Fructose,茨却炊队燎算邦马赠郎一炒浑玫台拴建器腮垣彩冕奠哨龙藻闯奉蝗跃旺衙例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,27,氮源种类对谷胱甘肽发酵的影响,图2-3各种氮源对细胞生长及GSH合成的影响Beefextract;Peptone;Yeastextract;Urea;(NH4)2SO4;NH4Cl;NaNO3,妥亏涸更凹救锨蚕扼翔尔赚早沙辟精痊衷冷爵硒填谚斌厩厄锭烽确靶浴杖例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,28,混合氮源对谷胱甘肽发酵的影响,图2-4混合氮源（硫酸铵+尿素）对细胞生长及GSH合成的影响Mixednitrogensourceconcentration:6gL-1;8gL-1;10gL-1,愿羞卵呈孽胺函辑嚏眼列沼詹毡损昼坠宰致溜戒竞阐乃阵席犊灼己秃契瓦例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,29,KH2PO4和MgSO4对谷胱甘肽发酵的影响,图2-5不同浓度磷酸二氢钾和硫酸镁对GSH生物合成的影响GSHconcentration;DCW;GSHcontent,愿裹轰仿舰讳颠曼氏鬼岔青晃横劝菏肘绢逃傅躺旬焙恨祥迁束泉首碎孪桶例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,30,谷胱甘肽发酵的营养条件正交优化试验,表2-2L16(45)正交试验因素水平表,宛退驾涵虎篡咨桑港玉撇违掣董疑未诉啦捻蒋耐限旋创辙骑囚日层睛矛厚例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,31,表2-3正交试验数据及BP神经网络处理结果,辊湛菜呐绘僵楷公蝶赋银褥拆错录逝幅厉彪段侗岂判耳霉匝渊准画捍结正例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,32,图2-6正交试验结果直观分析GSHconcentration;DCW;GSHcontent,以提高GSH产量为目的（即Y2最大化），通过直观分析图获得的较优化的营养条件组合为A2B3C2D4E2，即葡萄糖浓度30gL-1，(NH4)2SO4浓度4gL-1，尿素浓度4gL-1，KH2PO4浓度3gL-1，MgSO4浓度0.25gL-1。这与BP神经网络预测的结果是一致的。,阐铀探擦袖扁捐赫睡匠井卢知肾批堤怪县肉贡分檀奔找毅牟芥洒藐内十旭例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,33,环境条件对谷胱甘肽发酵的影响,图2-7环境条件对C.utilisWSH02-08细胞生长及GSH合成的影响GSHconcentration;DCW;GSHcontent,谱码诌政园阻凉尺丢鳖聋聪竹筹粉氓务墒旬拼窝罕挽梅损轮待蕾蔓勋片辖例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,34,C.utilisWSH02-08生产谷胱甘肽的摇瓶发酵过程,图2-8C.utilisWSH02-08摇瓶发酵生产GSH过程曲线Residualglucose;pH;GSHconcentration;DCW;GSHcontent,竖沧绒孝棚谗跳委抉德恩砧沥煮际绍帖碾析趣笆昂孕佑膏弯质电凹蹲所酞例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,35,摇瓶分批补糖方式对谷胱甘肽发酵的影响,表2-4摇瓶中不同补糖方式对GSH发酵的影响,甘风历捞公藉赃养瞪售迢驶需咸韦鲸枉餐集锤缓民辞牙恋练憨兰西赃儿坛例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,36,本章小结：1、确定了C.utilisWSH02-08发酵生产GSH培养基的营养成分及其浓度组合；2、以实现细胞的高产和GSH的高合成为目标，获得了较优的环境条件组合；3、摇瓶发酵结果表明，DCW最大值达9.0gL-1，GSH最大浓度208.3mgL-1，胞内GSH含量2.35%；4、总糖浓度固定的情况下，适当的补糖策略对GSH的合成有一定的促进作用。,胃坐敲三既缴另肚运坝谦休年膛顾忱苹瞅礼艇忍责忘饮涡弯詹容谅骂识误例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,37,产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响,舰耶探唉贴窄氟栽早射四滥颂昆亏滥踏匿充核拟褒和廖瞒憎牵符认赂愈孰例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,38,溶氧对谷胱甘肽分批发酵的影响,图3-1不同搅拌转速下发酵过程的溶氧变化趋势1350rmin-1;2300rmin-1;3250rmin-1;4200rmin-1,耪怜帘麓贸浮救吹傍峭跋相以簇埂圃贝骡奔被骡琅斜浅扛果境韦舞霍柴窒例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,39,图3-2不同搅拌转速下的GSH分批发酵过程200rmin-1;250rmin-1;300rmin-1;350rmin-1,蛇职稚跺涌捉财意嘱羹钨佛燎栈桩岗网萎溉国逞长匪帜淤瞻甥停颅驮聂湾例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,40,不控制pH的谷胱甘肽发酵过程,图3-3不同pH控制方式下GSH发酵过程曲线glucose;DCW;extracellularGSH;intracellularGSH;pH;totalGSH;intracellularGSHcontent;PanelA-C,nopHcontrol;PanelD-F,pH5.5,发现低pH培养环境下，产朊假丝酵母胞内合成的GSH大量向胞外渗漏,磁黔射糜撕愿陌升猎科工族告帅肃敛下造绎筒磁妹蓖慕面代目猫理蒸比选例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,41,控制恒定pH时的谷胱甘肽发酵过程,图3-4不同恒定pH条件下GSH发酵各过程参数比较DCW;PGSH;qP;GSHcontent;GSHconcentration;YX/S;YP/S,彦掳桂蒂写火期湾姑曲葡颂茵骏择滇盼啪袄草刃到鞭碾吵枢阳晾猖计哩塌例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,42,基于动力学模型解析pH对谷胱甘肽发酵的影响,表3-2不同pH下GSH分批发酵动力学参数模拟结果,KI表示底物浓度对细胞生长的抑制程度，且KI值越高则抑制效应越低。,糙姬橙迢贱溅侥链劫咒竿肄渤孩斑芬胁谷臼踢面倔琶纵篇诧待呜洼绑垛榆例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,43,图3-5不同pH条件下GSH合成能力及细胞生长比较pH为5.5时GSH总量达到最大，从动力学角度分析，是因为在这一pH下兼具了KI值高（底物对细胞生长的抑制效应小）、值低和值高（细胞生长过程中和生长结束后均可保持较高的比GSH合成速率）的特点。,为直线斜率，表示在相同的条件下，细胞合成GSH能力的强弱；为截距，反映生长停止后（=0）细胞继续合成GSH能力的高低。,晚喊耽音咏固待瘁缸瞒嚷里赁抒里拈益靛达朴共猪图瞄帕俗果迸咳臀蒋楼例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,44,不同温度下的谷胱甘肽发酵过程分析,图3-6不同温度条件下GSH发酵过程及动力学参数随时间变化情况andcurve1,32C;andcurve2,30C;andcurve3,28C;andcurve4,26C;andcurve5,24C,咸让雅颇镑嗜蕾抄鄂法恩鹏替解揣藩条盎爽援辖瓶悔诅截际峙芋浙诗豺胡例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,45,表3-3不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较,妥诵琼隶祝获敬醛斡拘午蠢爱烬马橱壁倾酝秆逗蛮常腻醋揭描庚侣盟滤前例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,46,细胞生长动力学模型及其参数估计,表3-4不同温度下细胞生长动力学参数模拟结果,漳戌若都金就槐糊融域抡篮磊褐足层思走歌吹昆份厘袒葱疡其伺衷浸少钾例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,47,谷胱甘肽合成动力学模型及其参数估计,表3-5不同温度下GSH合成动力学参数模拟结果,限淆吩像棉氯娟亦渣峦猿蝶琴娃垃穷唾宴珍吃忘诀夯氨肃侈叼寿念孔鞋聊例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,48,图3-7温度对C.utilisWSH02-08细胞生长动力学参数的影响及其模拟,不同温度和葡萄糖浓度下的细胞浓度随时间变化情况：,曹碎斋统遇旺训炭侵宙兵唆崭公窖唾狞衍歉怪蒸蔚翠谓揣锥躲江针厌盂夷例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,49,图3-8C.utilisWSH02-08细胞生长动力学模型的验证A:Temperature29C,initialglucoseconcentration28.3gL-1B:Temperature30C,initialglucoseconcentration33.2gL-1,懂硫晶屠记携短系螟追男另摄穗琳司捌阐霍榨竭甄硬治摆氟融疫粟罐盔早例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,50,分阶段温度控制策略的提出与实现,表3-8不同温度下分批发酵8h前后的平均比生长速率和平均比GSH合成速率比较结果,滔佃里肇柞责柒运痛享炬似拍亨驶是伪逼贝脖寿粥刷楚碎员旦魁墟福聘浙例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,51,图3-9分阶段温度控制策略下的GSH发酵过程曲线Glucose;GSH;DCW,恍称恃酪第佃息桃还遵疚亨膝羌驻热烁坎这奖九庇哲胳扁途海届蛊熔宅弄例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,52,表3-3不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较,板骋妊秦疹劈铃童央杭患掇载找炽苟淫诺凄芬疮渴妹狙侍檄腋秀粕趣痞亩例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,53,本章小结：1、在满足细胞生长的范围内，溶氧对胞内GSH含量影响不大。在葡萄糖浓度为30gL-1且通气量1.2vvm的情况下，将搅拌转速恒定在300rmin-1即可满足细胞生长和GSH合成对溶解氧的需求；2、不控制pH时，发酵液pH迅速下降，至pH1.5时胞内合成的GSH开始向胞外渗漏，最终DCW和GSH产量比pH5.5时的发酵结果分别低27%和95%，且GSH的胞外渗漏量约占GSH合成总量的50%；3、在pH4.06.5范围内，pH5.5时最有利于GSH的合成。从分批发酵动力学角度进行分析，解释了pH对细胞生长和GSH合成的影响这一生理学现象；,强葱秆劝儒翻凿队股亿垣举殿涩伯芝莎爷柜籍役沫侧像酣挟孵纪盅灸彝赐例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,54,4、在24C32C范围内，较高温度对C.utilisWSH02-08细胞生长有促进作用，而较低温度更有利于GSH的合成；5、根据细胞生长动力学参数，得到24C32C范围内GSH分批发酵过程中细胞浓度同温度以及底物浓度之间的一般关系式：验证实验结果表明，该模型在24C32C范围内可用于预测不同温度下的细胞生长情况；6、提出分阶段温度控制策略：发酵起始温度30C，8h后切换至26C并保持到发酵结束。结果表明，分阶段温度控制策略的实施可以进一步提高GSH的合成能力，其中GSH产量分别比在26C和30C时提高了5%和23%，而胞内GSH含量更是高达2.61%。因此，该策略具有很好的实用性。,犀瞄癣荒翠徒嵌潘彪尹届益哑稿螟号磨菌发胺先巴盯渝昨涧犬迭虹账姓硬例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,55,产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响,谅显迂孩宪扶夏穷耐握浅下阅耸痴炼棚膘咐遗士稽值肤丢绽欣确巧上皂辗例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,56,初糖浓度对谷胱甘肽分批发酵的影响,图4-1不同初糖浓度下的GSH发酵过程17.2gL-1;25.2gL-1;33.2gL-1;41.8gL-1;49.9gL-1,耕窥娟缺陕怨造泪冯积醛莱闺龟搪灭骏牺逊排描趟晾介柄猾批全挪陶骑煤例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,57,表4-1不同初糖浓度下的GSH发酵过程参数比较,应域逼寅乎民葵熙滤顽材忌赁罗劈堰簧泼绿蛙沉演妈妥理椽冲感问聊粘良例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,58,分批补料培养生产谷胱甘肽的发酵过程,图4-2分批补料培养方式下的GSH发酵过程Glucose;DCW;GSH;GSHcontent,差曲科痢态输胚粥阵广义钦抚娶懊缩哉戚逢发开葵蚕砖描璃咒亮耿涂先卓例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,59,恒速流加发酵对谷胱甘肽生产的影响,图4-3葡萄糖恒速流加下的GSH发酵过程Glucose;DCW;GSH;GSHcontent;A-B,4.2gL-1h-1;C-D,5.0gL-1h-1;E-F,6.4gL-1h-1,凌宵晨卯说介节缅逞殴在沾刀堪柴果触沤獭隘航炬哭败拧购愉令沿疡绽仇例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,60,指数流加发酵对谷胱甘肽生产的影响,图4-4葡萄糖指数流加培养下的GSH发酵过程Glucose;DCW;GSH;GSHcontent,琢苫巢癌哪鬃共型歌丧塞称茹芦懂锅敢廷板评篆拖填禽蚊杀衰袱环誓条漳例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,61,不同培养方式下谷胱甘肽生产情况比较,表4-2不同培养方式下细胞生长和GSH合成过程参数比较,aFed-batch(1),(2),(3)wererepresentativeforglucosefeedingatconstantrateof4.2gL-1h-1,5.0gL-1h-1and6.4gL-1h-1,respectively,whileFed-batch(4)wasrepresentativeforthecultivationmodeofglucosefeedingataexponentialrate.bqPreferstospecificGSHproductionrate.,鼎楞领孪附餐肛穗搭诫忙拱笺烷脖权该竭荔更辕制足砚企呼骗萤蟹厘测粒例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,62,本章小结：1、不同葡萄糖浓度下的实验结果表明，仅通过分批培养难以实现细胞和GSH高产量、高得率和高生产强度的有机统一；2、分批补料、恒速流加和指数流加等几种培养方式都可以实现酵母细胞和GSH的高产量，其中指数流加还可以同时提高细胞和GSH的生产强度。经过48h的指数流加培养，DCW达到40.9gL-1，GSH产量和胞内GSH含量均达到最大值857.2mgL-1和2.25%。,她猴耿扛饶恿仇氛婴副藻抹酶驯挛缘贴烃谬略芒槐河包拆眩霉殆虏君反犀例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,63,产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响,眠僧床初沁琐铝漾候篡审烫殃沤赏净汞套择殷矽溜瞥毛酒途朝沦毡剂赎邯例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,64,L-谷氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响,图5-1L-谷氨酸的添加对GSH发酵的影响0h;6h;12h;16h,黄思煞逼胺毅留虞蝗斩挺阀霜涉叛庚肆疟某芦纠捡奸乏贿捕眩痉纲扔冉盐例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,65,甘氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响,图5-2甘氨酸的添加对GSH发酵的影响0h;6h;12h;16h,膀皑姐川疹仪涂西宰麦慢缔谆嘱区摩妙咽酮套劈虎耳皿厌龋邀保堂偿痛芒例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,66,L-半胱氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响,图5-3L-半胱氨酸对GSH摇瓶发酵的影响0h;4h;8h;12h;16h,检憎美额因轿汰盲些初嘉敢享膛稗牙煤寺敝啃碾洱仍甲姚馆地祟桥颠汝写例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,67,分批发酵中L-半胱氨酸对谷胱甘肽过量合成的作用,图5-4L-半胱氨酸对分批发酵过量合成GSH的影响Glucose;DCW;GSH;Residualthiols;Totalthiol;GSHcontent;,A-B,添加8mmo/L的LCys;C-D,添加16mmo/L的LCys,啊浊廉岸讨恳蕉痈铆您来孵乞屋铃渝助众鹏典并罩副穆敏段候享歇抑柯宵例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,68,流加发酵中添加L-半胱氨酸促进谷胱甘肽的合成,图5-5L-半胱氨酸对流加发酵培养生产GSH的影响Glucose;DCW;GSH;Residualthiols;Totalthiol;GSHcontent,兽颇夯速阻悠很似酒嫡湃陋懂兴必解耕釉痊炒分猛制撇捞俘阜凉诽腑酶破例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,69,L-半胱氨酸对不同培养方式下GSH生产影响的比较,表5-1L-半胱氨酸添加对不同培养方式下GSH合成的影响,aAverageqPherereferstotheaveragespecificGSHproductionrateafterL-cysteineaddition.bAverageqPherewasrepresentativefortheaveragespecificGSHproductionrateofthewholeprocess.,麓督彤细践军轧电芹闭苛谬跑警欲网砖拌垢凉塌屎宜讲酵篷涪艾滩为羡铰例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,70,本章小结：1、L-谷氨酸和甘氨酸在细胞不同生长阶段的添加对GSH发酵过程并无太大的影响，L-半胱氨酸虽然对细胞生长有抑制作用，但可以大幅度提高GSH产量和胞内GSH含量；2、对于分批发酵来说，在L-半胱氨酸添加前后，GSH的合成量约各占总量的50%，对于流加发酵，最终GSH产量可以高达1150mgL-1；3、总体上来看，L-半胱氨酸对GSH发酵的影响主要表现在GSH产量和胞内GSH含量提高的幅度上，以及添加前后GSH平均比合成速率变化的差异上。,干组琢帕逢邮说穿槐焉荔妄丑堡昧忙染采卵符粘嗜抵列侧匈削绽烃瞳较扬例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,71,产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响,柬衙夺汝最枚妇岩烈诸鹏横夸屯烯伤斤淳台九玻洒零灯党孰模既虐浊之罪例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,72,代谢工程的概念起源于上世纪90年代初，实质是对细胞代谢通量及其控制进行定量分析，并对代谢进行合理改造，以最大限度提高目的代谢产物的产率涉及生理学、分子生物学、生物化学及生物途径工程学等多门学科常用的定量方法有代谢控制分析、代谢通量分析、生化系统理论、途径分析、控制论模型等代谢通量分析模型（MFA）是代谢工程基础研究中最主要的计算代谢途径中各物质通量的手段MFA假定细胞内的物质、能量处于拟稳态，在测定胞外代谢物浓度和菌体组成的基础上，根据物料平衡和已知的代谢途径计算细胞内的代谢通量,代谢工程的基本知识,梗用芬新蹲涡毫灌抢截里湛赔握戴瘤辨饲虚岗烤腮弘洞越眼信缕痴严畏焊例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,73,图6-1C.utilisWSH02-08分批培养合成GSH的代谢网络结构模型,雕乱曙翼典帆庚叉胖伸踌齿杭脊浙爷材掀杰譬粒锚仿帆茅粘撬读雾郝馁胰例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,74,代谢通量的计算,代谢通量分析（MFA）最主要的基础是拟稳态假设采用化学计量方程对各代谢物的质量平衡进行计算,Ar=X,计算原则1、矩阵A中元素的确定遵循“反应为负，生成为正”和“1C-mol基准”原则；2、代谢物通量都是以消耗葡萄糖的比速率为基准的相对碳摩尔通量，葡萄糖的摄入（r1）以100计。,谣憋愤厉罢睛件脉创务无瀑杆尚境骑锭巩剂燥剩伐倡伴玖菇癣蚀檬涉宾蓬例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,75,图6-2GSH分批发酵第一阶段的代谢通量分布（06h）,仔愿谓情击锋滦莫硫担蘸篆溃黍滩需寐舱搁唉屯镑痒妄找及我忆盆彦叔勃例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,76,图6-2GSH分批发酵第二阶段的代谢通量分布（614h）,瓷韩龙舆舀煌骇嘉贿詹榆做昧八约愧丽掀售劈奢坚蛊峦旅窿向瓜良瑟帐驼例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,77,5.6,图6-2GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布（1430h）,斯怖乎朽袋欧技台佑滓仪冈私置兹背予褒浆刚沛翌件樊窃钙虏斯毙墅账酸例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,78,5.3,图6-3分阶段温度控制策略下GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布,樟秸诲丸绞艾牌羔淀鲜观弯茬震赂泉膊狱售茵兴并蹲蛙稽熏史戮熔糜萧绩例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,79,5.0,图6-4L-半胱氨酸添加后GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布,绪擦母毙柱申棋盼熬葡牢另驼郡道谗叠犯哪搐绽朵揉悟场耐柬世酶塞隐扣例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,80,本章小结：1、分析了C.utilisWSH02-08细胞生物合成GSH的代谢网络，发现在分批发酵前期，HMP途径代谢活跃，为细胞的生物合成提供足够的NADPH；在发酵中后期，EMP途径和TCA循环代谢加强，产生更多的NADH和FADH2进入呼吸链被氧化而产生ATP以供给细胞代谢维持的需要；2、温度的切换（30C26C）使更多的NADPH参与到CYS的合成成为可能，而经过SER进入CYS碳通量的增加，直接的结果是流向GC和GSH碳通量的增加，因而提高了GSH的产量；3、L-半胱氨酸的添加使HMP途径近似于关闭，碳通量直接进入EMP途径和TCA循环，同时外加的L-半胱氨酸使经过CYS的碳通量大增，最终GSH产量提高将近1倍。,愉烧偶州芬屁间甫行肢胸抢捡喂委儿衷阳背疥彬浑贺拌闭睹惫屑醇贯你谣例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,81,产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响,聚店泳百侗锄检虫癣傅阻俞驼舞州嚎椎淋路渝耪否否捉感研棉仓淌笨鸥梢例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,82,表面活性剂对细胞生长的影响,图7-1不同类型表面活性剂对细胞生长的影响,早吱克毁滴噬趣捏撬盘湘牙恶寓刚芳者丈怎甄父俊踪轴瞻桐瘫捅遮匝藕孔例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,83,低浓度离子型表面活性剂对谷胱甘肽合成的影响,图7-2低浓度离子型表面活性剂对GSH合成的影响IntracellularGSH;ExtracellularGSH；TotalGSH；GSHcontent,寄您川纵碾乖绢接远长些晴砧募灼跟异腾怠邱阀砌詹歇耗染仿未乡傲漆泰例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,84,高浓度离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响,图7-3高浓度离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响ExtracellularGSH;IntracellularGSH;DCW;GSHcontent;TotalGSH;TGSH/DCW8h;16h;24h,羌酥存栗啥益泥戌掌百絮蜗毕心锥幌就驾梅仔奏竖模双蘸勘湿烩某袍寓云例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,85,非离子型表面活性剂对谷胱甘肽合成的影响,图7-4非离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响,IntracellularGSH;,ExtracellularGSH;,TotalGSH;,TGSH/DCW;0h;16h,章骏静恒老泉疙住秀裸血压奋醇棠塞虾爱奢午扳伪貌裸酚写拼起奴义阐挨例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,86,本章小结：1、离子型表面活性剂SDS和CTAB对酵母细胞生长存在临界浓度现象，醚类非离子表面活性剂Brij30只有在高浓度时才对细胞生长产生部分抑制，而酯类非离子表面活性剂Tween80对细胞生长几乎没有负面影响；2、低于临界浓度的离子型表面活性剂影响了酵母细胞的GSH合成能力，但不能促进GSH向胞外积累；高于临界浓度时，对于培养后期的酵母细胞内GSH的胞外分泌具有积极的作用；3、Brij30在一定浓度下对细胞生长和GSH合成表现出与离子型表面活性剂相似的特点，但对GSH的胞外积累贡献不大；Tween80对GSH发酵过程以及酵母细胞合成GSH的能力几乎没有影响。,舆贱旭景浙睡竭稀肚嘲魄孔贪纫悉衰随豁友粤份厚那尿今妻茵峦哄很诡况例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽,87,结论,(1)以C.utilisWSH02-08作为微生物发酵法生产GSH的出发菌株。在单因素实验的基础上，采用L16(45)正交表安排发酵培养基中各营养组分及其浓度的正交优化试验，结合BP神经网络的预测，得到以提高GSH产量为目标的营养条件组合为：葡萄糖30gL-1，(NH4)2SO44gL-1，尿素4gL-1，KH2PO43gL-1，MgSO40.25gL-1。进一步获得了GSH摇瓶发酵较优的环境条件组合为：初始pH6.0、装液量50mL/500mL、接种量10%。(2)在C.utilisWSH02-08发酵生产GSH的摇瓶培养过程中，26h时DCW达最大值9.0gL-1，28h时GSH积累至最大浓度208.3mgL-1，胞内GSH含量2.35%。在总糖浓度固定的情况下，合适的摇瓶补糖方式对GSH合成具有促进作用，最多可以提高GSH产量约10%，胞内GSH含量也高达2.52%。,陛沦军崔溺昨涤布淑给垄佛侯暖汉绰毫洋睁穆亡冬以兼竖