（药物分析学专业论文）四逆汤化学成分的测定及毒性分析.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语5 三、论文 论文一9 材料与方法9 实验结果1 0 论文二1 5 材料与方法1 5 实验结果1 6 论文三2 6 材料与方法2 6 实验结果2 9 讨论3 2 结论3 3 四、本研究创新性的自我评价3 4 五、参考文献3 5 六、附录 综述3 6 在学期问科研成绩4 2 致谢4 3 个人简介4 4 中文论著摘要 四逆汤化学成分的测定及毒性分析 目的 四逆汤是东汉张仲景伤寒论之名方，是备受历代医家推崇的温里回阳救 逆代表方，具有回阳救逆，温中祛寒之功效。主治阳虚欲脱、脉微欲绝等症。其 配伍得当，疗效确切，是现代中药研究的重要方剂。本课题对四逆汤中的乌头碱 类化学成分和微量元素进行了测定，并对四逆汤的毒性进行了测定及分析。 方法 采用高效液相色谱法建立了四逆汤中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱三种活性 成分的含量测定方法；采用火焰原子吸收光谱法建立了四逆汤中1 0 种微量元素的 含量测定方法；对四逆汤的毒性进行了测定，并利用p l s 回归分析统计方法建立 了乌头碱类化合物q s t r 的模型。 结果 确定了四逆汤中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱三种活性成分的含量测定方法， 四逆汤中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的含量测定液相色谱条件：色谱柱：测定 采用e c l i p s ex d b c 1 8 色谱柱( 4 6 1 5 0 m m ，5 9 m ) ；流动相：甲醇0 1 三乙胺 ( 6 5 ：3 5 ) 为流动相；流速为1 0 m l m i n ；检测波长为2 4 0 n m 。在此条件下，乌头 碱、新乌头碱和次乌头碱与其它成分达到基线分离。测定结果表明乌头碱在 o 1 2 0 4 6 0 2 9 9 范围内呈良好线性关系( 产o 9 9 9 7 ) ，平均回收率为1 0 0 7 4 ；新 乌头碱在0 0 4 1 2 - - - 2 0 6 9 9 范围内呈良好线性关系( r = 0 9 9 9 5 ) ，平均回收率为 9 9 9 ；次乌头碱在0 0 8 0 8 - - 。4 0 4 9 9 范围内呈良好线性关系( f o 9 9 9 9 ) ，平均回 收率为1 0 2 9 。采用火焰原子吸收光潜法建立了四逆汤中1 0 种微量元素含量的 测定方法。对四逆汤的毒性进行测定，采用q s t r 模型对鸟头碱类化合物的毒性 进行了预测，结果表明该模型预测能力较好。 结论 本研究测定了乌头碱、新乌头碱、次乌头碱三种活性成分的含量，同时测定 了四逆汤中l o 种微量元素的含量，从而可以更好的对四逆汤进行质量控制；质量 控制方法简便、准确、精密度和准确性均良好。对四逆汤毒性进行了测定，利用 p l s 回归分析统计方法建立了乌头碱类化合物的q s t r 模型，结果表明该模型预 测能力较好。 关键词 四逆汤乌头碱新乌头碱次乌头碱微量元素含量测定高效液相色谱法 原子吸收光谱法q s t r 英文论著摘要 t h ed e t e r m i n a t i o no fc h e m i c a lc o n s t i t u e n ta n dt h e a n a l y s i so ft o x i c i t yi ns in it a n g o b j e c t i v e s in it a n gi sr e p r e s e n t a t i v ep r e s c r i p t i o nf o rr e s t o r i n gy a n g w h i c hi sv e r yf a m o u s i ns h a n gh a nl u nw r i t t e nb yz h o n 舀i n gz h a n gi nt h ee a s t e r nh a n m a n ys u c c e s s i v e d y n a s t i e su s ei ta sp r e s c r i p t i o n sf o rd i s p e l l i n gi n t e r n a lc o l d i tc a i lb eu s e df o rr e s t o r i n g y a n g a n d d i s p e l l i n gc o l d m a i n l y t oc u r e y a n gd e f i c i e n c y a n dc o n d u i t s r i s k c o m p a t i b i l i t ye x p e d i e n ta n dc u r a t i v ee f f e c t i ti sv e r yi m p o r t a n tp r e s c r i p t i o nf o r t h es t u d yo fm o d e mc h i n e s em e d i c i n e t h et o p i cw i l ld e t e r m i n ea c o n i t i n ec h e m i c a l c o m p o s i t i o na n dt r a c ee l e m e n t so fs in it a n g d e t e r m i n et o x i c i t ya n da n a l y s i s m e t h o d r p - h p l cm e t h o d sw e r ed e v e l o p e da n dv a l i d a t e dt od e t e r m i n ea c o n i t i n e ； m e s a c o n i t i n e ；h y p a c o n i t i n et h r e ea c t i v ec o n s t i t u t e n ti n s in it a n g t h ec o n t e n t so f t e nt r a c ee le m e n t si n s in it a n gw e r ed e t e r m i n e db ya i r - a c e t y l e n ef l a m ea a s d e t e r m i n et o x i c i t yi ns in it a n g ，u t i l i z ep l sr e g r e s s i o na n a l y s i ss t a t i s t i c a lm e t h o dt o e s t a b l i s hq s t rm o d e l r e s u l t t oe s t a b l i s ht h eh p l cm e t h o df o rs i m u l t a n e o u sq u a n t i f i c a t i o no fa c o n i t i n e ， m e s a c o n i t i n ea n dh y p a c o n i t i n ei n s in it a n g d e t e r m i n a t i o no fs in it a n gi nt h e c h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n s ：c h r o m a t o g r a p h i c c o l u m n ： e c l i p s e x d b - c i8 ( 4 6 x 1 5 0 m m ，5 “m ) ；m o b i l ep h a s e ：m e t h a n o l w a t e r - t r i e t h y l a m i n e ( 6 5 ：3 5 ：0 1 ) ；t h e f l o wr a t ei s1 0m l 。m i n _ ；t h ew a v e l e n g t hw a ss e ta t2 4 0 n m i nt h i sc o n d i t i o n ，f o r a c o n i t i n e ，m e s a c o n i t i n ea n dh y p a c o n i t i n e ，t h el i n e a rr a n g e sw e r eo 12 0 4 6 0 2 p g ( r = o 9 9 9 7 ) ，0 0 4 1 2 - - 2 0 6 儿g ( r = 0 9 9 9 5 ) a n d0 0 8 0 8 - 4 0 4 “g ( r = 0 9 9 9 9 ) ，a n d t h e i r 3 a v e r a g er e c o v e r i e sw e r e 10 0 7 4 9 9 9 a n d10 2 9 t h ec o n t e n t so ft e nt r a c e e l e m e n t si n s in it a n gw e r ed e t e r m i n e db ya i r - a c e t y l e n ef l a m ea a s d e t e r m i n e t o x i c i t yi n s in it a n g ，d e t e r m i n et o x i c i t yi n s in it a n g ，u t i l i z eq s t rm o d e lp r o t e s t t o x i c i t yf o ra c o n i t i n ec h e m i c a lc o m p o s i t i o ni n s in it a n g t h er e s u l t ss h o w e dg o o d p r e d i c t i v ea b i l i t yo ft h em o d e l c o n c l u s i o n t h ed e t e r m i n a t i o no ft h r e ee f f e c t i v ec o m p o n e n t sa c o n i t i n e ；m e s a c o n i t i n e ； h y p a c o n i t i n ei ns in it a n g m e a n w h i l et h es t u d ya l s oe s t a b l i s ht h ed e t e r m i n a t i o no f t e nt r a c ee le m e n t si ns in it a n g t h em e t h o di sh o m e l ya n da c c u r a t e p r e c i s i o na n d a c c u r a c yi sg o o d d e t e r m i n et o x i c i t yi n s in it a n g ，u t i l i z ep l sr e g r e s s i o na n a l y s i s m e t h o dt oe s t a b l i s hq s t rm o d e lo fa c o n i t i n ec h e m i c a lc o m p o s i t i o ni n s in it a n g t h er e s u l t ss h o w e dg o o dp r e d i c t i v ea b i l i t yo ft h em o d e l k e vw o r d s s in it a n g ；a c o n i t i n e ；m e s a c o n i t i n e ；h y p a c o n i t i n e ；t r a c ee l e m e n t ；q u a l i t y c o n t r o l ；h p l c ；f l a m ea a s ；q s t r 4 英文缩略语 英文缩略英文全称中文全称 h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱法 r s d r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n 相对标准偏差 q s t r q u a n t i t a t i v es t r u c t u r e - t o x i c i t yr e l a t i o n s h i p 定量结构毒性关系 p l s l d 5 0 m t d p a r t i a ll e a s ts q u a r e sr e g r e s s i 。n 偏最小二乘回归分析 m e d i a nl e t h a ld o s e t h em a x i m a lt o l e r a n c ed o s e 半数致死量 最大耐受剂量 5 论文 四逆汤化学成分的测定及毒性分析 刖吾 休克是临床上常见的一种急危重综合征。其病因各异，病理生理变化复杂， 病情表现不一，来势往往迅猛，故需及时识别立即采取果断措施，否则病人的预 后将极为险恶【l 】。四逆汤是东汉张仲景所创的名方，始载于伤寒论，由附子、 干姜和甘草组成。本方用药精简，疗效卓捷，具有温中祛寒，回阳救逆之功【2 1 ， 是l 临床是治疗休克的常用药物。现已证实四逆汤中的乌头类生物碱既是其强心作 用的主要有效成分又是其毒性成分【3 】。中药的药理作用不仅与其化学成分有关， 而且与它们所含有微量元素的种类及含量的多少密切相关【4 1 。因此，对四逆汤中 乌头碱类化学成分和微量元素进行测定，以及对毒性进行测定和分析都是亟待深 入研究的重要课题。 一、四逆汤中化学成分的研究概况 文献报趔5 j o 】采用离子对萃取分光光度法、薄层层析紫外分光光度法、h p l c 等方法对四逆汤中的有机化学成分进行了分析。发现四逆汤中的主要化学成分为 乌头类生物碱、甘草酸、甘草次酸及姜酚类成分等。 二、中药中微量元素研究概况 微量元素是对于常量元素而言的。到目前为止，在人体中检测出的微量元素 已达5 0 余种。人体必需的微量元素有f e 、m n 、c u 、z n 、s e 、c r 、i 、c o 、m o 、 f 、n i 、s n 、s i 和v 。虽然人体中必须的微量元素含量极低，但在生命过程中所起 的作用却极人【l l 】。中药巾含有大量的微量元素，要保证中药材、中成药的安全有 效，就必须依赖于对中药的质量控制，我国近年来的中药质量控制虽然在理化分 析测试方i 酊有了长足的进步，但是由于中药本身的复杂性、可变性及多样性。现 有的质量监控体系已经远远不能适应形式的发展和困际竞争的需要。对中药中的 6 有益微量元素进行测定，并且对重金属类的微量元素加以控制是今后中药质量控 制的发展趋判12 1 。 三、四逆汤毒性研究概况 四逆汤中的毒性成分存在于君药附子中，乌头碱等双酯型生物碱具有很强的 药理活性和毒性，乌头碱v 1 服3 4 m g 即可中毒死亡，原因是乌头碱可以直接损害 心肌细胞，使心肌细胞通道丌放，加速内流，促使细胞膜去极化，提高自律组织 快反应细胞的自律性，导致心律失常【1 3 1 5 】。 四、立题依据 四逆汤是东汉张仲景伤寒论中回阳救逆的代表方。本方以附子为君，温 阳散寒，回阳救逆。干姜为臣，温中散寒，助附回阳。佐甘草，甘缓益气，又制 附子之毒性。主治少阴病的四肢厥逆，恶寒倦卧，吐利腹痛，下利清谷，神疲欲 寐，口不渴，脉沉或细数欲绝，以及误汗、误下之亡阳证【16 1 。在临床中广泛应用 于各种原因引起的休克。四逆汤中的乌头碱类化学成分既是其活性成分，也是其 毒性成分。本研究是为了更好的控制四逆汤的质量，合理指导临床用药。采用高 效液相色谱法，对四逆汤中的活性成分乌头碱类化学成分乌头碱、新乌头碱和次 乌头碱进行含量测定；采用原子吸收光谱法对四逆汤中的1 0 种元素进行测定；测 定四逆汤的毒性，建立了乌头碱类化合物的q s t r 模型。 仪器与试剂 高效液相色谱仪( 1 2 0 0 型)安捷伦科技有限公司 e c l i p s ex d b c 1 8 色谱柱安捷伦科技有限公司 u v - 1 2 0 0 紫外分光光度计上海仪器有限公司 乌头碱对照品( 11 0 7 2 0 2 0 0 4 1 0 )中国药品生物制品检定所 新乌头碱对照品( 7 9 9 9 4 0 3 )中国药品生物制品检定所 次乌头碱原料药( 7 9 8 9 4 0 3 )中国药品生物制品检定所 s b 2 5 1 2 0 超声清洗器宁波新芝生物科技有限公司 高速离心机科大创新股份公司中佳分公 百l 高速万能粉碎机 精密电子天平 三乙胺( 分析纯) 附子、干姜、甘草 t a s 一9 9 0s u p e r 型原子吸收分光光度计 铅、锰标准液 铜、铁标准溶液 硝酸( 优级纯) 高氯酸( 优级纯) 甲醇( 色谱纯) 磷酸( 分析纯) d b 3 型不锈钢电热板 昆明小白鼠( s p f 级) 天津市泰斯特仪器有限公司 美国奥豪斯公司 国药集团化学试剂有限公司 市售，经中国医科大学陈再兴 老师鉴定为正品药材 北京普析通用仪器有限责任 公司 国家标准物质研究中心 国家地质实验测试中心 沈阳市化学试剂厂 沈阳市化学试剂厂 山东禹王实业总公司化工厂 沈阳化学试剂厂 江苏金坛市金城国胜实验仪 器厂 中国医科大学实验动物中心 论文一 四逆汤中乌头碱类化学成分的测定 材料与方法 一、试样、试剂和仪器 附子、干姜、甘草均购自于沈阳市太原街天士力大药房，将样品洗净， 于1 0 5 恒温干燥，冷却至室温，粉碎后备用。 二、色谱条件： 色谱柱为e c l i p s e x d b c 1 8 柱( a g i l e n t ，4 6 x 1 5 0 m m ，5 9 m ) ，流动相为甲醇 0 1 三乙胺( 6 5 ：3 5 ) ，流速为1 0m l m i n 一，检测波长为2 4 0l l m ，柱温为3 0 。 三、测定方法： 1 、对照品溶液的制备 精密称取乌头碱对照品3 o l m g 、新乌头碱对照品1 0 3 m g 、次乌头碱对照品 2 0 2 m g ，置于一lo m l 容量瓶中，加入甲醇使溶解并定容至刻度，混匀，得 到混合对照品贮备液。 2 、供试品溶液的制备 取附子( 制) 3 0 0 9 、甘草3 0 0 9 ，加水煎煮两次，第一次煎煮2 小时，第 二次煎煮1 5 小时，合并煎液，滤过；取干姜2 0 0g ，用水蒸气蒸馏法提取挥 发油，另器保存；姜渣再加水煎煮l 小时，煎液与蒸馏后的水溶液合并，滤 过；再与附子、甘草的煎液合并，浓缩至约4 0 0 m l ，滤过，减压浓缩成稠膏 状。加入甲醇使溶解并超声提取10 分钟，放至室温，加入甲醇定容至1o m l ， 摇匀，过o 4 5 9 m 的微孔滤膜，即得。 3 、阴性对照溶液的制备 墩甘草3 0 0 9 加水煎煮两次，第一次煎煮2 小时，第二次煎煮1 5 小时， 合并煎液，滤过；取干姜2 0 0 9 ，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，另器保存；姜 9 渣再加水煎煮1 小时，煎液与蒸馏后的水溶液合并，滤过；再与甘草的煎液 合并，浓缩至约4 0 0 m l ，滤过，减压浓缩成稠膏状。加入甲醇使溶解并超声 提取1 0 分钟，放至室温，a n * 甲醇定容至l o m l ，摇匀，过o 4 5 1 t m 的微孔滤 膜，即得。 4 、测定法 精密吸取对照品及供试品溶液l o g l 进样，测定峰面积，按外标法计算含量。 实验结果 一、系统适用性试验结果 以乌头碱、新乌头碱、次乌头碱峰计，理论塔板数不低于2 0 0 0 ，对称因子在 o 9 5 - 1 0 5 之问，样品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱与其它组分的分离度大于 1 5 。 二、方法学考察结果 1 、阴性干扰试验取缺附子的阴性对照液在上述色谱系统下进样，由色谱 图可见，在乌头碱、新乌头碱和次乌头碱出峰位置上无其他峰干扰，色谱图见图 1 。 1 0 图l ，对照品溶液( a ) 、供试品溶液( b ) 阴性样品( c ) 的h p l c 色谱图 1 新乌头碱；2 乌头碱；3 次乌头碱 2 、线性关系考察结果 精密量取混合对照品贮备液适量，采用逐级稀释法配置成分别含乌头碱 3 0 1 、1 5 0 5 、6 0 2 、3 0 1 、6 0 2 9 9 m l ，新鸟头碱1 0 3 、5 1 5 、2 0 6 、1 0 3 、2 0 6 9 9 m l ， 次鸟头碱2 0 2 、1 0 l 、4 0 4 、2 0 2 、4 0 4 9 9 m l 的系列混合对照品溶液。按色谱 条件进样2 0 1 t l ，测定峰面积。以对照品浓度为横坐标( x ) ，峰面积为纵坐 标( y ) 做线性回归，结果见表l 。 表l ，乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的回归方程及线性范围 3 、精密度试验结果 取同一混合对照品溶液，连续进样5 次，测定峰面积。乌头碱、新乌头 碱和次乌头碱峰r s d 分别为o 7 9 、0 3 7 、o 9 0 ，结果表明仪器的精密度 良好。 4 、稳定性试验结果 取同一供试品溶液分别于0 、4 、8 、1 6 、2 4 h 进样2 0 1 t t l ，测定峰面积。 乌头碱、新乌头碱和次乌头碱峰r s d 分别为0 2 9 、0 3 2 、0 6 4 ，表明供 试品在2 4 h 内基本稳定。 5 、重复性试验结果 取同一批供试品，精密称定5 份，测定含量。乌头碱、新乌头碱和次乌 头碱含量的r s d 分别为1 0 5 、o 9 4 和o 9 8 ，结果表明方法的重复性良 好。 6 、回收率试验结果 取批号为2 0 10 0 1 的样品，精密称定5 份，分别置10m l 容量瓶中，精密 加入1 9 9 9 m l 乌头碱对照品溶液l m l ，1 0 p , g m l 新乌头碱对照品溶液l m l ，4 0 0 i _ t g m 1 次乌头碱对照品溶液l m l ，定容至1 0 m l 。依法测定，计算回收率。乌头碱、新乌 头碱和次鸟头碱的平均回收率分别为1 0 0 7 4 ( r s d = i 8 8 ) 、9 9 9 ( r s d = 2 9 8 ) 和1 0 2 9 ( r s d = i 3 2 ) ，结果见表2 。 表2 ，加样回收率测定结果 1 2 7 、样品测定结果 按照中国药典2 0 0 5 年版一部4 2 2 页方法制备5 批样品，五个批号( 2 0 1 0 0 1 ， 2 0 1 0 0 2 ，2 0 1 0 0 3 ，2 0 1 0 0 4 ，2 0 1 0 0 5 ) 四逆汤照“供试品溶液的制备”项下方法制 备。精密吸取供试品溶液l o l l ，进样分析，采用外标法计算含量，结果见表3 。 表3 ，四逆汤样品含量测定结果 2 0 l o o lo 0 3 8 l0 0 2 2 2 2 0 10 0 20 0 3 710 0 2 3 0 0 8 1 2 6 o 8 1 6 9 1 3 2 0 1 0 0 30 0 3 7 30 0 2 1 00 8 2 0 6 2 0 1 0 0 4 0 0 3 7 20 0 2 0 00 8 2 6 6 2 0 10 0 5 0 0 3 7 70 0 2 0 90 8 3 3 2 平均值m g 0 0 3 7 50 0 2 1 5 o 8 2 2 0 r s d 1 0 52 3 l0 9 8 1 4 论文二 四逆汤中微量元素的测定 材料与方法 一、试样、试剂和仪器 附子、干姜、甘草均购自于沈阳市太原街天士力大药房，将样品洗净， 于1 0 5 恒温干燥，冷却至室温，粉碎后备用。 锌、锰标准溶液，国家标准物质研究中一i i , ；铜、铁标准溶液，国家地质 实验测试中心；镉、铬、铅、镍、钙、镁标准溶液，国家环境保护总局标准 样品研究所；硝酸，优级纯，沈阳市化学试剂厂；高氯酸，优级纯，沈阳市 化学试剂厂；水为蒸馏水。 t a s 9 9 0s u p e r 型原子吸收分光光度计，附t a s 9 9 0s u p e r 数据工作站， 北京普析通用仪器有限责任公司；d b 一3 型不锈钢电热板，江苏金坛市金城国 胜实验仪器厂；实验所用的玻璃仪器均经过h n 0 3 h 2 0 ( 2 ：5 ，体积比) 浸泡 12 h 以上，晾干，备用。 二、样品处理 四逆汤：准确称取附子3 9 、甘草3 9 ，加水煎煮两次，第一次煎煮2 小 时，第二次煎煮1 5 小时，合并煎液，滤过；取干姜2 9 ，用水蒸气蒸馏法提 取挥发油，另器保存；姜渣再加水煎煮1 小时，煎液与蒸馏后的水溶液合并， 滤过；再与附子、甘草的煎液合并，浓缩至2 0 m l ，滤过。用移液管移取2 m l 至锥形瓶中，加入1 0 m lh n 0 3 h c l 0 4 ( 4 ：l ，体积比) ，摇匀，置于电热板上 1 4 0 消解2 h ，升高温度至消化完全，分2 次加入10 m l 水继续加热驱酸，缓 缓浓缩至近干，冷却，定量转移至量瓶中，以2 的硝酸定容。 三、原子吸收测定条件 各元素的最佳仪器l ：作条件见表4 。 表4 ，火焰原予吸收仪器的工作条件 元素c u f em np bc dc rz nn ic a m g 波长3 2 6 2 2 5 0 1 2 7 8 52 8 3 92 2 7 13 6 0 22 1 3 32 3 2 54 2 2 02 8 4 3 n m 灯电3 0 流 m a 增益3 1 1 值v 通带2 0 宽度 n m 5 0 4 0 3 03 0 5 0 5 0 3 03 02 0 3 2 43 1 73 3 53 0 33 2 9 2 9 42 8 73 0 l2 9 9 2 02 o2 o2 o2 0 2 02 02 02 0 标准曲线的绘制 实验结果 精密吸取铜、铁、锰、铅、镉、铬、锌、镍、钙、镁元素的标准储备液，用 体积分数为1 的h n 0 3 稀释配置成系列的标准溶液按表4 仪器所示的工作条 件进行测定，计算，线性回归方程和相关系数见表5 和图2 11 。 表5 ，线性回归方程及相关系数 c u 0 、0 5 、1 、2 、3 y = i 3 2 x1 01 x + i 3 x1 0 2 o 9 9 9 1 f e 0 、0 2 、0 4 、1 6 、2y = 3 6 3 1 0 - 2 x 十2 3 1 0 0 9 9 9 2 m n 0 、0 1 、0 2 、0 4 、1y = i 2 8 1 0 x + i 0 1 0 0 9 9 9 2 p b 0 、0 5 、1 、2 、5y = i 3 4 1 0 x + i 0 x1 0 3 0 9 9 9 7 1 6 c d 0 、0 0 2 5 、0 0 5 、o 1 5 、o 2 5y = i 8 5 1 0 x + 4 0 1 0 4o 9 9 9 4 c r 0 、0 5 、1 、2 、4 y = 2 7 l 1 0 一x + 5 0 1 0 0 9 9 9 9 z n 0 、0 2 、0 6 、1 、2y = i 5 7 1 0 1 x + 1 1 1 0 20 9 9 9 1 0 、0 5 、1 、3 、5 y = 2 9 5 1 0 2 x + 4 1 1 0 0 9 9 9 3 c a 0 、0 2 、1 、2 、4y = 2 7 8 1 0 x + 3 1 1 0 。3 0 9 9 9 1 m g 0 、0 5 、1 、2 、4 y = 8 2 3 1 0 2 x + 7 1 1 0 2o 9 9 9 6 1 7 i8 1 9 2 0 2 l 图2 1 1 ，铜、铁、锰、铅、镉、铬、锌、镍、钙、镁的标准曲线图 二、精密度实验 取铜、铁、锰、铅、镉、铬、锌、镍、钙、镁元素标准溶液适量，连续测定 5 次，计算吸光度相对标准偏差( r s d ) ，结果分别为0 5 2 、1 9 4 、o 5 0 、2 2 、 1 5 2 、2 2 、0 2 0 、0 9 8 、0 1 6 、1 7 2 ，表明仪器的精密度良好，结果见 表6 。 表6 ，精密度实验结果 c u0 0 7 1 10 0 7 2 00 0 7 1 4 0 0 7 1 2 0 0 7 1 70 0 7 1 5 0 5 2 f eo 0 1 2 l0 0 1 2 20 0 1 2 5 0 0 1 2 40 0 1 2 70 0 1 2 41 9 4 m n0 1 1 2 3 o 1 1 2 8 o 1 1 1 7 0 1 1 1 60 1 1 1 5 o 1 1 2 0 0 5 0 p b0 0 5l0 0 5 30 0 5 00 0 510 0 5 20 0 512 2 c d0 0 2 6 50 0 2 7l0 0 2 6 70 0 2 610 0 2 6 20 2 6 51 5 2 c r0 0 710 0 7 20 0 7 40 0 7 30 0 7 00 0 7 22 2 z n0 2 5 20 2 5 3l0 2 5 3 30 2 5 2 80 2 5 2 60 2 5 2 80 2 n i0 0 3 7 70 0 3 7 50 0 3 8l0 0 3 8 2 0 0 3 8 4 0 0 3 80 9 8 c a0 3 0 1 10 3 0 2 10 3 0 1 7 0 3 0 0 9 0 3 0 1 50 3 0 1 5 0 1 6 m g 0 1 5 6o 1 5 70 1 5 9o 1 5 40 1 6 10 1 5 71 7 2 三、回收率实验 采用加样回收率法，精密称取已知含量的四逆汤，精密加入各元素的标准溶 液适量，按表4 工作条件测定，计算各元素的加标回收率，c u 、f e 、m n 、p b 、 c r 、z n 、c a 、m g 的回收率分别为：1 0 3 1 2 、1 0 1 8 0 、1 0 3 1 1 、1 0 1 2 9 、1 0 1 3 9 、 1 0 1 6 8 、1 0 0 1 2 、9 9 9 3 ，结果见表7 。 表7 ，回收率实验结果 1 8 5 2 1 8 6 4 c u18 4 8 f e 1 8 5 5 1 8 6 5 1 8 2 6 1 8 3 1 1 8 3 7 2 0 o o 2 0 0 0 2 0 0 0 2 0 0 0 2 0 o o 2 0 0 0 0 2 0 0 o o 2 0 0 o o 3 9 1 4 3 9 1 1 3 9 0 7 3 9 1 7 3 9 2 5 3 8 5 7 3 8 7 6 3 8 4 2 2 3 1 0 3 3 5 1 0 2 5 2 1 0 3 1 91 0 3 1 20 3 3 1 0 3 3 4 1 0 3 2 2 1 0 1 7 0 1 0 2 4 6 1 0 0 2 7 1 0 1 8 0o 9 1 1 8 2 9 1 8 3 4 2 2 3 2 2 4 m n2 2 7 2 2 1 2 2 9 3 6 6 4 3 6 6 7 p b3 6 5 9 3 6 7 9 3 6 7 2 1 4 5 5 1 4 5 9 c r1 4 6 3 1 4 6 l 1 4 5 7 3 3 2 l 3 3 2 9 z n3 3 3 3 3 3 2 6 3 3 2 4 2 7 0 9 3 2 7 1 4 4 c a2 7 2 6 1 2 7 1 5 7 2 7 1 4 3 3 2 8 6 4 3 2 8 5 7 m g 3 2 8 9 1 3 2 9 0 7 3 2 9 0 4 2 0 0 o o 2 0 0 0 0 4 0 0 4 0 0 4 0 0 4 0 0 4 0 0 4 0 0 0 4 0 0 0 4 0 0 0 4 0 o o 4 0 o o 2 0 0 0 2 0 o o 2 0 0 0 2 0 0 0 2 0 0 0 4 0 o o 4 0 0 0 4 0 o o 4 0 0 0 4 0 o o 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 o o 3 0 0 o o 3 0 0 0 0 2 0 0 0 0 2 0 0 o o 2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 3 8 6 6 3 8 8 1 6 3 1 6 3 2 6 3 6 6 2 6 6 3 4 7 7 2 1 7 7 1 1 7 7 0 7 7 7 1 4 7 7 2 4 3 4 9 2 3 4 8 7 3 4 7 1 3 4 6 4 3 4 8 2 7 3 6 9 7 4 1 2 7 3 8 2 7 3 8 9 7 3 6 l 5 7 2 6 1 5 7 1 9 1 5 7 1 8 4 5 7 1 6 6 5 7 1 4 9 5 2 9 1 l 5 2 7 9 6 5 2 8 4 7 5 2 8 6 7 5 2 8 9 0 1 0 2 0 2 1 0 2 5 6 1 0 3 5 9 1 0 3 5 7 1 0 3 9 61 0 3 1 1 0 8 0 1 0 2 2 6 1 0 2 1 8 1 0 1 5 5 1 0 1 2 0 1 0 1 3 l1 0 1 2 9o 2 3 l o o 9 5 1 0 1 4 2 1 0 2 5 4 1 0 1 9 2 1 0 0 5 41 0 1 3 90 9 6 1 0 0 2 1 1 0 1 7 2 1 0 1 4 5 1 0 2 4 9 1 0 1 4 71 0 1 6 8o 5 2 1 0 1 8 9 1 0 1 1 1 1 0 0 6 2 1 0 0 1 7 9 9 7 21 0 0 1 2o 3 3 l o o 0 3 1 0 0 0 2 1 0 0 1 4 9 9 8 1 9 9 8 79 9 9 3o 1 3 9 9 8 8 9 9 9 6 2 4 四、样品测定 按表4 的工作条件对待测样品进行测定，结果见表8 。 表8 ，样品测定结果 2 5 论文三 四逆汤的毒性测定与分析 材料与方法 一、四逆汤的制备 取附子、甘草，加水煎煮两次，第一次2 小时，第二次1 5 小时，合并煎液， 滤过，取干姜用水蒸气蒸馏法提取挥发油，另器保存，姜渣再加水煎煮l 小时， 煎液与蒸馏后的水溶液合并，滤过；再与附子、甘草的煎液合并，浓缩，使其终 浓度为6 9 生药m l ，置于冰箱冷藏备用。 二、实验动物 普通级昆明种健康小鼠，体质量为2 0 _ _ _ 2 9 ，雌雄各半；由中国医科大学实验 动物中心提供。 三、急性毒性试验方法 取昆明小白鼠4 0 只，雌雄各半。分成高、中、低三个实验组和对照组， 每组各1 0 只。实验组将四逆汤煎剂分别以1 m l 2 0 9 、0 5 m l 2 0 9 和o 2 5 m l 2 0 9 体质量的剂量于空腹1 2 h 一次性灌胃，给药后4 h 恢复正常饲养，观察7 d ， 对照组正常饲养。 四、四逆汤中乌头碱类化合物的毒性预测分析 化合物定量结构一毒性关系( 构效关系，q u a n t i t a t i v es t r u c t u r e t o x i c i t yr e l a t i o n s h i p ， q s t r ) 研究方法是新药设计与研究的关键技术之一，也是目前探讨化合物结构和 毒性关系的一种有效手段，q s t r 方法不仪可以将分子三维结构有关的信息应用到 化合物的结构设计与改造上，对于化合物的毒性和其他理化性质的预测和体内活 性数据的处理等都足非常有效和仆常自用的。偏最小二乘回归分析( p l s ) 是一 种多元回归建模的方法，适用于观测数据的数黾较少，而自变量个数较多的情况， 可将观测从高维空间投影到低维空问，减少模型输入变量数。此方法被广泛地应 2 6 用于计量化学、生物信息等领域，最近此方法被应用于化合物毒性构效关系的研 究中，并取得了较好效果。 ( 一) 数据描述 利用p l s 方法建立q s t r 模型过程中，对1 4 种乌头碱类化合物的各种量化 参数进行了计算，以分子量、分子疏水系数、分子近似表面积、分子体积、摩尔 折射率、极化能、分子键合能、生成热和偶极矩1 0 种3 d 量化参数作为因变量， 变量符号表示及含义见表9 ；以1 4 种乌头碱类化合物的小鼠腹腔注射给药的毒性 数据值( 半数致死量，l d 5 0 ) 的对数值作为自变量( 见表1 0 ) ，利用s i m c 。p 软件 程序建立因变量与自变量之间的p l s 的q s t r 模型，结果表明该模型具有很好的 预测能力。 表9 ，q s t r 建模中采用因变量参数的含义 表1 0 ，乌头碱类化合物的小鼠腹腔注射毒性( l d 5 0 ) 序列c a s 臀记号二一：萜类生物碱类化合物名称l d 5 0 的对数 l 3 0 2 2 7 2a c o n i t i n e- 1 o o 216 2 9 8 9 0 一l i e s a c o n i t i n e0 5 2 32 7 5 2 6 4 9m e s a c o n i t i n e1 17 木47 7181 2 6 13 a c e t v l a c o n i t i n e0 4 0 56 9 0 0 8 7 4 h y p a c o n i t i n e 一0 3 3 68 214 4 7 4 9 d i a c e t v “n d a c o n i t i n e1 3 4 76 0 3 4 5 7 7 a c o n i t i n eh y d r o b r o m i d e0 8 7 奉8714 2 5 6 4 4m e s a c o n i t i n eh y d r o b r o m i d e一0 9 5 9714 0 2 5 9 0 h y p a c o n i t i n eh y d r o b r o m i d e 0 2 7 1 04 4 9 1 1 9 4i n d a c o n i t i n e 0 3 3 11714 0 2 6 2 5 b e 鼍z 掣1 等y p a c ? m e 1 41 望z 璺! 竺殳! 竺翌! 壁里 ( 二) 建模过程 1 、由于各项t o x i 数值差别较大，我们首先对其进行取对数处理，再对b e 、 h f 变量进行了缩小千倍的处理。 2 、我们用1 1 个数据的自变量和因变量进行数学建模型，由于用于进行建立 模型的样本空间数量为1 1 ，而相对于1 0 自变量的个数，1 1 个样本数较少，所以 不能用多元线性回归统计方法来构造模型。而p l s 回归分析方法具有在尽可能提 取包含自变量更多信息的成分的基础上，保证了提取成分与因变量间最大相关性， 并且适用于小样本，所以我们采用该方法来构建模型。 3 、在利用p l s 回归分析方法进行建模的过程中，我们首先进行提取p l s 成 分个数选取的判断，分别进行成分个数为1 、2 、3 、4 、5 的选取，得到如图1 2 所 示的提取不同p l s 成分个数时对模型的解释能力r 2 y ( c u m ) 和交叉有效性q 2 ( c u m ) 参数。 图1 2 ，提取1 5 个成分的r 2 y ( c u m ) 幂uq 2 ( c u m ) 参数对比 从图1 2 可以看出，当提取p l s 的成分为4 时，参数r 2 y ( e u m ) 和q 2 ( c u m ) 的 值逐渐增j u ，此时r 2 y ( c u m ) = 0 9 3 3 和q 2 ( c u m ) = o 6 2 6 。由于提取4 个p l s 的成分 时，表现对模型的解释能力的参数r 2 y ( c u m ) 接近于l ，交叉有效性验证参数 q 2 ( c u m ) 的值大于0 5 ，当提取5 个p l s 的成分时，参数r 2 y (