（有机化学专业论文）阿莫西林（氨苄西林）的工艺改进.pdf

附件一： 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任f h 本人 承担。 论文作者签名硅主盛日期：至堕z 侈 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：红导师签名：域日期：盈毕 山东人学聩j 学位论文 摘要 青霉素的问世可谓是2 0 世纪医学发展中的一个里程碑，使过去曾是致命 的疾病得到了有效治疗，拯救了数以千万计的生命。 半合成青霉素市场中具有一定份额的品种主要是氨苄西林、阿莫西林、美 洛两林、阿洛西林、氯唑西林、哌拉西林六大品种，由于阿奠西林口服吸收良 好，因此在全球的产销量稳步增长，经过2 0 多年的临床应用，阿莫西林已是处 方药中的大众品种。本文重点讨论阿莫西林、氨苄西林、美洛西林、阿洛西林 的合成工艺。来提高生产能力和反应收率。 本文通过调整优化生产工艺，改变反应时间和反应温度优化工艺控制。 用吡啶代替卢提啶，提高收率，降低生产成本，丌发出新的产品：美洛西林和 阿洛西林。为公司的经济效益贡献力量。 关键词：青霉素 阿莫西林氨苄西林 6 - a p a ( 6 氨基青霉烷酸) 合成 山东入学坝卜学位论文 a b s t r a c t t h ep e n i c i l l i n sd i s c o v e r yi sam i l e s t o n eo fm e d i c a ld e v e l o p m e n ti nt h e2 0 t l i c e n t u r y d i s e a s ew h i c hw a sd e a d l yi nt h ep a s t ，c a l lb ec u r e de f f e c t i v e l yb yt h e p e n i c i l l i n i th a sb e e nh e a l i n gm i l l i o n s o f p e o p l e i nt h es e m i s y n t h e t i cp e n i c i l l i n sm a r k e t t h e r ea r ea m p i c i l l i n 、a m o x i c i l l i n 、 m e z l o e i l l i n 、a z l o c i l l i n 、c l o x a c i l l i n 、p i p e r a c i l l i n ，w h i c hh a v ed e f i n i t es h a r e si nt h e p e n i c i l l i n sm a r k e t a sar e s u l to fa m o x i c i l l i nc a nb ea b s o r b e de f f e c t i v e l yb ym o u t h ， o u t p u ta n ds a l ei n c r e a s ew i t hs t e a d ys t e p si nt h eg l o b a l b y2 0y e a r sc l i n i c a l a d h i b i t i o n ，a m o x i c i l l i nh a sb e e nap o p u l a rk i n di nt h ep r e s c r i p t i o nd r u g s t h et h e s i s d i s c u s ss y n t h e t i ct e c h n i c so f a m o x i c i l l i n 、a m p i c i l l i n 、m e z l o e i i l i na n da z l o c i l l i n , w h i c h c a r li n c r e a s et h ep r o d u c t i o na n dt h er a t e o p t i m i z e dr n a n u f a c t u r a lt e c h n i c s t h r o u g ha l t e rr e a c t i o nt i m ea n dr e a c t i o n t e m p e r a t u r e ，i sd i s c u s s e di nt h i st h e s i s r e p l a c i n gt h e2 , 6 - d i m e t h y l p y f i d i n ew i t ht h e p y r i d i n e ，c a nr a i s et h ep r o d u c t i v i t y , a n dl o w e rt h eo p e r a t i n gc o s t s w ed e v e l o pn e w p r o d u c t s ：m e z l o c i l l i n a n da z l o c i l l i n ，w h i c hc o n t r i b u t es t r e n g t hf o rt h ee c o n o m i c p e r f o 彻a n c eo f t h ec o m p a n y k e y w o r d s ：p e n i c i l l i n a m o x i c i l l i n a m p i c i l l i n 6 - a p a s y n t h e s i s 2 山东人学顾l 学位论文 6 a p a p e n g k a i l c p a m o x a m p d m f t m s d m s o p y l m 丫- p y l h n m r 6 ， t o o l ， m l g ， o c p h l t 。 m p ， 符号说明 6 - a m i n op e n i c i l l a n i ca c i d ，6 - 氨基青霉烷酸 p e n i c i l l i ng p o t a s s i u m ，青霉素工业钾赫 a n a l y t i c a lr e a g e n t ， 分析纯 c h e m i c a lp u r e ， 化学纯 a m o x i c i l l i n ， 阿莫西林 a m p i c i l l i n ，氨苄西林 n ，n d i m e t h y l f o r m a m i d e ，n ，n - 二甲基甲酰胺 t e t r a m e t h y l s i l a n e ， 四甲基硅烷 d i m e t h y l s u l f o x i d e ，二甲基亚砜 p y r i d i n e ，吡啶 2 , 6 - d i m e t h y l p y f i d i n e ，2 , 6 一二甲基吡啶( 卢剔啶l u t i d i n e ) 4 - m e t h y l p y r i d i n e ，4 - 甲基吡啶 p r o t o nm a g n e t i cr e s o n a n c e ，质子核磁共振波谱 化学位移，单位p p m m o t e ，摩尔 m i l l i l i t e r , 毫升 g r a m 克 摄氏度 p o w e ro f h y d r o g e n ，酸碱度 r o o mt e m p e r a t u r e ，室温 m e l t i n gp o i n t ，熔点 山东人学坝l 学位论文 一、青霉素的概述 1 、青霉素的发现 第一章前言弟一早日ui 最著名的抗生素【1 】萸过_ 丁：1 9 2 9 年由f l e m m i n g 发现的青霉素( p e n i c i l l i n s ) 了。当时f l e m m i n g 一在埔养一种能够引起冲平菜此具他类型传染病的细菌会黄 色葡萄球萄。为了用显微镜检香培养结果，他不得不把培养皿的盖了拿掉一会 儿。一天当他丌始工作时，他注意到培养液被一种从空气中落入的蓝绿色霉菌 所污染，在霉菌生长周围的一定距离内，细菌群遭到破坏。进一步研究发现， 长有霉菌的清液对许多病原菌部有抑制和杀死作用。这种霉菌后来被鉴定为青 霉菌。由青霉菌所产生的类抗生物质总称为青霉素。 ( 图1 1 ) 图中央是青霉菌，周围是致病细菌。 距青霉素最远的细菌个大、色浓，活力十足：距青 霉菌较近的细菌个较小、色较浅，活力较差；而最 接近青霉菌的细菌个最小、色发白，显然已经死亡。 图1 1 青霉菌 第二次世界大战促使青霉素大量生产。1 9 4 3 年，已有足够青霉素治疗伤兵； 1 9 5 0 年产量可满足全世界需求。青霉素的发现与研究成功，成为医学史的一项 奇迹。青霉素从临床应用丌始，至今已发展为三代。 2 、青霉素的作用机理 青霄素在临床上丰要用于治疗葡萄球菌 0 染癌如脑j | ；! 炎、化脓症、骨髓炎 等，溶血性链球蔺传染症如腹膜炎、产褥热，以及肿炎、淋病、梅毒等。已有 的研究认为，青霉索的抗菌作用与抑制细胞壁的合成有关。细菌的细胞壁足一 4 山东人学坝i 学位论文 层峰韧的厚膜，用以抵抗外界的压力，维持细胞的形状；细胞壁的罩面是细胞 膜，膜内裹着细胞质。细菌的细胞壁土要由多赫组成。也含有蛋白质和脂质。 革芝氏f ；【j 性蔚细胞罐的组成是肽聚糖占细胞擘r 重的5 0 8 0 ( 革兰氏阴性 菌为1 1 0 ) 、磷壁酸质、脂蛋白、多糖和蛋n 质。其中肽聚糖足一种含有 乙酰基葡萄糖胺和翱肽单元的网状， i 物夫分f ，在它的， ：物合成中需要一种关 键的酶即转月 酶。 研究青霉素的作用机制，人们得出的结论是青霉素阻断了细菌细胞壁合成 的某一步。在人们阐明了粘肽的结构及其生物合成后，确定青霉素是抑制了粘肽 生物合成的最后一步。对于青霉素的作用，在二十世纪六十年代末曾提出两种解 释。一个假说是| = h s t r o m i n g e r 等人提出的，他们解释转肽作用的抑制是由于青霉 素与转肽酶结合的竞争性的抑带作用。另一个是r o g e r s 的假说，他认为由于青霉 素与底物五聚甘氨酸的游离氨基相结合，阻止了在交联反应罩肽键的形成，所以 青霉素抑制了转肽作用。基本上s t r o m i n g e r 假说得到了大多数人的认可，并且是 用完整细胞证实了青霉索事实上抑制了交联反应。图1 2 为青霉素的作用机理。 a 粘肽主链的末端；b 在另一股粘肽罩五聚甘氨酸链的未端； c 青霉素；d 结合了青霉素的酶：e n z 酶 图1 2 假定的青霉素抑制转肽酶的机制 ， 山东人学颀i 学位论文 o l f r c n h h o c 乞 青霉素基团 d 丙氮酰d 一丙氰酸( b ) 图1 3 青霉素与丙氨酰丙氨酸的结构对比 显然，s t r o m i n g e r 的假说提示，虽然青簿素分子罩的一个游离羧基对它们的 生物活性来说并非必不可少的，但它能大大的增强生物活性。简观底物，n 一乙酰 胞壁酸五肽部分的末端d 一丙胺酰一d - 丙氨酸的末端羧基是唯一的一个能与转肽 作用起反应的游离羧基。比较青霉素( 一个l d - 二肽) 与d 一丙胺酰一d - 丙氨酸的分子 模式，它们有显著的相似性( 图1 3 ) 。青霉素的含硫噻哗烷环( t h i a z o l i d i n e ) 与1 3 一内 酰胺环近似成直角。也就是青霉素b 内酞胺环罩具有高度反应性的c o - n 键和在 肽d 丙胺酰d 丙氨酸里的c o - n 键在分子模型里都精确地处于相同的位置上。所 以，可以推测转肽酶首先与d 丙胺酰d 丙氨酸的末端起反应并产生一个酞基一酶 的反应中间物，释出d 丙氨酸( 图1 2 ) 。最后五聚甘氨酸链的氨基端再与活化的中 间物起反应，从而形成交联。如果青霉素是d 丙胺酰- d 一丙氨酸末端的一个结构 类似物，那么它同样也能与转肽酶起反应。口内酰胺环的高度反应性的c o - n 键 将酰化酶，并使之失活。事实上，青霉素的作用比原来所想象的要复杂得多。细 胞壁的合成也是非常复杂的现象，细胞壁合成的调节作用是与脱氧核糖核酸的复 制和细胞循环连在起的。在生长期间，维持一定的细胞形状，细胞壁的合成是 随生长的速率而变化的，降解酶和合成酶的水平是保持着微妙的平衡的。青霉素 的作用并不局限于抑制转肽酶和抑制某些细菌的d 丙氨酸羧肽酶的活性，存在着 青霉素的多重靶。但是，青霉素处理细菌的杀菌和溶菌作用的基本原理是一样的， 只是与酶的结合速率大小不同。 青霉素的问世可谓2 0 世纪医学发展中的个胃利碑，使过去曾是致命的疾 病得到了有效治疗，拯救了数以千办讨的，l 命。但是随着青霉素的大规模使用， 越来越多的细蔺对它产生了向j 药性( 例如青霉素g 丌始使用时，只有8 的 葡萄球菌对它有时药性，到1 9 6 2 年耐药的葡萄球菌增加到7 0 ，其他抗生素 6 尸弋0 h 吵z h h 一 嚏c今天。 明菇 o i 叫 山东大学碗 。学位论文 也有类似的情况) ，使些传染病又重新开始威胁人类生命。已有研究表明， 些细菌之所以对青霉素产生耐药性，是由于它们逐渐产生了一种能迅速分解 青霉素的酶b 内酰胺酶豹缘故。已有足够的证据表明，p 内酰胺酶的基因 早在使用青霉素之前已存在于细菌。目的，化学家针对该酶活性中心部位含有 丝氨酸残基的特点，设计出与青霉素分子结构相似的b 内酰胺酶抑制剂青霉烷 砜等。青霉烷砜与b 内酰胺酶共价结合后形成失活念，使峻酶变成“死”酶。其 过程可表示为 3 、青霉素临床应用 中e 代表酶，s “- 0 卅啊疆e 上丝氨酸残基) 图1 4 假定的青霉素酶抑制剂的机制 青霉素的低毒性是由于它能够高度特异性地抑制转肽酶。还不知道人体内 哪个酶能识别它这样的结构。正因为这样，青霉索并不干扰人体的酶系统。它 选择性地作用于细菌并引起溶菌作用，但几乎不损害人和动物的细胞，所以青 霉素是一类比较理想的抗生素。 l 临床应用：4 0 多年，主要控制敏感金黄色葡糖球菌、链球菌、肺炎双球菌、 淋球菌、脑膜炎双球菌、螺旋体等引起感染，对大多数革兰氏阳性菌( 如金黄 色葡萄球菌) 和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体有抗菌作用。 优点：毒性小，但由于难以分离除去青霉噻畔酸蛋白( 微量可能引起过敏 反应) ，需要皮试。 青霉素的缺点：对酸不稳定，不能口服，排泄快，对阴性菌无效。 氨苄青霉素耐酸广谱；对抗绿脓杆菌的磺苄青霉素，耐酸、耐酶，口服的 7 山东大学硕卜学位论文 乙氧萘青霉素等。 4 、青霉素的分子结构及其衍生物 青霉素是6 一氨基青霉烷酸( 6 a m i n o p e n i c i l l a n i ca c i d ，6 - a p a ) 苯乙酰衍生 物。侧链基团不同，形成不同的青霉素，主要是青霉素g 。工业上应用的有钠、 钾、普鲁卡因、二苄基乙二胺盐。 青霉素发酵液中含有5 种以上天然青霉素( 如青霉素f 、g 、x 、k 、f 和v 等) ，它们的差别仅在于侧链r 基团的结构不同，其中青霉素g 在医疗中用得 最多，它的钠或钾盐为治疗革兰氏阳性菌的首选药物，对革兰氏阴性菌也有强 大的抑制作用。d c 霍奇金( d o r o t h yc r o w f o o th o d g k i n ) 用x 射线晶体学的 方法在1 9 4 9 年测定出了青霉素的结构。青霉素的结构通式可表示为 5 、我国的青霉素生产 r _ c o h n 0 青霉静。 青霉素c 。 青霉素x 。 青霉素k 。 青霉童f 。 青辅。 氡苄青霉砉， r 为c h 3c h 2c h = c h c h g r 为 重c h r ， r 为h o 一 重q h 2 r 为c h 3 ( c h 2 ) c i i f r 蔗j c h3 ( c h 2 ) 3c h 2 - r 为喇2 r 为 图1 5 青霉素的结构通式 1 9 5 3 年5 月，中国第一批国产青霉素诞生，揭丌了中国生产抗生素的历史。 8 r 重 旷如舛 卜加 山东人学碗l 学位论史 目前中国为青霉素( p e n i c i l l i n ) 生产大国，国内生产的青霉素，己占世界产量 的近7 0 ，国内较大规模的生产企业有华药、哈医药、石药、鲁抗等，单个发 酵罐规模均在1 0 0m 3 以上，发酵单位在7 0 0 0 0u m l 左右，而世界青霉素工业 发酵水平达1 0 0 0 0 0u m l 以上。 抗生素在目前的制药工业中仍占有举足轻重的地位，尤其是下游半合成抗 生素的发展，进一步刺激了上游的工业发酵。青霉素的单个发酵罐容积越来越 大，1 0 0m 3 的发酵罐被普遍采用，2 0 0m 3 甚至更大容积的发酵罐经常可见报道。 二、青霉素发酵工艺 发酵，就抗生素的生产而言：就是微生物活细胞在一定培养条件下，分解 利用各类有机物质生物合成抗生素的过程。抗生素分解利用培养基中的营养物 质来合成细胞物质，从而大量繁殖菌丝体。这时，初级代谢的有关酶活力高而 抗生素合成有关酶受到抑制，因此不合成抗生素或合成的抗生素的量很少【2 】。 抗生素发酵的第二个时期代谢活动减弱，初级代谢有关酶受到抑制，菌丝生长 大大减慢，仅维持菌丝量的平衡。抗生素合成酶的抑制被解除，大量合成抗生 素。 提到青霉素发酵就要提到产青霉素的微生物，下面介绍一下青霉素生产菌 的生物学特性及菌种选育情况。 i 、青霉素生产菌的生物学特性 最初由弗莱明分离的点青霉，只能产生2u m l 的青霉素。目i ； 全世界用 于生产青霉素的高产菌株，大都由菌株w i sq 1 7 6 ( 一种产黄青霉) 经不同改 良途径得到：7 0 年代前育种采用诱变和随机筛选方法，后来由于原生质体融合 技术、基因克隆技术等现代育种技术的应用【3 】，青霉素工业发酵生产水平已达 1 0 0 0 0 0u m l 以上。青霉素生产菌株一般在真空冷冻干燥状态下保存其分生孢 子，也可以用甘油或乳糖溶剂作悬浮剂，在7 0 0 c 冰箱或液氮中保存孢子悬浮 液和营养菌丝体。 9 山东大学硕 学位论文 孢子：形成绿色孢子和黄色孢子的两种产黄青霉( p e n i c i l l i u mc h r o s o g e n u m ) 菌株；深层培养中菌丝形态为球状和丝状两种，我国生产上采用的是丝状。 菌落：平坦或皱褶，圆形，边沿整齐或锯齿或扇形。气生菌丝形成大小梗， 上生分生孢子，排列成链状，似毛笔，称为青霉穗。孢子黄绿至棕灰色。圆形 或圆杜形。 种子制备阶段以生产丰富的孢予( 斜面和大米孢子培养) 或大鳗健壮的种 子罐为目的。为达到这一目的，在培养基中加人比较丰富的容易代谢的碳源( 如 葡萄糖或蔗糖) 、氮源( 如玉米浆) 、缓冲p h 的碳酸钙以及生长所必需的无机 盐，并保持最适生长温度( 2 5 2 6 0 c ) 和充分通气、搅拌。在最适生长条件下， 到达对数生长期时菌体量的倍增时间约为6 7 小时。在工业生产中，种子制备 的培养条件及原材料质量均应严格控制以保持种子质量的稳定性。 2 、发酵条件下的生长过程 影响青霉素发酵产率的因素有环境因素，如p h 值、温度、溶氧饱合度、 碳氮组份含量等；有生理变量因素，包括菌丝浓度。菌丝生长速度、菌丝形态 等，对它们都要进行严格控制。发酵中p h 值一般控制在6 4 6 6 ，发酵温度前 期2 5 2 6 0 c ，后期2 3 0 c ，以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。此外，还要 求发酵液中溶氧量不低于饱和溶解氧的3 0 ，通气比一般为1 ：o 8w m ( 单位 培养液体积在单位时间内通人的空气量) 。 第l 期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。 第2 期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。 第3 期：形成脂肪包涵体，机理贮藏物，没有空泡，嗜碱性很强。 第4 期：脂肪包涵体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始 产生抗生素。 第5 期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状，脂肪包涵体消失，青 霉素产量最高。 第6 期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状。释放游离氨，p h 上升。 第7 期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。 i o 山东人学颀t 学位论文 镜检：按规定时间取样，用显微镜观察7 个时期的形态变化，控制发酵过程。 l 一4 期为菌丝生长期，3 期的菌体适宜为种子。 4 5 期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。 在第六期到来之前结束发酵。 青霉素的工业生产包括发酵和提取两部分。工艺流程大致如下：菌种的保 藏、孢子制备、种子制各、发酵、提取和精制。种子和发酵培养基的常用碳源 有：葡萄糖、淀粉、蔗糖、油脂、有机酸等，主要为菌体生长代谢提供能源， 为合成菌体细胞和目的产物提供碳元素。有机氮源多用玉米浆、黄豆饼粉、麸 质粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等，硫酸铵、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸铵则是 常用的无机氮源。另外，培养基中还得添加无机盐、微量元素以及消沫剂，青 霉素还得加入特殊前体，即青霉素的前体苯乙酸。发酵过程普遍补加一种碳源、 氮源物质，如葡萄糖和硫酸铵。p h 值通过流加氨水进行调节，很多抗生素在发 酵中后期流加前体，对提高产量非常有益。 一叵 田一 - 山东大学硕 学位论文 图1 6 青霉素工艺流程图 3 青霉素的发酵工艺过程 ( 1 ) 生产孢子的制备 将砂土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养， 经传代活化。最适生长温度在2 5 2 6 0 c ，培养缸8 天，得单菌落，再传斜面， 培养7 天，得斜面孢子。移植到优质小米或大米固体培养基上，生长7 天，2 5 0 c ， 制得小米孢子。每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。 ( 2 ) 种子罐和发酵罐培养工艺 种子培养要求产生大量健壮的菌丝体，因此，培养基应加入比较丰富的易 利用的碳源和有机氮源。青霉素采用三级发酵： 一级种子发酵：发芽罐( 小罐) ，接入小米孢子后，孢子萌发，形成菌丝。培养 基成分：葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。通无菌 空气，空气流量l ：3 ( 体积比) ；充分搅拌3 0 0 - - 3 5 0d m i n ；4 0 - - 5 0 小时；p h 自然，温度2 7 1 。c 。 二级发酵罐：繁殖罐( 大量繁殖) 。玉米浆、葡萄糖等。空气流量l ：1 一1 5 ； 搅拌速度2 5 0 - 2 8 0r m i n ；p h 自然，温度2 5 l o c ；0 1 4 h 。 三级发酵罐：生产罐。花生饼粉( 高温消毒) ，麸质粉、玉米浆、葡萄糖，尿素， 硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酰胺及消泡剂，c a c 0 3 等。 接种量为1 2 1 5 。青霉素的发酵对溶氧要求极高，通气量偏大，通气比控制 0 7 1 8 ；搅拌速度1 5 0 - - 2 0 0r m i n ；要求高功率搅拌，1 0 0m 3 的发酵罐搅拌功 率在2 0 0 - - 3 0 0k w ，罐压控制0 0 4 - - - 0 0 5m p a ，于2 5 2 6 0 c 下培养，发酵周期在 2 0 0h 左右。前6 0 h ，p h 5 7 石3 ，后6 3 6 6 ：前6 0 h 为2 6 0 c ，以后2 4 0 c 。 4 发酵过程控制 反复分批式发酵，1 0 0 m 3 发酵罐，装料8 0 m 3 ，带放6 1 0 次，日j 隔2 4h 。 带放量1 0 ，发酵时间2 0 4h 。发酵过程需连续流加补入葡萄糖、硫酸铵以及 前体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控匍j 2 1 。在青 山东大学硕t 学位论文 霉素的生产中，让培养基中的主要营养物只够维持青霉菌在前4 0h 生长，而在 4 0 h 后，靠低速连续补加葡萄糖和氮源等，使菌半饥饿，延长青霉素的合成期， 大大提高了产量。所需营养物限量的补加常用来控制营养缺陷型突变菌种，使 代谢产物积累到最大。 ( 1 ) 培养基 青霉素发酵中采用补料分批操作法，对葡萄糖、铵、苯乙酸进行缓慢流加， 维持一定的最适浓度。葡萄糖的流加，波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成 速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶，葡萄糖浓度调节 是根掘p h ，溶氧或c 0 2 释放率予以调节。 碳源的选择：生产菌能利用多种碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖， 甘露糖，淀粉和天然油脂。经济核算f o l 题，生产成本中碳源占1 2 以上，对工 艺影响很大；糖与6 - a p a 结合形成糖基一6 a p a ，影响青霉素的产量。葡萄糖、 乳糖结合能力强，而且随时问延长而增加。通常采用葡萄糖和乳糖。发酵初期， 利用快效的葡萄糖进行菌丝生长。当葡萄糖耗竭后，利用缓效的乳糖，使p h 稳定，分泌青霉素。可根据形态变化，滴加葡萄糖，取代乳糖。目前普遍采用 淀粉的酶水解产物，葡萄糖化液流加。降低成本。 氮源：玉米浆是最好的，是玉米淀粉生产时的副产品，含有多种氨基酸及 其前体苯乙酸和衍生物。玉米浆质量不稳定，可用花生饼粉或棉籽饼粉取代。 补加无机氮源。 无机赫：硫、磷、镁、钾等。铁有毒，控制在3 0p g m l 以下。 流加控制：补糖，根据残糖、p h 、尾气中c 0 2 和0 2 含量。残糖在0 6 左右，p h 丌始升高时加搪。补氮：流加酸酸铵、氨水、尿素，控制氨基氮0 0 5 。 添加前体：合成阶段，苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸 等均可为青霉素侧链的前体，直接掺入青霉素分子中。也具有刺激青霉素合成 作用。但浓度大于o 1 9 时对细胞和合成有毒性。还能被细胞氧化。策略是流 加低浓度前体，一次加入量低于o 1 ，保持供应速率略大于生物合成的需要。 ( 2 ) 温度 生长适宜温度3 0 。c ，分泌青霉素温度2 0 0 c 。但2 0 0 c 青霉素破坏少，周 期很长。生产中采用变温控制，不同阶段采用不同温度。前期控制2 5 - 2 6 。c 山东人学坝i 学位论文 左右，后期降温控制2 3 0 c 。过高则会降低发酵产率，增加葡萄糖的维持消耗， 降低葡萄糖至青霉素的转化得率。有时发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温 度，以缩短生长时日j ，生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。 ( 3 ) p h 合成的适宜p h 在6 4 6 6 左右，避免超过7 0 ，青霉素在碱性条件下不稳 定，易水解。缓冲能力弱的培养基，p h 降低，意味着加糖率过高造成酸性中间 产物积累。p h 上升，加糖率过低不足以中和蛋白产生的氨或其他生理碱性物质。 酊期p h 控制在5 7 “3 ，中后期p h 控制6 3 - - 6 ，6 ，通过补加氨水进行调节。p h 较低时，加入c a c 0 3 、通氨调节或提高通气量。p h 上升时，加糖或天然油脂。 一般直接加酸或碱自动控制，流加葡萄糖控制。 ( 4 ) 溶氧 溶氧 o t r ，溶氧水平下降，发酵产率下降。在发酵 稳定期，湿菌浓可达1 5 - - - 2 0 ，丝状菌干重约3 ，球状菌干重在5 左右。另 外，因补入物料较多，在发酵中后期一般每天带放一次，每次放掉总发酵液的 1 0 左右。有丝状生长和球状生长两种。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵 液中的基质及氧接触，比生产率高，发酵粘度低，气液两相中氧的传递率提高， 允许更多菌丝生长。球状茵丝形念的控制，与碳、氮源的流加状况，搅拌的剪 切强度及稀释度相关。 ( 6 ) 消沫 发酵过程泡沫较多，需补入消沫剂。天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡 敌。少量多次。不适在前期多加入，影响呼吸代谢。青霉素的发酵过程控制十 1 4 山东大学硕t 学位论文 分精细，一般2h 取样一次，测定发酵液的p h 、菌浓、残糖、残氮、苯乙酸浓 度、青霉素效价等指标，同时取样做无菌检查，发现染菌立即结束发酵，视情 况放过滤提取，因为染菌后p h 值波动大，青霉素在几个小时内就会被全部破 坏。 三、青霉素的提炼工艺 青霉素不稳定，发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速，防止 降解 压巫丑吨亟卜母成品 图1 7 青霉素提纯t z 流程简图 l 预处理 发酵液结束后，目标产物存在于发酵液中，而且浓度较低，如抗生素只有 1 0 - 3 0k g m 3 ，含有大量杂质，它们影响后续工艺的有效提取，因此必须对其 进行的预处理，目的在于浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变 学特征，利于后续的分离纯化过程。是进行分离纯化的一个工序。青霉素发酵 液的预处理，一般加絮凝剂o 4 ( m g v ) 沉淀蛋白。过滤去除菌丝体，发酵 滤液的提取常用溶媒萃取法、离子交换树脂法、沉淀法、吸附法等提纯浓缩， 然后结晶干燥得纯品。 2 过滤 发酵液在萃取之前需预处理，发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空 转鼓过滤或板框过滤，除掉菌丝体及部分蛋白。青霉素易降解，发酵液及滤液 应冷至1 0 0 c 以下，过滤收率一般9 0 左右。 ( 1 ) 菌丝体粗长1 0t t m ，采用鼓式真空过滤机过滤，滤渣形成紧密饼状，容易 从滤布上刮下滤液p h = 6 2 7 7 2 ，蛋白质含量0 0 5 0 2 。需要进一步除去蛋 白质。 ( 2 ) 改善过滤和除去蛋白质的措施：用硫酸调节p h = 4 5 5 0 ，加入0 0 7 溴代 1 5 山东人学硕t | 学位论文 十五烷吡啶( p p b ) ，o 7 硅藻土为助滤剂。再通过板框式过滤机。滤液澄清透 明，进行萃取。 3 萃取 青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素 盐易溶于水。利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调节p h ， 再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。选择对青霉素分配系数高的 有机溶剂。工业上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取2 3 次。从发酵液萃取到乙酸 丁酯时，p h 选择在1 8 2 0 ，从乙酸丁酯反萃到水相时，p h 选择为6 8 7 4 。发 酵滤液与乙酸丁酯的体积比为l ：1 5 2 1 ，即一次浓缩倍数为1 5 2 1 为了避 免p h 波动，采用硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃取。发酵液与溶剂比例为l ： 3 4 。几次萃取后。发酵液浓缩到1 0 倍，浓度几乎达到结晶要求。萃取总收率 在8 5 左右。 生产所得滤液多采用二次萃取，用l o 硫酸调p h = 2 0 , - , 3 0 ，加入醋酸丁酯， 用量为滤液体积的三分之一，反萃取时常用碳酸氢钠溶液调p h = 7 o 8 0 在一 次丁酯萃取时，由于滤液含有大量蛋白，通常加入破乳剂防止乳化第一次萃 取，存在蛋白质，加0 0 5 0 1 乳化剂p p b 。 萃取条件：为减少青霉素降解，整个萃取过程应在低温下进行( 1 0 0 c 以 下) 。萃取罐冷冻盐水冷却。 4 脱色 萃取液中添加活性炭，除去色素、热源，过滤，除去活性炭。 5 结晶 萃取液一般通过结晶提纯。青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小，在二次 丁酯萃取液中加入醋酸钾乙醇溶液，青霉素钾盐就结晶析出然后采用重结晶 方法，进一步提高纯度，将钾盐溶于k o h 溶液，调p h 至中性，加无水丁醇， 在真空条件下，共沸蒸馏结晶得纯品。 直接结晶：在2 次乙酸丁酯萃取液中加醋酸钠一乙醇溶液反应，得到结晶 钠盐。加醋酸钾一乙醇溶液，得到青霉素钾盐 共沸蒸馏结晶：萃取液，再用o 5mn a o h 萃取，p h = 6 4 4 8 下得到钠盐 水浓缩液。加2 5 倍体积丁醇，1 6 2 6 0 c ，o 6 7 1 _ 3k p a 下蒸馏。水和丁醇形成 1 6 山东大学硕 - 学位论文 共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥后，得到青霉素产品。 二、中间体及目标产物 1 、6 - 氨基青霉烷酸( 6 - a p a ) 名称、结构 中文名称：6 - 氨基青霉烷酸 英文名称：6 - - a m i n op e n i c i l l a n i ca c i d 别名：6 - a p a 结构式： 图1 86 - a p a 的结构式 分子式：c 8 h 1 2 n 2 0 3 s 分子量：2 1 6 2 6 大多数青霉素类的药物都有一个共同的部分，即6 氨基青霉烷酸( 6 a p a ) ， 半合成青霉素的合成就是以6 a p a 为基本母核，接上各种氨基侧链 1 2 ，1 6 。 5 - a p a 可以从无前体的青霉素发酵液中得到，但是大量的6 a p a 还是从青霉素g 用酶解或化学裂解的方法得到，目前固定化酶法，可用于大规模的工业化生产。 早期生产6 - a p a ，是采用化学裂解法。将原料青霉素工业钾盐先酯化、保护 羧基、氯化、醚化、水解为6 a p a 。1 9 5 9 年英国的c h a i n 【4 】利用大肠杆菌酰胺酶 裂解青霉素g 制成了6 氨基青霉烷酸( 6 a p a ) 。同年英国b e e e c h e m 公司从 6 - a p a 合成了苯乙青霉素，以后又合成了耐青霉素霉的甲氧西林，接着合成了耐 霉、可供口服和注射的苯唑西林和抗菌谱广的氨苄西林，广泛的用于临床，从此 半合成青霉素诞生了。 2 、阿莫西林化学名称、结构 ( 2 s ，5 r ，6 r ) 一3 ，3 一二甲基- 6 - 【( r ) - ( - ) 一2 一氨基一2 - ( 4 - 羟基苯基) 乙酰氨基 一7 氧 代- 4 一硫杂一1 氮杂双环( 3 ，2 ，0 ) 庚烷- 2 甲酸三水合物 1 7 山东大学硕t 学位论文 通用名称：阿莫西林 俗名：羟氨苄青霉素 英文名称： a m o x i c i l l i n 分子式：c 1 6 h 1 9 n 3 0 5 s 3 h 2 0 分子量：4 1 9 4 6 结构式： 3 h 2 0 图1 9 阿莫西林的结构式 阿莫西林【5 ，6 ，7 ，8 ，9 ，1 7 ，1 8 为白色或类白色的结晶型粉末，稍有 特异的气味和苦味，难溶于水和甲醇，极不易溶于乙醇，几乎不溶于丙酮、 氯仿和苯。 阿莫西林为口服原料药，其特点是杀菌力强、毒性低，对大肠杆菌、变 型杆菌等有较好的抑制作用。 3 、氨苄西林化学名称、结构 ( 2 s ，5 r ，6 r ) - 3 ，3 一二甲基- 6 【( r ) ( 一) 2 - 氨基2 一苯基乙酰氨基卜7 氧代4 一硫杂 1 氮杂双环( 3 ，2 ，o ) 庚烷2 甲酸三水合物 通用名称：氨苄西林 俗名：氨苄青霉素 英文名称：a m p i c i l l i n 分子式：c 1 6 h 1 9 n 3 0 4 s 3 h 2 0 分子量：4 1 9 4 6 结构式： 1 8 山东人学碗i 学位论义 。3 h 2 0 c o o h 图1 1 0 氨苄西林的结构式 氨苄西林i s ，1 0 ，l l ，1 3 ，1 4 ，1 9 ，2 0 ，2 l 】为白色结晶性粉末，味微苦， 在水中微溶，在氯仿、乙醇、乙醚或不挥发油中不溶；在稀酸或稀碱溶液中溶 解。 4 、阿洛西林化学名称、结构 ( 2 s ，5 r ，6 r ) - 3 ，3 - 二甲基一6 ( r ) - 2 - ( 2 - 氧代一卜咪唑烷甲酰氨基) 一2 一 苯乙酰氨基】- 7 一氧代一4 一硫杂一l - 氮杂双环 3 2 o 庚烷一2 - 甲酸 英文名称：a z l o c i l l i n 分子式：c 2 0 h 2 4 n 50 6 s 分子量：4 8 3 4 7 结构式： 图i i i 阿洛西林的结构式 1 9 山东人学硕i 学位论文 阿洛西林 2 2 ，2 3 ，2 4 为半合成青霉素，对革兰阳性菌和阴性菌及铜绿假 单胞菌均有良好的抗菌作用。与阿米卡星、庆大霉素、奈替米星合用时可产生 协同作用。 s 、美洛西林化学名称、结构 ( 2 s ，5 r ，6 r ) 一3 ，3 一二甲基- 6 一【( r ) 一2 【3 一( 甲磺酰) 2 氧代- l 咪哗烷甲酰氨基】- 2 - 苯乙酰氨基】- 7 一氧代- 4 一硫杂- l 一氮杂双环【3 2 o 】一庚烷一2 一甲酸 英文名：m e z l o c i u i n 分子式：c 2 1 h 2 5 n 5 0 8 s 2 分子量：5 3 9 5 8 化学结构式： h n o o o h 图1 1 2 美洛西林的结构式 美洛西林【2 5 ，2 6 】属于第三代半合成青霉素产品，是一种高效苯咪唑青霉 素类抗生素，作用范围更广。该药对革兰氏阴性、阳性菌具有广谱抗菌作用， 同时对口一内酰胺酶具有一定的稳定性；对绿脓柯菌、大肠杆菌、肺炎杆菌、变 形杆菌、肠杆菌属、枸橼酸杆菌、沙雷菌属以及对青霉素敏感的革兰氏阳性球 菌均有抑菌作用，大剂量有杀菌作用：对大肠杆菌、肠杆菌属、肺炎杆菌、枸 橼酸杆菌、沙雷菌属等的抗菌活性强于羧苄青霉素和磺苄青霉素；对革兰氏阳 山东大学顿i 学位论文 性菌如金黄色葡萄球菌抗菌活性与羧苄青霉素相似，而对粪链球菌的抗菌活性 比羧苄青霉素和磺苄青霉素优越：对脆弱类杆菌等大多数厌氧菌有较好的抗菌 作用。该药物与庆大霉素、卡那霉素等氨基糖苷类抗生素联合应用时有显著的 协同作用。 四课题的立题依据、研究内容、方法和路线 1 立题依据 在医药市场竞争r 趋激烈、药品同质化程度极高的今天，各制药企业和经 销商纷纷推出自己的品牌药品，大力宣传。随着药品的不断推广，百姓的用药 观念也在发生着变化，不再一味地“跟着广告走”，用药心理日趋成熟。人们越 来越趋向于选择疗效好、安全性高、品质优良、价格合理的药品。而能够始终 在激烈的市场竞争中占有一席之地，被大众普遍接受，并被长期使用的药品已 少之又少。但是在众多的药品中，阿莫西林却是销量一直较好的药品之一。 据统计，全球阿莫西林无论从原料药和制剂的产量上，排位在抗生素品种 中均数前列，其原料药以每年6 的速度递增，预计2 0 0 5 年世界范围内阿莫西 林的产量将达到2 1 万吨。今年初统计，抗生素占世界抗感染药物市场的最大 份额( 约3 0 0 亿3 4 0 亿美元) ，在抗生素类药中，阿莫西林销售额独占鳌头，约 3 2 5 亿美元：奥格门汀( 由阿莫西林与克拉维酸钾组成的复方青霉素制剂) 紧随 其后，约2 2 亿美元。因此，仅阿莫西林一个品种就占世界青霉素类抗生素总销 售额的5 0 。国内原料药厂家也不甘落后，该药的主要生产厂家有华北制药、 先泰药业、石家庄制药集团、张家口制药集团、哈药集团、山东鲁抗集团、四 川制药、丽珠合成制药、联邦制药、山西同领药业等1 0 多家企业。预计2 0 0 5 年全国阿莫西林原料药产量将突破1 5 0 0 0 吨。随着原料药的国产化，其制剂产 量大幅攀升，反过来又拉动原料药的需求。 2 t 山东人学硕l 学位论文 2 研究动机 阿莫西林作为广谱抗生素，成为临床上应用最广泛的基础抗感染用药。特 别是国家将其列入医疗保险目录甲类药品后，价格比较合理，这也是该药受广 大医生和患者欢迎的原因之一。近一两年，华北制药、石药集团、联邦制药、 山西同领、哈药集团等企业先后扩产，预示今后阿莫西林原料药产量还要增多， 将形成供大于求的局面。如何在众多厂家中脱颖而出，成为各大厂家努力的方 向，开发新的后续产品，进一步提高阿莫西林( 氨苄西林) 的质量、收率和附 加值，降低成本，增强企业竞争力，故选此课题。 3 研究内容、方法和路线 本文在原有工艺的基础上，通过逐步改变反应的时b j 、温度，确立最优化 的反应时间和反映温度。改变反应的催化剂，提高反应的效率。改变反应的助 溶剂的种类，促进反应的进行。改变工艺中的温度、酸度等反应条件，提高产 品的质量和收率。 山东人学坝l 学位论文 一仪器与试剂 第二章实验部分 b r u k e r a v 6 0 核磁共振仪( c d c l 3 或d m s o d 6 ，t m s 为内标) ，f x 9 0 q ； z f q 9 7 1 旋转蒸发仪； x t 4 型显微熔点仪( 温度计未经校正) 苯甘氨酸邓盐 上海医药化学有限公司 对羟基苯甘氨酸邓盐东阳家园医药化学有限公司 t l c 薄层分析g f 2 5 4 硅胶板青岛海洋化工厂 柱层析硅胶( 2 0 0 - 3 0 0 目) 其余试剂均为国产分析纯试剂 烟台源博有限公司 山东大学硕i 学位论文 二目标化合物的合成 1 6 a p a 的合成 飞 夕 - c h 2 c o = d p g k ：3 7 2 5 6 - a p a ：2 1 6 2 5 + p g a + p h 8 1 0 1 t3 0 - j ：2 0 c 凤 芦c h 2 c o o h = p 从：1 4 2 1 1 硼酸缓冲液的配制：将3 0 2 0 c 的纯化水1 0 5 0m l 加入烧杯中，加入3 4g 的硼酸，搅拌溶解1 0m i n s 。调节缓冲液p h 为7 0 + 0 2 ，将5 0 0m l 缓冲液加入 烧瓶中泡酶。 1 2p e n g k 溶液的配制：将称量好的1 0 0gp e n g k 投入有缓冲液的烧杯中， 搅拌1 0 m i l l s ，使之完全溶解。将p e n g k 溶液经过滤加入三口瓶中，开始裂解。 用1 0m l 纯化水冲洗烧杯，同时转入三口瓶中。 1 3 裂解反应：启动自控加氨系统，用3 o 2m 的氨水调p h 值，使之保持在 8 0 , - -