（微生物学专业论文）低温菌pseudomonas+sphd8产絮凝剂的提取及纯化.pdf

；：i r 。： 黑龙江大学硕士学位论文 纯化和结构鉴定结果，为研究其絮凝机理奠定理论基础。 关键词：低温产絮菌；成分分析；提取工艺；分离纯化；结构鉴定 i a b s t r a e t a b s t r a c t b i o - f l o c c u l a n t sa r en e w , e f f i c i e n ta n dl o w - c o s tw a t e rt r e a t m e n tc h e m i c a l sp r o d u c e d b ym i c r o o r g a n i s m s c o m p a r e dw i t ht h ec o n v e n t i o n a lp o l y m e rf l o c c u l a n t s ，t h e i ro b v i o u s a d v a n t a g e s a r e n o n - p o i s o n o u s ，r e a d i l yb i o d e g r a d a b l e ，w i t h o u tp o l l u t i o n t ot h e e n v i r o n m e n ta n de a s yt oa c h i e v ei n d u s t r i a l i z a t i o n t h e yc a nb eu s e di nw a t e rt r e a t m e n t , f e r m e n t a t i o na n d b i o - p h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y i nt h i sp a p e r , t h el o wt e m p e r a t u r ef l o c c u l a n t - p r o d u c i n gb a c t e r i ap s e u d o m o n a s s p h d 8w h i c hw a si s o l a t e df r o mb i o - r e a c t o ro fw a s t e w a t e rt r e a t m n tw a su s e dt oc a r r y o u tt h ee x p e r i m e n t so ff l o c c u l a n te x t r a c t i o na n dc o m p o n e n ta n a l y s i s t h ee t h a n o lw a s u s e dt op r e c i p i t a t et h ef l o c c u l a n t t h ey i e l do ff l o c c u l a n tw a sa b o u t0 5 5 6 9g l t h e f l o c c u l a t i n gr a t et ok a o l i ns u s p e n s i o nw a s9 3 6 w i t ht h eb e s td o s a g e0 0 0 5 9 l t h e q u a l i t a t i v ea n a l y s i sa n dq u a n t i t i v ea n a l y s i sr e s u l t so fb i o f l o c c u l a n t ss h o w e dt h a tt h e m a j o rc o m p o n e n t sw e r ep o l y s a c c h a r i d ea n dp r o t e i n , w i t h51 a n d4 1 2 r e s p e c t i v e l y ， a l s ot h e r ew e r ea m i n os u g a r0 31 a n dg l u c u r o n i d e2 4 7 i no r d e rt oi m p r o v et h ey i e l do ff l o c c u l a n t s ，t h er e l e v a n tf a c t o r so fe x t r a c t i o n t e c h n o l o g yw e r ei n v e s t i g a t e di n c l u d i n g ：c 即t r i f i i 羽ir a t ec e i l t r i 删t i m e , t h ek i n do f p r e c i p i t a n t , t h ed o s a g eo fp r e c i p i t a n t , t h em u l t i p l eo fe o n c e n l r a t i o na n du l t r a s o n i ct r e a t m e n t c o n d i t i o n s o nt h e b a s i so ft h er e s u l t so fe x t r a c t i o no p m i l i z a t i o n , t h eu n i f o h l ld e s i g n m e t h o dw a su s e dt oo p t i m i z et h ee x t r a c t i o nt e c h n o l o g y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s t e x t r a c t i o np r o c e s s i n gw a s ：s u p e r s o n i ca t4 0 h zf o r3 0 m i n ，c e n t r i f u g a t ea t4 5 0 0 r r a i nf o r 8 m i n , t h e np r e c i p i t a t et h es u p e m a t a n tb y2 xe t h a n o lf o r2 4 h , c e n t r i f u g a t ea t6 0 0 0r m i n f o r15 m i r ba tl a s tt h ep e l l e tw a sd r i e d t h ec r u d ep r o d u c t sw e r el i g h tb r o w np o w d e r t h e m a x i m u m y i e l do ff l o c c u l a n tw a sa b o u t0 6 918 9 l ，i n c r e a s e db y2 4 2 。 t h er e s u l to fr e m o v a lp r o t e i ns h o w e dt h a tt h ea c t i v ei n g r e d i e n to ff l o c c u l a n t sw a s - 1 1 i 黑龙江大学硕士学位论文 p o l y s a c c h a d d c s t h ef l o c c u l a n tp o l y s a c c h a r i d e sw e r ef u r t h e rp u r i f i e db yi o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h ya n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y t h e r ew e r et h r e ef l o c c u l a t i n g a c t i v i 哆p e a k s ，t h eh i g h e s tp e a kw a sn a m e dh 8 3 ，埘廿1f l o c c u l a t i n gr a t e9 5 9 t h e a c t i v ei n g r e d i e n tw a ss t u d i e df o rs t r u c t u r a li d e n t i f i c a t i o n t h ea n a l y t i cr e s u l to ft h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h yi n d i c a t e dt h a th 8 3w a sc o m p o s e do fg a l a c t o s er e s i d u e s i n f r a r e d s p e c t r o g r a ms h o w e dt h a th 8 3h a dt h ec h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o np e a l 【o fp o l y s a c c h a r i d e s t h em o l e c u l a r w e i g h to ff l o e c u l a n tw a s3 5 0 0 0 0 0d e t e r m i n e db yg e lp e n e t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ( g p c ) i nt h i sp a p e r t h er e s u l to fe x t r a c t i o np r o c e s s i n g ，p u r i f i c a t i o n a n ds t r u c t u r a li d e n t i f i c a t i o nw o u l dp r o v i d eac e r t a i nt h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h er e s e a r c ho f f l o c c u l a ：t i o nm e c h a n i s m k e yw o r d s ：l o wt e m p e r a t u r ef l o c c u l a n t - p r o d u c i n gb a c t e r i a ；c o m p o n e n ta n a l y s i s ； e x t r a c t i o np r o c e s s i n g ；s e p a r a t i o na n dp u r i f i c m i o n ；s t r u c t u r a li d e n t i f i c a t i o n i v 目录 i i i i i i i i i i i i i i i i i i i ii itai i n 嗣i i i i 暑i i i i i i i i 目录 中文摘要i a b s tr a c t i i i 第1 章绪论。1 1 1 微生物絮凝剂的研究现状1 1 1 1 微生物絮凝剂的研究历史1 1 1 2 微生物絮凝剂的种类及产絮凝剂微生物的种类3 1 1 3 微生物絮凝剂的絮凝机理5 1 1 4 微生物絮凝剂在工业生产中的应用研究7 1 2 微生物絮凝剂的提取、纯化及结构特征8 1 2 1 微生物絮凝剂的提取和纯化8 1 2 2 微生物絮凝剂的成分及结构特征8 1 3 微生物絮凝剂研究中存在的问题及发展趋势1 0 1 4 课题研究的目的、意义及研究内容1 1 1 4 ：l 课题研究的目的、意义1 1 1 4 2 课题研究内容1 2 第2 章低温菌p s e u d o r n o n a ss p h d 8 产絮凝剂的初步提取及成分分析l3 2 1 试验材料一l 3 2 1 1 试验用菌株1 3 2 1 2 试验用药品及试剂1 3 2 1 3 培养基1 3 2 1 4 试验仪器l3 2 2 试验方法1 4 2 2 1 低温菌p s e u d o m o n a ss p h d 8 的絮凝活性分布试验1 6 黑龙江大学硕士学位论文 _ ii l l - i i l i i i i i i i i i i i i i i 2 2 2 低温菌p s e u d o m o n a ss p h d 8 产絮凝剂的提取试验1 4 2 2 3 低温菌p s e u d o m o n a ss p h d 8 产絮凝剂的成分分析15 2 3 结果与讨论1 6 2 3 1 低温菌p s e u d o m o n a ss p h d 8 的絮凝活性分布试验结果1 6 2 3 2 低温菌p s e u d o m o n a ss p h d 8 产絮凝剂的提取试验结果。1 7 2 3 3 低温菌p s e u d o m o n a ss p h d 8 产絮凝剂的成分分析结果1 8 2 4 本章小结。2 1 第3 章低温菌p s e u d o m o n a ss p h d 8 产絮凝剂的提取工艺优化2 2 3 1 试验材料一2 2 3 1 1 试验用药品及试剂_ 2 2 3 1 2 试验仪器2 2 3 2 试验方法。2 3 3 2 1 絮凝剂提取工艺的单因素优化试验。2 3 3 2 2 均匀设计法对絮凝剂提取工艺的优化试验。2 4 3 3 结果与讨论2 4 3 3 1 絮凝剂提取工艺的单因素优化试验结果2 4 3 3 2 均匀设计法对絮凝剂提取工艺优化的试验结果。3 7 3 4 本章小结3 9 第4 章低温菌p s e u d o m o n a ss p h d 8 产絮凝剂的纯化及结构鉴定4 0 4 1 试验材料。4 0 4 1 1 试验用药品及试剂：4 0 4 1 2 试验仪器4 0 4 2 试验方法一4 0 4 2 1 低温菌p s e u d o m o n a ss p h d 8 产絮凝剂的纯化试验4 0 4 2 2 低温菌p s e u d o m o n a ss p h d 8 产絮凝剂的结构鉴定试验4 3 一 第1 章绪论 第1 章绪论 目前常用的絮凝剂主要包括无机絮凝剂和有机絮凝剂两类。无机絮凝剂主要 是三价f e 3 + 和舢”的盐类，还包括硫酸锌、氯化锌、碳酸镁等；有机絮凝剂分人工 合成的和天然的两种【l 刃。无机絮凝剂在水中残留的高浓度的铝离子和铁离子具有 毒性和腐蚀性【3 】。合成有机高分子絮凝剂主要包括聚丙烯酰胺及其衍生物、同系物 等。它们的单体或水解、降解产物常常有毒性和三致效应( 致畸、致癌、致突变) 【4 】。天然有机高分子絮凝剂主要有碳水化合物类( 多聚糖类、淀粉类和单宁) 、壳 聚糖和甲壳素类、微生物絮凝剂类等【5 j 。该类絮凝剂易于生物降解且无毒性，无污 染，对环境保护和人类健康非常重要【6 】。 微生物絮凝剂( b i o f l o e c u l a n t ) 是一种新型的水处理药剂，可以通过生物技术， 利用微生物发酵、提取、纯化而得到r 刀。其主要成分有糖蛋白、多糖、蛋白质、纤 维素和d n a 掣引，其分子量一般在1 0 5 以上【9 】。具有作用范围广、絮凝剂产生茵 的种类多【1 2 1 、安全、高效、不污染环境以及易于实现工业化等特性。可以克服 传统絮凝剂本身固有的缺陷，是典型的环境友好型功能材料。在给水处理、发酵 行业以及生物制药领域可推广应用，具有良好的发展前景【1 3 】。 i i 微生物絮凝剂的研究现状 1 1 1 微生物絮凝剂的研究历史 18 7 6 年，l o u i sp a s t e u r 首次发现酵母菌( l e v u r e 徽，p p 淞p ) 具有絮凝作用【1 4 j ，且 与普通酵母相比絮凝酵母能够提高啤酒的质量。1 8 9 9 年b o r d e t 对细菌凝集现象进 行研究，并观察到可以凝集的细菌细胞。1 9 3 5 年，b u t t e r f i e l d 首先从活性污泥中分 离出一株絮凝剂产生菌，该菌通过代谢可以在培养液中形成凝结块1 1 5 1 。1 9 7 1 年， z a j i c 和k n e t t n i g 从煤油中分离出一株可产生多聚物的棒状杆菌，该物质对泥水有 黑龙江大学硕士学位论文 絮凝作用【1 6 1 。1 9 7 6 年，j n a k a m u r a 等人筛选出1 9 种絮凝剂产生菌，包括细菌、放 线菌、霉菌和酵母菌，其中酱油曲霉似s o j a e ) 产生的絮凝剂a j 7 0 0 2 对面包酵母的 絮凝效果最好【1 7 1 。1 9 8 5 年，h t a k a g i 等从拟青霉属( p a e c i l o m y c e ss p i 一1 ) 微生物的发 酵液中提取出絮凝剂p f l 0 1 ，其主要成分是半乳糖胺，对大肠杆菌、啤酒酵母、活 性污泥等均有良好的絮凝效果0 8 1 。1 9 8 6 年，r k u r a n e 等发现红平红球菌 饵e r y t h r o p o l i s ) 去除废水中酞酚酯的效率高，污泥沉降性良好，絮凝剂产品n o c l 用于有色废水的脱色时效果显著【1 9 1 。近年来日本、美国、泰国及以色列等国家对 微生物絮凝剂有很深入的研究。1 9 9 4 年，日本的k u r a n e 和m a t s u y a m a 等发现厄氏 菌属、不动杆菌属、土壤杆菌属和肠杆菌属可以协同作用产生絮凝剂【2 0 】。r k u r a n e 从土壤中分离出一株能产生多聚糖类絮凝剂的产碱杆菌( a l c a l i g e n el a t u sb 一1 6 ) 2 1 1 k s a k k a 筛选出一株假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p c 1 2 ) ，该菌的d n a 直接参与自身 细胞的絮凝嘲。m t a k e d a 瞄1 分离出一株放线菌能分泌一种絮凝性物质，成分为蛋 白质。h a r u h i k oy o k o i 等阱】从土壤中分离出一株芽孢杆菌，它可以产生主要成分为 谷氨酸均聚物的絮凝性物质。美国的c a r o l y nn a p o l i 等人，研究发现一种根瘤细菌 ( r h i z o b i u m 护和脚钨o ) 可以分泌一种具有絮凝性的纤维素【2 5 】。泰国的w d e r m l i m 等从活性污泥中分离出一种克雷伯式菌( k l e b s i e l l as p s i l ) ，该菌产生的酸性多糖为 絮凝剂的主要成分口6 】。以色列的n l e v y 等人发现一些海底蓝细菌能分泌一种含酮 酸的杂多糖，絮凝能力很强，并认为其絮凝机理是架桥作用f 2 7 l 。 国内对m b f 的研究起始于2 0 世纪9 0 年代，相对落后，大多处在菌种筛选和 菌株培养液对废水处理的实验室小试阶段 2 8 1 。尽管如此，我国的研究者在这一领 域仍然取得了一定的成绩。王镇等【2 9 1 筛选出四株絮凝能力较强的菌m f 3 、m f 6 、 m f 8 、m f 2 4 ；马放提出复合型生物絮凝剂的概念1 3 0 l ；周旭1 3 1 】利用鱼粉废水生产 出了性能良好的微生物絮凝剂p s d 1 ；陆茂林等分离的两株絮凝活性较高的诺卡氏 菌j i m 8 9 ，j i m 1 2 7 1 3 2 1 ；李剑【3 3 】采用乳制品废水培养g l 3 产生的生物絮凝剂对多 种工业废水有较好的絮凝效果；李良智等f 3 4 】分离到的c 眺口，i l y 刀酷8 7 2 4 ) 菌株，用 第1 覃绪论 于废水处理，固液分离效果良好，悬浮物、色度、浊度去除率均在9 0 以上；庄 源益筛选出6 株微生物，其发酵液对印染废水有良好的絮凝脱色作用 3 5 1 ；宫小燕 等1 3 6 】分离筛选的假单胞菌( a p 甜如m d 麟s p g x 4 1 ) 具有稳定的絮凝活性；黄民生分 离出3 株产絮菌q 1 ，q 2 ，y - 3 ，并发现菌株的发酵液可以去除土壤悬液的浊度， 对染料废水的色度去除率在9 2 左右【3 7 】；邓述波等【3 明筛选出一株芽孢杆菌a 9 ， 絮凝活性高，用量少，且不需添加助凝剂；游映玖【3 9 】从土壤中筛选出了具有絮凝 效果的y 5 菌株，并对其絮凝条件进行研究：李培等i 加】从污水厂的活性污泥中分 离得到产絮凝剂菌株n 2 ，并利用淀粉废水发酵生产微生物絮凝剂。 1 1 2 微生物絮凝剂的种类及产絮凝剂微生物的种类 1 1 2 1 微生物絮凝剂的种类 根据生物絮凝剂的来源可以分为4 类【4 l 】：( 1 ) 利用微生物细胞的絮凝剂。主 要包括一些存在于土壤、活性污泥和沉积物中的细菌、霉菌、放线菌和酵母1 4 2 j 。 絮凝机理是这些微生物可以将污水中有机物质的氧化分解，把大分子的有机物分 解成为小分子的有机物。( 2 ) 利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂。细胞的代谢产 物成分复杂，易与污水中的污染物质发生吸附沉降作用，起到去除污水中污染物 质的作用。s a a r a n a v e n t r i c u h t e c l 产生的胞外纤维可以附着于细胞外表面，从而使 这些细胞具有絮凝活性【4 3 】。该类絮凝剂的主要成分是多糖、多肽、蛋白质、脂类 及脂类复合物的细菌荚膜和粘液质m 。( 3 ) 利用微生物细胞壁提取物的絮凝剂。 微生物细胞壁提取物主要为含有羧基、氨基或烃基的长碳链，通过水解作用在水 中成为极性基团，在引力的作用下可以与污水中的异号电荷相吸引，最终由于重 力的作用而沉降下来【4 5 1 。该类絮凝剂的主要成分是脂多糖、蛋白质、磷壁质、n 一 乙酰葡萄糖胺、酵母细胞壁葡聚糖、甘露聚糖、褐藻酸和几丁质等【蛔；( 4 ) 利用 克隆技术而得到的絮凝剂。通过现代分子生物学理论和基因工程技术，把高絮凝 效果的基因转移到容易发酵的培养液中，构建高效遗传菌株，可以产生絮凝剂并 黑龙江大学硕士学位论文 且降解多种底物 4 7 1 。 根据产生物絮凝剂的菌种情况可以分为3 类：( 1 ) 纯种菌株及其代谢产生的 絮凝剂；( 2 ) 复合菌株及其所产生的生物絮凝剂【4 8 1 。如k m a n e 等分离的产絮凝菌 r 3 就是4 种菌株的混合体；( 3 ) 基因复合型微生物絮凝剂1 4 9 】，利用基因工程技术， 导外源絮凝基因，构建既具有絮凝活性又具有降解能力的菌株，可使污水处理效 率大大提高，具有相当高的应用价值。 1 1 2 2 产絮凝剂微生物的种类 絮凝剂产生菌是一类可以分泌絮凝剂和本身具有絮凝活性的微生物。至今发 现的具有絮凝活性的微生物达5 6 个种，其中细菌3 2 种，真菌1 1 种，放线菌5 种， 藻类3 种，酵母5 种。现将文献中【5 0 - 5 7 j 具有代表性的絮凝剂产生菌归纳如表1 1 。 表1 - 1 絮凝剂产生菌的种类 t a b l e1 - 1t h es p e c i e so f p r o d u c i n gb i o f l o c c u l a n t 第1 章绪论 i i i i i i _i i i - i iii i i i 1 1 3 微生物絮凝剂的絮凝机理 国内外在微生物絮凝剂絮凝机理方面只是提出了一些假说包括：( 1 ) 吸附架 桥学说、( 2 ) 病毒假说、( 3 ) 蛋白质沉淀假说、( 4 ) 絮凝胶体假说、( 5 ) 钙桥假 说、( 6 ) 电性中和学说类5 引、( 7 ) 荚膜学说、( 8 ) 疏水学说、( 9 ) b u t t e r f i e l d 粘质 假说、( 1 0 ) f r i e d m a n 菌体外纤维素纤丝学说、( 11 ) 离子键、氢键键桥学说、( 1 2 ) 三维基质模型假说、( 1 3 ) 类外源絮凝聚素假说等【5 9 1 。下面介绍几种目前得到普遍 认同的机理。 1 1 3 1 吸附架桥作用 关于絮凝机理较为普遍接受的是“架桥作用 i 删。絮凝剂多为半刚性的长链 大分子，在水中具有较好的伸展性和较大空间体积，可以借助静电引力、范德华 力等多种分子间作用力同时吸附多个胶体粒子，通过在颗粒间形成“胶粒一高分 子胶粒”的絮凝体产生架桥现象，从而形成一种网状三维结构沉淀下来。l e v y 以吸附等温线和( 电位测定证明环圈项圈藻p c c 6 7 2 0 所产絮凝剂对膨润土絮凝过 程确以桥联 机制为基础【6 1 1 。袁辉洲【6 2 】通过测定微生物絮凝剂对高岭土颗粒( 电 位的影响证明菌株g 1 5 的絮凝过程以吸附架桥现象最为明显。宫小燕6 3 1 通过吸附曲 黑龙江大学硕士学位论文 线和电位的测定表明p 口p 玎西口c f 朋淞p o l y m y x ab y - 2 8 产生的絮凝剂对高岭土悬液的 絮凝作用以吸附架桥为主。朱富坤删研究发现微生物絮凝剂p f 2 与高岭土颗粒通 过c a 寸以离子键形式结合，然后通过架桥作用絮凝沉淀。陈欢【6 5 1 研究发现絮凝剂 s c 0 6 的絮凝作用是因为其中的羧基与阳离子的架桥效应引起的。 1 1 3 2 电中和作用 生物絮凝剂多为带电荷的链状大分子，可以与污水中带相反电荷的胶体粒子 发生中和作用而充分靠拢，从而形成紧实的絮凝体，当胶粒足够大时，就会由于 重力的作用而沉降下来嗍。l e v y 6 1 1 在研究o 均帆d 6 船招一“m 肋d ，) w 砌”所s 仃a i l lj 1 产生 的絮凝剂f - j 1 时指出，在胶体颗粒的絮凝过程中，电中和效应也是不容忽视的。朱 艳彬【6 7 1 研究发现复合型生物絮凝剂h i 刑0 2 的絮凝机理包括蛋白质等两性电解质 的电中和作用。 1 1 3 3 卷扫作用 又叫网捕作用，在重力的作用下，絮凝剂形成的微小胶粒絮体在沉降的过程 中犹如一个过滤网迅速下降，卷扫水中胶粒而产生沉淀【嗍。卷扫作用基本是一种 机械作用。絮凝剂的用量与水中杂质含量成反比。 1 1 3 4 压缩双电层作用 絮凝剂可以使水中与胶粒上反离子具有相同电荷的离子浓度增加，这些离子 可与被吸附的反离子发生交换或挤入吸附层，从而使胶粒表面电荷数降低，减少 电位和扩散层厚度，有利于胶粒之间接近吸附脱稳，在重力作用下形成较大的絮 凝体后沉淀 6 9 1 。 1 1 3 5 “类外源絮凝聚素 假说 该学说主要用于解释酵母细胞的絮凝机理【4 2 】：酵母细胞壁上的特定表面蛋白 可以同其它酵母细胞( 絮凝和非絮凝细胞) 表面的甘露糖残基专一性结合从而引起 絮凝。絮凝的供体仅在絮凝细胞上发现，对蛋白酶敏感；受体存在于絮凝和非絮 凝细胞上，对蛋白酶不敏感。 第1 章绪论 1 1 3 6 “菌体外纤维素纤丝 学说 该学说主要是解释纤维素类絮凝剂的絮凝机理【刀：由于絮凝菌会在菌体外产生 纤丝，当不同菌体细胞接触时胞外纤丝会聚合形成絮凝物，从而产生絮凝现象。 微生物的絮凝过程是一个复杂的过程，是多种絮凝行为共同作用的结果。为 了更深入的理解，需要对不同絮凝剂的组成、结构、电荷、构象及各种反应条件 进行研列7 0 1 。 1 1 4 微生物絮凝剂在工业生产中的应用研究 微生物絮凝剂具有广谱的絮凝活性，不仅高效、安全、无二次污染，而且用 量少、对离子强度、p h 值及温度的的耐受性强，是传统絮凝剂的良好替代品，可 广泛的应用于工业废水处理及污泥处理等方面。 1 1 4 1 工业废水的处理 ( 1 ) 印染废水的脱色。黄民生等分离筛选出一株具有高效絮凝活性的动胶 菌属s h 一l ，实验表明以m 9 2 + 为助凝剂时，s h 一l 产生的絮凝剂对染料水溶液具 有较好的脱色效果，对酸性湖蓝a 水溶液的絮凝率可达8 0 。 ( 2 ) 废水悬浮颗粒去除。微生物絮凝剂n o c 1 1 7 2 主要用于处理高岭土、泥水 浆、粉煤灰等污水。沉降效果优于阳离子聚丙烯酰胺，处理陶瓷厂废水时浊度去 除率为9 7 9 ，处理坯体废水时浊度去除率可达9 6 6 。 ( 3 ) 高浓度有机废水处理。w i p al a p s i r o k u l 等【7 3 1 采用两段式厌氧絮凝的处理 工艺已成功的絮凝处理了高脂肪浓度的洗羊毛废水。梁峙吲通过正交试验发现某 白腐真菌所产的絮凝剂对煤泥水絮凝活性为9 8 7 1 。 ( 4 ) 造纸废水的处理。刘影【_ 7 5 】将微生物絮凝剂用于处理某纸箱厂废水，c o d 去除率接近5 5 ，氨氮去除率也达到8 9 。芦艳【硼利用絮凝剂粗制品对造纸污水 进行处理，絮凝率可达9 8 ，c o d 去除率为5 9 3 0 ，氨氮去除率大于9 6 。 ( 5 ) 畜牧场废水的处理。畜牧场废水中含有较高浓度的总氮( 耵d ，总有机碳 ( t o c ) 和b o d ，很难处理。研究表明【7 7 1 微生物絮凝剂可以有效地去除畜牧废水 黑龙江大学硕士学位论文 中的t n 和t o c 。r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 的发酵液对畜牧废水中的t n 和t o c 的去除率分别能达到4 0 和7 0 。同时废水中的o d s 6 0 值从8 6 下降到0 0 2 ，对废 水的脱色效果也很好。 ( 6 ) 发酵工业。生物絮凝剂对发酵液具有良好的絮凝沉降效果。研究表明采 用微生物絮凝剂来沉降发酵液中的菌体细胞不但可以大大减少能耗，而且操作简 单，因而有望成为取代传统的过滤或离心方法的新手尉j 7 l 。 1 1 4 2 污泥的处理 ( 1 ) 污泥沉降性能的改善。活性污泥处理系统常因污泥的沉降性能变差而处 理活性降低，在膨胀污泥中加入生物絮凝剂能有效地消除污泥膨胀状态，使污泥 容积指数快速下降，恢复污泥活性【7 8 1 。 ( 2 ) 污泥的脱水。用红平红球菌的发酵液在有c a 2 + 作为助凝剂的条件下处理 浓缩后的污泥，可以使污泥体积在2 0 m i n 内浓缩为原体积的9 2 。上清液的o d 6 6 0 值小于0 0 5 1 7 9 1 。如用微生物絮凝剂n o c 1 处理甘草制药废水生化处理过程中形成 的膨胀性污泥，可以使污泥的s v i 迅速从2 9 0 下降到5 0 ，并且恢复沉降能力【3 5 1 。 1 2 微生物絮凝剂的提取、纯化及结构特征 1 2 1 微生物絮凝剂的提取和纯化 微生物絮凝剂是以发酵液的形式获得的，其絮凝活性成分主要为多糖、蛋白 质类物质，容易被微生物利用而分解变质。未经任何处理时，发酵液一般只能保 存短短的几天，因而要将发酵液中的絮凝活性成分提取出来，以便于长期保存【硎。 生物絮凝剂的提取方法与一般的多糖和蛋白质的提取方法相似【8 1 1 。( 1 ) 发酵 液中菌体的去除。不同的微生物采用不同的方法，霉菌的发酵液采用过滤的方法 即可去除菌体；细菌、酵母菌则需用离心去菌体，离心条件一般为中高速 ( 5 0 0 0 1 0 0 0 0 r m i n ) 。( 2 ) 絮凝剂粗制品的获得。根据絮凝剂性质不同而采用不同物 质进行沉淀、盐析、萃取和分馏等【嘲，如蛋白质类絮凝剂可通过硫酸铵盐析获得， 第1 章绪论 多糖类絮凝剂可通过乙醇、丙酮、c p c ( 氯化十六烷基吡啶) ，盐酸胍等有机溶剂沉 淀得到；对于结构复杂的絮凝剂，可用酸、碱、有机溶剂等反复沉淀、溶解、盐 析、萃取等方法得到絮凝剂粗品。( 3 ) 絮凝剂纯品的获得。粗品溶于水，通过透 析、离子交换色谱、凝胶色谱、电泳等方法分离得到纯品。例如钱伟【8 3 】通过乙醇 沉淀，s e v a g e 法除蛋白，蒸馏水透析，真空干燥得到一株链球菌所产絮凝剂的粗产 品，再采用d e a e s e p h a d e x a 一2 5 和s e p h a r o s e 4 b 柱层析法获得该絮凝剂的纯品。下 面介绍几种常用的絮凝剂提取纯化方法。 ( 1 ) 有机溶剂提取法。用乙醇或丙酮沉淀法可以获得絮凝剂的粗制剂。有机 溶剂沉淀原理是通过加入乙醇、丙酮等有机溶剂，以降低多糖、蛋白质、核酸等 生物大分子在水溶液中的介电常数，从而降低其溶解度而使之沉淀出来删。将微 生物发酵液离心取上清，用同乙醇或丙酮以1 ：2 的比例低温提取2 4 h ，然后离心取 沉淀物，用不同浓度的乙醇或丙酮溶液洗，之后冷冻干燥，就可得到絮凝剂的粗 制剂。粗制剂可用于实验室的絮凝能力研究试验和工业用途【a s 。 ( 2 ) 离子交换色谱法。通过离子交换色谱法可以获得絮凝剂的纯品。该方法 的原理是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交 换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离【8 6 1 。 常用的纯化絮凝剂的离子交换剂包括纤维素类离子交换剂和多糖基离子交换剂， 如d e a e 5 2 、d e a e - s e p h a d e x a 一2 5 等。 ( 3 ) 凝胶过滤色谱法。凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具 有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。 层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖( 如葡聚糖或琼 脂糖l 类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除 在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就 按不同分子量筛分开了【明。常用的分离絮凝剂的填料有葡聚糖凝胶s e p h a d e x g 系列 及琼脂糖凝胶s e p h a r o s e 系列。 。一。? ? 。 黑龙江大学硕士学位论文 1 2 2 微生物絮凝剂的成分及结构特征 研究表明微生物絮凝剂的主要絮凝成分为糖类、蛋白质类、脂类和核酸类物 质。目前已发现的生物絮凝剂主要为糖类f 鼹】物质。例如p a e c i l o m y c e ss p i 1 产生的 絮凝剂p f 1 0 1 是由氨基半乳糖相连组成的粘多糖1 8 9 ；絮凝剂a p r - 3 的主要成分是 多糖，由葡萄糖、半乳糖、琥珀酸和丙酮酸组成。有一些絮凝剂为多肽、蛋白质 类1 9 0 1 物质，例如生物絮凝剂n o c 1 的主要成分即为蛋白质，含较多的疏水氨基酸。 目前仅发现一种脂类絮凝剂是1 9 9 4 年k u r a n e 从r e r y t h r o p o l i ss 1 的发酵液中得到 的，其分子中含有葡萄糖单霉菌酸酯( g m ) ，海藻糖单霉菌酸酯) ，海藻糖二霉 菌酸酯( 1 r i ) m ) 三种组分1 9 。还有些絮凝剂的主要成分为d n a1 9 2 。s a k k a 分离的假 单孢菌( p s e u d o m o n a s c 1 2 0 ) 菌体细胞凝集是由于其能分泌高分子量的天然双链 d n a 。光合细菌( r h o d o v u l u m s pp s 8 8 ) 分泌到胞外的d n a 亦直接参与絮凝1 9 3 。另 外糖蛋白类絮凝剂也占有一定比重。例如絮凝剂r e a 1 1 就是由半乳糖醛酸和微量 蛋白质组成的糖蛋白。a s p e r g i l l u s $ o j a ea j 7 0 0 2 产生的絮凝剂是一种聚糖胺和蛋白 质组成的糖蛋白【8 8 】。还有一些菌的代谢产物如p h b 、丫- 谷氨酸、聚磷酸盐、多聚 半乳糖醛酸等在一定情况下也会产生较强的絮凝活性【7 】。另外，有些絮凝剂中的无 机金属离子，如ca ；2 + ，m 矿，a ，和f 矿等也会发挥絮凝作用。 微生物絮凝剂具有种类多，结构性质各异及分子量高等特性。红外光谱分析 表明其化学结构中含有羧基、羟基、氨基和磷酸基等活性基团，这些官能团有助 于粘土的絮凝作用【舛】。已知微生物絮凝剂的微观结构有两种：( 1 ) 纤维状，这种 絮凝剂可以形成像棉絮一样的纤维，在絮凝体形成的过程作为颗粒间的连接物阱j 。 如厌氧诺卡氏菌( n o c a r d i aa m a r a e ) 产生的絮凝蛋白质；( 2 ) 球状，如从曲霉 ( a s p e r g i l l u s5 咖p ) 中获得的絮凝剂睇】和新型微生物絮凝剂d p 一1 5 2 等。 1 3 微生物絮凝剂研究中存在的问题及发展趋势 由于微生物絮凝剂的使用范围广泛，絮凝效率高，作用条件粗放，受温度和 第1 章绪论 p h 的影响较小，因此可以广泛应用于工业废水和污水处理中。目前国内微生物絮 凝剂的研究和应用大多处在实验室小试阶段：对产生菌的分离、筛选和培养，并 末大规模地生产与推广，且存在着生产成本较高的缺点，无法适应工业化生产的 需要。因此，寻找高效微生物絮凝剂产生菌、提高絮凝活性、降低絮凝剂用量及 生产成本是微生物絮凝剂的发展趋势： ( 1 ) 筛选微生物絮凝剂的高产菌株，选择替代性培养基，降低成本，利用高 浓度含氮有机废水及廉价原料进行微生物絮凝剂制备的工艺研究，打破生物絮凝 剂发展“瓶颈 【4 2 】。 ( 2 ) 利用生物技术对生物絮凝剂结构和絮凝机理的深入研究，深化生物絮凝 理论基础m 。 ( 3 ) 充分利用克隆技术研究生物絮凝剂的基因控制与表达，将其植入来源广、 易培养、繁殖快的工程菌中，使其大量表达，提高絮凝率嗍。 ( 4 ) 对复合型絮凝剂的研究，将微生物絮凝剂与其它絮凝剂配合使用，提高 絮凝效率【4 8 】。 1 4 课题研究的目的、意义及研究内容 1 4 1 课题研究的目的、意义 目前国内外研究的产絮凝剂微生物大多是中温菌，在低温菌方面的研究还很 少。我国北方地区气候寒冷，全年的冰冻期长，冬春季节水温可降至o 2 ， 若能得到低温微生物絮凝剂并用于污水处理，则对北方地区冬季低温污水的处理 具有重要意义。 本研究使用的低温微生物是从低温生物反应器中筛选的一株具有高絮凝活性 的絮凝剂产生菌p s e u d o m o n a ss p h d 8 ，适合在低温下生长并有絮凝作用。本研究 主要对这株低温菌所产絮凝剂进行提取，并进一步分离纯化和结构鉴定，目的是 得到这种絮凝剂的有效成分，为日后絮凝机理的研究和微生物絮凝剂的工业化生 黑龙江大学硕士学位论文 产奠定实验和理论基础。 1 4 2 课题研究内容 本研究主要对实验室筛选得到产絮菌p s e u d o m o n a ss p h d 8 所产絮凝剂进行提 取，并进一步分离纯化和结构鉴定。本课题的研究主要包括以下几方面： ( 1 ) 絮凝剂提取工艺的优化。考察的单因素有发酵液的离心转数、离心时问、 沉淀剂种类、沉淀剂用量、上清液浓缩倍数与超声处理条件。并采用均匀设计法 优化絮凝剂的提取工艺。 ( 2 ) 絮凝剂粗制品的成分分析。包括定性分析及定量分析试验。 ( 3 ) 絮凝剂的纯化。采用s e v a g e 法及柱层析法分离絮凝剂中的有效成分。 ( 4 ) 絮凝剂纯品的结构鉴定。包括絮凝剂单糖的种类的分析，基团分析及分 子量的测定。 q 一萘酚、葸酮、间苯二酚、硫酸铜、葡萄糖、硫酸、考马斯亮蓝一g 2 5 0 、牛血清 白蛋白、乙酰丙酮、对二甲氨基苯甲醛、盐酸、氨基糖、葡萄糖醛酸。 2 1 3 培养基 ( 1 ) 葡萄糖培养基：葡萄糖2 0 9 ，脲0 5 9 ，酵母膏0 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ， k i - 1 2 p 0 42 9 ，k 2 h p 0 45 9 ，n a c l0 1 9 ，( n t h ) 2 s 0 4o 2 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p n7 0 ， 1 1 2 灭菌3 0 m i n 。 ( 2 ) 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 9 ，蛋白1 0 9 胨，n a c l 5 9 ，琼脂l g g 溶 于1 0 0 0 m l 蒸馏水中，调p h 值至7 0 - - 7 2 ，1 2 1 高压湿热灭菌2 0 m i n 。 2 1 4