（微生物学专业论文）神灵杆菌脂多糖工艺及质量研究.pdf

中文摘要 中文摘要 神灵杆菌脂多糖是从粘质沙雷氏菌细胞壁中提取的一种脂多糖类药物，它可 诱导多种免疫抗体的产生，增强机体主动免疫的能力，具有抗炎、抗菌、抗感染 等多种功效，广泛应用在临床中。 目前，神灵杆菌脂多糖的制备工艺、质量标准、临床研究还不够透彻，因此， 本课题以粘质沙雷氏菌( s e r r a t i am a r c e s c e n s ) 为出发菌株，紫外诱变筛选出高产优 良菌株，对其进行1 6 sr d n a 基因序列分析及生理生化鉴定；利用发酵罐培养高 产菌株，并进行发酵工艺参数的优化，同时提取、纯化神灵杆菌脂多糖，对其药 理毒理、免疫学等进行深入研究。结果表明： 1 、紫外诱变筛选菌种，选取照射时间2 0 - - 2 5 s 致死率为7 0 0 , - 8 0 的菌悬液进 行高产菌株的筛选，平板初筛得到8 株菌，与出发菌株s n o 同时进行摇瓶复筛， 其菌体生物量达到1 4 9 3 m g 10 0 m l ，命名为s h 1 。 2 、1 6 sr d n a 基因序列分析结果表明，s h 1 与数据库中已有的s e r r a t i a m a r c e s c e n ss t r a i nh 3 0 1 01 6 sr i b o s o m a lr n ag e n e ( e f l 9 4 0 9 4 1 ) 等多株菌相似性都 为9 9 ；在扫描电镜观察的基础上，s h 1 生理生化鉴定结果与粘质沙雷氏菌具有 9 9 的相似性。 3 、通过对温度、通气量、搅拌速度、p h 在发酵罐运行中的考察，确定发酵 罐性能稳定，可以进行发酵生产；采用发酵罐培养神灵杆菌的最佳工艺参数为： 温度3 0 ，通气量2 5 l r a i n ，搅拌速度1 6 0 r m i n ，发酵时间7 2 h 。 4 、发酵所得神灵杆菌菌体经丙酮提取、机械破碎、除蛋白制得神灵杆菌脂多 糖粗品，s e p h a d e xg 1 5 0 纯化，高效液相色谱分析表明，实验所制得的神灵杆菌 脂多糖基本符合国家标准。 5 、通过对小白鼠药理毒理学研究表明神灵杆菌脂多糖安全、可靠；免疫学特 性研究结果显示，神灵杆菌脂多糖具有吞噬细胞、升高白细胞、抗菌、增强机体 免疫等作用。 关键词：神灵杆菌脂多糖；1 6 sr d n a ；免疫活性 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ep r o d i g i o s i ni sa nl i p o p o l y s a c c h a r i d e sd r u g ，w h i c hi se x t r a c t e df r o mc e l lw a l l o fs e r r a t i am a r c e s c e n s i th a sal o to fe f f c a c i e so fa n t i i n f l a m m a t o r y ，a n t i s e p s i sa n d a n t i - i n f e c t i o n , a tt h es a m et i m e ，i tc a ni n d u c ee m e r g i n go fm a n yi m m u n ea n t i b o d i e si n o r d e rt os t r e n g t h e nt h ea c t i v ei m m u n i z a t i o na b i l i t yo fo r g a n i s m ，i ti sw i d e l yu s e di n c l i n i c b u tt h ep r e p a r i n gt e c h n o l o g y ，q u a l i t ys t a n d a r da n dc l i n i c a lr e s e a r c ho fi ta r en o t w e l lk n o w n , s ot h i sa r t i c l eu s e ss e r r a t i am a r c e s c e n sa sp r i m i t i v es t r a i n ，a tt h es a m e t i m e ，e x c e l l e n ta n dh i g hp r o d u c to fs t r a i n sw e r es c r e e n e db yu l t r a v i o l e tm u t a g e n e s i s ， a n d16 sr d n a g e n es e q u e n c ea n a l y s i s ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o n w e r ec o n d u c t e d ；f e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r sw e r eo p t i m i z e dt h r o u g h c u l t u r i n gs e r r a t i am a r c e s c e n sb yf e r m e n t e r , e x t r a c t sa n dd e p u r a t e sp r o d i g i o s i n a tt h e s a m et i m ei tw e r er e s e a r c h e da b o u tp h a r m a c d o g y ，t o x i c o l o g ya n di m m u n d o g y c h a r a c t e ri s t i c s r n l er e s u l ts h o w s ： 1 t h es t r a i n sw a sd e a l 晰mb yu l t r a v i o l e tm u t a g e n e s i s ，h i g hp r o d u c ts t r a i n sw a s s c r e e n e dw h e nt h el e t h a l i t yo ft h es t r a i n ss u s p e n s i o n sw a s7 0 0 0 - - 8 0 a n dt h et i m eo f e x p o s u r ew a s2 0 2 5 s e i g h ts t r a i n sw a ss c r e e n e df i r s t l yb yt h ew a y o fp e t r id i s h t h o s e a n dp r i m i t i v es t r a i n so fs h 0w a sr e s c r e e n e db ys h a k ef l a s k t h eb i o m a s so fs t r a i n s b o d yw a sa b o u t1 4 9 3 m g 1 0 0 m la n dn a m e da ss h - 1 2 t h er e s u l to f16 sr d n ag e n es e q u e n c ea n a l y s i ss h o w st h a tt h es i m i l a r i t yo f s h 一1a n ds e r r a t i am a r c e s c e n ss t r a i nh 3 0 1 01 6 sr i b o s o m a lr n ag e n e ( e f l 9 4 0 9 4 1 ) i nd a t a b a s ec a nb e9 9 t h eh e t e r o g e n i c i t yo fp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o nr e s u l tb e t w e e nt h es h 1a n ds e r r a t i am a r c e s c e n sa r e9 9 i nt h eb a s eo f s e m 3 i tm a d es u r et h a tf u n c t i o no ff e r m e n t e rw a ss t a b l eb yi n s p e c t i n gt e m p e r a t u r e ， a b s t r a c t v e n t i l a t o r yc a p a c i t y ，s t i r r i n gs p e e d ，p h ，s oi tw a sf e a s i b l et of e r m e n t a t i o n ；t h eb e s t t e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e ro fc u l t u r i n gs e r r a t i am a r c e s c e n s 诵t l l f e r m e n t e rw a s t e m p e r a t u r eo f3 0 c ，v e n t i l a t o r yc a p a c i t yo f2 5 i ，m i n ，s t i r r i n gs p e e do f16 0 r m i n , f e r m e n t i n gt i m eo f7 2 h 4 t h ec r u d e p r o d i g i o s i nw a sm a d ef r o ms e r r a t i am a r c e s c e n sf e r m e n t e dt h r o u g h a c e t o n ee x t r a c t i o n ，m e c h a n i c a ld i s r u p t i o n ，a n dd e p r o t e i n i z a t i o n t h es e p h a d e x g 一15 0 p u r i f i c a t i o na n dh p l ca n a l y s i ss h o wt h a tt h ep r o d i g i o s i no b t a i n e di ne x p e r i m e n t sw a s a c c o r d e dw i t hn a t i o n a ls t a n d a r d 5 t h er e s e a r c ho fp h a r m a c o l o g ya n dt o x i c o l o g yo i lm o u s ei n d i c a t e st h a tt h e p r o d i g i o s i nw a ss a f ea n dr e l i a b l e ；t h er e s u l to fi m m u n o l o g yc h a r a c t e r i s t i c ss h o w st h a t t h e p r o d i g i o s i nh a st h ee f f e c t so fp h a g o c y t e ，h e i g h t e nl e u c o c y t e ，a n t i b a c t e r i a l ， r e i n f o r c i n gi m m u n i z a t i o no fo r g a n i s m k e yw o r d s ：p r o d i g i o s i n ；16 sr d n a ；i m m u n o c o m p e t e n c e - i i i 黑龙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名：茔违肇 签字日期：j 彬矿年多月多日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉堑太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉堑太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 躲萋学节翩虢名砷 签字日期：a 仍年，月6 日 签字日期：加o 年月彩日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第1 章绪论 1 1 多糖的概述 1 1 1 多糖简介 第1 章绪论 多糖是醛糖和( 或) 酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物，是构成生命的基本 物质，广泛分布于动植物体和微生物细胞壁中，在生物体的代谢过程中起着重要 作用【l - 2 】。随着人们对多糖的研究越来越多，发现它在免疫调节【3 一q 、抗肿瘤【5 1 、抗 疲劳及降血糖等方面具有独特的功效，如当归多糖能直接激活b 细胞并间接激活 辅助性t 细胞，提高机体免疫 6 1 ；细脚拟青霉多糖( p a e e i l o m y e e st e n u i p e s p o l y s a e e h a r i d e ) j m 过诱导小鼠巨噬细胞n o 合成和i n o sm r n a 的表达，促进脾细 胞的增殖，发挥免疫调节作用 7 1 。随着对多糖结构和免疫功能的研究，将会产生 生物学研究的新方向，加快药学和医学的飞速发展。 多糖种类众多，按来源可分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖等，其中微 生物多糖以其生产周期短、原料来源广等特点，具有较强的市场前景和广阔的发 展潜力。 1 1 2 微生物多糖研究状况 微生物多糖主要指真菌多糖和细菌多糖，根据结构可分为肽聚糖、葡聚糖和 脂多糖。微生物多糖广泛应用在石油、化工、食品、医药保健等多个领域瞵j ，对 工业生产和人们的生活有着重要的意义。 我国对微生物多糖的研究最早是从1 9 8 5 年鉴定黄原胶开始，发展态势迅猛， 目前已经利用现代生物技术如基因工程、细胞工程等方法来研究野油菜黄单胞菌 生物合成黄原胶的遗传机理【9 1 0 1 。微生物多糖用途广，应用前景好，开发微生物 黑龙江大学硕士学位论文 多糖产品，扩大产品市场在多糖未来发展进程中意义非凡。因此，需要对产生微 生物多糖的菌种选育、发酵工艺的优化、多糖结构和代谢途径等进行深入研究， 开发出更多的新型微生物多糖，为制药保健提供新的选择。 1 1 3 脂多糖生物活性研究进展 1 1 3 1 脂多糖的结构特点脂多糖( l i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) 是革兰氏阴性菌细胞 外壁中的主要成分，由类脂a 、核心多糖( c o r ep o l y s a e c h a r i d e ) 和o 一特异侧链 ( 0 s p e c i f i cs i d ec h a i n ) 组成。其结构由亲水性的多糖及疏水性的类脂质a ( l i p i d a ) 构成，类脂a 是脂多糖结构中最稳定的部分，无种属特异性，也是脂多糖的毒性 和生物活性中心i l lj 。 1 1 3 2 脂多糖生物学活性l p s 可激活生物体效应靶细胞诱导多种活性因子的产 生【1 2 。1 3 1 ，是一种非常有潜力的免疫调节剂。一方面，l p s 的毒性发生机理是在使 用抗生素治疗疾病时，l p s 可以在细菌周围形成保护膜，抵御抗生素的侵袭。如 l p s 作用于机体后可以刺激机体产生肿瘤坏死因子( t u m o rn e c r o s i sf a e - t o r , t n f ) 、 白细胞介素( i n t e r l e u k i n , i l ) ( i l 1 、i l ，6 ) 、干扰素、集落刺激因子等多种细胞因子， 从而产生大量的活性氧，可引起机体发热、弥散性血管内凝血、多脏器衰竭等临 床综合征【l 6 - 1 。另一方面，l p s 生物活性主要体现在能激活b 淋巴细胞、t 淋巴 细胞、巨噬细胞等免疫细胞，促进细胞因子生成及白细胞增生等，从而起到免疫 调节的作用。如t l 是l p s 诱导的腿信号途径的启动因子，l p s 通过激活 风，启动信号转导，产生特异性的免疫应答，介导天然免疫和炎性反应【l 丌。因 此，从细菌体内提取具有多种生理活性的l p s ，不仅可引起病理性改变，还可以 提高机体对肿瘤、感染的防御能力。如神灵杆菌腊多糖作为一种生物药品，不仅 具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗感染的特性，还有提高机体免疫的能力。 第1 章绪论 1 2 神灵杆菌脂多糖的研究概况 1 2 1 神灵杆菌脂多糖简介 粘质沙雷氏菌( s e r r a t i am a r c e s c e n s ) 是革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，属于肠杆菌 科( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 沙雷氏菌属( s e r r a t i a ) ，广泛存在于水、土壤中，它是一种条 件致病菌，具有很强的耐药性【1 8 1 。从粘质沙雷氏菌的细胞壁中提取的多糖复合物 称之为神灵杆菌脂多糖，亦称灵杆菌素【1 9 1 。早在2 0 世纪7 0 年代国外学者就对神 灵杆菌脂多糖的提取、分离纯化、生物合成及其特性做了基础性研究【2 4 】；国内 学者则是对粘质沙雷氏菌抗原寡糖片段的合成、细菌胞内自由氨基酸库含量和组 成进行了研究【2 5 硼。临床药理学实验证明神灵杆菌脂多糖是一种超抗原，可诱导 多种免疫抗体的产生，进而增强机体主动免疫的能力【27 。虽然目前对神灵杆菌脂 多糖的工艺研究还停留在实验室水平上，而且对其药理毒理等作用机制研究的还 不够深入，但是它在抗菌、抑癌、提高免疫力等方面的突出作用是不容忽视的。 1 2 2 神灵杆菌脂多糖的临床应用 1 2 2 1 免疫调节作用神灵杆菌脂多糖作为一种免疫调节制剂，能够诱导机体产生 免疫抗体，如抗体i g m 、i g g 、i g a 等，从而提高机体免疫调节的能力。陈艳才等 通过对恶性肿瘤化疗后白细胞减少症的治疗得出神灵杆菌脂多糖可以增加白细胞 数目，适用于骨髓造血功能正常的白细胞减少症患者【2 8 乏9 】。 1 2 2 2 抗病毒作用神灵杆菌脂多糖抗病毒的作用机理主要是诱导机体产生各种 干扰素，激活蛋白酶，抑制病毒蛋白合成；同时激活腺苷酸环化酶，磷酸酯酶及 钙离子通道，活化巨噬细胞，增强吞噬细胞的能力；另外还可激活细胞中的内切 核酸酶来降解病毒的m r n a 及细胞的r n a ，达到杀伤病毒细胞的目的。p a n i n - l e 等人通过动物药理实验证明，神灵杆菌脂多糖对肝组织的细胞增殖和修复有促进 作用 3 0 - 3 1 】；可以激活脑下垂体肾上腺素皮质系统，调整机体适应内部环境变化， 黑龙江大学硕士学位论文 增强机体防御病毒等病原微生物的侵袭。另外，在临床治疗中，对各类病毒感染 性皮肤病比如带状疱疹，单纯性疱疹【3 2 1 等均有明显效果，给广大的皮肤病患者带 来福音。 1 2 2 3 妇科感染类疾病的疗效神灵杆菌脂多糖对妇科炎症如盆腔炎、宫颈炎、附 件炎等均有一定的治疗效果，不同于其它治疗妇科炎症的药物，它能有效提高机 体免疫细胞数量、增强吞噬细胞的能力，对孕妇的效果显著( 不伤害婴儿) ，黑龙 江省应用微生物所在研究神灵杆菌脂多糖治疗1 6 0 例典型慢性顽固性盆腔炎患者 时得出：单独使用神灵杆菌脂多糖治疗有效率为9 1 ，联合抗生素使用总有效率 为1 0 0 ，高于单独使用。 1 3 神灵杆菌脂多糖工艺研究存在的问题及对策 1 3 1 神灵杆菌脂多糖工艺质量研究存在的问题 由于神灵杆菌脂多糖特殊的药理作用和确切的临床疗效，受到国家主管部门 高度重视，作为国家重点整顿的生物药物品种，经过反复验证，质量标准已被国 家药品标准所收载，但由于前期研究工作深度不够，在生产和质量管理方面还存 在着许多疑难问题，严重制约着神灵杆菌脂多糖在临床上的推广应用，主要表现 在以下几个方面： 对原材料控制不严格，神灵杆菌脂多糖的产生菌粘质沙雷氏菌，如菌 种鉴定、发酵条件、脂多糖提取、半成品纯化的生产制备工艺等在国家标准中没 有进行严格的规定，影响产品质量均一性，最终无法确保产品质量的稳定性，给 患者用药带来安全隐患。 国家标准中缺少神灵杆菌脂多糖特异性的质量检验手段，在其提取制备过 程中没有全面的、针对性高的质量监控体系跟踪，以致脂多糖的稳定性、有效性 及安全性无法控制。 提取工艺落后，方法陈1 日；生产工艺所需设备过于原始，研究还多停留在 第1 罩绪论 实验室小规模发酵，缺乏创新；生产的产品质量控制不规范，产品纯化过程没有 系统、高效、特异的质量监测手段，影响产品杂质限量标准的制定。 许多先进的分析手段和生物分析技术在监测过程中没有应用到药品的质量 控制中( 如h p l c 、m c 、s d s - - p a g e 等) ，以致神灵杆菌脂多糖在临床应用过程 中，不良反应和副作用经常发生，限制了临床应用及推广使用。 缺乏对质量稳定性和安全性控制方面的研究，这给药品的储存及运输带来 不便，同时也给临床合理用药带来了许多不利因素。 药品的制剂处方研究不充分，在很大程度上限制了神灵杆菌脂多糖新剂型 的开发，违背了临床合理用药。 神灵杆菌脂多糖免疫促进、抗病毒、抗感染、抗肿瘤方面的基础性研究较 少，这也是制约神灵杆菌脂多糖进一步研究的关键因素之一。 1 3 2 提高神灵杆菌脂多糖工艺质量研究的对策 建立一套完整的神灵杆菌脂多糖工艺质量保证体系，是解决阻碍神灵杆菌脂 多糖发展的重要措施。应用先进的分析技术手段，全面、完整地研究神灵杆菌脂 多糖质量控制方法具有重要的现实意义，以神灵杆菌脂多糖质量控制研究为前提， 将会大力推动我国生物药物的质量管理，促进科研创新。因此，对神灵杆菌脂多 糖工艺质量的进一步研究，需在前人研究的基础之上，从菌种来源及其鉴定、发 酵工艺优化等方面着手。 1 3 2 1 菌种来源及其鉴定优良的菌种是微生物发酵的关键，要求菌种具有需氧 低，发热量少，容易进行基因改良，原料廉价易得等条件【3 3 1 。菌种改良被广泛应 用在食品与药品行业中，如传统的酱油、黄酒等产品的发酵采用优选菌种，不仅 提高了原料的利用率，同时也改善了产品的风味【3 4 1 。通常采用微生物诱变的方法 筛选优良菌种，以适应工业化生产。 微生物诱变育种一般采用物理诱变、化学诱变和生物诱型3 5 】，即以某种手段 诱发微生物基因突变，改变遗传结构及其功能，并从多种突变株中筛选出产量高、 黑龙江大学硕士学位论文 性状优良的菌株，科学优化突变株的发酵培养条件，获得高效的目的产物。如申 玉香f 3 6 1 、w a l i dal o f t y 等通过紫外线诱变菌株，大大提高了原始菌株的发酵活 性，提高了产品收率。 传统的微生物鉴定主要是根据菌落形态特征、生理生化特征检测，自2 0 世纪8 0 年代开始，微生物鉴定体系逐渐发展，自动化程度也越来越高，但基本上 也都是以基因和生理生化为鉴定基础。随着基因组全序列测序的顺利完成，1 6 s r d n a 基因序列鉴定应用的也越来越多。 1 6 sr d n a 是细菌染色体上编码1 6 sr r n a 相对应的d n a 序列( r r n a 是重要 的衡量指标，它在生物中高度保守，并有“生物化石”之称f 3 s j ) ，存在于所有细菌染 色体基因中，它的内部结构由保守区和可变区两部分组成。因此可用p c r 扩增其 相应的r d n a 片断，快速检测样品中是否存在细菌或致病菌【3 9 删、细菌多样性分 析以及环境中细菌重新分类f 4 n 。 从上世纪7 0 年代以来，科学家们因1 6 sr r n a 的保守性，对其进行了大量研 究工作，现在已对1 6 sr d n a 序列有了清晰的认识【4 2 】。细菌1 6 sr d n a 全长约 1 5 4 0 b p ，片段长度适中，信息量大易于研究。在细菌的1 6 sr d n a 中有多个高度 保守区段，据此可以利用细菌的特异性通用引物( 引物不会与非细菌的d n a 互 补) ，扩增出所有细菌的1 6 sr d n a 片段，由细菌1 6 sr d n a 可变区的差异来区分 不同的细菌，因此1 6 sr d n a 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记 分子。 1 6 sr d n a 序列分析技术与其它细菌鉴定方法比较，具有高效、准确、简单、 特异性强等优点，运用1 6 sr d n a 序列分析技术对细菌进行分类鉴定，确定其在 进化中的位置，已成为细菌分类学中最重要的方法。如李吕木在山羊瘤胃液中分 离纯化出一株甲硫氨酸降解菌m b 6 1 ，采用p c r 方法扩增其1 6 sr d n a ，测定基 因的核苷酸全序列h 3 1 ；洪斌用p c r 方法扩增了一株石油降解菌株g 5 的1 6 sr r n a 基因全序列，对其进行克隆和测序【蜘；张卫从试验土壤中分离到一株高效降解阿 维菌素的菌株，经p c r 扩增、测序，将所测序列通过在线b l a s t 程序与g e nb a n k 中核酸数据进行比对，并进行系统发育学分析【4 5 1 。 6 第1 罩绪论 1 3 2 2 发酵生产工艺的优化发酵技术对微生物发酵来讲至关重要，通常按对氧 的需求情况分为需氧发酵和厌氧发酵；按培养基的相态分为液态深层发酵和固态 发酵【4 “3 】；按发酵工艺过程的连续性分为分批发酵和连续发酵等。如神灵杆菌采 用液态发酵技术对菌体进行扩大培养，与固态发酵相比它具有出产率高、周期短、 发酵速度快、自动化程度高、产品质量稳定等优点，而选择适宜的发酵条件则是 发酵罐培养神灵杆菌获得大量菌体的必要条件。 目前发酵技术广泛应用在医药、食品、农业、环保等领域中，生产的抗生 素大部分是发酵的产品，如b t 4 9 1 、井冈霉素【5 0 1 和螺旋藻【5 i 】等。因此，为达到发 酵工程高产值目的，选择高效和性能稳定的“发酵菌株”是前提条件；发酵过程的 优化控制，是使产品收率高、生产能耗低的关键步骤【5 2 1 ，如机理分析建模酬、黑 箱建模1 5 4 - 5 6 1 、混合建模【5 7 删等方法已经应用到发酵过程优化控制中，方法有效可 行，在实际应用中取得了很好的效果。最后对发酵过程进行后期处理，获取所需 要的理想产品。 因此，我们应该充分利用微生物资源、构建微生物工程菌种，发酵生产诸多 产品，从中寻求更加安全有效的新药，为人类的健康努力。 1 3 2 3 生物药品的质量控制首先，需要对生物药品的产生菌种进行筛选、优化， 确保其高产、性能稳定的特性，以便用于发酵培养，生产制备目的产物。 其次，生物药品与普通药品不同，要求原辅材料种类多且质量好，生产检验 的可重复性低。原辅材料的采购要经过严格检验，按照标准进行，经检验合格后 方可投入生产。为保证生物药品的质量，应挑选信誉良好的企业采购原辅料。 最后，质量控制是为保持某一产品生产过程或服务过程的质量，满足规定要 求所采取的作业技术活动【6 1 】。生物药品因其采用的原辅料为生物活性物质，外界 因素干扰时会改变特性，在中间产品及成品检验时往往查不出某些质量问题。因 此，对生物药品生产全过程必须全程监控，才会使最终产品符合质量要求。 产品质量是各行各业追求的根本，生物药品行业更应完善规范质量管理体系， 保证生物药品的质量，从而为人类提供安全可靠的药品，解决广大患者的痛苦。 黑龙江大学硕士学位论文 1 4 本课题研究的内容和目的 本课题通过紫外诱变筛选出高产优良神灵杆菌，确定其生理生化特性，并采 用基因手段对菌种进行鉴定，以确保诱变菌株的高产稳定性；分离提取纯化制得 神灵杆菌脂多糖，进行定量分析、药物安全性验证、免疫学研究，进一步探讨其 药理作用机制，为提高产品质量，工业化生产制备提供依据。 工艺路线图如下： 粘质沙雷氏菌 f 叫紫外诱变、复筛 高产优良菌株s h 1 发酵罐培养 上 分离提取神灵杆菌脂多糖 上 药理毒理免疫学研究 药 理 毒 理 免 疫 学 实 验 抑 菌 实 验 菌种鉴定 菌 体 形 态 观 察 田 。 生 理 生 化 鉴 定 蓊 邑 否 第2 章神灵杆菌菌种改良及毒力测定 2 1 前言 第2 章神灵杆菌菌种改良及毒力测定 本章通过紫外诱变筛选出神灵杆菌优良菌株，对其进行平板初筛、摇瓶复筛， 使之保持高产稳定的特性，作为发酵罐培养神灵杆菌的发酵菌株；同时选择小白 鼠为实验动物进行毒力测定，初步观察神灵杆菌在小白鼠体内的生长情况，并求 出其半数致死量。 2 2 实验材料与仪器设备 2 2 1 实验材料 2 2 1 1 菌种神灵杆宦f l ( s e r r a t i am a r c e s c e n s ) , 黑龙江大学药理实验室保存( 西林瓶 冻干) 2 2 1 2 动物昆明种小鼠，体重2 0 - - 2 2 9 ，雌雄各半，哈尔滨肿瘤医院动物房提供 2 2 1 3 主要试剂及材料 生理盐水( 0 9 ) l 半胱氨酸 牛肉膏 蛋白胨 琼脂 氯化钠 葡萄糖 n a 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 t w e e n 8 0 注射液 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 乳化剂 哈尔滨三联药业有限公司 武汉远成共创科技有限公司 北京奥博星生物技术有限责任公司 北京奥博星生物技术有限责任公司 s a n l a n dc h e m i c a lc o ，l t d 天津科密欧化学试剂有限公司 天津市瑞金特化学品有限公司 天津市光复精细化工研究所 天津市双船化学试剂厂 北京奥博星生物技术有限责任公司 黑龙江大学硕士学位论文 2 2 2 仪器设备 紫外可见分光光度计 水浴恒温振荡器 电热恒温培养箱 高压灭菌锅 电子天平 超净台 紫外灯 振荡器 显微镜 移液枪 冰箱 托盘天平 血球计数板 注射器 秒表 手术器械 玻璃仪器 2 3 菌种改良 2 3 1 培养基配制 7 5 2 型 s h a c h hb 1 l4 2 0 s y x q s g 4 6 - 2 8 0 p l 2 0 3 s z x 2 0 w s 1 x s 2 1 2 2 0 1 1 0 0 皿、1 0 0 0 此 b c d 2 1 6 ft b y p l 2 0 1 y a x b l0 0 l m l d m l 0 3 上海光谱仪器有限公司 江苏恒丰仪器厂 上海跃进医疗器械厂 宁波市镇海金鑫医疗器械有限公司 梅特勒托利多仪器有限公司 南通科学仪器厂 广东省同为光源惠州有限公司 北京金北德工贸有限公司 南京江南永新光学有限公司 大龙医疗设备有限公司 青岛海尔股份有限公司 上海精科 江苏省盐城市恒泰玻璃仪器厂 上海康寿医疗器械有限公司 上海星钻秒表有限公司 蛇牌新华手术器械有限公司 天津玻璃仪器厂 2 3 1 1 固体培养基精密称取牛肉膏5 9 、蛋白胨1 0 9 、氯化钠5 9 、葡萄糖2 0 9 、琼 脂2 0 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l 、p h 7 2 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n ，冷却后3 7 * ( 2 培养2 4 h ，检查 无菌，放入4 。c 冰箱备用。 第2 章神灵杆菌菌种改良及毒力测定 2 3 1 2 液体培养基精密称取葡萄糖8 9 、蛋白胨8 卧酵母膏6 9 、牛肉膏2 昏氯化 钠6 9 、k 2 h p 0 44 9 、k h 2 p 0 4l g 、蒸馏水1 0 0 0 m l 、p h 7 2 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n ，冷 却后3 7 c 培养2 4 h ，检查无菌，放入4 。c 冰箱备用。 2 3 2 出发菌株筛选 取神灵杆菌冻干粉0 1 9 生理盐水溶解至1 0 0 m l ，取1 0 0 1 t l 涂布平板固体培 养基上，3 0 。c 培养4 8 h 。选择菌落数目约为2 0 个的平板，挑取较大、界限清晰、 呈鲜红色长势良好的单菌落作为紫外诱变的出发菌株，取其菌体于生理盐水和玻 璃珠的三角瓶中制成无菌菌悬液5 0 0 m l ，3 0 、2 5 0 r m i n 水浴4 h ，制备成 10 6 c f u m l 的诱变菌悬液，备用。 2 3 3 菌株诱变及致死率的确定 紫外灯预热2 5 m i n ，分别取2 3 2 诱变菌悬液1 0 m l 置于多个平板( d = 9 c m ) 中， 均匀放置紫外灯下2 5 e m 处照射不同的时间( 0 s ，1 0 s ，1 5 s ，2 0 s ，2 5 s ，3 0 s ，3 5 s ， 4 0 s ，4 5 s ，5 0 s ，5 5 s ，6 0 s ) ，然后分别从每个平板中取出l m l 的菌悬液生理盐水 定容至1 0 m l ，逐级稀释至1 0 、1 0 2 、1 0 0 、1 0 4 、1 0 一、1 0 石倍，取各个梯度的稀 释液1 0 0 1 x l 在暗处涂布平板固体培养基上，3 0 培养2 4 h 后取出，挑取长势良好 的菌落，试管斜面固体培养基保存，进行高产菌株的筛选。同时，用未照射的菌 悬液做空白对照，计算紫外诱变致死率。 致死率= 麓雾瓣 ( 公式2 1 ) 黑龙江大学硕士学位论文 2 3 4 高产菌株的筛选 2 3 4 1 平板初筛根据紫外诱变选取照射2 0 2 5 s 的诱变菌悬液生理盐水稀释至 1 0 、1 0 乏、1 0 。、1 0 4 、1 0 、1 0 击倍，涂布平板固体培养基，3 0 c 培养2 4 h ，以菌 落大小、生长状态为观测指标选取单菌落4 6 株，试管斜面传代3 次后，稳定生长 的共8 株，命名为s h l 、s h 2 、s h 3 、s h 4 、s h 5 、s h 6 、s h 7 、s h g 。 2 3 4 2 摇瓶复筛 菌种：s h l 、s h 2 、s h 3 、s h 4 、s h 5 、s h 6 、s h 7 、s h 8 方法：将上述菌株与出发菌株s h 0 分别按4 的接种量置于装有液体培养 基的三角瓶中( 2 5 0 m l 5 0 0 n ：l l ) ，3 0 、1 6 0 r m i n 水浴7 2 h ，发酵液4 0 0 0 r m i n 离心 15 m i n 得湿菌体，6 0 恒温干燥，测定菌体生物量( 菌体干重) 。 2 3 5 菌种保藏 经过复筛所得神灵杆菌高产优良菌株试管斜面保存于4 c 冰箱。 2 4 毒力测定实验 2 4 1 菌悬液制备 2 4 1 1 稀释液精密称取n a 2 h p 0 46 9 、k h 2 p 0 44 5 9 、l - 半胱氨酸o 5 9 、t w e e n - 8 0 o 5 9 、琼脂1 9 ，加蒸馏水1 0 0 0 m l ，加热溶解，1 2 1 高压灭菌2 0 m i n 。 2 4 1 2 菌悬液制备取一支s h l 试管斜面菌种，生理盐水稀释( 1 0 0 m l 2 5 0 m l ) ， 充分振荡，制成菌悬液。 2 4 1 3 滴种法测活菌数精密称取2 4 1 2 菌悬液o 5 m l 生理盐水定容至5 m l ，依 次逐级稀释1 0 一、1 0 。2 、1 0 。3 、1 0 4 、1 0 、1 0 。6 、l o 。7 、1 0 一、1 0 9 倍，4 c 冰箱保存， 供小鼠毒力测定。同理，以稀释液制成的菌悬液，供菌落计数。选择1 0 石、1 0 。7 、 l o 罐3 个稀释度，分别取2 0 此从距离培养基表面5 c m 高度滴于平板固体培养基上。 第2 章神灵杆菌菌种改良及毒力测定 每个平板1 个稀释度，每个稀释度各6 滴，3 0 。c 培养2 4 h ，计数。 活菌数( c f u m l ) = n x l o xx 5 0( 公式2 2 ) n 为培养皿中6 滴菌悬液的平均菌落数 10 ) 【为所用的稀释度 5 0 代表每毫升滴数 2 4 2 半数致死量l d 5 0 的测定 2 4 2 1 实验分组取小鼠4 8 只，随机分为6 组，每组8 只，雌雄各半。 2 4 2 2 半数致死量l d 5 0 的测定取2 4 1 2 菌悬液配制2 x 1 0 9 ，2 x 1 0 9 , 2 x 1 0 7 , 2 x 1 0 6 ， 2 x 1 0 5 c f u m l ，腹腔注射进行接种，0 8 m l 只，接种后每隔6 h 进行一次观察，连 续观察7 d ，以k a r - b c r 法计算l d 5 0 ，对死亡小鼠进行无菌剖检，记录病理变化。 k a c r b c r 法公式： l g l d 5 0 = x k 一( - 0 5 ) ( 公式2 3 ) x l 广最大剂量的对数值 d 相邻剂量比值的对数 p 广各组死亡率的总和( 以小数表示) 2 4 2 3 检测神灵杆菌在小鼠体内的生长率取小鼠1 2 只，分别接种2 4 1 2 菌悬液 2 x 1 0 3 c f u m l ，于接种后1 d 、6 d 、l l d 、1 6 d 、2 1 d 分别杀死2 只小鼠，每次取肾 脏，称重、匀浆、稀释，涂布于固体培养基上，3 0 。c 培养2 4 h ，计算平板菌落数( 滴 种法计数) ，并折算成每克肾脏所含的菌落数目，用于检测菌株体内生长率，结果 以l g c f u g 形式表示。 活菌数( c f u g ) = n x l o xx 5 0 x l g( 公式2 4 ) n 为培养皿中6 滴菌悬液的平均茵落数 1 0 x 为所用的稀释度 5 0 代表每毫升滴数 黑龙江大学硕士学位论文 2 5 结果与讨论 2 5 1 菌种诱变结果 2 5 1 1 紫外诱变与致死率的关系神灵杆菌菌悬液于紫外灯下2 5 c m 处照射不同的 时间，得到诱变时间与致死率的关系，见图2 1 。 ol o2 03 04 05 06 07 0 图2 - 1 紫外诱变时间与致死率关系 f i g u r e2 - 1t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nu l t r a v i o l e tm u t a g e n e s i st i m ea n dl e t h a l i t y 据文献报道，紫外诱变通常在偏低剂量中出现正突变，偏高剂量中出现负突 变6 2 击3 1 。对于这个问题目前己倾向于低剂量处理细胞，一般致死率控制在 7 0 - 8 0 之间。本实验采用的照射时间为0 6 0 s ，结果表明：神灵杆菌在紫外照 射2 0 2 5 s 范围内致死率为7 0 8 0 。 2 5 1 2 高产菌株稳定性筛选结果 经紫外诱变筛选的s h l 、s h 2 、s h 3 、s h 4 、s h 5 、s h 6 、s h 7 、s h 8 稳定性较好 的8 株茵，与出发菌株s h o 同时进行摇瓶复筛，其中菌株s h 3 摇瓶发酵得到菌体 生物量( 菌体干重) 1 4 9 3 m g 1 0 0 m l ，高于其他菌株，命名为s h - 1 ，并于冰箱4 中 保藏，定期传代( 2 0 d 传代一次_ ) 。 胁 加 o 芭博u 敞 第2 章神灵杆菌菌种改良及毒力测定 表2 18 株神灵杆菌摇瓶复筛菌体生物量比较结果 t a b l e2 1t h ec o m p a r i n gr e s u l to f b i o m a s so fe i g h ts e r r a t i am a r c e s c e n sb y r e s c r e e n i n gw i t hs h a k e f l a s k 注：以上结果为3 组平均值 2 5 2 毒力测定结果 2 5 2 1s h - 1 对小鼠半数致死量l d 5 0 测定结果 表2 - 2s h 1 菌株毒力测定结果 t l b l e2 2t h er e s u l to f v i r u l e n e ed e t e r m i n e do f s t r a i n 注：“+ ”代表有异常，“一”代表无异常，“”代表全部死亡 滴种法计数得诱变菌株s h 一1 茵悬液浓度为2 x1 0 9 c f u m l ，采用表2 ：2 中给 药剂量、给药方式测定s h 1 菌悬液不同浓度对小鼠的致病能力 6 4 1 ，应用k a e r b e r 法，计算出s h 1 对小鼠的半数致死剂量l d 5 0 = 2 6 6 x10 7 c f u m l 。 黑龙江大学硕士学位论文 2 5 2 2s h 1 在小鼠体内的生长状况以2 x 1 0 3c f u m l 的s h 1 菌悬液腹腔注射接 种小鼠，在1 6 d 菌落数达到1 0 5 c f u g ，并在1 6 d 之后菌浓度开始降低。 裁5 基4 5 通气量 搅拌速度 发酵时间。初步确定发酵罐参数：温度为3 0 。c 、通气量为 2 l r a i n 、搅拌速度为1 6 0 r m i n 、发酵时间为7 2 h 。 黑龙江大学硕士学位论文 4 5 6 神灵杆菌发酵罐多因素考察结果 表4 1 2 发酵罐参数多因素对s h 1 菌体生物量的影响结果 t a b l e4 - 1 2t h ee f f e c tr e s u l to f b i o m a s so f s h - 1o nm u l t i - - f a c t o ro f f e r