（植物学专业论文）槭属植物srap技术体系的建立及其遗传多样性研究.pdf

摘要 槭属( a c e rl ) 是槭树科研c e r a c e a e ) 植物，我国是世界上槭树分布种类最多的国家，是世界 槭树的现代分布中心，拥有丰富的种质资源。但长期以来，关于槭属植物在分子标记上的亲 缘关系的研究就相对较少，本研究将s r a p 这种新的d n a 分子标记运刚剑槭属植物的遗传多样 性研究上，以期从d n a 水平上明确槭属植物种间亲缘关系和分类地位，为槭属植物种质资源 的科学利用提供依据。 本试验以槭属植物的叶片为材料，通过对不同的d n a 提取方法对比，探讨最佳的槭属植 物d n a 提取方法；同时对械属植物的s r a p 技术体系进行优化，并将该技术体系应用丁2 2 个槭 属植物材料的s r a p 扩增分析中。本试验研究结果如下： 1 本试验采用常规c t a b 法和改良c t a b 法两种方法对槭属植物叶片d n a 提取结果进行 对比，采用常规的c t a b 法所得的d n a 量很少、d n a 带弱、点样孔中有蛋白质存在、拖带现 象也较严重，且d n a 完整性差，在后期进 ? s r a p 扩增时，杂质导致扩增不稳定或者扩增火败。 而采用改良c t a b 方法提取的条带很整齐、d n a 质量较高、蛋白质少、无拖带现象、基冈组 完整性比较好。 使用改良c t a b 提取法有效地解决了槭属植物基冈组总d n a 提取中的褐变和多酚、多糖 和蛋白质等次生物质干扰等问题。从检测所得纯度可知该d n a 模板完全可以朋丁s r a p 分析； 另外，该方法还具有成本低、操作简单、省时等特点。 2 优化建立了适刚丁槭属植物d n a 分析的s r a p 技术体系 本试验以槭属植物基冈组d n a 为模板，通过m g 计、d n t p s 、p r i m e r 、d n a 与t a qp o l y m e r a s e 进行梯度试验，对槭属植物s r a p 反应体系进行优化，建立了适合丁槭属植物的s r a p p c r 反 虑体系，该体系总体积为2 5i t l ：m 9 2 + 2 5m m o l l ，d n t p so 2 5m m o l l ，p r i m e r8 0n g ，t a q p o l y m e r a s e1 5o d n a4 0n g 。 s r a p p c r 优化反应程序为：9 4 变性5m i n ；9 4 变性1m i n ，3 5 退火lr a i n ，7 2 延 伸lm i n ，共5 个循环；9 4 变性1m i n ，5 0 退火1m i n ，7 2 延伸lr a i n ，共3 5 个循环；7 2 延f 5m i n ；4 保存。结果表明该体系和程序可满足槭属植物基冈组s r a p 扩增的要求。 3 多态性引物对筛选 利用优化后的反应体系和科序，从6 4 个引物对中筛选出重复性好的、谱带清晰稳定的 引物对2 4 对。每个引物对产生扩增谱带4 1 3 条，共产生扩增谱带1 6 9 条，平均每个引物对产 生谱带7 0 4 条。其中每个引物对产生多态性谱带3 1 0 条，共产生多态性谱带1 0 7 条，平均每个 引物对产生多态性谱带4 4 6 条。每个引物对的多态性比率在5 4 8 3 之间，平均每个引物对 的多态性比率为6 3 。 4 用筛选出的部分引物对2 2 个槭属植物的d n a 模板进行s r a p 扩增，得剑了稳定的s r a p 谱带。这些引物对各种材料扩增所得剑的特征谱带反映了基冈组总d n a 碱基序列的特异性， 表明这些引物可刚于其他分析。 5 采用遗传距离和u p g m a 法对扩增出的谱带进行遗传聚类分析，得出反映各种间亲缘关 系的树状图。在遗传距离( d ) 3 3 2 处，将2 2 份供试材料分为五类，其下又有较多分支。聚类在 同一组里的有不同组的槭属植物样品，而在同一组的槭属植物义有的不能聚在一起。结果表 明，s r a p 对基冈组的分析结果与传统分类学的结果基本一致。但有些种的j j 属及种间关系 存在较人变化差异，因此对其亲缘关系有待丁进一步研究。 关键词：槭属植物；s r a p 技术：遗传多样性 2 s t u d yo ne s t a b l i s h m e n to fs r a pt e c h n i q u e sa n d ge n e t l cd i v e r s i t yi nt h eg e n u s a c e rl s u p e r v i s o r ：p r o f t i a nc h a o y a n g m a s t e rc a n d i d a t e ：h uy i n g a b s t r a c t ：t h eg e n u sa c e rl b e l o n g st ot h ea c e r a c e a ef a m i l y ，c h i n ai st h em a i n d i s t r i b u t i n gc e n t r e si nt h ew o r l d t h e r ea r ea b u n d a n tp r e c i o u sg e n e n t i cr e s o u r c ei nt h e c h i n a b u t ，s t u d yo nt h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i p so ft h eg e n u sa c e rl a r el e s sf o ral o n g t i m e t h i ss t u d yd e v e l o p e dt h es r a pm o l e c u l a rm a r k e rf o rt h eg e n u sa c e rl t o e l u c i d a t et h eg e n e n t i cr e l a t i o n s h i p s o fs p e c i e so ft h eg e n u sa c e rl a tt h ed n a m o l e c u l a rl e v e la n dp r o v i d et h es c i e n t i f i ca n de f f i c i e n to ft h ep e r s i m m o ng e r m p l a s m u s i n gt h el e a v e so ft h eg e n u sa c e rl a sm a t e r i a l s ，d i f f e r e n tw a y so fi s o l a t i n g g e n o m i cd n a w e r et e s t e dt of i n dt h eb e s to n e a tt h es a m et i m e ，t h eo p t i m a l s e q u e n c e - r e l a t e da m p l i np o l y m o r p h i s m ( s r a p ) t e c h n i q u e s f o rt h eg e n u sa c e r l w e r ee s t a b l i s h e da n da p p l i e dt o2 2l e a v e s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 i nt h i ss t u d y ，c o m p a r i s o nc o n v e n t i o n a lc t a bw i t hi m p r o v e dc t a bm e t h o d s i nt h er e s u l t so fd n ae x t r a c t i o nt h eg e n u sa c e rl u s i n gc o n v e n t i o n a lc t a bm e t h o dc o u l di s o l a t eo n l ya l i t t l ea m o u n to fd n a t h e b a n dw a sw e a k ，p r o t e i nw a se x i s ti nt h ep o i n t l i k eh o l e ，t h et o w i n gm o r es e r i o u s s i t u a t i o n ，t h ed n ai n t e g r i t yw a sb a d ，w h e nt h es r a pa m p l i f i e d a tl a t e ，t h ee f f e c t so f s e c o n d a r ys u b s t a n c e sl c a dt ot h ea m p l i f i c a t i o nw a si n s t a b l eo rf a i l e d t h er e s u l t so f u s i n gi m p r o v e dc t a bm e t h o dw a sn e a tb a n d ，t h ed n aq u a l i t yw a sh i g h e r ，l o w e r p r o t e i n ，n o n - t o w i n gs i t u a t i o n ，t h eg e n o m ei n t e g r i t yw a s b e t t e r u s i n gi m p r o v e dc t a bm e t h o dw a sa ne c o n o m i c ，e a s ya n df a s tw a y t oi s o l a t e g e n o m i cd n a i tc o u l do b t a i nq u a l i f i e dd n a f r o mp l a n t sc o n t a i n i n gh i g hs e c o n d a r y s u b s t a n c e s ，s u c ha sp o l y p h e n o l s 、p i g m e n ta n dp r o t e i n t h ed n a w a sq u a li f i e df o r s r a pa n a l y s i s 2 t h eo p t i m i z e ds r a pm a r k e rs u i t a b l ef o rt h eg e n u sa c e rl d n aa n a l y s i sw a s e s t a b l i s h e d t a k i n gg e n u sa c e rl g e n o m ed n a a st e m p l a t e ，t h em a j o rc o m p o n e n t so fs r a p , s u c ha sc o n c e n t r a t i o n so fm g ，d n t p s ，p r i m e r , d n a ，t a qp o l y m e r a s ew e r eo p t i m i z e d b yo r t h o g o n a ld e s i g n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h eo p t i m u ms r a pr e a c t i o ns y s t e m i n c l u d e s ：m g ”2 5m m o l l ，d n t p s0 2 5 m m o l l ，p r m i e r 0 8 n g ，t a qp o l y m e r a s e 1 5 u ，d n a4 0n gi nt h e2 5 lv o l u m er e a c t i o n t h em o s ts u i t a b l ep r o t o c o lw a sa sf o l l o w s ：p r e d e n a t u r a t i o na t9 4 f o r5r a i n f o l l o w e db y5c y c l e so fd e n a t u r a t i o na t9 4 f o r1m i n a n n e a la t3 5 f o rlr a i na n d e x t e n s i o na t7 2 f o rlm i n ；t h e n3 5c y c l e so f 9 4 f o rlm i n 5 0 f o r1m i na n d7 2 f o r1r a i n ；a n daf i n a le x t e n s i o na t7 2 f o r5r a i n ；k e p ta t4 n l ep r o g r a ma n d s y s t e mc o u l dm e e tt h ed e m a n d sf o rg e n o m es r a pm a r k e ri nt h eg e n u sa c e rl 3 p o l y m o r p h i cp r i m e rp a i r ss e l e c t e d s e l e t i o nw a sc a r d e da m o n gt h e6 4p r i m e rp a i r si nt h es r a p p c rr e a c t i o n p r o g r a ma n ds y s t e mo p t i m i z a t i o n e d 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew e r e2 4p r i m e r p a i r sd i s p l a y i n gp o l y m o r p h i s m e a c h c o m b i n a t i o nh a s4 13c l e a ra m p l i f i e d f r a g m e n t sa n dt h et o t a lw a s 16 9 ，a v e r a g ew a s7 0 4 ；e a c hp r i m e r p a i r sh a s 3 10 p o l y m o r p h i cf r a g m e n t sa n dt h et o t a lw a s10 7 a v e r a g ew a s4 4 6 t h ep e r c e n t a g eo f p o l y m o r p h i cf r a g m e n t sw a s5 4 - 8 3 ，a v e r a g ew a s 6 3 4 u s i n gs e l e c t e dp a r t sp r i m e rp a i r sa m p l i f i e df o r2 2p l a n t so f1 1 1 eg e n u sa c e r l i tg e t sas t a b l eb a n d t h e s ep r i m e r sa m p l i f i e dg e t st h ec h a r a c t e r i s t i cb a n dr e f l e c t st h e s p e c i f i c i t yo ft h et o t a lg e n o m i cd n as e q u e n c e ，i tc a n b eu s e df o rc l u s t e ra n a l y s i s 5 t h er e s u l to fc l u s t e ra n a l y s i sb yu s i n gu p g m am e t h o ds h o w e dt h a t2 2 g e n o t y p e sc o u l db ec l a s s i f i e di n t of i v et y p e si ng e n e t i cd i s t a n c e3 3 2 w h i c hr e f l e c t e d t h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i p sa m o n gs p e c i e sa n dw e r ea l m o s ta g r e e m e n tw i t ht h er e s u l t so f t r a d i t i o n a lm o r p h o l o g i ct a x a ，b u th y p o t a x i ss t a t u s o fv e r yf e ws p e c i e sw a ss l i g h t l y c h a n g e d k e yw o r d s ：1 1 1 eg e n u sa c e rl ：s r a pt e c h n i q u e s ；g e n e t i cd i v e r s i t y 4 1 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 槭属植物s r a p 技术体系的建立及其遗传学位 文题目 多样性研究级别 硕士 学生学科导师 姓名 胡颖植物学田朝阳 专业姓名 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特 别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指 导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论 文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生签名：硼颖导师签名：留痢渖 日期砷年6 月f 1 日嗍咿石月日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印刷本 和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发 表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离丌 河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为 河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学 所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签名：瑚妥虱导师签名：历i 妒学院领导签名： 同期：阳产年石月f 同同期：j 年彭月，同 同期： 年月 同 致谢 不知不觉间即将告别三年的研究生学习生涯。此时此刻，想起三年来老师们 的谆谆教诲、同学们的热情帮助以及家人无微不至的关怀，j 下是有了他们无言的 支持，我才顺利完成三年的学业。故在论文完成之际，特在此向读研期间关心以 及帮助我的辛勤耕耘的老师、亲密无间的朋友、朝夕相处的同学致以我心底最为 诚挚的谢意。 首先衷心感谢我的导师田朝阳副教授。f 只老师悉心指导我完成硕士论文，日 常接触中，田老师的为人处事在潜移默化中深深地影响着我。三年来，恩师的语 重心长激励着我不断的向上，恩师的谆谆教导鞭策着我勇于开拓、敢于拼搏。故 值此论文完成之际，特感谢恩师对我的悉心栽培! 向恩师致以最崇高的敬意和最 衷心的谢意! 三年来，生命科学学院植物系领导及全体教师对我的生活和学习给予了大量 的指导和帮助，借此机会表示真诚的感谢! 本实验的许多材料得到了河南省科学院珍稀植物工程技术试验基地工作人员 的提供帮助，在此表示衷心感谢! 在材料采集和试验过程中，得到师兄王从彦的热情指导，感谢他在实验最困 难的阶段，对我一贯的鼓励使我度过难关；感谢师妹胡小丽的热心帮忙。 在实验进行过程中，朱长山老师、郑文明老师、夏中良老师，李家美老师给 予我许多宝贵的建议和关心。 感谢同学杨秀君、陈邵宁、马培芳、刘瑞霞、刘秀敏、乔帅、武珂、等在学 习与生活上的关心支持及互谅互让表示感谢。对刘兆云、王佩佩、王会勤、董丽 萍、郭二辉、王瑞霞平时不断的支持鼓励表示感谢。 在论文研究中，微生物系的老师和同学在试验仪器使用上提供了很大的方便， 感谢同学刘元金、黄宁、王宝等的鼎力相助，并祝愿他们工作顺利和生活幸福! 最后，再次衷心感谢所有给过我关心、帮助、支持和鼓励的老师、同学和朋 友，祝他们永远幸福! 胡颖 2 0 0 9 年6 月于郑州 1 文献综述 1 1 我国的槭树科植物资源及分布概况 槭树科( a c e r a c e a e ) 有金钱槭属( d i p t e r o n i ao i l y ) 和槭属( a c e r l ) 两属，全世界约2 0 2 种， 主产北半球温带地区l 1 。槭属植物一般垂直分布于海拔5 0 - - 一4 0 0 0m 的高寒山区。我国是世 界槭树种类最多的国家，两属约1 5 1 种，产i 世界槭树种类的7 5 ，分布全国各地，主产长江 流域及其以南各省区。金钱槭属为中国特有属，仅2 种；槭属约1 4 9 种i l 引，其分布以云南省 最多1 4 1 ，有5 9 种。 1 2 河南省槭树科植物资源 河南植物志和河南树木志共记载河南白然分布的槭树科植物有2 属，2 0 种，l 亚种，9 变种。后经过相关科研人员的后续调查、增补和订止。目前，确认河南自然分布的 槭树科植物共有2 属，2 3 种，2 亚种和9 变种伟, 9 1 。其中，槭属分布有2 2 种，2 亚种，9 变 种。 1 2 1 河南省槭树科植物的自然分布 河南的槭树植物主要分布于豫北的太行山区、豫曲的伏牛山区和豫南的桐柚及大别山区 1 5 1 。其中，太行山区分布有9 种1 变种，占河南全省种数的3 9 ；伏牛山区分布有2 2 种2 亚 种7 变种，占河南全省种数的9 6 ；桐柏山区分布有1 4 种l 亚种l 变种，占河南全省种数 的6 1 ；大别山区分布有1 8 种1 亚种1 变种，占河南全省种数的7 8 。 河南省槭树植物的自然分布，除了受地形地貌、海拔高度、土壤、气候等白然条件影响 外，还与槭树科植物的起源和扩散趋向有直接关系。伏牛山是河南省地势最高、分布面积最 大的山脉，还是我国暖温带和北弧热带的分界线，有1 f = 常适合槭树科植物繁衍生息的生态条 件，再加上处于我国槭树分布中心向华北、撕北、华东扩散的通道上，使这里成为河南省槭 树科植物的分布中心，几乎囊括了河南省分布的所有槭树资源。桐柏山和人别山是弧热带季 风型人陆性湿润气候，水热条件好，植被茂密，也分布着较为丰富的槭树科植物：太行山区 由于其水热等气候条件相对较差，成为河南省槭树科植物分布最贫乏的地区【5 - 1 0 1 。 1 3 槭树资源利用价值评价 1 3 1 景观价值 槭属植物分落n l 与常绿两人类。目前，我国分布广、栽培多的落叶观叶槭树土要有鸡爪 槭似c e r p a l m a t u mt h u n b ) 、茶条槭臼c e rg i n n a l am a x i m ) 、三角槭0 c e rb u e r g e r i a n u mm i q ) 、 元宝槭c e rt r u n c a t u mb u n g e ) 平i l 青榨槭c e rd a v i d i if r a n c h ) 等。有些种类经多年人j ：栽种和 培育，已形成多个园艺品种，如鸡爪槭( a c e r p a l m a t u mt h u n b ) ，有深裂鸡爪槭似c e r p a l m a t u m v a r t h u n b e r g i i ) 等8 个变种和变型，均宜作庭同配置，亦可作行道树、绿篱、盆栽等，其枝n l 也可插瓶观赏m 1 。 槭树的常绿种类约有3 3 种，如富。j 。槭( a c e r p a i h e n g i o 、i s 蛾槭臼c e ro b l o n g u mw a l l e xd c ) 等儿乎全部产于长江流域以南，是我国特有的一类观赏植物资源，但国内很少栽培利刚1 4 l 。 3 常绿槭树，一般树冠冠幅较人，叶多而浓密，遮荫良好，许多种类材质优良，并具有较高应 用价值的园林树种。 观赏槭树在我国南北各地都有应用。华东是我国槭树吲林运用较好的地区，如南京，槭 树已成为城市生态系统和景观树的土要树种之一，广泛种植在风景区或街道绿地。中山陵、 雨花台等人型纪念性建筑群都种有成带或成片的色爪槭( a c e rm o r l om a x i m ) 、鸡爪槭叫 p a l m a t u mt h u n b ) 等，人秋叶红似火，使建筑群更添壮丽色彩。在无锡、苏州、杭州以及上 海等地园林中槭树也有较好运用1 4 l 。 槭树风景资源的开发利用在欧美和日本已达到很高水平。如鸡爪槭叫p a l m a t u mt h u n b ) 已培育出4 5 0 多个赏叶品种。在加拿大，糖槭叫c e r s a c c h a r u m ) 被誉为国树，糖槭叶成为加 拿大的国家标忠，是国旗、国徽的组成部分，国歌也为“枫叶永存”。我国槭树种类虽比欧关、 日本等国丰富，但利刚存在较人差距，虽有引种栽培，但与资源数量相比十分微小。许多资 源，如常绿槭树还未得到应有重视和利用，落叶槭树的廊川也不充分【i - 4 】。 因此，积极开发和利刚野生槭树资源，对于保护槭树的种质资源，提高我国园林建设水 平，美化城乡人民生活和发展旅游事业等均有重要意义。 1 3 2 营养保健功效 槭属植物人多营养丰富，如元宝槭t r u n c a t u mb u n g e ) l r t 中含有许多矿质营养元素，除 人量元素k 、n a 、c a 、m g 、p 、s 外，还含微量元素f e 、m n 、c u 、z n i l l l 。槭属植物种r 含 丰富油脂，其中含人体必需脂肪酸和脂溶性维生素。近年来研究发现，元宝槭油不仅对肿瘤 细胞有抑制作用，还能促进新生组织生k ，并对体细胞有修复作h j ，既是一种优质食州油， 也是一种医药保健油【1 2 1 。元宝槭一护u n c a t u mb u n g e ) 、茶条槭似g i n n a l am a x i m ) 等的根、叶、 果中还含有抗癌活性物质，可提取抗癌约物；茶条槭g i n n a l am a x i m ) 、苦茶槭( a c e r g i n n a l am a x i m s u b s p t h e i f e r u mf a n g ) 等的嫩叶可代茶作饮料，具有强身健体，降血脂等保健 功能；色小槭口m o n om a x i m ) 及从北美引进的糖槭( as a c c h a r u m ) 的树体含有较高的糖 分，尤其是糖槭是世界三人木本糖料植物之一，是北关地区很主要的食川糖源；另外人多数 槭树科植物还是很好的蜜源植物1 5 i 。 1 3 3 药用功效 槭属植物不但营养丰富，而且约川价值高。如元宝槭t r u n c a t u mb u n g e ) 叶中v e 含量 较剖1 5 , 1 6 l 。另外，元宝槭果翅有镇静、催眠、抗凝血笛生物活性【1 7 1 。糖槭口c p ，：s a c c h a r u m ) 树煎剂有明显镇咳作川i l 引。 1 3 4 材用价值 槭树植物术材坚硬致密，为室内装饰、家具、一：具、建筑等的优良川材。如河南省各大 山区分布普遍的元宝槭、权叶槭似c e rr o b u s t u m ) 、建始槭( a c e rh e n r y ip a x _ ) 等，均是十分理 想的川材树种。色术槭( 彳m o n om a x i m ) 、茶条槭似g i n n a l am a x i m ) 等术材纹理特别细密， 历米是制作高级乐器和。i ：艺品的特殊川材。匕蛾槭o b l o n g u mw a l l e xd c ) 是河南传统f ：艺 4 品南陬i 烙花筷的原料之一。 1 3 5 工业利用 许多槭树种类，如色术槭m o r om a x i m ) 、葛萝槭似c e r g r o s s e r ip a x ) 、青榨槭印d a v i d i i f r a n c h ) 等的树皮富含鞣质和纤维，可作烤胶、造纸原料；如元宝槭t r u n c a l u mb u n g e ) 雨l 建 始槭( 彳h e n r y ip a x ) 等的种子含油率高，油质好，可作为食用油或工业h j 油，也可作为生 物柴油树种资源进行开发p j 。 茶条槭似g i n n a l am a x i m ) 叶可提取没食子酸( g a l l i c a c i d ) ，在工业上制造墨水，染料等； 摄影术上做为显影剂，并广泛麻i j 于化j r 、轻1 ：等方面，其经济价值极人【1 9 2 们。 1 4 常用d n a 分子标记及其应用 分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r s ) 和l 形态标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) 、细胞标记( c y t o l o g i c a l m a r k e r s ) 、生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r s ) 是遗传标记( g e n e t i c m a r k e r s ) 的四种主要类利2 。 广义的分子标记包括两类，即同上酶标记和d n a 标记，狭义的分子标记仅指d n a 标记【2 2 1 。 d n a 标记是以生物体的遗传物质一核酸的多态性为基础的遗传标记。与传统遗传标记 相比，分子标记具有诸多优越性：直接以d n a 的形式表现，在植物体的各个组织、各发育 时期均可检测剑，不受季：1 7 环境限制，不存在表达与否的问题：数虽极多，遍及整个基因 组；多态性高，白然存在着许多等位变异，不需专| j 创造特殊的遗传材料；表现为中性， 即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；有许多分子标记表现为共显性，能 够鉴别山纯合基冈猁与杂合基冈型，提供完整的遗传信息，因而现己逐渐形成了许多新的分 子标记系统。 1 4 1 分子标记的种类 根据对d n a 多态性检测手段的差异将其分为二人类：以分子杂交为核心的分子标记技 术：基丁p c r 的分子标记和基丁单核昔酸多态性的分子标记1 2 2 ，2 3 1 。 1 4 1 1 以分子杂交为核心的分子标记技术 ( 1 ) r f l p 该技术由g r o d z i c k e r 等丁1 9 7 4 年创立，是第一代分子标记。其结果稳定可靠，重复性好 特别适应建立迮锁图，比如水稻r f l p 连锁图的建型2 4 2 5 1 ，b e n o i t 等通过r f l p 标记构建 b r a s s i c ao l e r a c e a 的迮锁图发现。有2 个与甘监根肿病2 号生理小种抗性基冈连锁的标记。分 别定位丁l g 6 和l g l 上。特定生物类型的基冈组d n a 经某一种限制性内切酶完全酶解后， 会产生分子鼙不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。r f l p 标记技术的基本原理就是 通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变( 新产 生和去除酶切位点) 和一段d n a 的重新组织( 如插入和缺火造成酶切位点间的k 度发生变化) 等均可导致限制性筲何片段的变化，从而产生r f l p 。该技术包括以下基本步骤：d n a 提取； p , - id n a 限制性内切酶消化：凝胶电泳分离限制性片段；将这些片段按原来的顺序和位置转 移到易操作的滤膜上：用放射性同位素或非放射性物质标记的d n a 作探针与膜上的d n a 杂 5 交( 称s o u t h e r n 杂交) ；放射性白显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段 多态性。 r f l p 标记的主要特点有：( 1 ) 遍布于整个基因组，数鼙几乎是无限的；( 2 ) 无表型效应， 不受发育阶段及器官特异性限制；( 3 ) 共显性，可区分纯合子和杂合子；( 4 ) 结果稳定、可靠； ( 5 ) d n a 需要量人，检测技术繁杂，难以川于人规模的育种实践中。 ( 2 ) 染色体原位杂交 染色体原位杂交技术( i ns i t uh y b r i d a z a t i o n ) 是d n a 探针与染色体上的d n a 杂交，并在 染色体上直接进行检测的分子标记技术。目前发展最快的是荧光素标记的原位d n a 杂交技 术，即荧光原位杂交技术( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d a z a t i o n 简称f i s h 技术) ，是利用与荧光素 分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测d n a 序列在染色体上的 位置。h j 作植物染色体原位杂交的探针因研究目的不同有许多种，主要的有：用丁物种起源 和亲缘关系研究的物种专化d n a 序列或外源物种总基冈组d n a ；, q - j 来构建染色体物理图谱 的低拷贝或单拷贝序歹u ：用于转基因植物鉴定的含目的基冈的b a c 和y a c 克隆。原位杂交 技术的基本步骤为：制备探针；染色体制片：染色体处理与变性；染色体与探针杂交；显微检 测【2 7 1 。 染色体原位杂交技术比较简便，结果直观。但其灵敏度和分辩率很人程度上依赖丁制片 技术和观察设备，一般实验室无法满足需要。 1 4 1 2 以聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 为核心的分子标记技术 ( 1 ) r a p d 由w i l l i a m s 等于19 9 0 年创2 引。其基本原理与p c r 技术一致。p c r 技术是一种体外快 速扩增特异基冈或d n a 序列的方法，由m u l l i s 等r1 9 8 5 年首创。该技术在试管中建立反应 体系，经数小时后，就能将极微量的目的基冈或某一特定的d n a 片段扩增数百万倍。其原 理与细胞内发生的d n a 复制过程相类似，首先是舣链d n a 分子在邻近沸点的温度下加热时 便分离成两条单链d n a 分子，然后d n a 聚合酶以单链d n a 为模板，并利用反应混合物中 的四种脱氧核苗二磷酸( d n t p s ) 合成新生的d n a 互补链，以上过程为一个循环，每一个循 环的产物可以作为f 一个循环的模板，经过2 0 3 0 个循环后，介丁两个引物间的特异d n a 片段以几何数得以人量复制。r a p d 标记技术就是用一个( 有时h j 两个) 随机引物( 一般8 1 0 个碱基) 1 卜定点地扩增基冈组d n a ，然后川凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基冈组d n a 如果在特定引物结合区域发生d n a 片段插入、缺火或碱基突变，就有可能导致引物结合位 点的分布发生相应的变化，导致p c r 产物增加、缺少或发生分子鼙变化。若p c r 产物增加 或缺少，则产生r a p d 标记。r e a d 应- l - j 是比较广泛的，特别是在寻找与目的基冈连锁的分 子标记方面，近年米报道了人量的与各种目的基冈连锁的r a p d 标记。番茄p t o 基冈和水稻 x a 2 1 基冈的成功分离就是首先找到了与目的基冈紧密连锁的r a r d 标记然后通过 m b c ( m a pb a s e dc l o n i n g 图位克隆) 方法克隆的目的基冈1 2 9 3 0 1 。 6 r a p d 标记的主要特点有：( 1 ) 不需d n a 探针，设计引物也无须知道序列信息；( 2 ) 显性 遗传( 极少数共显性) ，不能鉴别杂合子和纯合子：( 3 ) 技术简便，不涉及分子杂交和放射性臼 显影等技术；( 4 ) d n a 样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；( 5 ) 实验重复性较筹，结果 可靠性较低。 ( 2 ) a f l p 由z a b e a u 和v o s 于1 9 9 3 年发口月【3 。这种方法虽己申请了欧洲专利f 3 2 1 ，但很快被迅速传 播开来，因此，z a b e a u 和v o s 不得不以论文形式发表出来【3 3 l 。此后每年都有人量a f l p 的文 章发利3 4 1 。a f l p 标记是选择性扩增基因组d n a 酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实 质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不 同被检测出来。该技术结合了r f l p 的稳定性和p c r 技术的简便高效性，同时又能克服r f l p 带型少、信息量小以及r a p d 技术不稳定的缺点。其基本技术原理和操作步骤如卜：首先用 限制性内切酶酶解基冈组d n a ，形成许多大小不等的随机限制性片段；接着在这些片段的两 端连接上特定的寡聚核苗酸接头( o l i g on u l e o t i d ea d a p l e r ) ；然后根据接头序列设计引物，由于 限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3 端加入l 3 个选择性碱 基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板彼扩增，从而达到 对限制性片段进行选择扩增的目的；最后通过聚丙烯酞胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物 分离开来。 a f l p 标记的土要特点有：( 1 ) 由于a f l p 分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种 类、数目很多，所以该技术所产生的标记数日是无限多的；( 2 ) 典型的a f l p 分析，每次反应 产物的谱带在5 0 1 0 0 条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高：( 3 ) 表现共显性，晕典型孟德尔式遗传；( 4 ) 分辩率高，结果可靠：( 5 ) 目前该技术受专利保护，用 丁分析的试剂盒昂贵，实验条什要求较高1 3 4 1 。 ( 3 ) s s r ( s s l p ) 由m o o r e 等y - 1 9 9 1 年创立。s s r 即微卫星d n a l 3 5 】，是一类由几个( 多为1 5 个) 碱基组 成的基序( m o t i f ) 串联重复而成的d n a 序列，其长度一股较短， 泛分布r 基冈组的不同位 置，如( c a ) n 、( a t ) n 、( g g c ) n 等重复。不同遗传材料重复次数的可变性，导致了s s rk 度 的高度变异性，这一变异性止是s s r 标记产生的基础。尽管微卫星d n a 分布丁整个基冈组 的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列殴计一对特 异引物，通过p c r 技术将其间的核心微甲星d n a 序列扩增出来，利川电泳分析技术就可获 得其k 度多态性，即s s r 标记。近年来，s s r 广泛应用丁水稻等品种的选育和品种鉴纠3 纠3 1 。 s s r 标记的主要特点有：( 1 ) 数量丰富，广泛分布于整个基冈组；( 2 ) 具有较多的等位性 变异；( 3 ) 共显性标记，可鉴别山杂合子和纯合子；( 4 ) 实验重复性好，结果可靠；( 5 ) f l jy - 创 建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，冈此其开发有一定困难，费川也较耐舭1 。 7 ( 4 ) s t s 由o l s o n 于1 9 8 9 年开发成功。s t s 是指基冈组中长度为2 0 0 5 0 0 b p ，且核苛酸顺序已知 的单拷贝序列，通过p c r 可将其专一扩增出来。其基本原理是，依据单拷贝的r f l p 探针、 微卫星序列、a l u 冈子等两端序列，设计合适的引物，进行p c r 扩增，电泳显示扩增产物多 态性。有时扩增产物还需要特定的限制性内切酶酶解后才能表现山多态性。目前刚于s t s 引 物设计的主要是r f l p 探针1 4 5 1 。杨杰松等h js t s 标记检测矮秆基冈r h t b i b 和r h t d i b 在中 md , 麦中的分页4 6 1 。 s t s 标记的主要特点有：( 1 ) 标记来源广，数量多；( 2 ) 共显性遗传，可区分纯合子和杂 合子；( 3 ) 技术简便，检测方便：( 4 ) 与s s r 标记一样，开发依赖丁二序列分析及引物合成，成 本较高；( 5 ) 多态性常常低于相应的r f l p 标记，这是冈为s t s 仅仅检测该引物所分布区域 的片段差异或酶切位置差异，而r f l p 标记的多态性往往可能是探针以外区域的差异，这一 部分差异无法转化成s t s 标记的多态性【4 7 1 。 1 4 1 3 基于单核昔酸多态性的分子标记 ( 1 ) s n p 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s l n s ，s n p ) 标记被称为第二代d n a 分子标 记，这种分子标记是分散于基因组中的单个碱基的著异这种差异包括单个碱基的缺火和插 入，但更常见的是单个核苷酸的替换1 4 8 , 4 9 】。被认为是应用前景较好的遗传标记物。其优点是： ( 1 ) s n p 在种群中是二等位基冈性的，在任何种群中其等何基冈频率都可估计出来；( 2 ) 位点丰 富，5 即几乎遍布丁整个基因纽；( 3 ) 部分位丁基冈内部的s n p