（微生物学专业论文）山西老陈醋酿酒功能菌选育与有效成分分析.pdf

摘要 摘要 山西老陈醋作为我国的四大名醋之一，其历史悠久，风味独特，品 质优良，享誉中外，是中华民族先祖留给我们的一块酿造艺术瑰宝。多 少年来，山西老陈醋酿造一直沿用传统工艺，科技含量低，在市场竞争 日益激烈的今天，渐渐暴露出诸如产品质量不稳定、产量偏低以及市场 上真假老陈醋难以分辨等问题。为了满足生产及市场需求，提高山西老 陈醋的品质与产量，确定山西老陈醋质量优劣的量化指标，本论文主要 从筛选山西老陈醋大曲中的功能酵母菌、选育高产糖化酶菌株、优化山 西老陈醋的酿酒工序并测定山西老陈醋中的有机酸成分和微量元素含量 四方面展开研究。 在筛选老陈醋大曲中功能酵母菌的研究中，通过对山西老陈醋大曲 中酵母菌的富集培养，筛选到9 株高产乙醇或高产乙酸乙酯的酵母菌功 能菌株，分别挑选高产乙醇和乙酸乙酯的酵母菌各一株进行共培养试验。 通过l ，6 ( 4 5 ) 正交试验选择的最佳共培养条件为：麦芽汁培养基、p h 值 4 0 、3 3 、8 0r r a i n 摇床培养。应用该共培养物进行了酿酒试验，乙醇 和乙酸乙酯产量分别达到5 9 3 ( v v ) 并l ：l0 0 2 ( v v ) 。按接种量3 将共培 养物加入到传统山西老陈醋的酿酒过程中，主要生产指标较传统工艺有 显著提高，其乙醇产量提高1 4 ，糖醇转化率提高1 8 6 ，乙酸乙酯的 含量提高了1 倍。结果表明，通过构建功能菌共培养体系改善大曲微生 物的群落结构，提高传统酿造产品的产量与质量是一条可行的途径。 在选育高产糖化酶菌株的研究中，以工业常用菌株黑曲霉a s 3 4 3 0 9 ( 糖化酶活力为2 2 0 0 u g ) 为出发菌株，采用离子注入及氯化锂一紫外 线复合诱变方法多次进行交叉诱变处理，选育到一株高产糖化酶菌株 l i c li v 7 3l ，其糖化酶活高达8 2 7 2 u g ，是出发菌株的3 6 8 倍。经检测， 其遗传性较稳定。与出发菌株相比较，l i c li v 7 3 1 菌株菌丝短，孢子少， 色素少，菌落颜色为黄白色，无霉味，比较适合于酿造生产。 在优化l l i 西老陈醋的酿酒工序的研究中，将黑曲霉a s 3 4 3 0 9 及高产 糖化酶l i c li v 7 3 1 菌株分别制成麸曲，测定麸曲糖化酶活分别为 3 7 4 5 u g 和1 4 2 8 5 7 u g 。将制备的黑曲霉a s 3 4 3 0 9 和l i c li v 7 31 麸曲 山西老酥醋酿酒功能菌选育与有效成分分析 分别代替部分老陈醋大曲与构建的的酵母菌共培养液一起添加到山西老 陈醋传统酿酒工序中，改善大曲微生物的群落结构。结果表明，与传统 工艺相比较，添加l i c li v 7 3 1 麸曲与酵母菌共培养体系的工艺淀粉利用 率提高了2 7 ，酒精产量提高了3 4 ，乙酸乙酯产量提高了一倍，各项 指标不仅优于山西老陈醋传统酿酒工艺，而且均优于添加a s 3 4 3 0 9 麸曲 与酵母菌共培养液的工艺。这些数据表明，我们选育到的l i c li v 7 3 i 与 构建的酵母菌共培养体系对于改进山西老陈醋的酿酒工艺是非常有效 的。 在测定山西老陈醋中有机酸成分和微量元素的研究中，分别建立了 采用c ，。固相萃取柱样品预处理方法和高效液相色谱法测定山西老陈醋 中有机酸成分的方法及采用火焰原予吸收法测定山西老陈醋中微量元素 的方法，并采用上述方法对不同山西老陈醋样品中的有机酸及微量元素 进行了分析测定，结果表明：山西老陈醋中的有机酸主要有醋酸、乳酸、 甲酸、丙酸、丙酮酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等，微量元素主要有c a 、 k 、f e 、z n 、p b 、c u 等。对上述结果分析，发现不同jj j 西老陈醋样品一= | = i 各种成分的含量及相互比例均有明显差异，为进一步确定表征山西老陈 醋质量优劣的量化指标，建立完善的山西老陈醋质检标准奠定了基础。 本论文为山西老陈醋酿造生产的工艺改进及质检标准的建立提供了 重要的技术支持和理论基础。 关键词：山西老陈醋；功能菌选育；糖化酶；酿酒；有机酸 i i 摘要 a b s t r a c t s h a n x io v e r m a t u r ev i n e g a ra so n eo ft h ef o u rf a n m u sv i n e g a r si nc h i n a ， h a sav e r yl o n gh i s t o r y ，a n di sf a m e df o ri t su n i q u ef l a v o r i n ga n de x c e l l e n t q u a l i t y i nt h ew o r l d i no r d e rt oi n c r e a s et h ey i e l da n dq u a l i t yo fs h a n x i o v e r m a t u r ev i n e g a r ，t od e c r e a s ep r o d u c t i o nc o s ti nt h eg r e a t e s td e g r e ea n ds e t u pt h eq u a l i t yc r i t e r i o no fs h a n x io v e r m a t u r ev i n e g a r ，w eh a dc a r r i e do u tt h e f o l l o w i n gr e s e a r c h ： i s o l a t i n gy e a s t sf r o mk o j io fs h a n x io v e r m a t u r ev i n e g a r ：o n eh i g h a l c o h o l p r o d u c i n gy e a s tn z l 9 3a n do n eh i g he t h y la c e t a t e p r o d u c i n gy e a s t n z 9 8w e r ew e r ei s o l a t e df r o mk o j io fs h a n x io v e r m a t u r ev i n e g a ru n d e r d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s t h e n ，t h eo p t i m a lm i x e d c u l t u r ec o n d i t i o n so fn z 9 8 a n dn zl9 3w e r es t u d i e d b y l16 ( 4 3 ) o r t h o g o n a ld e s i g n t h ee t h a n o l f e r m e n t a t i o n e x p e r i m e n t r e s u l to ft h em i x e d c u l t u r e s y s t e m i st h a tt h e c o n c e n t r a t i o no fa l c o h o la n d e t h y l a c e t a t ew a s5 9 3 a n d0 0 2 r e s p e c t i v e l y w h e nt h em i x e d c u l t u r es y s t e mw a sa d d e dt ot h et r a d i t i o n a l t e c h n o l o g yo fs h a n x io v e r m a t u r ev i n e g a rw i t h3 i n o c u l u m t h ey i e l do f a l c o h o lw a si n c r e a s e db y14 ，t h ec o n v e r s i o nr a t eo fa l c o h o lt os u g a rw a s i n c r e a s e db y1 8 6 a n dt h ec o n t e n to f e t h y la c e t a t ew a si n c r e a s e db y1 0 0 t h er e s u l ts h o w st h a tt h em i x e d c u l t u r e s y s t e mo fy e a s t sc a no p t i m i z e m i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e ，a n dc a ni n c r e a s et h ey i e l da n dq u a l i t yo f s h a n x io v e r m a t u r ev i n e g a r b r e e d i n go fh i g hg l u c o a m y l a s e p r o d u c i n gs t r a i n ：u s i n ga s p e r g i l l u s n i g e r 3 4 3 0 9a st h e o r i g i n a ls t r a i n s ，o n eh i g hg l u c o a m y l a s e p r o d u c i n g a s p e r g i l l u sn i g e rl i c li v 7 31 w a sb r e db yt h ec o m p l e xm u t a g e n i cm e t h o do f 盯i o ni m p l a n t a t i o na n du l t r a v i o l e tr a y - l i t h i u mc h l o r i d e t h e e n z y m e a c t i v i t i e so fg l u c o a m y l a s er e a c h e d8 2 7 2 u g ，3 6 8t i m e sh i g h e rt h a ne n z y m e a c t i v i t i e so f 3 4 3 0 9 c o m p a r e d t ot h e o r i g i n a ls t r a i n ，t h em y c e l i ao f a s p e r g i l l u sn i g e rl i c li v 7 31 i ss h o r t ，t h es p o r e si ss p a r s e ，a n dt h ep i g m e n t j s t h j n 山西老陈醋酿酒功能菌选育与有效成分分析 o p t i m i z i n g t h ea l c o h o l b r e w i n gt e c h n o l o g y o fs h a n x io v e r m a t u r e v i n e g a r ：t h eh i g h g l u c o a m y l a s eb r a n - - k o j io fl i c ii v 7 - 31 a n d3 4 3 0 9w a s m a d e ，r e s p e c t i v e l y ；t h eg l u c o a m y l a s ea c t i v i t i e s o ft h eb r a n - k o j ir e a c h e d 1 4 2 8 5 7 u g a n d 3 7 4 5 u g ，r e s p e c t i v e l y w h e n t h e b r a n k o j i a n d m i x e d c u l t u r es y s t e mo fy e a s t sw e r ea d d e dt ob r e w i n gt e c h n o l o g yo fs h a n x i o v e r m a t u r ev i n e g a r ，t h ey i e l do fa l c o h o lw a si n c r e a s e db y3 4 ，t h ec o n t e n t o f e t h y la c e t a t ew a si n c r e a s e db y10 0 ，a n dt h eu t i l i t yo fs t a r c hr e a c h e d7 8 a v e r a g ei n d e xw e r eh i g h e rt h a nt h et r a d i t i o n a lb r e w i n gt e c h n o l o g yo fs h a n x i o v e r m a t u r ev i n e g a r t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a ta s p e r g i l l u sn i g e rl i c li v 7 - 31 a n dt h em i x e d c u l t u r es y s t e mo fy e a s t si se f f e c t i v eo ni n c r e a s i n gt h ey i e l d a n di m p r o v i n gt h eq u a l i t yo fs h a n x io v e r m a t u r ev i n e g a r d e t e r m i n a t i o no fo r g a n i ca c i d sa n dt r a c ee l e m e n t so fs h a n x io v e r m a t u r e v i n e g a r ：t h e m e t h o d w a sb u i l tt h a tt h e s a m p l ep r e p a r a t i o n m e t h o do f s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) ，a n dt h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o do fo r g a n i ca c i d s b yh i g hp e r f o m a a n c eli q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n dt r a c ee l e m e n t sb y f l a m ea t o m i ca b s o r p t i o ns p e c t r o p h o t o m e t r y ( f a s s ) o fs h a n x io v e r m a t u r e v i n e g a r o r g a n i ca c i d sa n dt r a c ee l e m e n t si nd i f f e r e n ts h a n x io v e r m a t u r e v i n e g a rw e r ea n a l y z e dt h r o u g h t h e s em e t h o d ，a n dt h er e s u l ts h o w e d ：t h e r ea r e o r g a n i ca c i d ss u c ha s ：a c e t i ca c i d ，l a c t i ca c i d ，m a l i ca c i d ，c i t r i ca c i d ，p y r u v i c a c i d ，o x a l i ca c i d ，t a r t a r i ca c i d ，f o r m i ca c i di ns h a n x io v e r m a t u r ev i n e g a r ；a n d t h e r ea r et r a c ee l e m e n t ss u c ha s k ，c a ，f e ，z n ，c u ，p bi ns h a n x io v e r m a t u r e v i n e g a r i tw a sf o u n dt h a tt h ec o n t e n ta n dp r o p o r t i o no fe v e r yo r g a n i ca c i d a n dt r a c ee l e m e n ti sd i s t i n c tb e t w e e nd i f f e r e n ts a m p l e so fs h a n x io v e r m a t u r e v i n e g a r t h e s er e s u l t sl a i dt h ef o u n d a t i o n so fs e t t i n gu pt h eq u a l i t yc r i t e r i o n o fs h a n x io v e r m a t u r ev i n e g a r s 。 t h i sp a p e rp r o v i d e di m p o r t a n tf o u n d a t i o n so ft e c h n i q u ea n dt h e o r yf o r m a k i n gp r o g r e s si np r o d u c t i o na n ds e x i n gu pt h eq u a l i t yc r i t e r i o no fs h a n x i o v e r m a t u r ev i n e g a r s k e y w o r d s ：s h a n x i o v e r l n a t u r e v i n e g a r ；b r e e d i n g ；g l u c o a m y l a s e ； a l c o h o lb r e w i n g ；o r g a n i ca c i d i v 第一章文献练述 第一章文献综述 人类在远古期就已开始利用微生物酿酒、做酱、制醋。食醋是人们常用的酸性 调味品，不仅具有调味功能，而且具有良好的保健功能，可防治多种疾病。我国是 世界上公认的文明古国之一。勤劳睿智的民族先祖曾经在古代酿造术方面谱写了光 辉灿烂的历史篇章，为后人留下了优秀的文化遗产与丰美的物质享受。在近代科学 技术发展的进程中，我们虽然落后了，但是从来也没有停止过努力与奋斗。近几十 年来，酿造技术不断进步，企业规模一再扩大，生产水平逐渐提高。然而，与其他 行业相比，酿造业的技术进步相对滞后：与世界先进水平相比，我国酿造技术更是 有着较大的差距。在科学技术飞速发展的今天，我们必须将现代生物技术的研究手 段与研究成果应用于酿造行业的技术改造，以尽快提高其科技水平和经济效益。应 用先进的生物学和工程学技术，改变生物的某些特性，利用生物进行物质转化，生 产人类所需要的各类产品。随着科技的进步和经济的发展，生物工程技术在酿造调 味品2 _ , l k 生产的作用越来越大，推动酿造工业不断向前发展。 1 食醋的历史概况与国内外制醋技术的研究进展 我国和古巴比伦人用发芽的谷物酿酒，差不多同出于新石器时代。在反复出现 酒质变酸的过程中，人类学会了酿醋。那时的酿醋方法都是相同的，后来由于文化 底蕴的差别，孕育出东西方两种不同的酿醋工艺路线。我国先民对事物的认识重在 “综合”，西方则重“分析”。食醋是一种以醋酸为主，多种成分构成的酸味调味品。 先民重视食醋多种成分综合起来的调味作用，视食醋为调味品而不是单纯的醋酸。 西方人则注重分析食醋的主要成分，视食醋为醋酸，不讲究调味的作用【l 】。 几千年来，西方各国一直保留着原始的，以果汁、麦芽汁、酒液酿醋的方法。 一直到1 8 6 0 年巴斯德创立发酵生物学说后，西方的发酵技术才有了较大的发展。1 8 2 3 年德国学者舒莱巴赫提出快速制醋工艺，后由德国f r i n g s 公司做了较大改进，这种 工艺一个半世纪以来，一直是工业化生产食醋的主要方法。1 8 8 3 年德国汉森成功 对啤酒酵母进行单细胞分离培养，纯种发酵开始用于啤酒和酒精生产。这一新技术 的推广应用，促进了西方发酵工业的蓬勃发展。深层发酵醋酸工艺始于2 0 世纪5 0 年代初。德国于1 9 4 9 年和1 9 5 1 年报导了工业化深层发酵醋酸工艺。1 9 5 4 年德国f r i n g s 公司开发了称为“a c e t a t o r ”的深层醋酸发酵罐并于1 9 5 5 年获得专利。这种发酵罐 类似于我国自吸式发酵罐，至2 0 世纪8 0 年代来，国外很多酿造企业采用这种自吸 式深层发酵法生产食醋。 山西老陈醋酿酒功能菌选育与有效成分分析 我国先民重视食醋的整体呈昧作用，在对微生物引起的醋酸发酵一无所知的古 代，从生产实践中不断地追求探索食醋风味的改善，积累了丰富的经验，创造出以 谷物为原料，多菌、生料制曲，多菌混合发酵和固态发酵等有利于风味改善的传统 工艺。因我国地域广阔、物产丰富、南北气候差异较大，在长期的酿醋生产中我国 各地人们按照本地历史、地理、物产和生活习惯，创造了多种富有特色的传统制醋 工艺，打造了众多不同风味的品牌食醋，如山西老陈醋队镇江香醋、福建红曲老醋、 保宁麸醋、江浙玫瑰醋等名醋，至今仍名扬天下，深受消费者喜爱。 同时，由于传统工艺自然接种靠天吃饭和人工操作保守落后，我国酿造科技工 作者引进微生物纯粹分离培养技术，采用西方单菌纯粹培养的模式，改造传统酿造 产品，提高醋酸生成率。早在3 0 年前，我国已经开始推广液体深层发酵制醋。在醋 种选育上，中科院微生物研究所分离筛选醋酸菌，选育成功耐高温、产酸速度快、 酒精转化率高的“巴斯德杆菌”。同时我国科技人员进行固定化细胞制醋口t 4 5 】工艺的开 发和应用研究，产酸速率较普通深层发酵又有了提高。另外，科技人员改进并吸取 国外先进酿醋技术和积极应用现代生物技术，创造自吸式液态深层发酵法、酶法自 然通风回流制醋、固液两步发酵法制醋和纯种固态发酵法制醋等一系列酿醋新工艺。 2 我国的酿醋工艺及发展趋势哺1 胡 随着科学技术的发展，食醋的酿造工艺也千变万化，但都可归纳为：由含糖或 含淀粉的物质，通过微生物作用产生的酒精，再经过醋酸化作用，产生醋酸的过程。 生产醋的各种工艺，都可以看作是不同的酒精发酵、醋酸发酵过程的组合。目前， 我国的食醋酿造工艺分为固态发酵法和液态发酵法两大类，这两类中各自有其代表 性的酿造工艺。 2 1 固态发酵法酿醋工艺 2 11 传统固态酿造工艺“”1 传统固态酿醋以谷物为原料，多菌制曲，多菌混合发酵。采用传统固态发酵工 艺酿制的食醋，色、香、味、体俱全，通常呈琥珀色或红棕色，具有浓郁的醇香， 体浓澄清。总酸、不挥发酸和还原糖等理化指标优异。还困含有多种氨基酸所具有 的缓冲作用以及菌体自溶后产生的各种风味物质的作用，使产品醋酸含量虽高，但 无尖锐刺激感，其明显的优良的品质远非其他工艺所能及。目前国内知名品牌的食 醋多采用此种工艺酿制而得，如山西老陈醋。由于固态发酵食醋文化积淀深厚、风味 独特，有广泛的消费基础，因而有强大的市场号召力。主要优势如下： ( 1 ) 主辅料搭配成分丰富 第一章文献综述 固态发酵原料有很多种，大量辅料的加入使各种营养成分齐备，特别是可供选 择的原辅料：大米、糯米、高粱、玉米、青稞、麦麸、谷糠，种类繁多；碳水化合 物、蛋白质、粗纤维、脂肪、维生素和无机物含量丰富。这些物质既是有益微生物 生长繁殖的营养成分，又是食醋产酸、呈香、生色和增稠的反应底物。同时，原辅 料资源丰富，来源广泛，这也正是传统酿造工艺的重要优势之一。 ( 2 ) 各类微生物并存、多种酶系共酵 发酵过程中，霉菌、酵母菌和醋酸菌并存，液化性淀粉酶、糖化型淀粉酶、酸 性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维索酶、果胶酶、酒化酶和醋化酶等多种 酶系共酵，为糖化、酒化和醋化的顺利反应，以及食醋色、香、味、体的协调生成 奠定了良好的基础。 ( 3 ) 多菌制曲 传统醋曲种类很多，概括有以曲霉为主的大曲和以根霉为主的小曲，另还有药 曲、红曲等。虽然制曲原料不同，生产方法各异，但都是利用自然气温变化的规律， 创造适宜的养分、水分、温度和湿度等条件，使自然存在的多种微生物竞争生存， 能适应制曲环境而保存下来，生长繁殖并分泌多种有益于发酵的酶系。以霉菌为主 兼有酵母菌、细菌共栖的多菌曲，它具有菌株多酶系广、多菌优势互补和为产品提 供风味成分和前体物质等优点。成曲具有水解淀粉、蛋白质、脂肪、半纤维索的能 力和发酵力、产酯力，在发酵过程中形成种类繁多的代谢产物。不同的微生物因其 代谢途径不同，因而形成种类不同的代谢产物，多种微生物的协同作用能产生单菌 所不能起到的作用。在制曲过程中，微生物不断分泌酶类，把曲料中的不溶性大分 子物质分解为可溶性化合物，供自身代谢，也积累了风味成分及其前体物质。同时 曲中菌体自溶产生的氨基酸、核苷酸和脂肪酸等，更加丰富了产品中的风味成分， 使成品醋具有浓郁的芳香和醇和的厚味。所以多菌曲的作用不是任何优良酶制剂、 固定化菌株或单菌纯种糖化曲所能取代的。 工艺特点是产品风味较好，香气浓郁，口味纯厚，色泽较深，但其存在着劳动 强度大、需要辅料多，发酵周期长、原料利用率低，受季节性限制等缺点。 山西老陈醋正是采用传统的固态酿醋工艺酿制而成，其历史悠久，风味独特， 品质优良，享誉中外，是中华民族先祖留给我们的一块酿造艺术瑰宝。它的工艺特 点是以优质高粱为主要酿造原料，麸皮与谷糠为辅料，大曲为生物作用剂，独具一 格的熏醋工艺，夏伏晒，冬捞冰，贮陈老熟。正是这一独特的酿造工艺使得山西老 陈醋有着色、香、味为一体的独特风格【1 1 , 1 2 10 2 1 2 纯种固态制醋工艺 纯种固态发酵制醋所用的主要微生物霉菌、酵母、醋酸菌均用人工培养，分别 山西老陈醋酿酒功能菌选育与有效成分分析 制成糖化麸曲和酒母，代替了传统的大曲。解决了原始制醋工艺中腐败变质的难题。 从2 0 世纪5 0 年代开始，我国就开始了纯种固态法生产食醋的尝试。如济南酿 造厂使用纯种人工培养的曲霉和酵母成功进行了固态酒精发酵，但食醋发酵仍采用 传统工艺。此法提高了出醋量，但它没有应用人工培养，没有解决人工翻醅的问题。 上世纪6 0 年代，上海创造了酶法液化自然通风回流的固体发酵工艺。原料经淀 粉酶等酶制剂液化处理后，使用纯种培养的曲霉菌、酵母菌、醋酸菌作为发酵剂进 行发酵，在发酵池底层设一假底，开设通风口，将假底下醋汁用泵回浇醅表层，能 够均衡的调节发酵品温，同时也可有效地通气供氧，保证发酵正常进行。原料使用 酶法液化，出醋率有所提高，比传统固态酿造提高出醋率l o 以上；并初步实现了 管道化、机械化生产，大大降低了劳动强度。 纯种固态制醋技术，采用纯菌种培养、简化了工艺、缩短了发酵周期、提高了 原料利用率和食醋出品率、打破了季节限制。但其风味不及老法，产品质量还有待 提高。 2 2 液态发酵酿醋工艺 液态发酵酿醋工艺主要是以纯种微生物进行发酵，其产品澄清透明、酸味清爽、 沉淀少、产品质量稳定、原料利用率高、生产工艺先进、劳动强度低、生产周期短、 可实现连续化、机械化生产。但其存在着香气差、色泽浅、酸刺激性强及内在一些 指标( 如糖份、氨基酸态氮) 均不如固态发酵的食醋等缺点。其代表性工艺有氧化 塔速酿醋工艺和自吸式液态深层发酵制醋工艺。 2 2 1 氧化塔速酿醋工艺 该工艺以白酒为原料，适当加入营养液，在氧化塔中醋化。塔底设假底，假 底上放置已附生大量醋酸菌的填充料( 如榉木、芦苇梗等) 。用水泵回浇的方法将假 底醋汁从底部抽至塔顶，循环喷洒，利用填充料上附生的醋酸菌将酒精氧化为醋酸。 该工艺的特点：不用拌料工序，可节约大量的麸皮和谷糠，醋酸发酵结束后不 用出渣，提高了劳动生产率，降低了劳动强度；发酵周期极短，5 0 h 左右即可出醋， 设备简单，占地面积少，投资少；但其成品风味单纯、刺激性强，除酸味外无其他 风味可言。 22 2 自吸式液态深层发酵制醋 自吸式发酵罐液态制醋是当今世界匕最流行的制醋方法，盛行于德国、美国、 日本等国。我国的纯种液态制醋开始于2 0 世纪7 0 年代中期，上海市酿造科学研究 所与上海醋厂协作，进行了自吸式发醇罐液体制醋的研究。这是我国近代食醋工业 上的一科研项重大技术发展，使我国食醋生产进入国际先进行列。它的工艺特点是： 4 第一章文献综述 设备新颖、工艺合理、机械化程度高、发酵周期短、劳动生产率高、厂房占地面积 少、原料利用率高，而且可以不用麸皮、谷糠等辅料。自吸式深层发酵工艺先后在 上海、天津、石家庄、济南、郑州、牡丹江、大连、温州、余姚、宁波、西安等地 投产，取得了良好的经济效益。 总之，传统酿醋工艺采用特定原辅料、大曲群体微生物和独特生产： 艺，产品 风味好，使之形成了产品质量好的优势。纯种液态制醋工艺，虽然食醋风味较差， 但生产技术与设备先进，易于实现生产管理自动化和生产规模大型化，是提高我国 食醋总产量的主要依靠工艺。目前，从我国整体食醋行业来讲，食醋技术已经形成 传统酿醋工艺和纯种液态制醋工艺路线并存的格局。这两种工艺各具优势，在今后 相当长的时期内将会共存发展。但是，由于液态发酵具有原料利用率高，出品率高、 产品质量稳定及易于实现连续化、机械化生产等优点，将会是我国制醋技术发展趋 势，它的技术难点就是如何在保持高产稳产的同时，改善食醋的风味，提高食醋的 质量。 3 食醋工业微生物菌种优化选育 31 食醋酿造菌种 食醋的酿造机理： 以淀粉质原料酿造食醋时，必须先将淀粉糊化，在经曲霉的糖化酶作用将淀粉 分解为可发酵的葡萄糖：之后由酵母菌在厌氧条件下进行酒精发酵作用，再由醋酸 菌在好氧条件下进行醋酸发醇，将酒精氧化生成醋酸；其整个反应方程如下： 淀粉堕墨凼些盟一c 6 日1 20 6 型堕卫! 坠斗c 2 日5 0 吁塑堕堕d ! 盟斗c h 3 c o o h 各步转化都是由不同的微生物，不同酶的作用下进行的。 3 11 曲霉( 糖化菌种) “3 。 曲霉主要起糖化作用，食醋酿造所用的糖化菌株包括黑曲霉和黄曲霉等。其中 黑曲霉以糖化型淀粉为主，酶作用于淀粉生成的葡萄糖能直接供酵母菌利用，其糖 化酶耐酸、糖化力持续性强，出酒率高m 】。因而，曲霉菌种质量的优劣决定着糖化 酶产量的高低及淀粉的利用率。近年来，人们用其生产酒曲，使淀粉分解为葡萄糖， 供酵母菌发酵生产酒精及各种自酒。目前，酿造工业上广泛应用的糖化酶活力较高 的菌株为a s 3 4 3 0 9 ( 俗称u v - 1 1 ) 。 31 2 酵母菌 厌氧条件下酵母菌将可发酵糖转化为酒精，其发酵作用贯穿于整个食醋酿造过 程。食醋生产中应用的酵母菌有两大类：一类为酿酒酵母，主要进行酒精发酵作用； e 山西老陈醋酿酒功能菌选育与有效成分分析 另一类为生香酵母主要作用是生成香味物质。用于酒精发酵的酵母主要有拉斯酵母 1 2 号、k 字酵母、南阳5 号和南阳混合酵母等。生香酵母主要有汉逊酵母、毕赤酵 母、球拟圆酵母、假丝酵母等。食醋生产可采用一种或两种以上的酿酒酵母分别扩 大培养后使用，充分利用各种菌的优良特性。例如南阳5 号酵母发酵能力一般，但 成品口味较好；拉斯1 2 号酵母发酵能力强但成品口味差一些。将这两种酵母混合使 用，可起到取长补短的效果。 3 1 3 醋酸菌 食醋发酵选用的醋酸菌种，应氧化酒精速度快、能力强，而分解醋酸能力弱、 耐酸性强。应用于食醋酿造的优秀醋酸菌的特性主要如下( 包启安，1 9 9 9 ) ：产酸迅速， 产酸速度快；具有强氧化性能，达到目标酸度：无过氧化性；在残留酒精至一定限 度前，中途发酵不应停止；生成的醋应有一定芳香气味。目前国内厂家常采用单一 菌种生产液态粮食醋，常用菌种为a s l 4 1 和沪酿10 1 。 32 菌种优化选育方法”7 ”1 优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵1 业产品的种类，产量和 质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌株。目前，对于微生物菌种的 选育通常有以下几种方法： 3 2 1 物理诱变 物理诱变包括紫外线，激光，离子束，x 射线，t 射线，射线，p 射线，超声 波等。其特点是应用简单易行，操作方便，无多大危害，无污染，但也存在一些不 足之处，即诱变效果稍差，往往正突变少。 紫外线是最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使d n a 双链之间或同一条链 上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正规配对，从 而复制错误，引发突变。施安辉等对我国食醋生产上常用的菌种a s i 4 l 进行了紫外 线单因子常规诱变育种，获得了高产醋酸的优良菌株。不仅产酸率高f 达到7 8 2 g 1 0 0 m l ) ，并且代谢产物丰富，在食醋生产中可明显提高产品的质量【”1 。 另外，朱俊晨等人用蓝光照射黑曲霉口s p e r g i l l u sn i g e ，) 东酒一号的菌丝使其糖化 酶活力最高达6 6 0 3 u i m l l 2 0 1 。山东省食品发酵工程重点实验室以热冲击处理、紫3 1 、线 和c 0 6 。吖射线照射获得一支高产酒精酵母菌种n h y 4 3 6 ，以玉米淀粉为原料3 2 。c 发 酵6 0 6 8 h 可产酒精度1 7 5 “v ) 以上，耐酒精度2 0 ( v v ) 以上，并适合边糖化边 6 第一章文献综述 发酵工艺2 1 1 。藏晋等采用氯化锂和紫外线复合诱变处理经自然分离选育得到的两株 高产醋酸菌，得到了产酸能力更高的醋酸菌，产酸率达9 9 1 0 0 m l - 1 0 9 1 0 0 m l 。 32 ，2 化学诱变 常用化学诱变剂主要是碱基结构类似物，5 澳尿嘧啶、2 - 氨基嘌呤、亚硝酸、羟 胺、烷化剂( 如亚硝基胍n t g 及硫酸二乙酯) 等。化学诱变方法要求的设备简单， 经济实惠，诱变效果较好，但大部分化学诱变剂是强致癌物质，使用中需谨慎小心， 避免直接接触或吸入其蒸汽。其中亚硝基胍是一种有效的化学诱变剂，主要引起d n a 链中的g c 转化为a t 。 3 23 原生质体融合 制备原生质体的方法有机械法和酶法。机械法主要用于分离植物原生质体，酶法 广泛用于微生物和植物原生质体的制备。在融合时，两亲本基因由接触到交换，从 而实现基因重组，在再生的新细胞中就有可能带有两亲本细胞的遗传特性，因此对 原生质体实施分离，融合和再生技术，刺微生物育种起到了重要作用。l e g m a n n 将 酿酒酵母( 不耐高渗) 与蜂蜜酵母( 能耐4 0 以上的葡萄糖) 作为亲株进行原生质体 融合获得融合子在3 5 葡萄糖培养基中产乙醇的速度为亲本的3 倍和7 倍2 2 】。s e d i 等人采用原生质体融合技术将酿酒酵母t j l 与一株a w a m o n 酿造菌株融合得到的融 合株在4 0 c t 产酒精1 2 4 ( v v ) 且该菌株表现出良好的絮凝性2 ”。张文学等人以 白曲霉似s p e r g i l l u sk a w a c h i i ) 基因工程菌t r l 2 和黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 3 4 3 0 9 为两 个亲本，以p e g 诱导进行了原生质体的融合，并进行了紫外线照射的诱变育种，获 得了一株具有较高酶活力的新菌株，其耐酸性c 【一淀粉酶活性和糖化酶活性分别达到 9 1 2 u m l 和3 2 1 6 2 u m l 2 4 , 2 5 , 2 6 。 原生质体融合的方法虽简便易行但对于原生质体的制备则不那么容易，且成功率 很低。 324 基因转化法 分子生物学技术的飞速发展为菌种的改良工作提供了更为广阔的天地，1 9 8 5 年 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 简称p c r ) 的发明，更加有力地 推动了基因体外扩增、分子克隆等一系列先进技术的发展。利用分子水平的手段对 目的菌进行基因改造，使其取氏补短的发挥功效。日本的醋酸菌专家已成功地分离 出了一些耐醋酸性的遗传因予，并将其导入实用醋酸菌的一菌株中，加大了乙醛脱 山西老陈醋酿酒功能菌选育与有效成分分析 氢酶的活性，从而加快了醋酸的生产速度和最终所要达到的酸度。 基因转化法是一种分子水平的操作方法，要求条件高，且存在遗传稳定性、安全 性等问题，因此实际应用于食品工业化生产的工程菌并不多见。 3 25 离子注入法”1 2 8 ”3 “ 近年来，虽然随着代谢控制理论、基因工程技术、蛋白质点突变技术等生物技术 的发展，代谢控制育种、杂交育种，特别是基因工程育种在微生物育种工作中发挥 着越来越大的作用，但由于种种原因，传统的( “经典的”) 诱变育种仍是大多数工 业微生物育种最重要、最有效的技术。但是，随着这些诱变剂的反复使用，很多工 业生产菌株对其产生了耐受性，这就需要选用新的育种方法。 离子注入生物体诱变育种正是人工诱变方法的一种新发明。注入离子与生物体作 用的原初过程，可分为能量沉积、动量传递t 32 1 、质量沉积和电荷交换吲四个方面， 此过程大约在1 0 。9 1 0 4 内同时发生，很难区分各自的独立作用。具有菌体正变率 高、独特的“马鞍型”菌体存活曲线( 传统的物理、化学诱变产生指数型或肩型的 存活曲线) 等优势。目前利用离子注入进行微生物菌种种选育时所选用的离子大多 为气体单质离子，并且均为正离子，如h + 、a r 、n l ，其中最常用的是n + 。 离予束作为一种新的诱变源虽然在微生物上的应用起步较晚，但成果显著。如中 国科学院上海生物工程研究中心的陈祖华等用n + 离子注入诱变处理热带假丝酵母， 经筛选，获得了l 株能够利用正十二烷烃发酵产生长链二元酸的高产菌，在底物浓 度为1 5 ( 体积比) 下产酸量由4 3 5 g l 上升到7 3 ，2 g l 。中国科学院等离子体 物理研究所的姚建铭等利用此技术对花生四烯酸产生菌进行诱变高产菌筛选，其产 酸量最终提高致细胞干重的4 5 ，在5 0t 罐发酵生产花生四烯酸占总脂的5 0 以上， 是美国专利水平的2 5 倍f 3 5 】。 这项技术也可以和其它方法结合对菌种进行复合诱变，如安徽农业大学轻工学院 的李平等对黑曲霉原生质体进行紫外、l i c l 复合诱变，其b 一葡萄糖苷酶的酶活由 出发菌株的1 0u m l 提高到1 4 7u m l 。再列高产突变株进行氮离子注入，酶活又提 高2 0 【3 6 】。 综上所述，离子注入育种技术作为一种新兴的交叉学科，显现了巨大的优势。 离子注入集化学诱变和物理诱变于一身，突变率高、操作简单。加之离子束介导转 基因的可能性，使其在微生物育种中更具有目的性和针对性。随着研究程度的深入， 研究范围的拓宽，相信离子注入法在微生物育种中能发挥巨大的作用。 r 第一章文献综述 4 食醋的有效成分分析及研究进展 食醋作为酸性调味品，虽然其含量最多的是醋酸，但决定食醋品质主要还有酯、 醇、醛、酮、有机酸、糖分、氨基酸以及无机物等微量成分。不同组成决定了食醋 的风味质量特征，对食醋品质的评价起重要作用。但是人们对于食醋有效成分的分 析缺乏深入的研究，国外近年来已采用气相色谱法研究食醋中的香气成分( 酯、醇、 醛、酮) ；国内也曾有人采用气相色谱法分析了食醋中的香气成分，但目前仍采用常 规化学分析和品尝相结合的方法评定其风昧和质量，对食醋香味成分的研究则更是 寥寥无几。 食醋中的有效成分主要有酯、醇、醛、酮、有机酸、糖分、氨基酸及无机物等， 这些物质的分析方法有多种，这里仅就有机酸的分析方法作一介绍。 用于有机酸分析的方法很多，例如n a o h 滴定法、比色法、荧光法、薄层色谱 法、分光法、酶法等。n a o h 滴定法一般只适用于总酸度的测定，而比色法、荧光法、 薄层色谱法、分光法、酶法等方法虽说可用于有机酸的分析，但这些方法一般要进 行预分离、衍生化等繁琐的前处理，且能达到同时分离的有机酸种类较少。食醋中 的有机酸利t 类繁多，各种有机酸之问的相对含量差别较大，因此用上述常规方法进 行分析是十分困难甚至不可能完成的。目前用于有机酸的分析的方法主要有气相色 谱法( g c ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 、离子色谱法( i c ) 和毛细管电泳法( c e ) 。 ( 1 ) 气相色谱法( g c ) 食醋中大部分有机酸为不挥发酸或难挥发酸，用o c 分析时常因有机酸的沸点 较高、不易气化而需要衍生使其转化为三甲硅烷衍生物、甲酯或乙酯等具有挥发性 的物质，方法繁琐。同时又因有机酸衍生化反应不易定量进行而直接影响测定结果 的准确性。因此尽管g c 具有高的选择性和灵敏度，但其用于调味品中有机酸分析 的报道很少，其中最成功的为y a n g 和c h o n g 通过g c 分析了3 7 种液体食品中( 包 括葡萄汁) 的1 3 种挥发性短链有机酸i ”】。 ( 2 ) 反相高效液相色谱法( r p h p l c ) r p h p l c 一般使用弱极性固定相和较强极性的流动相。浚法是根据各种有机酸 在两相中分配系数不同而进行分离的，是目前使用较广泛的有机酸液相色谱分析法。 s p h e r i s o r bo d s 2 、z o r b a xo d s 、s e p p a c kc 1 8 是目前应用较多的反相色谱柱。s i l v i a s u a r e z l u q u e 和j o s efh u i d o b r o 等用s p h e r i s o r bo d s 2s 5 柱通过紫外检测器测定了 蜂蜜中的5 种有机酸【3 8 1 ，辛梅华和李明春等用h y p e r s i l o d s 2 柱分析测定了酱油和 食醋中的有机酸【3 9 j 。 r p h p l c 中通用的是紫外( u v ) 检测器。此外，作为改