（微生物学专业论文）相思根瘤菌质粒的研究.pdf

独创性声明 9 2 8 9 8 9 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 壹曼盔鲎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权南昌太学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名 萼杜外 签字日期：年月 f 9 签字日期：年 月日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 ， 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 摘要 本文研究了2 0 株相思根瘤菌株对5 种常见抗生素的抗性，并对它们的质粒 分布进行了研究。在此基础上，运用接合转移的方法把质粒p m c 7 3 a 从供体菌 催娩克斯菌n g l 3 引入受体菌相思根瘤菌m z 和a j 0 1 8 中，并对接合子进行了结 瘤试验、耐氨试验及固氮酶活性分析。结果显示： 1 、参试的2 0 株菌株对抗生素的抗性有明显的差异。绝大多数的菌株对k m 、s m 敏感，其中y m 2 菌株对所有的抗生素都敏感，而菌株4 2 对所有的抗生素都具 有抗性，确定t c 为相思根瘤菌m z 、a j 0 1 8 抗性筛选标记。 2 、通过比较三种质粒检测的方法，确定了碱裂解法为相思根瘤菌的质粒快速检 测方法。采用该方法对2 0 株相思根瘤菌的质粒分布进行了检测，发现相思根瘤 菌都只含有一个质粒，而菌株l r 0 0 5 没有检测到质粒。实验过程中，对质粒检 测的条件进行了优化，确定相思根瘤菌质粒检测的菌液量为2 0 m l 。 3 、运用接合转移的方法把质粒p m c 7 3 a 从供体菌催娩克斯菌n g l 3 引入受体菌 相思根瘤菌m z 和a j 0 1 8 中，接合频率都为1 0 。8 数量级。对接合子电泳检测表明， m z 接合子能检测到质粒p m c 7 3 a 条带，而a j 0 1 8 接合子未能检测出。接合子 的质粒稳定性研究显示，质粒在宿主菌中具有一定的稳定性。 4 、对3 4 株接合子菌株进行结瘤实验。结果显示，所有的接合子菌株都能在马占 相思的根部形成根瘤。筛选出6 株结瘤能力高于野生型相思根瘤菌的菌株： m z l 、m z 2 、m z 4 、m z l 2 、a j 7 、a j 9 。 5 、通过结瘤实验，筛选出了6 个相思根瘤菌接合子，即菌株m z l 、m z 2 、m z 4 、 m z l 2 、a j 7 、a j 9 。这6 个相思根瘤菌接合子的耐氨实验和固氮酶活性研究表明： 所有的菌株在( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度为1 0 0m m o l l - 1 、3 0 0 m m o l l - 1 、5 0 0m m o l l 1 的液体 培养基中都能较好的生长，但各菌株在1 0m m o l l - 1 ( n h 4 ) 2 s 0 4 条件下不能正常固 氮，不过仍具有一定的固氮能力，其固氮酶活性值( n m o l m l 。1 h 。1 ) 为：m z l ：3 1 2 3 1 ； m z 2 ：3 0 2 8 9 ；m z 4 ：2 9 6 3 2 ；m z l 2 ：2 3 1 1 3 ；a j 7 ：2 5 3 2 8 ；a j 9 ：2 4 ，9 8 2 。这 表明，通过接合转移相思根瘤菌已经获得了一定的耐氨固氮能力。 关键词：相思根瘤菌；耐氨固氮菌；质粒分布：抗生素抗性；接合转移；固氮酶 活性 l 、 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 a b s t r a c t t h eg r o w t hb e h a v i o ro f2 0s t r a i n so fa c a c i ar h i z o b i u mi n s o l i da n dl i q u i d m e d i u m so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no ff i v ek i n d so fa n t i b i o t i c sa n dt h ep l a s m i do f 彳c 口c f 口f 确五乙d 6 i “mw e r es t u d i e di n t h i sp a p e r o nt h i sb a s e ，w e f o u n dp l a s m i d d m c 7 3 ac a nb et r a n s f e r e df r o mk o x y t o c an g l 3t oa c a c i ar h i z o b i u m ( m za n d a j 0 1 8 ) b yc o n j u g a t i o n t h en o d u l a t i o na b i l i t y , a m m o n i at o l e r a n c ea n dn i r o g e n a s e a c t i v i t yo fe x c o n j u g a n t sw e r ea l s os t u d i e d i nt h i sp a p e r 1 、t h ea n t i b i o t i cr e s i s a n c eo f o f2 0s t r a i n so fa c a c i ar h i z o b i u mh a so b v i o u s d i f f e r e n c e m o s ts r a i n sa r es e n s i t i v et ok ma n ds m ，y m 2h a sn ot o l e r a n c et o a l l a n t i b i o t i c sw h i l e4 - 2s t a i nh a sa n t i b i o t i cr e s i s a n c et oa l la n t i b i o t i c s t cw a ss e l e c t e d f o rt h ea n t i b i o t i cf i l t e rs i g no fm za n da j 0 18s t r a i n s 2 、p 1 a s m i d so fa c a c i ar h i z o b i u mw e r ed e t e c t e dw i t ht h r e ed i f f e r e n tm e t h o d s t h e r e s u i t ss h o w e dt h a ta l k a l i n el y s i sm e t h o dw a ss u i t a b l ef o ra c a c i ar h i z o b i u m t h e p l a s m i d so fa c a c i ar h i z o b i u mw e r es t u d i e di n t h i sp a p e r t h er e s u l t s s h o w e dt h a t m o s ts t r a i n se a c hh a so n ep l a s m i dw h i l et h e r ea r en op l a m i d sd e t e c t e di nl r 0 0 5s t r a i n t h ep l a s m i dc o n d i t i o n sw e r eo p i t i m i z e da n dt h es u i t a b l ev o l u m eo fb a c t e r i ai sa b o u t 2 0 m 1 3 ) p i a s m i dp m c 7 3 a c a nb et r a n s f e r r e df r o mk o x y t o c an g l 3t oa c a c i ar h h o b i u m m zb yc o n j u g a t i o n ，a n dt h et r a n s f e rf r e q u e n c ya r e 8 o x l o - s t h ep l a s m i ds t a b i l i t y s h o w e dt h ep l a s m i dc a nb em a i n t a i n e di nm z t h ee l e s r o p h r e s i se x a m i n a t i o ns h o w e d t h a tt h es t r a po fp m c 7 3 ac o u l db es e e ni nm ze x c o n j u g a n tb u tc o u l d n o tb e e ns e e ni n a j 0 1 8e x c o n j u g a n t 4 、t h er e s u l so fa c a c i ar h i z o b i u ms e e d i n g si n o c u l a e dw i t h3 4s t r a i n s i nt e s tt u b e s s h o w e dt h a tn o d u l ec o u l db e e ns e e ni na l lt h eh o s ts e e d i n g s m z l ，m z 2 ，m z 4 ，m 1 2 ， a j 7a n da j 9a r et h o s es t r a i n sw h i c hh a v eb e t t e rn o d u l ea b i l i t yt h a nw i l ds t r a i n s 5 1t h es t u d vo fa i n m o n i at o l e r a n c ea n dn i r o g e n a s ea c t i v i t ys h o w e dt h a tm z l ，m z 2 ， m z 4 ，m 1 2 ，a j 7a n da j 9s t r a i n s h a dg r o w t hb e h a v i o ri nt h el i q u i dm e d i u m so f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f ( n h 4 ) 2 s 0 4 舢lt h es t r a i n sc o u l dn o tk e e pn o r m a ln i t r o g e n 2 z ， 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 f i x i n ga c t i v i t yw h e nl o m m o l l l ( n h 4 ) 2 s 0 4 e x i s t e di nm e d i u m ，b u ts t i l lh a v es o m e n i t r o g e nf i x i n ga c t i v i t y , w h i l et h e i rw i l ds t a i n sh a d n on i t r o g e nf i x i n ga c t i v i t y a l lo f t h i si n d i c a t e dt h ea m m o n i a - r e s i s t a n tn i t r o g e nf i x i n ga c t i v i t yw a sr e c e i v e dt h r o u g h c o n j u g a t i o n k e yw o r d s ：a c a c i ar h & o b i u m ；a m m o n i a - r e s i s t a n tn i t r o g e nf i x i n ga c t i v i t yb a c t e r i u m ； p l a s m i dp r o f i l e ；a n t i b i o t i cr e s i s a n c e ；c o n j u g a t i o n ；n i t r o g e n a s ea c t i v i t y 3 1 生物固氮的研究 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 第一章文献综述 一 1 氮、磷、钾是作物的三大营养元素，其中氮元素是主要的。虽然空气中约有 8 0 是氮气，但由于其化学性质十分稳定，不能为作物直接利用，必须将氮分子 转化成氨或其它形式的氮化合物，作物才能吸收利用。目前工业上化学合成氨的 过程需要在高温、高压和催化剂条件下才能进行，不仅要消耗大量不可再生能源， 而且由于不合理的使用带来环境污染等一系列人们所关注的问题。自然界有些微 生物能将空气中的氮还原成氨，为植物、动物和其它微生物生长提供氮源，被称 之为生物固氮。生物固氮的总量十分巨大，据联合国粮农组织( f a 0 ) 1 9 9 5 年粗略 估计，全球每年由生物固定的氮量已近2 1 0 8 t ( 鲥f l 当于4 1 0 8 t 尿素) ，相当于 地球上可利用氮源f 生物固氮、化学固氮、闪电等非生物自然条件形成的氮化合 物) 的2 3 。 1 1 生物固氮研究的重要意义 2 l 世纪3 0 年代我国人口将达到1 6 亿，年需粮食( 按人均4 0 0 k g 计算) 6 4 1 0 8 f 。 每收获i t 粮食约投入 o o k g 尿素，总计需尿素6 4 1 0 1 0t ，为了满足我国2 0 3 0 年对氮肥的需要，至少还要新建年产3 1 0 5t 尿素厂1 0 0 座。这不仅投资巨大( 约 千亿元) ，而且还要消耗不可再生的化石能源和污染大气。此外，大量施用化肥， 既提高了农业生产成本，也招致水土严重污染，破坏生态平衡，阻碍农业可持续 发展。 生物固氮只提供能与固氮微生物共生结瘤的高等植物( 主要是豆科作物和牧 草以及某些非豆科树木等) 生长所需要的氮素，而其它植物，特别是重要粮食作 物如水稻、小麦、玉米以及多种果树、蔬菜等都没有能与之共生的固氮微生物， 且由土壤中自主固氮微生物所提供给它们的氮素又有限。因此，这些作物的高产 不得不依赖化学氮肥，如何在这些非豆科作物生产中发挥生物固氮的作用，以降 低化肥用量和减少土壤污染，是大自然向人类的严峻挑战。 微生物固氮不仅与农业生产密切相关，而且也是生命科学中的重大课题，对 4 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 1 于它们的作用机制的研究，一向受到各国重视。人们一方面企图用化学的方法模 拟生物固氮，改革沿用己久且耗费巨大的高温高压合成氨的老工艺，建立在温和 条件下合成氨的体系，以降低化学氮肥的生产成本，推动合成氨工业的革命；另 一方面，由于共生固氮体系涉及固氮微生物与高等植物之间的遗传信息相互应答 微妙而复杂的关系，深入研究两者之间的关系，不仅可阐明外界各种信号因子导 致植物和微生物各自基因的表达和两者之间相互作用机制，为扩大宿主范围提供 科学依据，同时也可促进植物病理学中病原微生物致病性和寄生植物抗病性之间 信号传递和基因相互作用的研究。 1 2 固氮微生物的种类和特点 生物固氮作用存在于一些原核生物中，已鉴定有生物固氮作用的微生物已近 5 0 个属，包括细菌、蓝藻、放线菌，其中与上述微生物共生、有固氮作用的豆 科植物有6 0 多个属，非豆科植物约1 3 个属。根据固氮微生物与高等植物的关系， 可以将它们分为三个类型即自生固氮微生物、共生固氮微生物和联合固氮微生物， 或自生固氮，共生固氮，联合固氮三个体系【1 j 1 ) 自生固氮微生物：是指能够在自由生活状态下固氮的微生物总称。在自 然界，自生固氮微生物种类很多，分散地分布在细菌和蓝细菌的不同科、属和不 同的生理群中，并大致可以分为光合细菌和非光合细菌两类。前者如红螺菌、红 硫细菌和绿硫细菌等，其中的某些种类可与其它微生物联合而相互有利；后者的 种类很多。根据非光合细菌的自生固氮菌对氧的需求，可以分为厌氧的细菌如梭 状芽胞杆菌；需氧细菌如自生固氮菌、贝捷林克氏固氮菌、固氮螺菌等；以及兼 性细菌如多粘芽胞杆菌、克鲁伯氏杆菌、肠杆菌等。自生固氮微生物中的某些种 类，在有些情况下可以与植物进行联合固氮。 一般地，自生固氮微生物固定的氮素满足本身生长繁殖需要以后就不再固氮 了，多余的氮反过来会抑制它们自身的固氮系统。同时，它们固氮效率也比较低。 据测定，每消耗1 9 碳水化合物，自生固氮微生物固定1 0m g 氮，而共生固氮的 根瘤菌则可以固定2 7 0 m g 氮【1 1 。所以，这个类群的微生物从固氮量的角度衡量， 对作物的氮素供应的贡献并非很大。许多试验结果证明，这类微生物所产生的各 种激素和其它活性物质是促进作物生长的主要因素之一。 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 一 飞 2 ) 联合固氮微生物：有些自生固氮微生物在特定植物根际环境中生长、繁 殖比非根际土壤中旺盛得多。这是由于植物根系的分泌物和脱落物提供能源物 质，固氮微生物利用这些能源物质生活和固氮，这种互利关系称之为联合固氮。 联合固氮体系最先是在雀稗和雀稗固氮菌之间发现，后来发现小麦、水稻、甘蔗、 玉米、高梁等禾本科植物亦存在联合固氮体系。能够进行联合固氮的微生物种类 较多，似乎没有什么特异性，有些微生物既可以在自生条件下进行自生固氮作用， 又能在田间与一些禾本科作物进行联合固氮作用。已经报道过的联合固氮的主要 微生物种类有：浸麻芽胞杆菌、多粘芽胞杆菌、巴西固氮螺菌i 含脂固氮螺菌、 克鲁伯氏杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌和粪产碱杆菌等【2 巧j 。 与共生固氮相比，联合固氮微生物与植物之间的关系不紧密，双方也没有共 同的组织结构，因而固氮效率不高。 3 ) 共生固氮微生物：是指能与宿主植物形成特定固氮组织结构的一类微生 物。它们彼此生活在一起，植物向微生物提供光合产物供微生物固氮需要，微生 物则向植物提供氮素营养，双方互相有利。以豆科植物一根瘤菌共生体系为例来 说，由于有根瘤组织作为它们的共生结构，共生效率是最高的。其原因是这种共 生体系满足了上述所说的生物固氮的条件。已知的比较清楚的共生体系除了豆科 植物根瘤菌共生体系外，还有非豆科植物固氮放线菌体系和红萍固氮蓝藻共 生体系【6 - l o l 。 1 3 国际生物固氮研究发展概况 自1 8 8 6 年德国植物化学家h e l l r i d g e l 和w i l f a r t h 开展共生固氮研究以来，共 生固氮研究已经从单纯的固氮领域扩展到涉及生态学、生理学和遗传学的综合领 域，从细胞水平进入了分子生物学水平，这些研究对提高豆科植物共生固氮作用 和非豆科植物固氮奠定了科学基础。生物固氮的研究已有一百多年的历史。自 1 9 7 4 年以来，已经召开了1 1 次国际固氮大会，1 9 8 0 - - 1 9 9 6 年间已召开了7 次非 豆科植物生物固氮国际会议，此外，欧洲、北美等地区性生物固氮国际会议几乎 每年都有召开。1 9 9 2 年在菲律宾国际水稻所曾专门就水稻固氮问题，集中了3 0 位国际著名的生物固氮专家举行研讨会，拟订研究计划，预期1 0 年将水稻化肥 用量的2 0 由生物固氮代替。1 9 9 7 年美国罗氏基金会组织了2 2 位科学家在意大 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 一 飞 利召开题为“生物固氮：全球的挑战和未来的需要”国际研讨会，讨论了生物固 氮的基础研究，制订研究行动纲领，并再次强调对水稻、小麦、玉米等粮食作物 生物固氮的研究。据国外统计，1 9 9 1 年投入的研究经费就达1 0 多亿美元。除各 国政府给予资助外，己登记在册的5 个国际性组织，如联合国科教文组织 ( u n e s c o ) 和联合国粮农组织( f a o ) 等，以及有些大国的专一性组织和机构，如 美国国际开发署( u s a i d ) 都对生物固氮研究给予了大力资助。 近2 0 年来，随着分子生物学的迅速发展，生物固氮研究在国际上已取得显 著进展：( a ) n 氮酶高分辨率的空间结构研究。国际上已于1 9 9 2 年阐明了其活性 中心原子簇f e m o c o 及其周围蛋白分子的三维结构【1 1 , 1 2 】。与此同时，化学模拟固 氮酶温和条件合成氨的研究已取得了很大的进展。( 2 ) 共生固氮的分子机理研究 有重大进展，为提高根瘤菌的固氮效率和扩大宿主范围，特别是为粮食作物的共 生固氮，提供了理论基础【1 3 - 2 1 1 。( 3 ) 共生固氮功能基因组学和蛋白质组学研究。 共生固氮功能基因组学和蛋白质组学研究包括根瘤菌和宿主植物两方面。功能基 因组学研究的前提是对目前的生物的基因组进行全序列分析。目前国际上已经对 苜蓿根瘤菌基因组进行了全序列分析【2 列，接着是大豆根瘤菌和百脉根根瘤菌基 因组。在宿主植物方面已经启动了对苜蓿、大豆、百脉根基因组序列的分析【强2 5 】。 ( 4 ) 与粮食作物联合固氮的固氮螺菌的固氮调节机制研究己逐渐明朗，为构建在 有氨条件下，也能固氮的基因工程菌株打下理论基础。( 5 ) 在某些作物( 如水稻和 甘蔗等) 体内发现了内生固氮菌，为作物生物固氮增添了新途经【2 6 ，7 7 j 。 1 4 我国生物固氮研究的状况 我国2 0 世纪5 0 年代初使用大豆根瘤菌开始了生物固氮在农业生产中的应 用。最初用于生产根瘤菌剂的优良菌种是b 1 5 、c 8 和5 2 0 2 菌株，当时的应用面 积达5 0 0 0 余万亩，大豆接种根瘤菌后的增产幅度为1 0 左右，为建国初期我国 的大豆生产做出了重大贡献。随着高效固氮根瘤菌菌株的不断开发，我国东北、 华北、华东、西北及大部分南方地区相续进行了大豆根瘤菌的大面积应用，与此 同时，花生根瘤菌、紫云英根瘤菌和三叶草、苜蓿沙打旺、笤子锦鸡儿等豆科牧 草的根瘤菌应用也大面积推广应用【2 8 】。进入7 0 年代，由于石油危机，氮肥价格 高涨，全球生物固氮研究兴起高潮，我国也不例外。1 9 7 2 年中国科学院生物学部 7 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 以生物固氮作为重大研究项目，组织我国著名科学家如唐敖庆、卢嘉锡、蔡启瑞 等化学家和沈善炯等分子遗传学家以及农业部门的一些专家，开展固氮酶结构与 功能及其化学模拟和固氮基因精细结构等基础研究，并进一步推动根瘤菌的田间 应用，取得很多成果：在此基础上，1 9 7 8 年我国第一次派团赴美参加第三届生物 固氮大会。卢嘉锡团长在大会上做了题为“中国固氮研究现状”的报告，引起与会 学者的重视，认为我国在化学模拟生物固氮和固氮分子遗传学的研究工作己达到 国际先进水平，尤其在化学模拟研究领域已领先国外。2 0 世纪8 0 年代以来，我 国一方面从分子水平进一步研究根瘤菌在豆科植物的固氮机理和改造根瘤菌，另 一方面通过人工诱发非豆科植物根部结瘤，试图使非豆科植物也能共生固氮。其 中相继对水稻、小麦、玉米和高粱等非豆科作物的联合结瘤固氮进行了深入的研 究，并成功分离出一批具有高效固氮功能的联合菌株。“共生固氮体系中最佳结 瘤固氮控制模型的研究项目己被列入国家的“攀登计划”。我国生物固氮研究 所取得的主要成就为： 1 ) 在固氮分子遗传学研究方面，我国处于世界先进行列。我国科学家7 0 年代在固氮基因精细结构的研究上就己进入国际先进行列。8 0 年代在深入研究 固氮基因正调控基因( n i f a ) 的表达及其产物活性调节的基础上，构建了不受氨 调控的组成性表达的n i f a 质粒，将其引入阴沟肠杆菌和大豆根瘤菌后，固氮作 用不受氨阻遏【2 9 - 3 3 】。用耐氨固氮菌株接种水稻可获增产【3 4 ，3 5 1 。9 0 年代在苜蓿根 瘤菌结瘤基因的表达和调控方面，发现结瘤基因n o d d 3 的表达不受苜蓿类黄酮 物质的启动，为扩大宿主范围的研究提供了依据【3 6 3 7 1 。此外，根据宿主植物对根 瘤菌识别因子和固氮嫌氧机制的研究，将豆科植物的凝集素基因和血红蛋白基因 转入烟草和水稻，获得基因表达，为进一步研究非豆科植物和根瘤菌侵染的关系 奠定了基础 3 8 , 3 9 】。 2 ) 关于固氮酶催化机理和化学模拟研究，我国学者于8 0 年代初，证明固氮 酶催化h d 的形成绝对依赖于氮气【柏1 ，对国外学者发表的不依赖氮气也可形成 h d 的观点提出异议。9 0 年代初，在固氮酶催化还原氮气的放氢气机制中，提出 了固氮酶双位点放氢气的假说【4 1 1 。近来又根据现己明确的活性中心原子簇三维 结构与其周围多肽环境的关系，进一步优化了模型，提出了固氮酶还原底物有两 条质子通道的设想【4 2 , 4 3 】。这些研究成果对合成高效无机催化剂和实现温和条件合 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 成氨的研究有重要指导意义。 2 根瘤菌质粒的研究 弋 质粒是存在于细菌内，独立于基因组d n a 的能够自我复制的双链环状d n a 分子。在正常情况下，质粒对细胞的生存并非是必要的，但在特殊情况卞，质粒 却起着重要作用。研究已经证实，根瘤菌的固氮基因( n i f ) 和结瘤基因( n o d ) 都定位在质粒上。 2 1 根瘤菌质粒的提取和检测 根瘤菌的质粒组成可以作为菌种的一个鉴定指标【4 4 , 4 5 】，对质粒分布情况的检 测还可为结瘤、固氮、吸氢相关基因的定位以及通过质粒的诱动转移来筛选高效 固氮菌株的工作打下良好基础。目前，对热带、亚热带豆科植物研究较少。黄志 坚曾报道银合欢根瘤菌大质粒的分离，刘鸿洲等从8 种热带、亚热带豆科植物中 分离出9 种快生型根瘤菌，用双梳子胶内裂解法检测其中的质粒分布情况。他们 发现，质粒数从1 到6 不等，大小从3 2 k b 到8 7 0 k b 。从不同属种分离出的根瘤 菌，其质粒及分子量各不同【4 6 】。 2 2 根瘤菌质粒与基因重排有关的遗传单位 根瘤菌质粒含有许多与基因重排有关系的遗传单位，如插入序列以及转座子 等。插入序列较小，般小于2 5 k b ，它在整个基因组中均有分布( 包括共生质 粒和非共生质粒) 。p r m e g r 4 b 质粒的序列分析表明，几乎每2 5 k b 就有一个插 入序列，在一个1 3 k b 范围内找到了i s r m 3 、i s r m 6 和i s r m 7 以及与转座酶同源 的二段序列。u l r i c k 和p u h l e r 报道了r l b v v i c i a e 两个菌株的非共生质粒上各含 有个拷贝的转座子t n l 6 3 。s m e l i l o t i 1 0 7 6 中质粒p s v l 有n o d b 和n o d c 基因 的重复序列，但只有后者有功能。n i l e 和n i f b 的重复序列也被发现，但只有n i f e 有功能。i s 转座子和重复d n a 序列均可能导致基因的重排，如基因扩增、缺失 或质粒的消失与共价结合等。p a l a c i o s 4 7 】根据重复d n a 序列提出了根瘤菌基因 扩增的动态模型。 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 2 3 根瘤菌质粒的稳定性 w e a v e 将含质粒的菜豆根瘤菌传代1 2 0 次后其质粒依然维持不变，说明根 瘤菌的质粒具有精细的复制和稳定机制【鹌1 。现在已找到了几个与此相关的片断。 如在s m e l i l o t i 和p s y m b 克隆并测序的0 , 8 k b d n a 片断上含有复制起点的几个功 能区、几段a t 丰富的序列，一个与大肠杆菌复制起点c 类似的1 3 个碱基片断， 可是这个复制起点似乎不是必要的f 4 引。因此，该质粒应存在另一个复制起点。 另一个序列是来自s m e l i l o t ig r 4 菌株的p r m e g r 4 a ，这个4 8 k b 的p s t i 片断负 责质粒的自主复制【5 0 】，序列分析表明它有几个阅读框，但缺失研究表明，只有 一个阅读框是必需的。从d n a 序列的比较来看，原核生物的复制机制与真核生 物在某些方面是相似的，与农杆菌r e p a 、r e p b 基因同源的序列在r 1 b v v i c i a e 中 也已经找到。另外，用p r m e g r 4 a 的r e p c 基因为探针检测到p r m e g r 4 a 和 s i n o r h i z b i u mf r e d i i q 均有同源序列。现在已根据r e p c 保守序列设计出了通用引 物，并成功地经p c r 扩增出多属根瘤菌相应片断，并作了序列测定【5 1 1 ，从而在 深入认识质粒地起源、稳定性、不相容性和构建有关载体等方面都有非常重要的 意义。 2 4 根瘤菌质粒的可转移性 根瘤菌的质粒一般是不能转移的，但在辅助质粒作用下可以实现根瘤菌质粒 的诱动转移。目前仅证明r 1 b v t r i f o l i i 不仅在培养条件下以1 0 4 频率自我转移， 而且在土壤中也能向土著菌转移。r l e g u m i n o s a r u m 菌株3 0 0 的6 个内源性质粒 也具有自我转移能力。s m e l i l o t ig r 4 的p r m e g r 4 a 也具有自我转移能力，它甚 至能够诱导另一个不能自我转移的质粒p r m e g r 4 b 共转移到s m e l i l o t i 中，而不 能转移到农杆菌中。到目前为止，发现根瘤菌自我转移的质粒极少，且仅限于少 数几个菌株，但尚不能低估在自然环境中共生质粒和非共生质粒以低频率向其它 菌株进行自我转移和共转移的生物学意义。根瘤菌质粒尤其是共生质粒的研究对 提高根瘤菌的结瘤及固氮能力、阐明根瘤菌质粒的稳定机制及起源均具有重要意 义【5 2 】。 1 0 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 3 相思根瘤菌的研究进展 相思属( a c a c i a ) 为含羞草科( m i m o s a c e a e ) 树种，原产于亚洲、非洲和大洋 洲北部等地区。相思属是一个较大的属，拥有乔灌木植物约6 0 0 余种，其中仅乔 木树种就有6 0 余种。相思属树种具有生长迅速，适应性强，耐贫瘠及固氮等特 性，是迹地更新、纸浆用材林、农用林业的主要造林树种，也是干旱及贫瘠地区 造林的先锋树种。近年来，在东南亚地区如马来西亚、泰国，菲律宾、文莱等国 家大面积发展，成为短期工业用材林的重要发展树种之一。 长期以来，根瘤菌的接种及其在生产上的应用研究较集中在油料豆科植物， 而对木本豆科植物特别是相思树种则研究较少，在应用方面就更少。1 9 9 4 年丁 明懋等发现马占相思根瘤菌固氮酶活性的昼夜变化与固氮能源的供给有关，并且 受光、温度的影响较大1 5 引。1 9 9 7 年章宁等对肯氏相思根瘤菌的亚显微结构进行 观察，初步了解该根瘤茵在宿主细胞中的发育和衰老以及引起宿主细胞的亚显微 结构的一些变化，并探讨了周膜扩增的问题【5 4 】。1 9 9 8 年康丽华等对相思根瘤菌 进行耐酸性研究并对耐酸菌株进行筛选，得到目的菌株1 5 引。在同年她们对相思 苗木接种根瘤菌取到成功【5 酬。2 0 0 0 年黄维南等测定了4 年生肯氏相思、大叶相 思和马占相思树木根瘤菌的固氮酶活性，发现它们均具有明显的季节性变化【5 7 】。 2 0 0 2 年蓝崇钰等对大叶相思根瘤菌共生固氮体系进行研究，结果发现，大叶相 思根瘤菌对z n 2 + 的耐受性为小于1 0 0m m o l 的浓度【5 8 】，说明接种相思根瘤茵的植 物可以在缺氮的、含有重金属矿业废弃地的环境生长。关于相思树种根瘤菌的生 物学特性的研究也很少。吕成群等对从广西不同地点采集的相思树种进行分离、 纯化，获得1 5 株具有典型个体形态和菌落特征的根瘤菌，这些菌株可分为快生 菌和慢生菌，它们与厚荚相思幼苗能共生结瘤，并且多数相思树种根瘤菌能利用 无机氮【5 9 】。黄宝灵等研究了1 5 个来自不同生态环境的相思树种根瘤菌菌株对温 度、p h 、n a c l 的耐受性以及抗药性，结果表明，相思树种的根瘤菌有着丰富的 抗逆菌株【6 0 1 。目前关于相思根瘤菌质粒的研究国内报道不多，刘鸿洲报道他们 所研究的两株相思根瘤菌各含有一个3 2 k b 和3 4 k b 的质粒m j 参考文献 【1 】慈恩，高明生物固氮的研究进展【j 】中国农学通报，2 0 0 4 ，1 ：2 7 3 0 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 【2 】新楠，连秀芬，樊明寿非共生生物固氮的重要作用和研究进展【j 】内蒙古农业科 技，2 0 0 5 ，2 ：2 4 2 5 【3 】李久蒂，安千里联合固氮研究进展f j 】植物学通报，1 9 9 7 ，1 4 ：1 4 2 1 4 】田颖，陈萍联合固氮菌的研究进展【j 】安徽农业科学，2 0 0 5 ，1 1 ：1 3 5 1 3 7 【5 】李久蒂，靳红帆固氮酶结构基因在联合固氮菌k l e b s i e l l a p l a n t i c o l a l 9 1 细胞中的定位f j 】。+ 植物学报，1 9 9 4 ，1 0 ：2 0 。2 3 【6 】崔玉海，秦敏，王焰玲，等f r a n k i a 基因文库的构建及根瘤菌基因区同源克隆的筛选【j 】遗传 学报，1 9 9 0 ，5 ：7 3 7 8 【7 】邹铧，弥铁镌，张忠泽，苏风岩，等f r a n k i a 与链霉菌融合予特性的研究【j 】微生物学 报，1 9 9 4 ，4 ：7 3 7 8 【8 】何新华，陈力勤，陈怡非豆科木本植物与放线菌共生固氮相关基因研究进展 j 】浙江林学 院学报，2 0 0 4 ，1 ：1 1 2 1 1 6 【9 】胡传炯，周启，周平贞马桑弗兰克氏菌的生物学特性的多样性 j 】土壤，1 9 9 8 ，3 ：1 5 8 1 6 0 【1 0 】王树凤，隋益泰非豆科植物固氮菌一f r a n k i a 的基因组研究进展【j 】土壤，2 0 0 5 ，4 ：4 0 5 0 11 】k i mj ，r e e sdc ，s t r u c t u r em o d e l sf o rt h em e t a lc e n t e r si nt h en i t r o g e n a s em o l yb d e n u m i o n p r o t e i n 【j 】s c i e n c e ，1 9 9 2 ，2 5 7 ：1 6 7 7 - 1 6 8 2 1 2 】c h a nmkr e e sdc ，t h en i t r o g e n a s ef e m o - c o n f a c t o ra n dp - c l u s t e rp a i r ：0 2 2 r i mr e s o l u t i o n s t r u c t u r e 【j 】s c i e n c e ，1 9 9 3 ，2 6 0 ：7 9 4 - 7 9 7 【1 3 】p e t e r snk v e r m a tdps p e n o l i cc o m p o u n d sa sr e g u l a t o r so fg e n ee x p r e s s i o ni n p l a n t m i c r o b ei n t e r a c t i o n 【j 】p l a n t m i c r o b ei n t e r a c t ，1 9 9 0 ，3 ( 3 ) ：4 8 1 4 】d e n a f ej s i n g a l i n ga n dh o s tr a n g ev a r i a t i o ni nn o d u l a t i o n 【j 】a n nr e vm i c r o b i o l ，1 9 9 2 ， 4 6 ：4 9 7 5 3 1 【1 5 】b r e w i nhj d e v e l o p m e n to ft h el e g u m er o o tn o d u l e 【j 】a n nr e vc e l lb i o l ，1 9 9 1 ，7 ：1 9 1 2 2 6 【1 6 】v a nb r u s s e lan i n d u c t i o no fp r e - i n f e c t i o nt h r e a ds t r u c t u r e si nt h el e g u m i n o u sh o s tp l a n tb y m i t o g e n i cl i po l i g o s a c c h a r i d e so f r h 担o b i v m 【j 】s c i e n c e ，1 9 9 2 ，2 5 7 ：7 0 7 1 【1 7 n a pjp ，b i s s e ! i n gt d e v e l o p m e n t a lb i o l o g yo fap l a n tp r o k a r y o t es y m b i o s i s ：t h el e g u m er o o t n o d u l e 【j 】s c i e n c e ，1 9 9 0 ，2 5 0 ：9 4 8 9 5 4 【1 8 】s c h e r e sb ，t h ee n o d l 2g e n ei se x p r e s s e da tg e n ep r o d u c ti si n v o l v e di nt h ei n f e c t i o n p r o c e s sd u r i n gp e a - r h i z o b i u mi n t e r a c t i o n j 】p l a n tc e l l ，1 9 9 0 ，2 ( 6 ) ：2 8 0 2 9 4 【1 9 】v i j ni n o df a c t o r sa n dn o d u l a t i o ni np l a n t 【j 】s i e n c e ，1 9 9 3 ，2 6 0 ：1 7 6 4 1 7 6 5 【2 0 】c o o p ejb l o n gsr m o r p h o g e n e s i sc o m p l e m e n t a t i o no f r h i z o b i u mm e l l o t in o d u l a t i o n m u t a n t sb yt r a n s z e a t i ns e c r e t i o n 【j 】p l a n tc e l l ，6 ( 2 ) ：2 1 5 2 2 5 2 1 】黄家风，李克梅，王爱英豆科植物一根瘤菌共生固氮的分子机理【j 】石河子大学学报( 自 然科学版) ，2 0 0 2 ，6 ( 1 ) ：7 4 7 8 【2 2 】g a l i b e r tf ，f i n a ntm ，l o n gsl ，e ta 1 t h ec o m p o s i t eg e n o m eo ft h el e g u m es y m b i o n t s i n o r h i z o u b i u mm e l i l o t i i 【j 】s i e n c e ，2 0 0 1 ，2 9 3 ：6 6 8 6 7 2 1 2 南昌大学2 0 0 3 级硕士研究生毕业论文 2 3 】b e l lcj ，d i x o nra ，f a r m e rad ，e ta 1 t h em e d i c a g og e n o m ei n i t i a t i v e ：am o d e ll e g u m e d a t a b a s e 【j 】n u c l e i ca c i d sr e s , 2 0 0 1 ，2 9 ( 1 ) ：1 1 4 - 1 1 7 2 4 】s h o e m a k e rr ，k e i mp ，v o d k i n ，e ta 1 ac o m p i l a t i o no fs o y b c a ne s t s ：g e n e r a t i o na n da n a l y s i s j 】g e n o m e ，2 0 0 2 ，4 5 ：3 2 9 3 3 8 2 5 】m a r k e rlem u d g ej ，d a m i e l l el ，e ta 1 s o y b e a ng e n o m i cs u r v e y ：b a c e n ds e q u e n c e sn e a r r f l pa n ds s r m a r k e r s j 】g e n o m e ，2 0 0 1 ，4 4 ：5 7 2 5 8 1 【2 6 】陈丽梅，樊妙姬，李玲甘蔗固氮内生菌一重氮营养醋酸杆菌的研究进展【j 】微生物学通 报，2 0 0 0 ，1 ：6 3 6 6 f 2 7 王桂文，李海鹰，范家晔甘蔗内生固氮菌研究f j 】广西农业生物科学，2 0 0 0 ，1 ：7 0 7 4 【2 8 】孟庆杰，王光全生物固氮及其应用 j 】生物学教学，2 0 0