（微生物学专业论文）酸性淀粉酶产生菌的诱变及酶的性质研究.pdf

四川大学硕士学位论文 2 酸性淀粉酶产生菌的电镜观察和1 8 s r d n a 鉴定4 9 3 酶的分离纯化结果5 2 4 酶的性质初步研究5 3 5 金属离子对酶活的影响5 6 6 酶水解淀粉产物的薄层层析5 6 讨论 1 鉴定方法创新5 7 2 诱变方法新颖5 7 3 采用生物化学方法纯化微生物产品5 7 4 具体工业化还有待研究5 8 小结5 8 参考文献5 9 致谢6 2 科研成果简介6 3 声明6 4 图形目录 图1 ：离子注入致死率4 8 图2 ：酶s e p h a d e x g - 1 0 0 层析图谱5 2 图3 ：酶的s d s p a g e 凝胶电泳5 3 图4 ：反应温度对酶活的影响5 3 图5 ：酶的热稳定性5 4 图6 ：p h 对酶活的影响5 5 图7 ：酶的酸稳定性：5 5 图8 ：淀粉酶促转化产物的薄层层析5 7 图9 ：t i m b a r r e lo f 2 t a a ( t a k a - a m y l a s e ) 9 图1 0 ：t i m b a r r e lo f 2 a a a ( a c i d 锄y l a s e ) 1 0 图1 1 ：a k a w a c h i l l 耐酸性淀粉酶基因克隆图解2 1 图1 2 ：a k a w a c h i l l 耐酸性淀粉酶核苷酸序列和氨基酸序列图2 3 四川大学硕士学位论文 图1 3 ：c a 0 7 菌株的扫描电镜照片4 9 表格目录 表l ：s d s p a g e 浓缩胶配制表4 6 表2 ：诱变后菌株传代稳定性4 8 表3 ；酸性a 一淀粉酶分离纯化结果5 2 表4 ：金属离子对酶活的影响5 6 表5 ；c 矿对酶的激活作用5 6 表6 ：a 一淀粉酶主要的微生物来源4 表7 ：e x p r e s s i o no fc l o n e dg e n e sf o rm i c r o b i a la - a m y l a s e6 表8 ：耐酸性a 一淀粉酶的酸稳定性( 残余酶活) 1 6 i l l 四川大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得 的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 驯渺 u 闪“ 幽彳 生 师 籼 副 四川i 大学硕士学位论文 酸性淀粉酶产生菌的诱变及酶的性质研究 微生物学专业( 工业微生物) 研究生：陈远钊指导教师：胡承 摘要 以实验室保存的一株筛选自醋醅的产a 一淀粉酶酵母为出发菌， 对其采用1 8 s r d n a 序列分析作进一步鉴定，结果表明其为水生假丝酵 母。对菌株进行n + 离子注入诱变，使其产物酶活提高了2 1 9 达到 4 9 7 u g 。对其所产a 一淀粉酶进行分离纯化，得知该酶的最适温度为 6 0 。c ，最适p h 值是4 0 ，分子量约为8 1 k d ，c a 2 + 对该酶的激活作用不 明显。薄层层析结果表明，该酶水解淀粉产物为糊精和多种低聚糖。 酸性a 一淀粉酶是在酸性条件下能水解淀粉的酶类，它可以在低 p h 条件下液化淀粉，可应用于酸性条件下淀粉原料的加工，如烧酒的 制备和高麦芽糖浆的生产。开发适合于胃酸性环境( p h 2 0 左右) 的酸 性q 一淀粉酶用于制备消化助剂将会使医疗效果更为有效，此外酸性 a 一淀粉酶还可应用于青贮饲料、发酵饮料、废液的处理等多种领域。 日本以其传统烧酒和清酒工艺为研究重点，是研究耐酸性淀粉酶较早 的国家。1 9 6 2 年，山田指出黑曲霉产生的耐酸性a 一淀粉酶的最适p h 值是4 0 。随后不断从白曲霉发酵产物中分离纯化出在酸性条件下能 保持高活力的耐酸性a 一淀粉酶。 关键词：离子注入诱变；水生假丝酵母；酸性a 一淀粉酶；纯化 四j i i x 学硕士学位论文 i n d u c t i o no fm u t a t i o no fa c i da - a m y l a s e p r o d u c i n gs w a i na n dt h ec h a r a c t e r o fp u r i f l c a t e d a c i da - a m y l a s e g r a d u a t es t u d e n t ：c h e ny u a n - z j a a o t u t o r ：h uc h e n g a b s t r a c t t h ea c i d 舭a m y l a s ep r o d u c i n gs t r a i nw a st r e a t e db yn + t h ea c i d a a m y l a s ea c f i 嘶w a sr a i s e df r o m1 5 5 8 u g t o4 9 7 u g t h e p h y l o g ya 埘a l y s i si sf i n i s h e da c c o r d i n g t ot h ea n a l y s i so ft h e1 8 s r d n aa n di ts h o w st h es t a i ni sc a n d i d aa q u a t i c a t h eo p t i m u m t c a n p e r a t u r eo fa c i d0 t - a m y l a s ew a s6 0 ( 2a n dt h eo p t i m u mp hw a s 4 0 t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ep u r i f i e da c i dc t - a m y l a s ew a sa b o u t 8 l k d t h ee f f e c to fc a z + o nt h ea c i d - a m y l a s ei sn o tr e m a r k a b l e t h er e s u l t so ft h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h yd e m o n s t r a t e dt h a tt h e p 刚u c t sf i o ms t a r c hc a t a l y z e db yt h ee n z y m ew e r l eo l i g o s a c c h a r i d e a n dd e x t r i n t h i s 咖y l t i es h o u l db ec l a s s i f i e da sa l la - a m y l a s e k e yw o r d s ：i o ni m p l a n t a t i o n ；a c i da - a m y l a s e ；p u r i f i c a t i o n ；c a n d i d aa q u a t i c a 2 四川大学硕士学位论文 文献综述：一一一 微生物o r 一淀粉酶的研究进展 1 前言 在当今生物工艺学中，淀粉酶是最重要的一类酶。淀粉酶家族的 酶类所具有的重要意义在意他们广泛的应用。淀粉酶是水解淀粉和糖 原酶类的总称，广泛存在于动植物和微生物中，也是最早实现工业生 产并且迄今为止用途最广，产量最大的酶制剂品种。人类对淀粉酶的 应用开始于几千年前，但是酶提取出来使用是从十九世纪开始的。 1 8 3 3 年，p a y e r 从麦芽提取液中加酒精沉淀获得淀粉酶，1 8 9 6 年日本 人高峰让吉用麸皮培养米曲霉，用水提取，再以酒精沉淀得到淀粉酶 作为消化剂，并在美国设厂从事微生物酶的生产和研究。1 9 2 0 年左右， 法国人b i o d i n 和e f f r o n t 等又先后发现枯草杆菌可以分泌耐热并且活性 更高的0 一淀粉酶，于t 9 2 6 年在德国设厂生产，为微生物酶的工业生 产奠定了基础。淀粉酶作为工业酶制剂的重要组成部分，占了酶制 剂市场的约2 5 份额。 n 一淀粉酶是一种内切酶，作用于淀粉时，以无规则的方式切开 淀粉分子内部的a l ，4 糖苷键，而使淀粉分子迅速降解，生成糊精、 低聚糖、麦芽糖及少量葡萄糖等，同时淀粉失去粘性和与碘的显色反 应，并使水解产物的还原性增加。1 。因为产物末端葡萄糖残基c i 碳原 子为q 一构型，故称为q 一淀粉酶。a 一淀粉酶的这种作用在工业上 被称为淀粉的液化，而a 一淀粉酶也被称之为液化酶。 淀粉酶被应用到很多工业中如食品，发酵，纺织和造纸业。在淀 粉处理工业中，微生物源淀粉酶已经成功取代了化学水解方法。而且 如果酶具有了相应的特性，他们也被广泛应用到制药业和化学药品工 业中。随着生物工艺学的发展，淀粉酶的应用扩展到其他领域，如临 床，医学，分析化学，r e c e n t l yw i t c z a k ”最近的一篇关于将作为一种 新的治疗方法的文章获得了广泛的关注，新的发展尤其是在 t h i o - s u g a r s 的人工合成和药物化学方面，都是对碳水化合物药物设计 四j t i c k 学硕士学位论文 而言相当重要的，包括淀粉酶和脂肪酶在内的酶控机制在这个生物学 过程中起到了重要作用。在临床和医药领域中，有不少过程是应用到 淀粉酶的，s u t t o ne ta l ”1 在免疫血清分析中确定了1 3 中分析物，包括 淀粉酶，l e p pe ta 1 “1 所发展的新的0 l y m p 吣a u 6 0 0 4 化学分析稳定液 态试剂中包括了一淀粉酶。g i r lc ta 1 改良了利用q 一淀粉酶探测高 浓度寡糖的方法，这个方法已经被证明比银硝酸盐这种被其灵敏性 限制的检测法有效得多。d 一淀粉酶常常在s o i - q e l 过程中作为壳聚 糖混合膜的分散剂，同时a 一淀粉酶在环式糊精生物化学分析中作为 酶调节剂。 2 q 一淀粉酶来源 a 一淀粉酶来源于几种细菌，酵母和真菌。表6 ”1 列举了a 一淀粉 酶主要的微生物来源。通常情况下，细菌淀粉酶因为具有几种特性而 优于真菌淀粉酶。a s p e r g i l l u ss p 和b a c i l l u ss p ，特别是b a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s 和b 1 i c h e n i f o 册捃，是目前主用的商业q 一淀粉酶来 源。 表6a 一淀粉酶主要的微生物来源 a e r o m o n a 哼c a v i a e a l t e r o m o n a sh a l o p l a n e t i s a s p e r g i l l u ss p aa w a m o r e i a f u m i g a t u s a n i g e r a u s a n i i 最a c i d o c o l d a r i u s b b r e v i s 丑c o a g u l a n s b g l o b i s p o r u s a l i c y c l o b a c i l l u sa c i d o c a l d a r i u s a n a e r o b i cb a e t e r i u n l a r c h a e o b a c t e r i u m p y r o c o c c u sw o e s e i a f l a t u s a k a w a c h i a o r y z a e b a c i l l u ss p 置a m y l o l i q u e f a c i e n s 置c i r c u l a n s b f l a v o t h e r m u s 丑l i c h e n i f o r m i s 四川1 大学硕士学位论文 丑m e g a t e r i u m 且s u b t i l i s c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m c t h e r m o h y d r o s u l f u r i c u m e u b a c t e r i u ms p h a l o b a c t e r i u mh a l o b i u m h u m i c o l ai n s o l e 肿 且s t e l l a t a lc e l l o b i o s u s m i c r o c o c c u sl u t e u s m i c r o m o n o s p o r av u l g a r i s m y c e l i o p h t h o r at h e r m o p h i l a n o c a r d i aa s t e r o i d e s p s e u d o m o n s as t u t z e r i l y r o c o c c u sw o e s e i s c y t a l i d i u ms p t a l a r o m y c e st h e r m o p h i l u s t h e r m o a c t i n o m y c e ss p t h e r m o c o c c u s p r o f u n d u s t h e r m o n o s p o r ac u r v o l a t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s 且s t e a r o t h e r m o p h i l u s c h l o r o f l e x u sa u r a n t i a c u s cb u t r i c u m c t h e r m o s u l f u r o g e n e s f i l o b a s i d i u mc a p s u l i g e n u m 且s a l i n a r i u m 且l a n u g i n o s a l a c t o b a c i l l u sb r e v i s m a l b r a c h e a p u l c h e l l av a t s u l f u r e a mv a r i a n s m u c o r p u s i l l u s m y x o c o c c u sc o r a l l o i d e s p e n 把i l l i u mb r u n n e u m p y c n o p o r u ss a n g u i n e u s r h i z o p u ss p s c h i z o p h y l l u mc o m m u n e t h e r m u ss p zv u l g a r i c u s t h e r m o m o n o s p o r av i r i d i s zv u l g a r i s t h e r m o t o g am a r i t i m a 3 q 一淀粉酶分子生物学 有关基因工程在酶工程领域的成功应用的文献如雨后春笋般大 量涌现，运用基因工程技术可以改善原有酶的各种性能，如提高酶的 产量，增加酶的稳定性，使酶适应不同的环境，提高酶在有机溶剂中 的反应效率，使酶在后提取工艺和应用过程中更容易操作等，运用基 因工程技术也可以将原来有害的，未经批准的微生物产生的酶的基 因，克隆到安全，生长迅速的，产量很高的微生物体内，实现高效生 四川大学硕士学位论文 产。运用基因工程技术还可以通过增加编码该酶的基因拷贝数目，来 提过微生物生产的酶的数量，这一原理已经成功运用到酶制剂的工业 生产上了叫。 3 1 原生质体融合和诱变 在蛋白质工程中，原生质体融合与诱变被广泛作为获得高产酶菌 株或特异蛋白的工具。l i n a r d ie ta 1 描述了c a n d i d a f e n n i c a 的淀粉酶 产生菌株的种内融合。在酵母的一种应用缺陷型突变菌株的a 一淀粉 酶产生能力提高了3 2 。 3 2 基因克隆及氨基酸序列 基因工程技术已经被广泛应用到了淀粉酶生产菌株的克隆上。主 要是为了获得a 一淀粉酶满意的克隆宿主。基因克隆的目的是为了获 得耐热淀粉酶，高活力的淀粉酶表达和在一个生物体中获得两种酶的 表达。 在不同微生物的。一淀粉酶基因克隆方面已经作了大量的工作， 主要在e s c h e r i c h i ac o l i * s 戈s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ( 表7 ) 0 1 。 表7e x p r e s s i o no f d o n e dg e n e sf o rm i c r o b i a la a m y l a s e s o u r c eo f g e n e t h e r m o t o g am a r i t i m a a l i c y c l o b a c i l l u sa c i d o c a l d a r i u s b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 丑s u b t i l i s 丑a m y l o l i q u e f a c i e n s 丑s t e a r o t h e r m o p h i l u s 丑a m y l o l i q u e f a c i e n s 丑s u b t i l i s r e e o m b i n a n th o s t e s c h e r i c h 胁c o l i ec o l i ec o l i s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e sc e r e v i s i a e ec o l i sc e r e v i s i a e x a n t h o m o n a s 四川大学硕士学位论文 bs u b f f l i s b ? t i c h e n f o r m i s t b 1 i c h e n f o r m i s l 最s t e a r o t h e r m o p h i l u s 丑s t e a r o t h e r m o p h i l u s & c e r e v i s i a e s a c c h a r o m y c o p s i s f i b u l i g e r a c a m p e s t r i s ec o l i ec o l i 最b r e v i s ec o l i s ec o l i c e r e v i s i a e sc e r e v i s i a e l i c b le ta 1 。1 描述了t h e r m o t o g am a r i t i m am s b 8 中一淀粉酶基 因结构，是染色体基因，编码包含重要的氨基酸序列的含有5 5 3 个氨 基酸的前体蛋白。t m a r i t i m eo 一淀粉酶是第一个发现的脂蛋白q 一 淀粉酶，在信号多肽后面，有一条大家公认的由2 5 个富含丝氨酸和苏 氨酸残基的多肽。这个基因能在大肠杆菌中表达。s u g a n u m ae ta 1 “” 研究- j a s p e r g i l l u su s a n i i 的a 一淀粉酶的n 端氨基酸序列，这个序列的 前2 0 个氨基酸和a n i g e r q 一淀粉酶的相同。l ( i m c ta 1 描述了b a c i l l u s b c h e n i f o r m i s 中编码一种新d 一淀粉酶的基因，这个基因已经被克隆并 在大肠杆菌中表达。b 1 i c h e n i f o r m i s 的基因组d n a 用两种内切酶e c o r i 和b a m h i 消化后连接到质粒载体p b r 3 2 2 上，转化占c o l i 携带了含有 3 5 k b 碎片的b 1 i c h e n i f o r m i sd n a 的重组质粒p l l 3 2 2 。由重组质粒 p l j 3 2 2 编码的纯化蛋白具有水解支链淀粉和环化糊精如淀粉的能力。 i e 觚ie ta l “描述了一种c r y p t o c o c c u ss p s 2 能水解生淀粉并能耐热q 一淀粉酶的克隆和序列分析。e d n a 的一个开放阅读框包含6 1 1 个氨基 酸，其中有一条公认的由2 0 个氨基酸组成的信号肽。这个酶的n 端区 域( 从n 端至u 4 9 6 个氨基酸位置) 与源于4 o r y z a e 的一种a 一淀粉酶的 相同部分有4 9 7 的同源性，c 端有与爿n i g e r 源的g a 的c 端相似的序 列。m a r c oe ta 1 m 1 将一个b s u b t i l i s 一淀粉酶基因插入一个质粒中， 转a e c o l i 。在克隆中，编码1 7 1 个c 端氨基酸的3 端区域被一段编码 不是在原先蛋白质中出现的3 3 个氨基酸的核苷酸序列所取代，转化蛋 四川大学硕士学位论文 白具有较强的淀粉水解能力。 为了获得能直接将淀粉转化成酒精的酵母菌菌株，a 一淀粉酶 c d n a 通过线性整合载体“”，整合到带有g a 的单倍体鼢c 蛔，d m w 即 d i a s t i t c u s 。整合载体包含有一个a l e u 2 基因，j 函n i 被用作酶切l e u 成为线性载体，一株转化菌在细胞增殖1 0 0 代后表现出1 0 0 有丝分 裂。为了提高其酒精发酵能力，单倍体转化株比没有n 一淀粉酶活力 的工业用多倍体菌株有用。杂合菌株r h 5 1 能生成高水平的酒精。 b i r o le t a l “克隆了三株5 ：c e d e v i s i a e ( y p g a b ，y p g m m ，y p b g ) 。 y p b g 能分泌一种具有两种不同功能的酶，其同时具有b s u b t i l i s 一 淀粉酶和a s p e r g i l l u sa w a m o r i g a 功能。当这些菌株被分别用于葡萄糖 和淀粉作为底物的酒精生产时，y p g a b 在酒精生产中表现出最高的 淀粉利用率，将y p g a b 与y p b g 相比较发现其较高的淀粉利用率与 其a 一淀粉酶的高酶活密切相关。s h i b ae ta 1 研究了包含了两个质粒 p _ n a 3 和p n a 7 的d 一淀粉酶基因转化菌株c e r e v i s i a e 2 0 b 1 2 。两个质 粒上的a 一淀粉酶基因分别被启动子s u c 2 和p g k 调控，当酒精浓度 为2 5 鲫，基因表达水平时酒精浓度为2 0 9 i 的两倍。 s t e y na n dp r e t o r i u s 将b a m y l o l i q u e f a c i e n s 编码a 一淀粉酶基因 ( a m y ) 和d i a s t a t i c u s 编码g a 的基因( s t a 2 ) 转入一个酵母菌的整合 载体( y i p 5 ) ，形成重组质粒p s p i 和p s p 2 ，a m y 和s t a 2 被一同连 带连接到载体到y i p 5 中，产生质粒p s p 3 。随后，编码抗g e n e t i e i n4 18 显性标记的a p h i 被克隆到p s p 3 中得到p s p 4 。为了增强g e n e t i c i n 4 1 8 的表达，p s p 4 再连接启动子g a l l 0 和终止子u r a 3 ，这样就得到质 粒p s p 5 。p s p 5 通过增加a r s l h 和c e n 4 序列被修改成环形微染色 体p s p 6 。转入了p s p l p s p 6 的实验室c e r e v 括i a e 菌株能稳定产多 种a 一淀粉酶和g a 。m i r a n d a 和b e r g l u n d 描述了一种ab s t e a r o t h e r m o p h i l u s 一淀粉酶在ec o l i 中表达并被用于一种食品级 聚合体。s t r i p e e k ec ca 1 通过对比转入带有丑s u h t i l i s 一淀粉酶基因 杂合质粒的x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s 和不分解淀粉的xc a m p e s t r i s 细 胞研究了n 一淀粉酶基因在发酵中的作用。 j u g ee t a l “”描述了不同 四川大学硕士学位论文 基因在爿n i g e ，中表达产a 一淀粉酶情况，编码一淀粉酶同工酶i ( a m y l ) 和它的信号肽的e d n a 位于z n i d u l a n s 3 一磷酸甘油醛脱氢酶 启动子的调控下。 3 3a 一淀粉酶分子结构 在a 一淀粉酶的初始序列中都有四个保守区域，其中一些氨基酸 序列与作用位点相关，一些则跟t i m 折叠拓扑结构的稳定性有关。其 空间构型也具有相同点。它们都具有一个( p a ) 8 或t i m 折叠结构 的活性位点。a 一保守结构是a 淀粉酶家族所有酶共通的特点，在它 们的特异性反应中都有发生构型变化。基本的差别在于活性位点有不 同的辅助区域或在活性位点附近的吸附糖的位点不同。活性位点a 是在a 淀粉酶家族中最保守的部分，它包含有一个氨基末端的( b a ) | 折叠结构“6 ”1 。 a 一淀粉酶分子最重要的三维空间结构是t a a ( 如图9 ) ，一些次 要的内部或外部结构则是普通的( 口a ) 8 - 圆桶折叠，使作用位点定 位在圆桶领域的b 链c 一末端。 四川大学硕士学位论文 幽1 0t i m 的旧io f2 a a a ( m ：i d - a m y m e ) 4 淀粉酶的生产 虽然不少微生物能产生淀粉酶，获得适合商业生产需要的菌株仍 然具有挑战性，在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株是最重要的因 素，有时候单一菌株会产生多种酶，如一淀粉酶和g a ，如a n i g e r 中 不少菌株能产生1 9 种酶，而能产生a 一淀粉酶的2 8 种菌株。 b a c i l l u s d 姒为是生产a 一淀粉酶的最重要的生产菌株，通常以 s s p 艘和s m f 业列两种形式被用于酶的生产。b a j p a ie ta 1 和o m i d i j ie t a i 发展了用于n 一淀粉酶生产的经济简单的培养基，玉米浆、豆饼粉、 千酪乳清；一这个培养基能用于q 二- 淀粉酶工业生产。s a l v aa n dm o r a e s 研究了不同碳源对d 一淀粉酶生产的影响。虽然乳糖，右旋糖苷和 可溶性淀粉都适合酶的产生，但是葡萄糖作为碳源的时候，获得了最 高的酶产量。e lh e l o w 和e lg a z a e r l y 比较了利用三种营养培养基生 产q 一淀粉酶，获得了分别用甜菜浆、玉米粒、米糠、麦麸和麦秆部 分代替选择培养基中的营养成分的酶生产模式。当有玉米粒或麦麸的 时候，a 一淀粉酶获得最高产量。s y ua n dc h e n 曲1 还研究了当以葡萄 糖、麦芽糖、木糖和淀粉分别作为碳源的时候对a 一淀粉酶生产的影 响，葡萄糖能导致菌体的快速生长，而培养基中淀粉的存在能获得高 的酶活或特定酶活。h i l l e r e ta 1 嘲1 利用准确配制的合成培养基证明 四川大学硕士学位论文 了乳糖和氮对细胞生长和q 一淀粉酶的生产的影响。实验结果显示细 胞生长和q 一淀粉酶的生产模式相似，与限制营养无关。k e l l ye ta 1 1 研究了获得a 一淀粉酶高酶活的双相培养过程。氧的传递情况和溶 氧量被作为a 一淀粉酶生产的重要方面来考查“”。在酶产量高的培养 过程中，通气量是很重要和基本的，可是没有发现控制溶氧量对酶的 产生有利。b a b u 和s a t y a n a r a y a n a “”在充入二氧化碳的条件下获得了 最高的a 一淀粉酶产量。 由于丝状真菌常被当作生产胞外酶最常用的菌株，用真菌生产a 一淀粉酶的研究也一直在进行。有报道显示喜温菌类t h e r m o m y c e s l a n u g i n o s a 是生产a 一淀粉酶的优良菌株“1 ，可以通过调控生长条件 和培养基的成分获得酶的高产。s u d oc t a l 对比了用s m f 和s s f 生产 耐酸性一淀粉酶，探究爿k a w a c h i ii f o4 3 0 8 通过s s f 生产的耐酸性 a 一淀粉酶比通过s m f 的多，一些s s f 的特性被作为其酶产量高于 s m f 的主要原因，d es o u z ae ta 1 检测了8 0 0 多株用于。一淀粉酶生产 的r h i z o p u s 菌株，其中一株能通过s s f 显示出强的耐热性q 一淀粉酶 产生能力。t o r r a d oe ta 1 通过氧化或降低氮源研究了在固体培养条件 下p h 调节。根据这些，他们提出了一种q 一淀粉生产模式。k r i s h n a 和 c h a n d r a s e k a r a n 汹1 利用香蕉废弃物培养4 e r o m o n a sc a v i a e 结果显示这 株菌具有良好的利用价值，而且香蕉废弃物也有通过s s f 生产。一淀 粉的商业利用价值。 细胞固定化技术也被广泛应用到d 一淀粉的生产中， i v a n o v ae t a 1 ”3 比较了不同的固定化技术，包括在n 一淀粉酶生产过程中藻酸 钙、岸一角叉胶、琼脂固定过程和它们与聚乙烯的化合、在聚乙烯聚 合物上的吸附、，在活性甲醛丙烯腈丙稀酰胺膜上的固定。发现琼 脂、丘一角叉胶、琼脂聚乙烯氧化物胶体和这些膜适合a 一淀粉酶 生产。b 1 i c h e n i f o r m i s 的膜固定细胞的产酶量与自由细胞相比提过 1 7 6 。a r i g ac ta 1 啪1 研究了聚乙烯醇微囊固定重组子ec o l i 和丑 b r e v i s 持续生产a 一淀粉酶的过程。在所有的b b r e v i s 实验中，酶从微 囊中释放出来，而没有细胞的泄漏，细胞生长在微囊的外面。在固定 四j 1 大学硕士学位论文 ec o l i 细胞时，在培养基中加入糖胶以帮助酶的释放时必要的 s t e f a n o v a e t a l 用琼脂凝胶膜固定b b r e v i s 细胞生产耐热性q 一淀粉 酶。d o b r e v ae ta 1 利用膜聚合体固定b 1 i c h e n i f o r m i s 细胞生产d 一 淀粉酶，酶产量受到载体成分的化学反应和间隔距离的影响，活性甲 醛聚砜膜对固定化效率最适合。通过实验室重复实验证明可以增加 6 2 的产量。l i nc ta 1 1 描述了一种固定b a m y l o l i q u e f a c i e n s 细胞持续 生产。一淀粉酶的旋转喷灌反应器的设计，他们认为当被正确应用 时，这种生物反应器对于酶的生产能力的提高比摇瓶有效。细菌 h a l o b a c t e r i u ms a l i n a r i u m 菌株细胞通过藻酸钙球体固定，附着在聚乙 烯乙醇膜上生产耐盐a 一淀粉酶。”。 5 q 一淀粉酶纯化和酶的特性 酶在药物和临床方面的应用要求酶要具有很高的纯度，所以发展 经济有效的工艺以获得具有高酶活的化学纯级别的酶是相当重要的。 传统的从发酵培养基中纯化淀粉酶一般通过以下几个步骤：培养液离 心过滤( 对于固体培养基来说抽提步骤是必需的) ，悬浮物的选择性浓 缩，一般是通过超滤方法，再选择性沉淀酶如硫酸铵盐析或有机溶剂 如冷乙醇沉淀，然后粗酶再通过层析和分子筛纯化。 细菌口- 淀粉酶：因为细菌a 一淀粉酶一般是由b a c i l l u s 生产的， 在嗜温和嗜热菌株产生的a 一淀粉酶纯化和酶特性做了不少研究。 u g u r u e ta 1 。”描述了b s u b t i l i s ，产生的耐热胞外一淀粉酶的纯化， 其酶活比初始的2 2 0 0u n i t s m g p e r l i t r e ：提高了2 4 倍。b o l t o ne ta 1 1 通过硫酸铵盐析，离子交换和分子筛纯化了一种。一淀粉酶。酶被二 乙基焦碳酸抑止活性。b 1 i c h e n i f o r m i s 产生的一种耐热性胞外d 一淀 粉酶先通过离子交换和分子筛后，用聚乙烯，右旋糖苷两相分离系统 纯化。耐热性具有c e + 依赖性，纯化的蛋白质活性被n 溴代琥珀酰亚 胺和e d t a 强烈抑止。m a r c oe ta 1 m 3 描述了一种基因修饰的一淀粉 酶，分子量( 4 8 0 0 0 d a ) 比亲本菌株编码的原始氨基酸序y u ( 分子量为 5 7 7 0 0 d a ) 。酶活被h g 、f e 3 + 和a 1 3 + 抑制，能被m n 2 + 和c 0 2 + 激活。 四川大学硕士学位论文 胞外n 一淀粉酶所必须具备的一个基本特性是能适应其形成环 境的p h 值和温度。b f l a v o t h e r m u s 生长环境p h 值为6 0 ，温度为5 5 ， 其产生的d 一淀粉酶最适d h 值为5 5 - 6 0 ，最适温度是6 0 。b a c i l l u s s p 嗜碱菌株g m 8 9 0 1 ，最佳生长p h 值为1 0 5 ，稳定5 0 ，其产生的一 种一淀粉表现出的最适p h 值为1 1 0 - 1 2 0 ，最适温度为6 0 。c 。 b a c i l l u ss p 的另一株菌生长的最佳环境为p h 值为8 5 ，其a 一淀粉作 用的最适p h 值为9 0 。”。s a t o h e t a l “1 纯化了一种s t r e p t o c o c c u s b o r i s 被麦芽糖和可溶性淀粉诱导的胞内a 一淀粉酶，这种酶表现出与同一 菌株产生的胞外a 一淀粉酶不同的特性，两者之间没有相同之处。一 种来自sb o r i sj b l 另一株菌的胞外一淀粉酶分别表现出与b a c i l l u s s p o 一淀粉4 0 相似性和c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u mq 一淀粉酶2 7 的相似性，分解直链淀粉成为麦芽糖，麦芽三糖和麦芽四糖。i l o r i 等 。”) ) k m i c r o c o c c u sl u t e u s 和l a c t o b a c i l l u sb r e v i s 纯化了胞外q 一淀粉 酶，这两种酶都能被e d t a 、k c n 和柠檬酸抑止活性，也都能被m 9 2 + c a ”，n a + 和心激活。一种b i f i d o b a c t e r i u ma d o l e s c e n t i s 胞外a 一淀 粉酶能被e d t a 、葡萄糖、麦芽糖、c u 2 + 、z n 2 + 和n 溴代琥珀酰亚胺 抑止，但能被b 巯基乙醇激活m ，。 一些关于特异的喜温菌株产生的淀粉酶特性的报道1 ，研究的热 点在于它们的特性在改进工艺技术方面的应用。这种类型的第一个报 道是关于t h e r m u s 的一株嗜热菌株产生的a 淀粉酶特性， e g a s p 明 通过离子交换，纯化了这种蛋白质。8 0 以上，c a 2 * 对其耐热性有 增强的作用。e d t a 抑止其活性，但加入了c a 2 + 或s p 离子后解除 抑止；h 9 2 + 、c u 2 + 和对氯高汞苯甲酸也能抑止其活性。s h a w 也从 淀粉粒上吸附的t h e r m u ss p 纯化了一种d 一淀粉酶，酶活性被c u 2 + 和f e 2 + 强烈抑止，c a 2 + 不能激活其活性。产自原始细菌 t h e l l l l o c o c c c u sp r o f u n d u s 的- - 种d 一淀粉酶通过硫酸铵盐析， d e a e t t o y o p e a r l 层析，s u p e r d e x 2 0 0h r 分子筛纯化。c a ”能增 强这种酶的耐热性。但是来自于另一种原始细菌p y r o c o c c u sf u r i o s u s ， 的a 一淀粉酶的耐热性和酶活都不依赖c a 2 + 。a l i c y c l o b a c i l l u s 四川大学硕士学位论文 a c i d o c a l d a r i u s 一淀粉酶表现出嗜酸性。产自嗜热绿色光合细菌 c h l o r o f l e x u xa u r a n t i a c u s ，的产物为麦芽三糖和麦芽四糖的纯化a 一淀 粉酶在碱性p h 值条件( 上升到了1 2 ) 和高温条件下( 上升至f j s s c ) 保持 稳定。 真菌d 一淀粉酶 关于真菌。一淀粉酶纯化的详细研究主要局限在一些嗜温真菌 种类中，虽然关于一些嗜温真菌的生长和a 一淀粉酶的产生已经有人 做过研究，关于它们物理化学特性的延伸资料被当作几种特定种类如 m u c o r p u s # u s ，t a l a r o m y c e se m e r s o n i i 和t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s a 发 表。产自fl a n u g i n o s a 耐热性q 一淀粉最适d h 值比产自彳o r y z a e 的c 1 一淀粉酶最适p h 值低一个p h 单位，比产自m p u s # u s ，o 一淀粉酶高 一个p h 单位，与产自ze m e r s o n i i 和a a w a m o r ia 一淀粉酶相似。 酵母。一淀粉 只有少量文献描述酵母q 一淀粉酶纯化的，产自c r y p t o c o c c u ss p 的能消化生淀粉的耐热性n 一淀粉仅通过a 一环化糊精琼脂糖6 b 柱一步就能纯化【酶表现出一些与h o r y z a eq 一淀粉酶和a n g e r g a 类似的相似性。t s i o m e n k o 纯化并检验了产自担子菌酵母 f i l o b a s i d i u mc a p s u l i g e n u m 的d 一淀粉酶酶学特性，其酶活不受c a 2 + 影响。p r i e t o 1 通过硫酸铵盐析，交链淀粉吸附，d e a e b i o g e l a 层 析纯化了一种产 | l i p o m y c e sk o n o n e n k o a e 的新型一淀粉酶。 6 特殊q 一淀粉酶 a 一淀粉酶通常在p h 5 5 8 o 稳定，p h 4 以下容易失活，酶活 性的最适p h 值为5 6 。纯化后的q 一淀粉酶在5 0 以上容易失活，但 在有大量钙离子存在时，酶的热稳定性增加。随着。一淀粉酶在不同 工业的应用范围不断扩大，对n 一淀粉酶的特性也有了不同的要求。 在极端条件下具有高酶活的n 一淀粉酶种类满足了这些要求，由于它 们在特定条件下的稳定性，在有关工业中具有高度的重要性。 6 1 耐热口一淀粉酶 四j ”大学硕士学位论文 耐热性n 一淀粉酶具有作用温度高，作用力强，反应速度快的特 性，其作用的最适温度为9 0 9 5 ，最适使用范围为9 5 1 0 5 c 。 由于耐热性在工业用酶方面具有的的优越性，产耐热性淀粉酶的 耐热性微生物是研究的热点，最近关于耐热性淀粉酶特别是n 一淀粉 酶的的研究主要集中在耐热性或极端耐热性方面。l o n s a n e 和 r a m e s h 总结了固态发酵生产b a m y l o l i q u e f a c i e n s 和b 1 i c h e n i f o r m i s 耐 热细菌淀粉酶工艺，指出固态发酵过程使生产酶和淀粉水解最经济适 用的方法。 耐高温。一淀粉酶可在食品工业的啤酒，酒精，淀粉糖，酿造及发酵 工业中得到广泛的应用，并起到推动新工艺新技术的运用与研究，降低消 耗，降低成本的作用。 6 2 耐碱性。一淀粉酶 嗜碱性微生物作为极端环境中的一种微生物，是一类仅能在碱性条 件下( p h 9 o 1 1 生长的生物的总称。由嗜碱微生物产生的胞外q 一淀粉 酶具有在高p h 值条件下保持高活性的特点