（分析化学专业论文）利用细胞内钙离子的浓度变化检测乙酰胆碱.pdf

本论文共包括三部分内容： 中文摘要 前言部分首先对激光共聚焦荧光显微镜和落射荧光显微镜及其工作原理进 行简要介绍；然后介绍了细胞内的第二信使一钙离子以及与之相关的钙离子通 道，着重介绍了爱体门控的钙通道、胆碱能受体及其效应机制；最后对乙酰胆碱 及其检测方法进行了总结和评述。 第一章采用激光诱导荧光的方法检测钙离子，选择f l u o 3 a m 为钙离子荧光 探针，通过细胞内钙离子的荧光强度变化检测乙酰胆碱的含量。首先，钙离子荧 光探针在室温下3 0r a i n 负载，在细胞内酯酶的作用下脱掉乙酰甲酯变成f 1 u o 。3 ， f l u o 一3 与细胞内游离的c a z + 结合。用激光共聚焦显微镜连续扫描细胞，获得加乙 酰胆碱前后的荧光图像。对图像的分析结果说明乙酰胆碱能引起细胞内的钙离子 的浓度升高。用落射荧光显微镜确定检测乙酰胆碱的最佳条件，用e m c c d 获得 荧光图像，数据结果由m a t e m o r p h 软件测量分析。浓度为5 0 x1 0 4 3 1 0 xl f f l l m o l l 时，乙酰胆碱与荧光信号的增加值有较好的线性关系，检测限为3 2 x1 0 1 3 m 0 1 l 。 第二章采用微流控分析芯片与单细胞分析相结合的方法检测了乙酰胆碱的 含量。通过模塑法制作了通道直径为约1 0 0 mp d m s 微流控芯片，利用微流控 芯片单细胞进样。选择h u o 一3 a m 为钙离子荧光探针，乙酰胆碱刺激单个细胞。 用落射荧光显微镜检测了单个细胞内c a 2 + 的荧光强度变化。当乙酰胆碱浓度为 1 0 x1 0 d 3 3 0 x1 0 nm o l l 时，检测到的荧光信号的增加值与乙酰胆碱的浓度 成正比，检测限为1 6 1 0 - ”m o l l 。 关键词：激光诱导荧光，单细胞分析，乙酰胆硫细胞内钙离子 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o nc o n s i s t so ft h r e ep a r t s ： i nt h ep r e f a c e ，f i r s to fa l l ，l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e ( l s c m ) a n d e p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yw e r ei n t r o d u c e db r i e f l y t h ed e t a i lo p e r a t i o np r i n c i p l e s o fl s c ma n de p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yw e r ed e l i v e r e d s e c o n d l y ，c a “，髂ak i n d o fc e l l u l a rs e c o n dm e s s a g e r s ，c a l c i u mc h a n n e la n dc h o l i n o c e p t o rw h i c hw a sas o r to f r e c e p t o ro p e r a t e dc a l c i u mc h a n n e lw e r er e v i e w e d t h e n ，a e e t y l c h o l i n ea n dm e t h o d s f o rd e t e c t i o n sw e r ei n t r o d u c e db r i e f l y i nt h ec h a p t e ro n e ，w ed e v e l o p e dan o v e lm e t h o df o ra n a l y s i so fa e e t y l c i m l i n e ( a c h ) b yi n c r e a s e df l u o r e s c e n ti n t e n s i t yo fi n t r a c e l l u l a rc a 2 + t h i s ， s i g n a l i n gi n methodfluo3 a mw a sa p p l i e dt oc a l c i u mf l u o r e s c e n tp r o b ea n dl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a l m i c r o s c o p e ( l s c m ) a n de p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yw e r ec a r r i e do u tt od e t e c tl a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n t ( l i f ) i n t e n s i t y b ya c e t y l c h o l i n e s t i m u l a t e d c e l l f i r s t l y , f l u o 一3 a mw a sl o a d e da tr o o mt e m p e r a t u r ef o r3 0m i n t h e n ，a f t e rh u o 一3 a r w a s c h a n g e di n t o f l u o 一3b y t h ei n t r a c e l l u l a re s t e r a s e s w e a no b s e r v eav e r yl a r g e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi n c r e a s ei nr e s p o n s et oc a 2 + b i n d i n g t h eo p e r a t i o nm o d eo f l s c mw a sc h o s e nt oc o n t i n u o u ss c a n n i n gt h ea c e t y l c h o l i n es t i m u l a t e dc e l l t h e a c q u i r e di m a g e s a n da n l y t i c a tr e s u l t si h d i c a t e dt h a ti n c r e a s e di n t r a c e l l u l a rc a 2 + c o n c e n t r a t i o nw a ss t i m u l a t e db ya c e t y l c h o l i n e t h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o nw a s d e f i n e dw i t he p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p i ci m a g i n g ，w h i c hw a sa c q u i r e db ye m c c d a n dm a t e m o r p hs o f t t h el i n er a n g ef o rt h ec o n c e n t r a t i o no fa c hf o r m5 0x1 0 1 m o l l t 0 1 0 1 0 1 1 m o l l , a n d t h e l i m i t o f d e t e c t i o n w a s 3 2 1 0 1 3 m o l l i n t h ec h a p t e rt w o ，m e a s u r e m e n to fa c e t y l c h o l i n e ( a c h ) w i t ht h et e c h n o l o g yo f m i c r o f l u i d i cc h i p sc o m b i n e dw i t hc e l l u l a rb i o s e n s o r ap d m sm i c r o f l u i d i ec h i p s a b o u t1 0 0 t mc o l u m nd i a m e t e rw a sf a b r i c a t e d c e l l sw e r es e p a r a t e dt os i n g l eo n eb y i l l 山东大学硕士学位论文 m i c r o f l u i d i cc h i p s s i n g l ei n t r a c e l l u l a tf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi n r e s p o n s et o c a 2 + b i n d i n gw e r em e a s u r e db ye p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p i ci m a g i n g t h el i n er a n g ef o r t h ec o n c e n t r a t i o no fa c hf o r m1 o x1 0 1m o l lt 0 3 o l f f l lm o l l , a n dt h el i m i t so f d e t e c t i o nw a s1 6xl f f l 3m o l l k e y w o r d s ：l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n e ，s i n g l e - c e l la n a l y s i s ，a c e t y l c h o l i n e ，i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m 山东大学硕士学位论文 符号与缩写 l s c m ：激光共聚焦显微镜 p m t ： 光电倍增管 l w ：激光诱导荧光 e p i ：落射荧光显微术 e m c c d ：电子扩增电感耦合装置 c c d ：电荷耦合器 l d ：半导体激光器 v o c ：电压门控的钙通道 r o c ：受体门控的钙通道 s o c ：钙库控制的钙通道 g p c r ：g 蛋白偶联受体 e r ：内质网 s r ：肌浆网 口3 ：磷酸肌醇 p t d l n s p 3 ：磷脂酰肌醇4 ，5 二磷酸 d a g ：甘油二酯 p l c ：磷脂酶c n a ：去甲肾上腺素 m r ：毒蕈碱型受体 n m in 2 受体 n n ：n l 受体 a c h ：乙酰胆碱 p d m s ：聚二甲基硅氧烷 l o d ：浓度检测限 叮a s ：微型全分析系统 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：二乏型匿日期：丕幺二梦 l 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：导师签名； 山东大学硕士学位论文 前言 1 激光共聚焦扫描显微镜( l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e ) 激光共聚焦扫描显微镜( l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e ，l s c m ) 是上世纪 8 0 年代发展起来的先进的细胞生物学分析技术。l s c m 可以进行亚细胞水平结构功 能的研究 1 ，2 ，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，观察细胞的形态变 化和生理功能变化，特别是在结合了先进的生物学技术 3 以后，更成为药理学 4 、 形态学 5 3 、细胞生物学 6 3 研究中强有力的新一代研究工具。1 9 8 7 年w h i t e 和a m o s 在英国 n a t u r e 杂志发表了“c o n f o c a lm i c r o s c o p yc o m e so f a g e ”一文 7 ，标志着 l s c m 已成为科学研究的重要工具。 l s c m 是在荧光显微成像的基础上加装了激光扫描装置。如图l 所示，它采用激 光做光源，激光束经照明针孔，由分光镜反射至物镜并聚焦于样品上，对标本内焦平 面上的每一点进行扫描，然后，激发出的荧光经原来入射光路直接返回到分光镜，当 通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管( p h o t o m u l t i p l et u b e ，p m t ) 探测 收集，并将信号输送到计算机，在显示屏上显示图像。在此过程中，只有焦平面上的光 才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的，不能通过 小孔，因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明针孔与探测针孔 相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。这 样避免了传统光学显微镜由于光散射造成的图像信噪比降低，图像清晰度和分辨率 不高的缺点。l s c m 主要配置有激光器、扫描头、显微镜和计算机图像处理系统四 大部件，包括数据采集、处理、转换及相应应用软件、图像输出设备及光学装置。 山东大学硕士学位论文 圈1l s c m 基采结构冒 2 落射荧光显微镜( e p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ) 荧光显微镜是细胞观测的基本工具，它是主要由光源、滤板系统和光学系统等 部件组成。它是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过显微镜系统进行放大以 观察标本的荧光图像。荧光显微镜分为透射荧光显微镜和落射荧光显微镜。 落射荧光显微镜的工作原理：光源发出的激发光首先通过激发滤光片，将光源 发出的较宽波长的激发光截取到荧光染料所需的波长范围之内，激发光由分光镜反 射，经过物镜垂直照射在待测样品上。待测样品发射的一部分荧光经由物镜收集， 由光路透射通过分光镜。样品荧光通过发射滤光片后，仅有所需测定的一定波长的 荧光信号被观测。通过对所得到的荧光图像就可以对生物的组织( 无论活体、染色、 未染色) 、细胞( 包括细胞器【8 】、细胞信号传达【9 】、跨膜运输 1 0 】) 、病毒【1 1 】以致 单个分子 1 2 1 进行分析。目前，落射荧光显微镜己应用于生物学 1 3 1 、药理学 1 4 1 、 形态学 1 5 1 、细胞生物学【1 6 】、神经科学 1 7 1 、胚胎学【l s l 、免疫学 1 6 1 等领域 落射荧光显微镜现在多采用1 0 0w 的超高压汞灯作光源，它发射出很强的紫外 山东大学硕士学位论文 光和蓝紫光，足以激发各类荧光物质。落射荧光显微镜也可以采用激光作为激发光 源，气体激光器是目前最常用的激光光源，如h e 2 c d 激光器( 激发波长3 2 5r i m 、4 4 2 n m ) 、a r + 激光器( 激发波长：5 1 4n m 、4 8 8n m 、4 5 8a m ) 。半导体燃( 1 a s e rd i o d e ， l o ) 也是比较理想的激发光源，具有输出功率稳定，输出光强波动小、寿命长、体 积小、价格低等优点。 图2 汞灯落射显微镜测定f i t c 标记细 胞膜表面蛋白的荧光图像 图3 激光落射显微镜测定f i t c 标记细胞 膜表面蛋白的荧光图像 图2 和图3 是分别使用汞灯和激光作为激发光源观测f i t c 标记细胞膜表面蛋 白的荧光图像。通过图2 和图3 的对比可以看出由于汞灯的发射光谱较宽，即使激 发光通过激发滤光片的截取也会有较多物质被同时激发，从而造成背景信号过高， 掩盖掉部分所需观测的荧光信号。图3 中使用激光作为激发光源，由于激光单色性 高，波长为固定单一波长，仅有所需观测的荧光物质被激发，取得了较高的信噪比， 有利于观测背景较为复杂的样本，降低了荧光物质的检测限，可以测定生物样本中极 低含量的荧光物质。 3 细胞内钙离子 钙离子作为细胞内的第二信使，调控细胞内许多重要的生物和病理过程。几乎 所有的生理活动都受c a 2 + 的调控。钙离子在生命的开始就可以触发受精过程，控制 细胞发育和分化使之成为特定类型的细胞，然后调节细胞的各种生理活动，最后参与 细胞凋亡过程 1 9 。细胞内的钙离子主要贮存于线粒体和内质网内。一般细胞内的 山东大学硕士学位论文 c a 2 + 浓度为1 0 7 m o l l ，细胞外的浓度为2 x l o m o l l 2 0 。 胞浆内c a 2 + 来源于两个方面，即外钙内流和内质网肌浆网( e r s r ) 内的钙库 释放( 非激动细胞是内质网，激动细胞是肌浆网) 外钙进入途径主要分成三大类： 电压门控的钙通道( v o l t a g eo p e r a t e dc a l c i u mc h a n n e l ，v o c ) 、受体门控的钙通道 ( r e c e p t o ro p e r a t e d c a l c i u mc h a n n e l ，r o c ) 和钙库控制的钙通道( s t o r eo p e r a t e d c a l c i u mc h a n n e l ，s o c ) 。 3 1 受体门控的钙通道( r o c ) 受体门控的钙通道广泛分布于各种细胞，一般选择性较差，它引起c a 2 + 内流至 少有三种途径。 3 1 1 配体门控钙通道 此类通道是受体与通道的一个复合体，当配体与受体结合后，通道开放，c a 2 + 内流。其中研究较为清楚的是a t p 门控钙通道 2 1 3 1 2g 蛋白与钙通道偶联 该途径是通过经典的神经递质如乙酰胆碱( a c h ) 和去甲肾上腺素( n a ) 在激动通 过g 蛋白与钙通道偶联的受体后紧接着产生具有一定程度c a 2 + 选择性的阳离子电 流。 3 1 3 受体与g 蛋白偶联 该途径是通过第二信使( 如i p 3 、i p 4 等) 介导细胞内钙库释放c a 2 + ，并且调节受 体依赖性钙通道或电压依赖性钙通道。目前发现，一系列的细胞内信号转导途径可 调节受体依赖性钙通道，如钙一钙调蛋白 2 2 ，肌球蛋白一轻链激酶 2 3 ，酪氨酸激 酶 2 4 ，肌醇磷脂系统，p k c 及细胞内外的c a2 + 浓度 2 5 ，2 6 3 。 3 2 胆碱能受体( e h o l i n o e e p t o r ) 分类及效应机制 凡是能与乙酰胆碱结合的受体叫做胆碱能受体。它又可分为两种：一种是毒蕈 4 山东大学硕士学位论文 碱型受体( m u s c a r i n i cr e c e p t o r ，m r ) 或m 受体，它和乙酰胆碱结合时具有与毒蕈碱 相似的作用。另种叫烟碱型受体( n i c o t i n i cr e c e p t 0 0 或n 受体，它与乙酰胆碱结合 时具有与烟碱相似的作用。 3 2 1 m 型胆碱受体( m 受体) ， m 受体是g 蛋白偶联受体( gp r o t e i n - c o u p l e dr e c e p t o r , gp c r ) 超家族中的一员， 七次跨过细胞膜，形成七个跨膜区( t ml a ) ：三个胞外区( 0 1 3 ) 、三个胞内区( i l - 3 ) 及 一个包括细胞外n 末端( n ) 和细胞内c 末端( c - ) 的区域。哺乳动物的5 种亚型的m 受体的氮基酸序列很相似，一个约1 4 5 个氨基酸的区域是它们共同具有的，它们还 都具有一个向膜内伸出的具有1 5 7 2 4 0 个氨基酸的环【2 7 】。在细胞膜上，七个跨膜 区呈轮辐状排列，形成一个跨膜的朝向细胞外的“凹穴”。这种结构使m 受体形成 一个位于中心、高度保守的亲水凹陷 2 8 】( 见图4 ) 。m 受体共分m l - m 5 五种亚型， 其中m 2 受体主要分布在大脑皮质，而其它四种亚型多存在于外周组织 2 9 1 。 3 2 1 1m 受体的分布及作用 m 受体主要分布于胆碱能神经节后纤维所支配的效应器，如心脏，胃肠平滑肌、 膀胱逼尿肌、瞳孔括约肌和各种腺体。在m 受体的5 种亚型中，较为公认的是m l 、 m 2 、m 3 三种亚型( 见表1 ) 表1m l 、m 2 、m ，三种亚型在组织中的分布 山东大学硕士学位论文 图4 乙酰胆碱通过静电、偶极和疏水性相互作用与受体结合 在非激动细胞中，如血液细胞、肝细胞、内皮细胞，细胞质内的c a ：+ 浓度升高 以肌醇1 ，3 ，4 _ 三磷酸( i p 3 ) 介导的为主【2 9 】。上皮细胞也同样如此 3 0 1 。m g c 一8 0 3 细胞是人低分泌粘液腺胃癌细胞，细胞形态特征属上皮肿瘤细胞。 m 受体属于与鸟苷酸结合调节蛋白( g 蛋白) 偶联的超家族受体，m 受体激动 后与g 蛋白偶联，进而激活磷脂酶c ( p l c ) ，使磷脂酰肌醇- 4 ，5 - 二磷酸( p t d i n s p 3 ) 转变为磷酸肌醇( i p 3 ) 和甘油二酯( d a g ) 【3 i 】。i p 3 作为细胞内的第二信使与i p 3 受体结合，使内质网内的c a ：+ 从内质网中流向细胞质内。刺激毒蕈碱型乙酰胆碱受 体m 3 能有效地排尽内质网中c a ：+ 库，迅速引起细胞质内c a ：+ 浓度提高。时间是瞬 时的，同时以某种方式引起c a ：+ 跨过细胞膜内流1 3 2 1 。例如通过控制c a ：+ 的驱动力， 膜电位调控大量的c a 2 + 直接流到细胞质内，以超极化的方式提高细胞质内c a 2 + 水平。 非激动细胞可通过超极化的方式使膜外c a ：+ 内流，如开放k + 通道使膜电位的电负性 增大。使电压依赖型的c a 2 + 通道开放，c a 2 + 迅速跨膜内流 2 0 1 。 m l 或m 3 受体激动后与g 蛋白偶联激活磷脂酶c ( l p c ) ，产生一系列效应 3 3 】。 m 2 受体激动后与g 蛋白偶联可抑制腺苷酸环化酶、或激活k + 通道和抑制c a ” 通道，产生生物效应 3 4 】。 3 2 2n 胆碱受体( n 受体) 3 2 2 1n 受体的分布 n 受体根据分布不同，分为n m ( n i c o t i n i cm u s c l e ，或称n 2 受体) 受体和n n ( n i c o t i n i cn e u r , 或称n l 受体) 受体。l q m 受体分布于神经肌肉接头( 骨骼肌细胞 膜) ，n n 受体分布于神经节。 6 山东大学硕士学位论文 3 2 2 2n 受体的信号传导通路 n m 受体和n n 受体均属配体门控型离子通道型受体，当a c h 与n 受体结合后， n 受体发生构象改变，离子通道开放，调节n a + 、k + 、c a 2 + 跨膜电位，细胞产生局 部去极化。具有n m 受体的骨骼肌细胞表现为细胞外钙内流和细胞内钙释放，肌肉 收缩；具有n n 受体的神经节次一级神经元表现为兴奋的继续传递。 4 乙酰胆碱 神经递质是神经元之间或神经元与效应器之间进行信息传递的化学物质。乙酰 胆碱( a c h ) 是一种经典的神经递质，既是外周神经递质又是中枢神经递质。a c h 主 要在胆碱能神经末梢内合成，少量在胞内合成。 4 1 乙酰胆碱作为外周神经递质的分布和作用 所有自主神经节前纤维、大多数副交感节后纤维，少数交感节后纤维( 引起汗 腺分泌和骨骼肌血管舒张的舒血管纤维) 以及支配骨骼肌的纤维，都属于胆碱能纤 维【3 5 】。 a c h 作用于胆碱能m 受体，可产生一系列自主神经节后胆碱能纤维兴奋的效应， 包括心脏活动的抑制、支气管平滑肌的收缩、胃肠平滑肌的收缩、膀胱逼尿肌的收 缩、虹膜环形肌的收缩、消化腺分泌的增加以及汗腺分泌的增加和骨骼肌血管的舒 张等所有自主神经节神经元的突触后膜和神经一肌接头的终板膜上都分布有n 受 体。小剂量a e h 能兴奋自主神经节神经元，也能引起骨骼肌的收缩，而大剂量的a c h 则阻断自主神经节的突触传递。 4 2 乙酰胆碱作为中枢神经递质的分布和作用 乙酰胆碱存在于脊髓前角运动神经元、脑干网状结构上行激动系统、纹状体等 部位【3 5 】。这些部位的乙酰胆碱主要和学习、记忆、识别及判断等功能有关【3 6 】。乙 酰胆碱在丘脑中的含量与动物的睡眠的清醒程度有关，含量越高越清醒【3 7 】。大脑 皮层及海马和学习、记忆密切相关。许多研究证明胆碱能拮抗剂可干扰学习模式， 山东大学硕士学位论文 而胆碱酯酶抑制剂则促进学习 3 8 】。目前已证明，毒蕈碱系统能促进感觉信息加工 过程。在感觉刺激过程中，皮层乙酰胆碱的释放增j 3 3 9 。 4 3 乙酰胆碱分析 1 9 2 1 年德国科学家l o e w i ，用离体双蛙心灌流实验证明了用电刺激迷走神经时 迷走神经释放了一种能抑制心脏的物质。实验如图5 所示，用两个离体灌流蛙心，第 一个带有神经，第二个没带。刺激第一心脏的迷走神经几分钟，心跳减慢；随即将 其中的任氏液吸出，转移到第二个未被刺激的心脏内，后者的跳动也慢了下来，正 如刺激了它的迷走神经一样。1 9 2 6 年证明迷走神经释放的是乙酰胆碱( a c h ) ，它作 用于胆碱能受体。定量测定神经组织a c h 的含量及释放量的方法大致可分两大类： 物理化学测定法和生物测定法 4 0 】。 电刺激 耐闰【s 秒) 图5 证明迷走神经释放乙酰胆碱的双蛙心实验 甲、乙分别为离体蛙心 走神经 4 3 1 物理化学测定法 气相色谱与火焰离子检测器联用法的选择性很高，甚至在室温都可完成 4 1 。 用g c f i d 检测叔胺类化合物含量来确定乙酰胆碱的含量 4 2 】，这种方法的检测限为 o 0 2n m o l 4 3 】。 山东大学硕士学位论文 气相色谱质谱联用法测定了老鼠的肝脏、心脏、肌肉、肾脏、血浆、血红细胞、 脑以及人血浆中乙酰胆碱的含量【4 4 4 6 】。采用毛细管色谱柱，检测乙酰胆碱和胆碱 的检测限为o 5p m o l m l 4 7 。气相色谱与其它仪器联用都存在如下缺点：样品处理 费时、灵敏度与特异性不够、设备昂贵等【4 8 】。 1 9 8 3 年p o r e r 等【4 9 】首先建立了高效液相一电化学检测器联用( h l p c - e d ) 的方法 检测乙酰胆碱，这种方法简单、稳定、具有足够高的灵敏度和特异性【5 0 】，它的灵 敏度达到2p m o l 4 9 。缺点是乙酰胆碱峰和胆碱峰有重叠现象，影响检测结果 4 0 】。 1 9 8 7 年d a m s m a 等 5 i i 把胆碱酯酶和胆碱氧化酶以共价键的形式绑定到柱后酶 固定反应器( i m e r ) 中，增加了灵敏度并减少了酶的用量 5 2 - 5 4 】，灵敏度达到l o f m o l 5 5 。采用柱前胆碱氧化酶固定反应器一色谱分离柱一柱后乙酰胆碱酯酶、胆 碱氧化酶固定反应器解决了胆碱峰太宽影响乙酰胆碱检测结果的问题 5 6 1 。1 9 9 7 年 段文贞等【5 7 】建立高效液相柱后衍生化电化学检测器( h p l c r e e c d ) 法，用普通 的十八烷基硅烷( o e t a d e c y l s i l y l ，o d s ) 柱代替昂贵的阳离子交换柱，用玻碳电极 代替铂电极，灵敏度达至l j p m o l 水平。 另外，b i o a n a l y t i c a ls y s t e m 公司( u s a ) 【5 8 】和e i c o m 公司( j a p a n ) 【5 9 隈供带有 微径分离柱和i m e r 的乙酰胆碱和胆碱的试剂盒。 微径高效液相色谱能提高检测生物样品中乙酰胆碱和胆碱的灵敏度1 6 0 1 ，检测 的线性范围为0 0 5 1 0p m o l 5 止，检测限达1 0n m o l l 5 9 ，6 1 ，6 2 。贾兴元等【6 3 】 用微柱高效液相色谱法测定大鼠脑微渗透析液中的乙酰胆碱和胆碱，检测限为5 n m o l l 。d o n g 等 6 4 1 建立了固定微径高效液相色谱酶固定反应器- 电化学检测器体 系。该体系能够防止样品中其他物质被氧化，保证只有一个样品峰。 1 9 8 1 年k h a n d e l w a 等 6 5 1 首先利用裂解色谱和化学电离质谱仪联用法( p y r o l y s i s g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ) 同时检测乙酰胆碱和胆碱。乙酰胆碱的检测 限为1 0 x1 0 。2m o l l 。t 9 9 1 年i k a r a s h 等1 6 6 利用熔合快原子轰击液相色谱和质谱仪联 用法( f r i tf a s ta t o mb o m b a r d m e n t ( f a b ) l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ) 检测了老鼠脑部的乙酰胆碱含量。1 9 9 3 年l s h i m a r u 等 6 7 3 用高效液相色谱和持续的快 原子轰击质谱仪联用法同时检测鼠脑部的乙酰胆碱和胆碱，检测限分别为2 p m o l 和5 p m o l 。2 0 0 2 年h o w s 等 6 8 1 用高效液相色谱和两级质谱仪串联联用法( h p l c m s m s ) 山东大学硕士学位论文 检测了脑渗透液中乙酰胆碱含量，乙酰胆碱在一分钟内裂解并被检测，检测限为l f m o l l 。2 0 0 5 年u u t e l a 6 9 1 等利用灵敏的液相色谱和带电喷雾离子源的质谱仪联用法 f l c e s i - m s m s ) 检测了大鼠、小鼠脑微渗透样品中乙酰胆碱和胆碱含量。检测胆碱 的线性范围为l 1 0 0 0 n m o l l ，检测乙酰胆碱的线性范围为3 3 0 0 0 n m o l l 。 1 9 8 0 年i s r a e l 等 7 0 】用化学发光的方法检测了连续刺激电鳗放电器官释放的乙酰 胆碱。乙酰胆碱被乙酰胆碱酯酶水解为胆碱，胆碱转变为甜菜碱和双氧水，双氧水 氧化鲁米诺发光。1 9 8 2 年i s r a e 等 7 1 1 y 用化学发光的方法检测了哺乳动物器官释放 乙酰胆碱。1 9 9 4 年t e m a u x 等【7 2 】用7 = 甲基氨基萘- l ，2 - 酰基肼( 7 一d m a n ) 代替鲁 米诺，化学发光强度增) 3 1 1 3 倍，检测限为6 5 0f m o l l 。 1 9 7 0 年o n e i l l 等 7 3 】用荧光法检测了生物样品的乙酰胆碱提取物。1 9 7 2 年 b r o w n i n g 等【7 4 】用荧光法同时检测乙酰胆碱和胆碱。1 9 8 2 年g o n c h a r o v a 等 7 5 1 用荧光 法检测了血液中乙酰胆碱的含量。1 9 8 8 年郑肖钊等【7 6 】按s p e e g ；3 1 f e l l m a n 的方法，对 树脂的吸附条件，荧光谱的稳定性方面做了改进，测量组织的乙酰胆碱的灵敏度达 o 5n m o l 。1 9 8 9 年m a c d o n a l d 等【7 7 】用荧光法分析乙酰胆碱，灵敏度达至1 p m o l l 级。 1 9 8 9 年r i c n y 等【7 8 】利用流动注射的方法检测了组织提取液中的乙酰胆碱。该方 法是将大量的胆碱转换过氧化氢，过氧化氢可以用荧光和化学发光的方法检测。化 学发光法检测的灵敏度为1 0p m o l ，荧光法检测的灵敏度为0 2p m o l 。2 0 0 3 年k i b a 等 【7 9 】利用流动注射法结合三亚乙基四胺化学发光传感器同时检测了老鼠脑组织匀浆 中乙酰胆碱和胆碱的含量。该方法检测胆碱的线性范围为1 1 0 0 0n m o l l ，检测乙 酰胆碱的线性范围为3 3 0 0 0n m o i l 。 4 3 2 生物测定法 1 9 6 5 年以前a c h 的测定主要用生物测定法。其原理是应用对a c h 敏感的组织， 如蛙腹直肌等，在低浓度a c h 作用下可发生收缩，而a c h 的浓度在一定范围内与 组织收缩的幅度呈正相关。故可根据肌肉收缩的幅值推算a c h 的浓度，其中包括水 蛭背肌法 8 0 】，蛙腹直肌法【8 l 】等。 生物测定法的主要缺点是灵敏度和特异性较差【8 2 】，如a c h 使不同标本产生的 反应可被有关的酯类所模拟：而且，每个标本需逐个进行测定，费时较长；此外， 山东大学硕士学位论文 实验易受生物材料本身的限制，有时实验结果不很稳定。因而，乙酰胆碱的生物测定 方法并没有随着近年来兴起的生物分析、单细胞分析而取得明显进展。 5 参考文献： 【l 】1d e m a n d o l x , d ，e ta 1 m u i t i c o l o u ra n a l y s i sa n dl o e a l i m a g ec o r r e l a t i o ni nc o n f o c a lm i c r o s c o p y 【j 1 m i c r o s ，1 9 9 7 ，1 8 5 ：2 1 - 3 6 【2 】j u s k a l t i s ，1 l ，w i l s o n , t ，n e i l ，m a ，k o z u b e k , m e f f i c i e n tr e a l - t i m ec o n f o c a lm i c r o s c o p yw i t h w h i t el i g h ts o u r c e si j l n a t u r e ，1 9 9 6 ，3 8 3 ( 6 6 0 3 ) ：8 0 4 - 8 0 6 【3 jk i n g ，r g ，d e l a n e y , e m c o n f o c a lm i c r o s c o p yi np h a r m a c o l o g i c a lr e s e a r c h ( j 1 t r e n d s p h a r m a c 0 0 1 s e i ，1 9 9 4 ，1 5 ( 8 ) ：2 7 5 - 2 7 9 【4 1 4s h o t t o n , d ，w h i t e ，n c o n f o c a ls c a n n i n gm i c r o s c o p y ：t h r e e - d i m e n s i o n a lb i o l o g i c a li m a g i n gi j l t r e n d si nb i o c h e m i c a ls c i ，1 9 8 9 ，1 4 ：4 3 5 - 4 3 9 【5 】m a t s u m o t ob m e t h o d si n c e l lb i o l o g y , v 0 1 3 8 ，c e l lb i o l o g i c a la p p l i c a t i o n so fc o o n f o c a l m i c r o s c o p y 【m 1 n e wy o r k ：a c a d e m i cp r e s s ，1 9 9 3 ，1 3 5 - 2 3 6 【6 】f i n e ，a ，a m o s , w b ，d r u b i n , k m ，m c n a u g h t o n , p 丸c o n f o c a lm i c r o s c o p y ：a p p l i c a t i o n si n n e u r o b i o l o g y 哪t r e n d si nn e u r o s c i ，1 9 8 8 ，1 1 ( 8 ) ：3 4 6 - 3 5 1 7 】7w h i t e ，j g ，c ta 1 c o n f o c a lm i c r o s c o p yc o m e so f a g el j i n a t u r e ，1 9 8 7 ，2 8 ：1 8 3 - 1 8 4 【8 】g a i d a r o v , 1 ，s a n t i r d ，e ，w a r r e n , & ，a ，k e e n , j ，h ，s p a t i a lc o n t r o lo fc o a t e d - p i td y n a m i c si n l i v i n gc e l l sl j l n a t u r ec e l l b i o l o g y , 1 9 9 9 ，1 ：l 一8 【9 】j a m o r a , c ，d a m a n u j ，r ，k o c i e n i e w s k i , p ，f u c h s ，e ，l i n k sb e t w e e ns i g n a lt r a n s d u c t i o n , t r a n s c r i p t i o na n da d h e s i o ni ne p i t h e l i a lb u dd e v e l o p m e n tl j l n a t u r e ，2 0 0 3 ，4 2 2 ：3 1 7 - 3 2 6 【1 0 s t e y e r , j ，a ，a l m e r s ，w ，t r a c k i n gs i n g l es e c r e t o r yg r a n u l e s i nl i v ec h r o m a f f i nb y e v a n e s c e n t - f i e l df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yl j l b i o p h y s i c a lj o u r n a l ，1 9 9 9 ，7 6 ：2 2 6 2 - 2 2 7 1 f li 】l a k a d a m y a l i , m ，r u s t , m ，j ，b a b c o c k , h ，只，z b u a n g , x ，w i ，v i s u a l i z i n gi n f e c t i o no f i n d i v i d u a l i n f i u e n z av i r u s e si j l p r o c n a t l a c a d sc i ，2 0 0 3 ，1 0 0 ：9 2 8 0 9 2 8 5 【1 2 】k u e s ，t ，p e t e r , r ，k u b i t s c h e c k , u ，v i s u a l i z a t i o na n d t r a c k i n g o fs i n g l ep r o t e i n m o l e c u l e s i n t h e c e l ln u c l e u sl j i j b i o p h y s ，2 0 0 1 ，8 0 ：2 9 5 4 - 2 9 6 7 【1 3 】k i n g , r g ，d e l a n e y ，p m c o n f o c a lm i c r o s c o p yi np h a r m a c o l o g i c a lr e s e a r c hl j l t r e n d s p h a r m a c 0 1 s c i ，1 9 9 4 ，1 5 ( 8 ) ：2 7 5 2 7 9 【1 4 s h o r t e nd ，w h i t en c o n f o c a ls c a n n i n gm i c r o s c o p y ：t h r e e - d i m e n s i o n a lb i o l o g i c a li m a g i n gl j i t r e n d sb i o c h e m s c i ，1 9 8 9 ，1 4 ( 1 1 ) ：4 3 5 0 3 9 f 1 5 】i a t s u m o t o , b ，m e t h o d si n c e l lb i o l o g y , v 0 1 3 8 ，c e l lb i o l o g i c a la p p l i c a t i o n so fc o n f o c a l m i c r o s c o p yi