（微生物学专业论文）菊粉内切酶基因克隆、表达及菊寡糖中试设计.pdf

摘要 菊粉是一种天然果聚糖，菊粉内切酶能够水解菊粉生成低聚果糖。低聚果糖是一种功能性食 品添加剂，其保健作用体现在能够降低血糖水平，促进人体和动物肠道的微生态平衡和提高免疫 力等等。利用微生物菊粉内切酶可以一步法水解菊粉获得高达8 0 的低聚果糖，但是只有少数微 生物产菊粉内切酶，并且产酶量极低，从而造成分离纯化困难，制约低聚果糖工业的发展。本研 究的主要目的就是构建菊粉内切酶的工程酵母来高效表达菊粉内切酶，为解决目前低聚果糖生产 中的问题提供有效的解决途径。 本研究以黑曲霉9 8 9 1 的基因组d n a 为模板进行p c r 扩增获得了编码菊粉内切酶的基因， 并将它克隆进表达载体p p i c 9 ，经过酶切、p c r 和测序验证后，将重组表达载体p p i c 9 e n d o i n u 经船i 酶切线性化后电转化到鼢 缸p 口s f 0 廊g s l l 5 中。重组子通过营养缺陷型培养基进行筛选。 重组菊粉内切酶在p f c 缸p f o mg s l l 5 中实现了表达并在7 l 发酵罐中对其进行了优化表达研 究，蛋白分泌量达2 1 5 咖l o 表达产物的s d s p a g e 分析表明，蛋白质分子量大小约为5 9 k d 。 菊粉内切酶的活性测定结果为1 5 0 1 u 1 1 1 l ( 以蔗糖为底物) 和2 9 1 u ，i l l l ( 以菊粉为底物) ，同原始 供体菌株相比，分别高1 0 5 倍和2 7 3 倍，通过酶学特性研究显示该酶反应最适n h 为5 6 ，最适温 度是5 5 。同时还对菊粉内切酶的高级结构进行了模拟，得到了该蛋白的高级结构的初步信息。 根据s d s - p a g e 电泳和酶的功能性分析，证明目的蛋白己在a c 触l 肿5 r d 胁中成功实现表达。且 重组转化子一捌c 缸p 口咖m g s l l 5 9 8 9 l ( 1 1 2 7 ) 遗传稳定性良好。同时完成了中试生产线建设设计 方案，包括菊粉内切酶水解生产菊粉寡糖的工艺设计；设备选型：低聚果糖工艺生产设备平面布 置初步方案等酶法生产菊粉寡糖的生化工程的下游工作。 关键词； 菊粉内切酶，黑曲霉，巴斯德毕赤酵母，菊粉寡糖，中试工艺设计 a b s t r a c t i n u l i i sak i n do fn a c u r a l i m c t o s ep o l y m e r ，e n d o i n u l i n a s ec 柚c a t a l y s e 也eh y d l y s i s0 fi n u l i ni n t o o l j g o - f n c t o s e ，w h i c hi sr e g a r d e da s ah n do ff l l n c o n a lf o o di n g r e d i e n t i tp h y sa np f e l t yi r p o r t a n t r o l e i nh e a l t h ya s p e c l ，s u c ha si t sa b i l i t yl od e c r e a s eb l o o ds u g a rl e v e l ，t oi r l l p r o v et h eb 丑1 a n c eo f m i c f o - e c o l o g yo fi nh u m a 锄da n 主m a ld i g e s t i o t r a c la dt oi i l c r e a s et l l e 蛔m u n i t yt od i s e a s ea n ds o0 n i tc a i lb eo b t a i n e d 砒y i e l dj e v e lo f8 0 o l i g o - l n l c t o s ei no n es t 印b yu 蝴j z 吨i n j c r o b i e s ，e n d o 劬l j a s e 0 1 1 l yf e wm j c r o o 曙a n i s mp r o d u c ee n d o i n u l i i l a s e ，h o w e v 盯“e x i s t ss o m ep r o b l 哪s ，t h a ii s ，l o w e r q u a n l i l yo fo l 谵。抽c t o s ea n dd i f i c u h yo f b e 啦i s 0 1 a f c da n dp u 商e d ，t os u mu p ，i su r g e tt os o l v e t h e s ep 加b l e m st ob e n e f “t h ei 丑d u s 晡a 1p d u c t 1 奄eo b j e no ft l l 。p r e n ts t u d yi st 0o o n s t n l c t h e r e c o m b j n a n ty e tf o rt h eh i g b k v e le 】c p r e s s i o n0 f 虹蛇e n d o 加u u n a s e ，i no f d e rt op r o v i d c 卸甜i c i e n t w a y t 0s o l v et h ep r o b l e m sj nm e p r o d u c eo f0 j i g o - 劬c t o s e i nt h i sp a p e r ，t h eg e e n c o d i n ge n d o 虹姒组a s ei sa i i l p l i f i e db yp c rw i 血m et e m p l a t eo fg e n o i i l i c d n ao f 爿胖曙拙s 拉啦r9 8 9 1a n dt h e ni ti sc l o n e di n t oe x p t e 酷i o nv e c t o rp p i c 9 a n e rv e 面e db y r e s t r i c t i o ，p c ra n ds e q u c n c j i l g ，t l i ev e c i o rp p i c 9 _ e n d o i n l la f t e rb e i n g 妇c a f i z c d 州t h 助f i s t r 柚s f o 珊e d 砸om ee u k a r y 0 沁h o s t ( ”私ta 曲妇p 口哟ms t r a i l lg s l l 5 ) w i c he l e d f o l l i cp u l s e t h e r e c o i n _ b i d a n t y e a s t o b l a i t b r o u g hc u l t u r i go n u 仃i t i o nd e f i c i e n tm e d i u m t h er e c o m b i n a n t e n d o i n u l i n 酗ew a sh i 曲1 ye x p 阳s s e da i l dt h e0 p t i i l l i z a t i o no ft h ee 印r e s s i o i na71 i e ro ff e 衄e n t o rh a s b e e ni n v e s 虹g a t e d d u r j n gf e n n e n t a t i o n ，t h ec o n c e n t m t i o no fp r o t e i ns e c r e i e di s2 1 5m 咖ls d s p a g e a n a l y s i ss u g g c s t e dt h a c l h es i z eo fp r o t e j ni sa b o u t5 9 d t h ea c l i v i t yo fc d o i n n u n a s ei s1 5 0 1u 脚 w 汕s u c r o s ea ss u b s t r a t ea n d2 9 1u i n lw i l hi 1 1 u na s 鲫b s 仃a l e ，1 0 5a 们2 7 3f o l d sh i g h e ri h a t h a t 如m t h eo r 蟾i a is t r a j i ir e s p e c 石v e l ya dt l l r o u g l lt h er e a r c h0 fp r o p e r 【i e s0 fe z y n l ea c 虹v n y ，i ts h o 、张i b a i t h eo p i i m a lc o d d i t i o n f o re n 纠m e 佗a c t i o na r e p h 5 6a n d5 5 a t t l l es a m e t i m e ，t h ea d v a n c e ds u c t l l r e o fe n d o i n u l i n a s ei sp r e d j c t e dw j t hs o f t w a r e a c c o r d i gi ol h e r e s u l io fs d s p a g e 柚di h ec n z y m e f u n c i i o a la s s a y ，l h el a l g e tp r o t e i ni se x p r e s s e ds u c c e s s f u u yi nt l l er 西如p 口哟m a d d i t i o n a y ，t h e y e a s ti r a s f 0 衄a n t - 国肭缸p 口5 幻mg s l l 5 ，9 8 9 1 ( 1 1 2 7 ) s h o w c dt h e q u i i eg o o dg e i l e t i cs t a b i l i t y i n a d d i t i o n ，t l l ed e s i g np r o j e c io fm i d d l ee x p e r i m e n t a t i o np r o d u c tl i n ew a sa c c o m p l i s h e d ，t h a ti st h e d a 、n s t r e a m 、v o r ko ft b 。p r o d u c l i o no fi 1 1 u l i i l o l i 9 0 - f n i c t o s eh y d r 0 i y z e db ye n d o i n u l i n a s e ，w h i c h i n c j u d e dt 1 1 a tt h e e c h n k a ld e s i g no ft h ep r o d u c t 妣o f 舢l i no l i g 。如c t o s e h y d r 。l y z e db y e n d o i n u l i n a s e ；s e l e c t i n gm em o d e lo fe q u i p m e n ta n di n s t a u a 虹o n s ；也ep l a n ed e s i g no fw o f k s h 叩a n dt 1 1 e p n o ts t u d yo fc o n s t m c t i n gt h em i d d l ee x p e r i l e n 蛆t i o nw o f k s h 。p k e yw o r d s ：e n d o i n u l j n a s e ，a 甲e 僵i ，船n 喀p r ，只c 矗扭p 目5 f d r 扛，i n u l i o l i g o s a c h a r i d e s ，t 1 1 ed e s i g no f i n 把m l e d i a c ep i i o t i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 时间：翔o f 年6 月7 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权傈留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫摇等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名 导师签名 时间：函0 6 年6 月 r 日 ， 多月多 日 ：詈銮兰竺兰譬墨圭茎釜鎏兰 兰：耋2：! il 第一部分引言 菊粉内切酶( 曲d o i u l i a s e ，e c 3 21 7 ) 可以水解菊粉生成低聚果糖( 如c i o - o l 远o s a c c h 撕d e s 缩写f 0 s ) ，利用微生物菊粉内切酶一步法水解菊粉可以获得高纯度的低聚果糖。低聚果糖除了 有糖醇的功能外，其还具有增殖双歧杆萄、调节肠道功能，抑制内毒素、保护肝脏，调节脂肪代 谢不引起血糖波动，提高免疫力、抗肿瘤等功能目前已被国际公认为具有保健功能的甜昧剂。 1 菊粉化学 1 1 菊粉的分布 果聚糖( f n l c t 蛐s ) 是一类由果糖苷和果糖连接组成的长链碳水化合物，其分子结构和分子量 各不相同，广泛分布的在单子叶、取子叶和绿色藻类中有三种不同形式( p o 血，1 9 9 0 ；w a t e r h o 惦e a n dc l l a i 神t i o n 。1 9 9 3 ) ，它们分别为：菊粉( i n u l i n ) 、左旋果聚糖( 1 e v a n ) 和革兰明糖( g r a l i 丑) 。 其中菊粉是由呋哺果糖以b 2 。1 一d 糖苷键连接形成，左旋果聚糖以b - 2 ，6 键连接为主，而革兰明 糖则是b ( 2 ，1 ) 和b ( 2 ，6 ) 建两种连接方式都有。菊粉又称菊耱，它是一类天然果聚糖1 8 0 4 年德国 科学家r o s e 首次从旋复花属( 且h 缸) 土木香( 知“肠愚出n 血删) 根茎中提取得到一种果聚糖，1 8 1 8 年1 k m s o n 将其命名为菊粉。菊粉在自然界中的分布十分广泛，其主要来源是植物。在取子叶植 物中的菊科、龙胆科、橘梗科等科和单子叶植物的百合科、禾本科中的很多植物都音有菊粉( 见 表1 1 ) 。 表卜1 主要舍菊粉的植物强其菊粉岔量 表1 - 1 主要含菊粉的植物及其菊粉含量 t a b l e l - l m 埘n p h t s n t 酊i 明娃n 椰l h 出m c 施 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分引言 某些真菌和细菌中也含有菊粉，例如在假单胞菌类( a p “加n d c e ) 、肠细菌类 ( 砌把，曲口c 圯r i 口c p ) 、链状球菌类( r r 单f o c d c 口p ) 、放线菌类( 爿c 砌。7 c p 姗) 、芽孢杆菌类 ( 肋c f 池c e ) 和乳酸杆菌类( 己口c t d 6 口c f 砌s ，“地“) 等中就发现有菊粉的存在。 1 2 菊粉的结构特征 菊粉是由呋喃果糖以b 2 ，1 d 糖苷键连接形成的多聚果糖，其还原性末端连接一个葡萄糖残 基( b a c o na n de d e l i i l a n ，1 9 5 1 ) ，为线性直链结构。其聚合度及平均分子量大小写不同的植物来 源、收获季节、气候、土壤以及生产加工过程有关。标准菊粉的聚合度为2 6 0 ，其平均聚合度 为1 0 1 2 ，长链菊粉的平均聚合度为2 5 。菊粉分子式可以用g f n 表示，其中g 为菊粉还原性末 端连接的一个葡萄糖分子，f 代表果糖分子，n 则代表果糖单位数。 在加世纪6 0 年代，人们开始了对菊粉物理化学结构的研究，p h e i p s 在1 9 6 5 年提出菊粉分 子物理化学结构为1 2 n m 0 3 5 i n 0 3 m ；1 9 7 7 年m i d d i e t 认为菊粉分子的最佳结构为 1 n m x o 9 m o 5 n m 。1 9 8 0 年m a r c h e 1 t 等通过x 射线和电子衍射证明菊粉结晶为b 2 。1 d 呋喃 果糖，有5 个折叠螺旋环，每两个螺旋环相隔0 2 1 6 i l i n ，其中4 个折叠螺旋环为右手螺旋，剩余 的一个折叠螺旋环为左手螺旋。e i g e r 等在1 9 8 8 年利用小角度激光扫描并结合排阻色谱和动态 光束扫描等技术研究发现菊糖晶体为杆状体，最小结构单元为5 9 棚1 6 n m ( 长平均直径) ；同 年f r e n c h 通过计算机n h m a p 程序模拟了菊糖b d 呋喃果糖线状结构，认为菊糖分子结构理论 上为右手螺旋结构，但多数研究者认为实际存在形式可以是左手螺旋也可以是右手螺旋。1 9 9 6 年a n d r e 等通过o 0 2 菊糖溶液和乙醇按1 ：4 比例在5 5 制备单晶体，然后借助透射电子显微镜 和3 d 电子衍射证明：在室温下菊糖晶体呈半水合状态，空间构造为正菱形结构，并结合6 个水 分子，其单元参数分别为a - 1 6 7 0 n m ，b - o 9 6 5 m ，c = ( c h a i l la r x i s ) = 1 4 4 0 n m ；并认为菊耱链为6 折叠螺旋环而不是在1 9 8 0 年m a r c h e s s a u n 等人报道的5 折叠螺旋环结构；其由2 个反向平行的6 折叠螺旋环围绕晶体单元的2 个折叠螺旋轴组成，结构特征为扣6 6 0 ，甲= 1 5 4 0 ，m = 一8 2 0 ，电子衍 射数据表明菊粉最佳的分子模型为r = 2 2 7 和r ”= 2 2 3 ( r 为晶体残余因子) ，而菊粉分子在水 合状态下，a 一1 6 7 i l l i l ，b = o ，9 8 0 n m ，c = 1 4 7 0 n n l ，r = 1 8 1 ，”= 1 6 5 ，并且结合的水分子数为1 2 个。 1 3 菊粉的物化性质 1 3 1 菊粉的水溶性 菊粉易溶于热水微溶于冷水，其溶解度随温度升高而增加。在1 0 时其溶解度为6 ，加 热可以促进菊粉溶解，在8 0 时可以完全溶解。菊粉有a ，b 和y 三种形式，它们的水溶性差异 是由分子内和分子问氢键引起的，譬如t 菊粉溶解度低和其含有较多分子内氢键有关( b o b r o v i l 【 l d g r e k i l o v a m g r o u s h e i s k y r l e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。另外，菊粉溶于水时，可以使水的冰点下降、沸 点升高。 1 3 2 菊粉的粘度 菊粉溶液粘度会随其浓度增加而增大，随着温度的升高而降低。菊粉分子相互交联成网状结 构，当菊粉溶液浓度达到加一3 0 时，经过高剪切作用或加热一冷却过程，菊粉逐渐形成微粒凝 2 土兽查些篮盥圭鲨鎏。 一。一一一。一： 2 兰盐：，二量 2 2 菊粉内切酶酶学性质 2 2 1 生化特性 来源于p 钿埘f f f m 印1 n 8 8 ( n a k a m u r a t e ta 1 ，1 9 9 7 ) 的菊粉内切酶，其只作用于菊粉而不 作用于蔗糖和棉子糖；纯化酶k m 值为o 2 衄o l l ，到s 值无穷大 酶蛋白分子量为6 8 l a ，其最 适酶反应温度为5 0 ，最适p h 为5 2 。来源于f 锄缸埘“mp h 啊“r d 秽n m l 的菊粉内切酶分子量为 6 4 k d a ，d i 值为3 6 ，粗酶i s 值为5 0 。纯化酶鹏值高达4 1 4 0 ；其水解菊粉的特点是随着d p 降 低，k m 增大，v m a x 下降：最适反应p h 为5 o ，并且在p h 4 0 1 0 0 的范围内相当稳定，在5 5 以下稳定性很好，高于5 5 稳定性很差。 4 印e 僵强m s 疗删“脚( e t l a l i b im a n db a r a t djc ，1 9 9 0 ) 来源的菊粉内切酶的分子量为4 7 2 k d a ， k m 值为l m m o l l ，不水解蔗糖。4 印p 喇砌5 确p ( n a k a m u r at e ta 1 ，1 9 7 8 ) 纯化菊粉内切酶分 子量为5 4 k d a ，只水解菊粉，对蔗糖无作用，最适温度为4 5 ，5 0 以上酶开始失活，8 0 时完 全失话，最适d h 值为5 3 。 来源于4 r 咖曲口c 把r 踮( h i d a k ah e la l ，1 9 8 7 ) 的菊粉内切酶其粗酶液经硫酸铵沉淀和 d e a e c e l l u l o s e 柱显示两个峰，其中一个峰用0 3 5 m o mn a a 洗脱，水解菊粉为低聚果糖和果糖， 另个峰用0 2 r n o l ln a c l 洗脱水解菊粉只产低聚果糖，k m 值为1 7 l n l 0 1 l 。酶反应最适p h 值 为7 5 ，最适温度为5 0 ；在p h 5 0 1 0 5 范围内或3 0 4 0 的温度范围内该酶较稳定，最大酶活 可达8 0 以上。 2 2 2 金属离子和其它化合物对酶活性的影响 裹1 - 3 金属离子和其它化台物对酶活性的影响 t a b l c 】- 3n ei n n u e n c eo f 皿c l a l i o na n do t h e f m p o u n d0 e 聊m ea c 廿v i y 2 3 菊粉内切酶的基因克隆 2 3 1 菊粉内切酶的序列特征 菊粉内切酶通常具有5 个保守序列，它们分别是：一w n 呕p h g 一，一y h m f y o 一，一 w g h m t s 一，一r d p y l 一，一w e m p 一。青霉菊粉内切酶有两种类型，其中一种类型是来源于 a n 把沁“，l 印1 n 一8 8 的菊粉内切酶，其n 端序列为一d d t p a f c p a e n x o 忸p n g u o s t x h 一，另一种类型是来源于n h f c 册n mp “憎“r 口g e h 的菊粉内切酶，它的n 端序列为一 d d y r p 矾f c p a 王烈w m n e p n gu k i d s t w h 一在上述两个来源于青霉的菊粉内切酶n 端序列 4 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分引言 中，都存在b 呋喃果糖苷酶家族的特征结构域一蛐幔p n g 一，g l u - 4 3 和g l u 2 3 3 是酶活性中心功 能基团。爿印p 憎f 珈5 厨“( e t t a l i b i m d b a m t t ij c ，1 9 9 0 ) 的菊粉内切酶的酶活性中心有h 基团。爿r 晰坩妇c 埘印内切菊粉酶n 端序列为一a d p 且l 1 y d o p n g s l l v u ) e v g r s n f t v - ， 和其它微生物菊粉内切酶的n 端序列相比没有序列相似性。 2 3 2 菊粉内切酶的基因结构 n n 止f 胁mp “印“，昭蹦m l 菊粉内切酶基因讥h 4o r f 长1 5 4 8 b p ，编码5 1 5 a a ，1 2 5 a a 为信 号肽，g + c n l o l 为4 7 8 ( o d o 盯ase ta 1 ，1 9 8 8 ) 。爿砌r 曲口c 舯辨s 3 7 菊粉内切酶基因o r f 长 2 4 3 9 b p ，1 - 5 3 a a 为信号肽，成熟酶蛋臼7 5 吼a ，比其它微生物来源的菊粉酶多1 3 5 2 9 a ( m k y e la 1 ，1 9 9 6 ) 。黑曲霉内切菊粉酶有两种基因加“4 和拥妇，0 r f 长度均为1 5 4 8 b p ，编码5 1 6 从， 1 2 3 a a 为信号肽，不含内含子，二者间有8 个a a 不同，二者g + c m 0 1 分别为5 4 和5 4 3 。 无花果曲霉菊粉内切酶基因如h 2o r f 长1 5 5 l b d ，编码4 9 2 a a ，1 之2 a a 为信号肽与n h 耙f 陇m m p “啊w e n 内切酶之间序列同源性高达7 3 3 。 2 4 菊粉内切酶的基因表达 凸e “咖m 口s 印内切菊粉酶基因加以在e c d 矗中得到表达，水解菊粉形成低聚糖产量达7 8 ， 但是胞内表达的原核表达系统普遍存在着分离纯化困难( d o n 窖h y u n 硒me ta 1 ，1 9 9 7 ) 。o h i a 等 ( 1 9 9 8 ) 将黑曲霉菊粉内切酶基因加“和加妇，以e c 口“为宿主菌、构造表达载体p n i c l 和p n i g l 所作的表达初步研究表明，痂d 酶蛋白表达量很低，几乎检测不到。m 等( 1 9 9 9 ) 将爿加h 内切菊粉酶基因加“2 转入血c c 口，啪y c 船c 讹协缸e 达得到c 删扫缸e y s h 2 6 4 2 c ( p r 4 u 2 ) 基因 工程菌，只产内切酶，不产外切酶，但表达水平很低。 3 菊粉内切酶的应用 3 1 低聚果糖的功能 菊粉内切酶可以水解菊粉生成低聚果糖，它可以作为功能性食品和饲料添加剂。它是理想的 蔗糖替代品，除了有糖醇的功能外，其还具有以下几个方面的功能。 3 1 1 增殖双歧杆菌、调节肠道功能 g i b s o n 等测定了双歧杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌和大肠杆菌的特定生长速率，他们发现即 使在纯培养条件下，低聚果糖也比葡萄糖更能促进双歧杆菌的增殖。低聚果糖对双歧杆菌具有增 殖作用( g i b s o n g r ，b e a r e r ，w a n g x ，e ta 1 ，1 9 9 5 ) 的机理是低聚果糖优先被双歧杆菌利用，产 生醋酸盐和乳酸盐，降低了肠道内的p h 值，从而抑制了有害菌如沙门氏菌、李斯特菌、金黄色 葡萄球菌、大肠菌群等的生长。通过促进乳酸菌的生长来维持人体和动物体肠道的微生态平衡， 调节肠道功能，预防结肠癌。低聚果糖在肠道内可以自身发酵成丁酸盐能刺激结肠黏膜细胞的生 长，提高肠黏膜的吸收能力( s c h e p p a c h w ，1 9 9 4 ) ， 3 1 _ 2 调节脂肪代谢 低聚果糖在肠道内可以自身发酵成短链脂肪酸( 醋酸盐和丙酸盐) ，抑制胆固醇的合成，还 可降低热量及血液中胆固醇和甘油三酯的含量( b o t h a mrl ，r y d e np ，r o b e r c s o nj a ，e ta 1 ，1 9 9 8 ) ， s 中国农业科学院硬士学位论文第二部分菊粉内切酶的基因克隆及其在p f c h 缸p 口s 幻西中的表达 2 方法 2 ，1 菊粉内切酶基因的克隆 2 1 1 黑曲霉菌株卸孵i h wn 培p r9 8 9 1 ( c g m c c 眇虬) 基因组d n a 的提取 ( 1 ) 将土豆斜面保存的黑曲霉菌株爿印e ，f 船柚渺9 8 9 1 划线接种在土豆斜面培养上进行活化， 3 0 ，培养4 8 h ； ( 2 ) 挑取成熟斜面孢子一环接种到装有5 0 m lc z 叩e k s 液体培养基的2 5 0 i n l 三角瓶中3 0 ， 2 0 0 r n d n ，培养6 0 h ； ( 3 ) 过滤收集菌丝，将过滤收集的菌丝放入无水乙醇清洗过的研钵中，加入液氮速冻菌丝并研磨 成粉末状； ( 4 ) 称取5 0 m g 冻干菌丝 将其悬浮于5 0 q “1 浸提缓冲液( o 5 s d s ，2 0 0 n o i ，i 皿i s ，2 5 m m o l ，l e d r a ，2 5 0 m m o l 几n a c lp h 8 5 ) 中，再加入3 5 叽l t r i s 饱和酚和1 5 q “1 氯仿，1 3 0 0 0 印m ，4 ， 离心l h ； ( 5 ) 离心后，吸取上清加入却lr n a s e ，3 7 处理5 1 0 m i n ； ( 6 ) 加入等体积酚；酚：氯仿：氯仿：异戊醇分别抽提； ( 7 ) 离心后吸取水相加入0 5 4 倍体积的异丙醇沉淀，沉淀用7 0 乙醇洗后真空干燥，溶于5 叫 无菌水中备用。 2 1 _ 2 设计引物钓取菊粉内切酶基因 参考g e n b a n k 中黑曲霉来源的菊粉内切酶基因的部分基因序列设计引物，引物合成工作由上 海基康生物技术有限公司完成。 合成引物如下( 其中划线处为髓d r i 酶切位点) ： p l ：5 a c a a r r 立& 羔a t g c a a r c l a a l b a 兀：a c c c 玎b 3 p 2 ；5 一a c a 戌丌璺邕野匹了- i ：l t c a c c g t c a 衄r ( c c c 兀j g 一3 2 1 3p c r 扩增目的基因 2 1 3 1p c r 扩增目的基因片段 以提取的黑曲霉菌株a 妒p 喇池j 呱 p r9 8 9 1 的基因组d n a 为模板，在o 5 r n l 的p c r 小管中 加入以下成分，同时设置空白对照。p c r 扩增反应体系如下： 模板1 “l 1 0 p c rb u 矗e r 5 “l d 1 1 p sk l 上游引物p 1 ( 2 0 p m 0 1 几)2 5 m 下游引物p 2 ( 2 0 口m o 扎)2 5 “l p f u 聚合酶( 2 u m l )1 “l 烈毯；q3 丝! 总反应体积5 肌1 p c r 反应条件：9 4 5 m i n ；9 4 1 m i n ，5 5 1 m i n ，7 2 l 。5 r n i n ，3 0 个循环；7 2 延伸1 0 商n 。 1 0 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。 x 基( 周祥山等，2 0 0 3 ) ，如葡萄糖和甘油中，包含乙醇氧化酶的过氧化物酶体迅速降解，酶活受 到掷制。 4 2 毕赤酵母表达系统的优点 4 2 1 高稳定性 载体线性化以后形成游离的5 h 0 艘末端和3 “d 搬末端，两末端与酵母染色体的同源区域 发生双交换，取代宿主染色体中的爿d 职编码区( r o m a n o s 鲋以，1 9 9 2 ；z a m o s t ，2 0 0 1 ) ，这种通过双 交换的方式使线性化表达载体整合到酵母基因组染色体上的重组酵母菌株十分稳定，在大规模发 酵培养时也不致表达框架的丢失。 4 2 2 高分泌性 利用酿酒酵母的a 因子分泌信号可以使a 因子信号肽引导下将外源蛋白分泌到培养基中 ( c f e g gjm ，1 9 9 3 ) ，这样，不仅避免了产物被细胞内蛋白酶降解和因产物在细胞内堆积所造成的 毒性作用而影响细胞代谢，而且大大简化了产物的分离纯化过程，为工业化大规模生产提供了便 利条件。 4 2 3 高表达性 由于表达载体利用的乙醇氧化酶基因启动子为强启动予，从而实现高效表达。从毕赤酵母表 达异源蛋白的资料中可以看出，毕赤酵母表达系统表达的外源蛋白产量很高，比其他表达系统高 1 0 倍甚至1 0 0 倍。 另外，毕赤酵母易培养，繁殖快，便于基因操作：由于微体的存在，可咀使外源基因表达的 蛋白免受蛋白酶的降解而且不对细胞产生毒害：具有真核生物的蛋白质翻译后的加工功能，能够 对外源蛋白质的正确折叠和糖基化( c r e 鹊j m ，1 9 9 3 ) ，有助于保持蛋白质的天然功能并且不产生 新的抗原性。 5 问题的提出与解决方案 5 1 问题的提出 低聚果糖是动物和人体内微生态平衡的有效调节物质，并且己广泛证实低聚果糖对人体和动 物体生长发育具有一系列积极作用。现在国内外生产的低聚果糖的工艺中存在两大弊端，其大大 妨碍了低聚果糖的发展应用：一是产物纯度低，以蔗糖为原料依靠果糖基转移酶生产低聚果糖， 产物中蔗糖、葡萄糖和寡糖均有相当比例，寡糖至多为5 5 ( y 曲j we ta 1 ，1 9 9 0 ；1 9 9 2 ) ，虽然通过 离子交换分离可以提高纯度，由于产物寡糖的单糖单位数量并不一致 果寡糖分离效果差，成本 十分高：二是蔗糖水解形成的副产物葡萄糖对果糖基转移酶活性有明显抑制作用，至今没有降低 果糖基转移酶反应体系中葡萄糖含量的有效办法( y u nj we ta 1 ，1 9 9 3 ) ，绝大多数商品的低聚果糖 含有大量蔗糖和葡萄糖，是一种含多种糖的混合物，产品中低聚果糖纯度低，最高含量5 5 6 0 。 在反应体系中加入葡萄糖异构酶或葡萄耱氧化酶以降低葡萄糖含量，可提高低聚果糖产量，但葡 萄搪异构酶主要动力学参数容易发生变化难以把握以致不能稳定地降低体系中葡萄糖含量，此 外，其他方法如利用离子交换柱进行色谱分离以提高纯度的尝试主要由于过高的成本限制而在生 1 0 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分引言 产上均难以奏效。因此，研究如何低成本生产高纯度果寡糖的新途径对于真正推动低聚果糖的广 泛使用很有必要。 5 2 本研究拟解决问题的方案与相关研究内容 5 2 ，1 本研究拟解决问题的方案 出于生产高纯度低聚果糖的考虑，人们另辟途径，以富含多聚果糖的植物材料为原料、利用 微生物产多聚果糖降解酶一菊粉内切酶一步水解菊粉生产低聚果糖。该途径由于原料低廉、发酵 酶解一步完成、产品获得率高。并且与由蔗糖经果糖基转移酶作用转移的合成工艺生产低聚果糖 的方法更具优势，主要表现在纯度高( 产物中低聚果糖含量 8 0 ) 、原料廉价和所需酶量更少。 本研究拟从筛选高产菊粉内切酶供体菌株开始，继而进行基因克隆、构建重组菊粉内切酶工程酵 母、高密度发酵优化表达，最终获得高表达量的菊粉内切酶，从而解决一步酶法生产低聚果糖的 关键技术难题。同时为该新兴寡糖生产车间初步设计做了前期研究，旨在推进其产业化。 5 2 2 研究内容与技术路线 研究内容包括以下方面：产酶微生物天然菌株筛选、目的基因克隆、鞠建重组表达载体、构 建重组酵母、重组酵母筛选与验证、重组酵母表达优化及其重组酶酶学研究，和中试设计等。 技术路线如下所示： 高产菊粉内切酶供体菌株的筛选 0 设计引物钓取目标基因 l 通过酶切、连接构建重组表达载体 l 电转化受体菌a 曲缸p 蛔廊g s l l 5 阳性重组子筛选 优化表达因素 产酶发酵小试( 实验室规模) l 重组菊粉内切酶 l 表达产物鉴定 l 厂丁 酶学性质研究l酶解产物分析 中试设计 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分引言 6 本研究的目的和意义 目前，工业化生产低聚果糖的方法有两种。一种是由蔗糖经d 果糖基转移酶( d f m c t o s v l t r a 疵r e ，e c 2 4 1 9 ) 合成低聚果糖；另一种就是利用内切菊粉酶部分水解菊糖而得。 前法反应进行不彻底，产物中含有大量的葡萄糖和果糖，低聚果糖含量：s 5 6 0 ，且工艺复杂， 生产成本高。后法工艺简单，低聚果糖含量高达8 0 以上。我国现阶段只有少数几家公司用蔗糖 生产低聚果糖，其产量不能满足需要，且价格较高。日本、欧洲和美国近二十年来在微生物菊粉 酶研究方面积累了丰富的资料，但专门针对菊粉内切酶的研究则开始于1 9 9 4 年。随着对菊粉、 低聚果糖结构、功能和性质研究的深入，菊粉产品已成为开发新型食品和饲料添加剂的重要产品， 本研究进行的菊粉内切酶基因工程菌的构建准备为制各菊粉内切酶酶法生产低聚果糖工艺开辟 一条新的途径，将对推动低聚果糖的制备及应用研究、开发新的食品配料及低热量、低糖、低脂 功能保健食品具有重要意义。 中国农业科学院硕士学位论文第二部分菊粉内切酶的基因克隆及其在融面p n m 施中的表达 p c r 扩增仪( t e c h g e n e0 5 型) 恒温培养箱( d n p 9 0 8 2 ) ( 上海精宏实验设备有限公司) 恒温水浴锅( d k _ 9 8 i ) ( 天津泰斯特仪器有限公司) 自动式压力蒸汽灭菌器( 上海申安医疗器械厂) 紫外透射仪( 上海康禾光电仪器有限公司) 7 5 2 紫外光栅分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) 恒温摇床( h 2 8 8 1 1 k ) 、脱色摇床( 太仓科教器材厂) 7 升机械搅拌发酵罐( a i h o b i o2 0 0 0 ) ( 江苏镇江东方生物工程有限公司1 p h 电极( 4 0 5 d p a s s c k 8 s ，3 2 5 ，m e r n e r t 0 u 3 d o ，瑞士) 溶氧电极( i p r o6 8 0 0 s e f i e s 0 2 s e n s o r s l 2 m m ，m e 丌1 e r t o u o ，瑞士) 中国农业科学院硬士学位论文第二部分菊粉内切酶的基因克隆及其在p f c h 缸p 口s 幻西中的表达 2 方法 2 ，1 菊粉内切酶基因的克隆 2 1 1 黑曲霉菌株卸孵i h wn 培p r9 8 9 1 ( c g m c c 眇虬) 基因组d n a 的提取 ( 1 ) 将土豆斜面保存的黑曲霉菌株爿印e ，f 船柚渺9 8 9 1 划线接种在土豆斜面培养上进行活化， 3 0 ，培养4 8 h ； ( 2 ) 挑取成熟斜面孢子一环接种到装有5 0 m lc z 叩e k s 液体培养基的2 5 0 i n l 三角瓶中3 0 ， 2 0 0 r n d n ，培养6 0 h ； ( 3 ) 过滤收集菌丝，将过滤收集的菌丝放入无水乙醇清洗过的研钵中，加入液氮速冻菌丝并研磨 成粉末状； ( 4 ) 称取5 0 m g 冻干菌丝 将其悬浮于5 0 q “1 浸提缓冲液( o 5 s d s ，2 0 0 n o i ，i 皿i s ，2 5 m m o l ，l e d r a ，2 5 0 m m o l 几n a c lp h 8 5 ) 中，再加入3 5 叽l t r i s 饱和酚和1 5 q “1 氯仿，1 3 0 0 0 印m ，4 ， 离心l h ； ( 5 ) 离心后，吸取上清加入却lr n a s e ，3 7 处理5 1 0 m i n ； ( 6 ) 加入等体积酚；酚：氯仿：氯仿：异戊醇分别抽提； ( 7 ) 离心后吸取水相加入0 5 4 倍体积的异丙醇沉淀，沉淀用7 0 乙醇洗后真空干燥，溶于5 叫 无菌水中备用。 2 1 _ 2 设计引物钓取菊粉内切酶基因 参考g e n b a n k 中黑曲霉来源的菊粉内切酶基因的部分基因序列设计引物，引物合成工作由上 海基康生物技术有限公司完成。 合成引物如下( 其中划线处为髓d r i 酶切位点) ： p l ：5 a c a a r r 立& 羔a t g c a a r c l a a l b a 兀：a c c c 玎b 3 p 2 ；5 一a c a 戌丌璺邕野匹了- i ：l t c a c c g t c a 衄r ( c c c 兀j g 一3 2 1 3p c r 扩增目的基因 2 1 3 1p c r 扩增目的基因片段 以提取的黑曲霉菌株a 妒p 喇池j 呱 p r9 8 9 1 的基因组d n a 为模板，在o 5 r n l 的p c r 小管中 加入以下成分，同时设置空白对照。p c r 扩增反应体系如下： 模板1 “l 1 0 p c rb u 矗e r5 “l d 1 1 p sk l 上游引物p 1 ( 2 0 p m 0 1 几)2 5 m 下游引物p 2 ( 2 0 口m o 扎)2 5 “l p f u 聚合酶( 2 u m l )1 “l 烈毯；q 3 丝! 总反应体积5 肌1 p c r 反应条件：9 4 5 m i n ；9 4 1 m i n ，5 5 1 m i n ，7 2 l 。5 r n i n ，3 0 个循环；7 2 延伸1 0 商n 。 1 0 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。 中国农业科学院硕士学位论文 第二部分菊粉内切酶的基因克隆及其在a c 缸p 口5 o r 西中韵表达 2 1 3 2 目的基因片段的回收 采用o n q u i c kp c rp u i i f i c a t i o nk i t 进行扩增目的基因片段的回收，方法参见操作手册。 1 0 琼脂糖凝胶电泳检测并估计回收的d n a 浓度。 2 1 4 重组载体p p i c 9 一e n d o i n u 的构建 2 1 4 _ 1p c r 扩增目的片段的酶切、纯化 ( 1 ) 回收p c r 扩增目的片段用d r i 酶切，反应体系和条件如下： p c r 扩增目的片段3 咄l 1 0 x b u 船rl o “l e c o r l ( 2 0 u 耻1 ) 耳l l 盟h；q鲤越 总反应体积l o 咄l 3 7 恒温水浴，2 h 。 ( 2 ) 酶切产物的纯化 酶切体系加入等体积的酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，充分混匀，1 0 0 0 0 r d m 离心5 m i n ； 取上层水相于另一管中，加入等体积氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 混匀，1 0 0 0 0 r d m 离心5 l l