凝血.ppt

,血栓与止血检测,血栓与止血检测,一、止血、凝血和纤溶机制,二、凝血及纤溶实验室检测进展,三、血凝质控四、目前开展血凝项目的临床意义五、常见分析错误的原因分析,血栓与止血检测,一、止血、凝血和纤溶机制,（一）血管壁的作用,1.血管的收缩（神经反射；内皮素、血管紧张素；TXA2、5-HT）。2.血小板的激活（表达并释放血管性血友病因子vWf，导致血小板在损伤部位黏附和聚集）。3.启动内、外源凝血（因子的激活和组织因子TF的释放）。4.局部血黏度增高。,血栓与止血检测,（二）血小板的作用,1.形成血小板血栓(白色血栓)，机械性修复受损血管。2.血管受损GPb经vWf粘附3.释放血小板第三因子（PF3）直接参与凝血反应。4.活化血小板在前激肽释放酶及高分子量激肽原存在的条件下，直接激活F及F。5.ADP(来自红细胞)、凝血酶、胶原血小板GPb/a结合Fg,血栓与止血检测,（三）凝血因子的作用,(目前至少有14种),包括12个经典的凝血因子（因子I-XIII,除因子VI)以及激肽释放酶原（PK）、高分子量激肽原(HMWK).除因子IV（Ca2+）外，其他均为蛋白质除因子III(TF)外，其他均存在于血浆中整个凝血过程分三期：凝血活酶形成期凝血酶形成期纤维蛋白形成期,血栓与止血检测,（三）凝血因子的作用,1.外源性凝血途径,2.内源性凝血途径,3.凝血共用途径,注意,12个凝血因子除F、F、和部分F外，主要产生于肝脏。F、F、F、F是维生素K依赖因子血友病（甲、乙、丙）三种分别缺少F、F、F，均影响内源性凝血途径。,IntrinsicXII,XI,IX,VIII(APTT),Extrinsic-VII(PT),ProthrombinThrombin,FibrinogenFibrin,CommonPath(TT)FXFXa,XIIIa,XIII,Thrombin,Fibrin(strong),Fibrinogen,Fibrin(weak),IX,XI,XIa,IXa,Xa,Va,XIIa,Prothrombin,TF-VIIa,(Prothrombinase),PL,PL,(Tenase),VIIIa,PL,X,IntrinsicPathway,HKa,ExtrinsicPathway,TFPathway,ProteinC,ProteinS,AntithrombinIII,血栓与止血检测,（四）抗凝血系统的作用,1.细胞抗凝作用：包括单核巨噬细胞、肝细胞、血管内皮细胞,2.体液抗凝作用,抗凝血酶（AT-）,肝素介导下,灭活凝血酶、Fa、Fa、Fa、Fa,灭活TF/a、Fa,TFPI,蛋白C和蛋白S,灭活Fa、Fa激活纤溶系统,血栓与止血检测,（五）纤维蛋白溶解（纤溶）系统的作用,组织型纤溶酶原激活物（t-PA）,尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA),激活,纤溶酶原（PLG）,纤溶酶（PL）,抗纤纤溶酶（2-AP）,纤溶酶原激活抑抑制物PAI、PAI2,降解,降解,纤维蛋白原,纤维蛋白,凝血因子,降解为X、Y、D、E等碎片，生成D-D、r-r二聚体。上述碎片多聚体统称为FDP,抗血小板聚集及抗血液凝固作用,二、凝血及纤溶实验室检测进展,血液凝固是一个复杂的生理生化代谢过程实质是通过一系列酶促反应，使血浆中呈液态的纤维蛋白原转变成固态的纤维蛋白丝，因而凝血是属于生理生物化学范畴的课题涉及血液学、分子生物学和免疫学等诸多领域由于这些相关学科研究的日益深入，不断地给凝血的理论和实践注入新的内容，因此，在测定方法学上也由过去精密度低的方法过渡到精密度高的方法。,凝血及纤溶检测方法,凝血及纤溶检测项目越来越多，目前应用的实验大体分为：筛筛选试验和确证试验方法学上又可分为三大类：功能测定免疫学测定化学测定,功能测定,即传统的最终以出现纤维蛋白作为判断依据的方法如凝血酶原时间（PT）、活化的部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT），以及用各种缺乏因子血浆测定某一凝血因子含量的方法等,功能测定,PT测定是检测凝血因子、的过筛试验，要用统一标有国际敏感指数(ISI)的凝血活酶试剂，在抗凝治疗监控和决定用药剂量时，一定要用国际标准化比率(INR)报告APTT是公认较好的检测“内源性”凝血因子缺陷的过筛试验，基本上可用于代替了过去的凝血时间测定，凝血时间的测定不管是玻片法还是试管法，都过于粗糙，敏感性太差。以前用于个别凝血因子缺乏的一些“纠正”试验以及所谓的“凝血活酶生成”试验，都因操作繁琐，敏感性不高，已经淘汰,免疫学测定,是近年来发展最快的检测方法，其原理是以纯化的被检物质为抗原，制备相应的抗体，然后用抗原抗体反应原理对被检物质进行定性或定量测定其方法采用ELISA、胶乳微粒凝集、火箭电泳等方法。对许多新发现的抗凝因子，纤溶和纤溶抑制因子，纤维蛋白原裂解，纤维蛋白原和纤维蛋白降解产物，凝血酶原活化等过程中被切下的小肽，如我们目前开展的FDP、D-二聚体等的测定，基本上都用免疫学方法检测,免疫学测定,从理论上讲，免疫学测定不可能全部取代功能测定。因为免疫学测定的仅是该因子的抗原性，只能表明体内存在该因子，但却不能说明其是否有生物活性，而功能测定则是测该因子在凝血或纤溶中的生理生化功能。,化学测定,理论根据是：许多凝血、抗凝及纤溶因子本身是水解酶，可以用人工合成含有该酶酶切位点并带有色原（指示剂）的寡肽作为底物，用常规的生化比色法加以测定。国内外已有一些合成的底物用于测定，诸如AT、凝血酶、F、Fa，以及纤溶酶等等。,三、凝血及纤溶实验质控,质量是医学检验工作的生命线，是当今医学检验工作中的关键问题凝血与纤溶检验质量，关键在于诊断试剂。以往，大量凝血检测试剂由于各实验室自行制备，手工操作难以达到规定的质量标准和全国、全球标准化，也难以达到室内、室间质控的要求为此WHO和血栓和止血委员会（ICTH）制定了一些标准或提供少数统一的标准品供各国校准各种试剂和方法。国内市场上能购到的商品试剂来源，国外主要有美国、法国；国内有天津、上海、北京、福建等。,凝血及纤溶实验质控,我们临床检验工作者都要从方法学与试剂的标准化等方面严把质量关，全面系统地掌握新的知识动态，进一步提高质量意识，使我国在凝血与纤溶测定总体水平上进一步提高，与国际接轨。,凝血及纤溶实验质控,良好的检测结果靠三方面来获得:精确度仪器：靠保养、靠校准可靠的试剂：合格，优质规范的操作：严格按SOP文件,凝血及纤溶实验质控,重复性-靠什么来保证？1、仪器的重复性：包括仪器内部各个通道自身与各个通道之间的一致性2、试剂、消耗品的重复性只能在稳定的仪器上获得,凝血及纤溶实验质控,准确性：是仪器、试剂、消耗品、操作人员的综合体现包括：仪器的计算公式、标准曲线试剂的保存、制备、存放效期试剂污染来源的控制,质控不规范洗针问题,高浓度清洗液洗针腐蚀样品针导致重复性下降次氯酸钠残留导致干扰结果低浓度清洗液洗针不能有效灭活凝血酶，造成交叉污染结果不准针容易堵塞、半堵塞造成样本、试剂加样不准,日常工作中应注意的问题,（一）血标本应注意的问题1.采血后标本在低温保存时间范围：有报道在32保存血浆6、12、24h因子活性可分别消失50%、60%、95%，即使保存在4也分别消失5%、55%、70%。V因子活性在32分别消失25%、40%、80%，而在4则仅损失0%、5%、10%。因此测定APTT的血浆在-80至少可保存1个月、4为6h、20为4h、而32仅为2h。测定PT的血浆，在4为24h、20为6h、32为2h。,日常工作中应注意的问题,2.血液与抗凝剂比例：国际血液学标准化委员会（ICSH）、国际血栓与止血委员会（ICTH）推荐使用3.2g/dl（含2H2O）或0.109mol/L的枸橼钠作为凝血因子检查的抗凝剂。血液与抗凝剂按9：1比例混合，实际上是指抗凝剂与正常红细胞压积血液之间的比例而言。因此应根据患者红细胞比积（Hct）状况随时调整抗凝剂用量。,（二）实验操作应注意的问题,许多试验误差都来源于技术的错误。在实验技术、试剂、温度及pH值上很微小的变化都会导致试验结果明显的变化离心因素。APTT、PT需乏血小板血浆，一般3000r/min离心10min后分离血浆。离心前注意标本量，离心后注意血浆的量（Hct）以保证抗凝剂与标本量最适比例试验前检查血浆是否有溶血、黄疸、脂血和出现凝块。红细胞膜含有磷脂，溶血标本具有与血小板第因子（磷脂）相似的凝血活性，这种磷脂能缩短溶血血浆的APTT值。标本中如果出现凝块，无论凝块多么小，均会影响试验结果。,四、开展出凝血检测的内容与临床意义,意义：1出血性疾病进行诊断与分型(血友病，血小板病)2血栓性疾病的诊断与分型(易栓症，高凝状态)3DIC诊断与分期，疗效观察4药物治疗监测(抗凝、抗血小板、溶栓治疗)5术前常规检查,(一）凝血功能检测,血浆凝血酶原时间测定(PT)活化部分凝血活酶时间测定(APTT)血浆纤维蛋白原测定(Fbg)凝血时间（CT）单因子抗原含量,血浆凝血酶原时间（PT）,血浆凝血酶原时间（PT）原理：该测定是在受检血浆中加入钙离子和组织因子后，观察其凝固时间。本试验是反映外源性凝血系统各凝血因子总的凝血状况的筛选试验。为外凝血途径常用筛选试验。正常参考范围为11-13秒，超过3秒以上为异常PT延长先天性因子、缺乏症，DIC，Vitk缺乏症,肝脏疾病，抗凝剂使用后PT缩短高凝状态，血栓性疾病。如DIC早期、心肌梗塞、脑血栓形成、多发性骨髓瘤。,INR值：国际标准化比率计算公式：INR=（测量PT/正常PT）ISI意义：它不但建立了测量值与正常人的对照，而且，排除了不同实验室、不同试剂之间的差异，使它的值更具有临床统一的意义。在口服抗凝剂的监测中更有统一标准的临床意义。,血栓与止血检测,活化部分凝血活酶时间（APTT）,原理,参考值,该测定是在受检血浆中加入APTT试剂（接触因子激活剂和部分磷脂）和钙离子后，观察其凝固时间。本试验是反映内源性凝血系统各凝血因子总的凝血状况的筛选试验。,手工法：2840秒，较正常对照值延长10秒以上为异常。,APTT,临床应用：活化部分凝血活酶时间（APTT）是检查内源性凝血因子的一种过筛试验，是用来证实先天性或获得性凝血因子、的缺陷或是否存在它们相应的抑制物，同时，APTT也可用来激肽释放酶原(PK)和高分子量激肽释放酶原(HMWK)是否缺乏，由于APTT的高度敏感性和肝素的作用途径主要是内源性凝血途径，所以APTT成为监测普通肝素首选指标，前后之比1.5-2.5为佳。APTT缩短：DIC高凝期，血栓性疾病等。,E,XII,XI,Ca+,Ca+,Ca+,I,VII,II,X,V,IX,VIII,Ca+,纤维蛋白原（Fg）测定,正常凝血反应的最终结果为纤维蛋白原反应生成纤维蛋白，所以，纤维蛋白原的检测也十分重要。参考值：2-4g/L增高见于糖尿病、急性心肌梗塞、急性感染、结缔组织病、急性肾炎、烧伤、多发性骨髓瘤、休克、大手术、妊高症、恶性肿瘤、血栓前状态、放射治疗.减低见于DIC、原发性纤溶症、重症肝炎和肝硬化、先天性纤维蛋白原缺乏症,（二）抗凝血功能检测,1.凝血酶时检查Fg有无异常间测定(TT)检查循环血中有无抗凝物共同途径异常标志2.抗凝血酶AT-活性增高出血AT-活性降低血栓形成3.血浆蛋白细胞抗原测定(PC)必须转换成活化的蛋白细胞(APC)才发挥抗凝作用减低:见于先天或获得性PC缺乏症，后者鉴于DIC、肝病,血栓与止血检测,血浆凝血酶时间,参考值,1618s，受检TT值延长超过正常对照3s以上为延长,临床意义,延长见于:低（无）纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症；血中FDP增高（如DIC）；血中有肝素或类肝素物质存在（如肝素治疗中、SLE和肝脏疾病等。）缩短：高FIB血症钙离子存在时或标本有微小凝结块及PH呈酸性,抗凝血酶-3（AT-）,AT-是一种单链糖蛋白，属于2球蛋白，主要由肝脏合成。AT-是依赖肝素的丝氨酸蛋白酶抑制物，故肝素作用于AT-的赖氨酸残基，可使AT-的抗凝血酶作用增强1000倍。AT-除对凝血酶有抑制作用外，对Xa、a、a、a、纤溶酶（血浆素），胰蛋白酶也有抑制作用，而且它对因子a的亲和力大于凝血酶，所以对因子,抗凝血酶-3（AT-）,AT-活性增高：见于某些出血性疾病，如血友病、再生障碍性贫血、心瓣膜病（心力衰竭肝肿大者）AT-活性增高。肾脏疾病尿毒症肾移植后12年内个别AT-活性不增高者可因肺栓塞而死亡。服肝素类抗凝药物后，AT-的活性会增高，停药后即可恢复正常AT-活性减低：见于弥漫性血管内凝血（DIC）、肝硬化、败血症、血栓形成性疾病（心肌梗塞，静脉血栓形成等），先天性AT-缺陷，口服避孕药.动态观察血中AT-含量的变化对监护治疗效果及了解预后情况均是有力的依据,（三）纤维蛋白溶解功能检测,1.纤溶酶原测定(PLG)增高表示纤溶活性见于血栓前状态和血栓降低表示纤溶活性见于原发继发纤溶和PLG缺乏2.纤溶酶纤溶酶抑制物复合体(PIC)能较快地反映纤溶活性(PIC半衰期6h)，体内纤溶情况的指标3.血浆硫酸鱼精蛋白副凝试验(3p试验)了解血中FDP.FM.尤其是X片段存在4.D二聚体测定(D-dimer)鉴别原发性、继发性纤溶症重要指标5.纤维蛋白(原)降解产物(FDP)纤溶亢进的标志,D-dimers检测临床应用,深静脉血栓(DVT)和肺栓塞(PE)活动性深静脉血栓形成肺栓塞时，血浆D-D显著升高；而陈旧性静脉血栓，D-D往往不增高；动脉血栓性疾病，如冠心病，动脉硬化等，D-D增高不如静脉血栓显著。排除肺栓塞（PE）D-D总体敏感性90-95%，特异性(45%68%),值得纳入诊断标准。当D-D阴性,临床上中低度可疑PE，并且V/Q造影不确定的患者，可不再进一步检查。,D-dimers检测临床应用,弥散性血管内凝血(DIC)和凝血因子消耗继发的纤溶(与脓血症，肿瘤，烧伤，先兆子痫等相关）纤溶治疗,D-dimers检测临床应用,D-二聚体不增高见于：原发性纤溶症时，D-二聚体不增高，是与继发性纤溶亢进的鉴别要点。陈旧性血栓形成时，D-二聚体不增高。短时间内的D-二聚体改变，常见于药物应用后。,血栓与止血检测,血浆纤维蛋白（原）降解产物测定,参考值,小于5mg/L,临床意义,增高见于:原发性纤溶症、DIC、恶性肿瘤、急性早幼粒细胞白血病、肺梗塞、DVT、肝脏疾病等。判定纤溶发展的阶段监测外科手术是否使器官陷于纤溶酶原活化的高风险状态,D-dimers与FDP联合应用的意义,1）DIC的诊断：原发性纤溶亢进时，由于无血栓形成，FDP显著升高，D-D一般不增高；继发性纤溶亢进时，血浆D-D显著升高，二者联合检测有利于提高DIC实验室诊断的灵敏度和特异性，尤其对早期DIC的诊断更有意义2）溶栓治疗的监测：溶栓治疗深静脉血栓或急性脑梗后2天内D-dimers增高23倍，但FDP升高1013倍，以后逐渐下降；到7天时，D-D已低于溶栓前水平，但FDP仍比溶栓前高5倍。,（四）凝血和抗凝血功能筛选指标,1、凝血时间测定（CT）2、活化部分凝血活酶时间测定（APTT）3、血浆凝血酶原时间测定（PT）4、血浆纤维蛋白原测定(Fbg)5、复钙交叉试验（CRT)轻症时过筛试验可阴性,（五）纤溶活性检查的筛选试验,1、优球蛋白溶解试验（ELT)2、血浆凝血酶时间（TT)3、血浆硫酸鱼精蛋白副凝集试验（3P)4、血浆纤维蛋白（原）降解产物测定（FDP）5、D-二聚体检测,血栓与止血检测,血小板检测,（一）血小板计数（PC或plt）,参考值,（100300）109/L,临床意义,1。血小板减少：PC低于100109/L称为血小板减少。常见于：,血小板生成障碍,血小板破坏或消耗过多,血小板分布异常,血栓与止血检测,2。血小板增高：PLT高于400109/L称为血小板增多。常见于：,原发