（植物学专业论文）pa诱导生成研究.pdf

p a 诱导生成研究 摘要 本文以t t 鄂宜1 0 5 ”水稻、“e 5 ”小麦及莴苣新鲜离体叶片等为材料， 分别用1 0 。6m 0 1 l 1 人工合成寡糖、1 0 5 t o o l l 4 c u m s o d 及纹枯菌源物 及其盐析蛋白进行处理，经过对诱导新生化学物进行分离、纯化承检测， 研究上述外源物对诱导植保素( p h y t o a l e x i n ，p a ) 生成的作用。睁果表 明： l 、人工合成寡糖、c u m s o d 及纹枯菌源物及其盐析蛋白诱导p a 生 成时，经一定培养时间后均能引起组织褐变，同病原物侵染时的表现十分 相似； 2 、经t l c 和h p l c 检测，人工合成寡糖能诱导水稻p a 生成； 3 、经t l c 和g c m s 检测，c u m s o d 能诱导两种水稻p a 生成：已 知结构的樱花素( s a k u r a n e t i n ，s a ) 和未知结构的纹枯病p a ； 4 、纹枯菌源物诱导水稻p a 生成，有效诱导子可能是存在于代谢分泌 物中的蛋白成分； 5 、经t l c 检测，c u m s o d 能诱导小麦和莴苣p a 生成，进步检测 仍在进行中。卜。 关键词：人工合成寡糖；c u m s o d ；纹枯菌源物；诱导；p a 生成 2 s t u d y o nt h ei n d u c f i o ho f p a f o r m a t i o n a b s t r a c t i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，f r e s hr i c el e a v e s nv i t r oo f “e y i l 0 5 ”v a r i e t ya n df r e s h w h e a tl e a v e si nv i t r oo f “e 5 ”v a r i e t yw e r et r e a t e dw i t ht h ew a t e rs o l u t i o no f s y n t h e t i co l i g o s a c c h a r i d ea tt h ec o n c e n t r a t i o no f1 0 m o l l 1 w a t e rs o l u t i o no f m o d e lc o m p o u n do fs o d c o n t a i n i n gc o p p e r ( c u m s o d ) a t t h ec o n c e n t r a t i o no f 1 0 。5m o l l 。a n dt h ec u l t u r eo f p e l l i c u l a r i as a s a k i i ，s e p a r a t e l y t h e i ri n d u c i n g a c t i v i t i e so f p h y t o a l e x i n ( p a lf o r m a t i o nw e r es t u d i e da f t e rt h ei s o l a t i o n 、 p u r i f i c a t i o na n dd e t e c t i o no f t h ei n d u c e d n e w b o r nc h e m i c a l s r e s u l t sa r e a s f o l l o w s ： 1 、t i s s u e b r o w n i n g o nt h es u r f a c eo fi e a v e ss i m i l a rt ot h es y m p t o m w h e ni n f e c t e dw i t ht h ep a t h o g e n i cf u n g iw e r eo b s e r v e da f t e rs o m et i m eo f c u l t u r ew h e nt r e a t e db yt h ee x o g e n o u se l i c i t o r sm e n t i o n e da b o v e , 2 、d e t e r m i n e d b yt h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) a n dh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，s y n t h e t i co l i g o s a c c h a r i d ec o u l d i n d u c ep af o r m a t i o ni nr i c el e a v e s ； 3 、d e t e r m i n e d b yt l c a n d g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( g c m s ) ，c u m s o dc o u l di n d u c et h ef o r m a t i o no f t w o k i n d so f p a si nr i c e i e a v e s ：o n ei ss a k u r a n e t i n ( s a ) w i t hak n o w n s t r u c t u r e ，t h eo t h e ri sa nu n k n o w n - s t r u c t u r ep ai s o l a t e df r o mr i c ej e a v e si n f e c t e dw i t hp e l l i c u l a r i a s a s a k i i ； 4 、t h ec u l t u r eo f p e l l i c u l a r i as a s a k i ic o u l di n d u c ep a f o r m a t i o ni nr i c e l e a v e s t h ee f f e c t i v ee l i c i t o re x i s t sm a yb et h e p r o t e i nc o m p o n e n t o f t h e m e t a b o l i n ： 5 、d e t e r m i n e d b yt l c ，c u m s o d c o u l di n d u c ep af o r m a t i o ni nw h e a t a n di e t t u c el e a v e s ，f u r t h e rd e t e r m i n a t i o ni sb e i n gc a r r i e do u t n o w k e yw o r d s ：s y n t h e t i co l i g o s a c c h a r i d e ；c u m s o d ；c u l t u r eo f p e l l i c u l a r i a s a s a k i i ；i n d u c t i o n ；p af o r m a t i o n 3 文中主要缩写符号 p a ：p h y t o a l e x i n ，植保素 s o d ：s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ，超氧化物歧化酶 p o d 、p o x ：p e r o x i d a s e ，过氧化物酶 c a t ：c a t a l a s e ，过氧化氢酶 s o d m c ：m o d e l c o m p o u n d o fs o d ，s o d 模型化合物总称 c u m s o d ：m o d e lc o m p o u n d o fs o d c o n t a i n i n gc o p p e r ，s o d 模型化合物 的一种( 含铜) t l c ：t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，薄层层析 c l c ：c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ，柱层析 h p l c h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，高效液相色谱( 层析) g c m s ：g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ，气相色谱质谱 4 前 言 一、p a 诱导生成 1 9 4 0 年m o l l e ，“在马铃薯块茎切面接种非亲和性晚疫菌小种，发现褐 变部未发生感染，菌丝完全不伸长：但在褐变部位以外的组织内菌丝大量 繁殖。从这个观察结果推定，褐变部位中产生了新的抗菌性物质，阻止病 原菌的侵入。m o i l e r 将该类抗菌性物质称作植保素( p h y t o a l e x i n ，p a ) ，这就 是p a 概念的最初提出。在随后的6 0 年中，p a 的研究又取得了很多进 展。至今，已确认2 0 0 余种植物可生成p a t ”。1 9 8 1 年，根据p a 研究发展 需要，在世界著名的病理学讨论会上，重新审议了p a 含义。p a 是植物在 接触微生物时，宿主合成蓄积的低分子抗菌活性化合物。此后，p a 含义 在不断扩大，包括植物在重金属离子和u v 照射等非生物因子作用下生成 蓄积的低分子化合物，也称胁迫化合物。 用病原物感染诱导p a 生成是p a 检索的常用方法之一。用晚疫病原 菌( p h y t o p n t h or o a i n f e s t a n s ) 感染马铃薯块茎可诱导生成p d s h i t i n ；用桑芽 枯病菌( f u s a r i u ms o l a n i f s p m o r i ) 接种桑树枝皮层部，诱导生成 m o r a c i n a - z i 3 ”( 图1 ) ；真菌肋缈t i sc i n e r e a 能诱导松树幼苗生成一种芪 类p a ( p i n o s y l v i n ) f 8 l ；稻瘟菌( po r y z a e ) 感染水稻叶片诱导生成 o r y z a l e x i na d ( o a o d ) 1 9 - 1 4 1 。p a 具有强效抑菌作用，如：水稻谷壳素 a ( m o m i l a c t o n e a m a ) 和樱花素( s a k u r a n e t i n ，s a ) 对p o r y z a e 的e d 5 0 均为1 5 p p m 。 病原菌感染诱导p a 的生物合成，菌源物起到了关键作用。迄今已分 离并鉴定结构的生物诱导子中，糖类、几丁质及其衍生物具有p a 诱导活 性。z a k i 等 “分离出一种蛋白质一脂多糖成分，能诱导棉花茎生成棉子酚 类p a ；k o g a 等l l ”报道用鞘脂类诱导子由致病真菌m a g n a p o r t h e g r i s e a 中分离得到的脑苷脂a 和脑苷脂c 处理水稻叶片能引起p a 的累 积、细胞死亡及对相继感染病菌的抗性增强。 除上述生物诱导子外，p a 的生成还可通过些非生物诱导子实现。 k o d a m a 、李文新等i “”2 3 l 从u v 照射水稻叶片中确认到m a 、m b ( m o m i l a c t o n e b ，谷壳素b ) 、o a 、o s ( o r y z a l e x i ns ，水稻素s ) 、s a 等p a 的诱导生成；并推定了其生物合成途径。k o d a m a 等i “1 用l mm o l l 重金属盐( c u c l 2 、f e c l 3 、a g c l 2 ) 处理水稻创伤部也诱导水稻p a 生成。 以病原菌感染宿主到用物理、化学胁迫诱导p a 的生成，健p a 的研 究方法有了一个飞跃，特别是化学诱导子日益广泛的应用也为本文的形成 提供了思路。 二、p a 诱导生成机理 上一节概述了p a 诱导生成的多种外源诱导子( e x o g e n o u s e l i c i t o r ) ，实际上诱导p a 生成的是经外源物胁迫后宿主防御性代谢的化学物，即 内源诱导子或内因性诱导子( e n d o g e n o u s e l i c i t o r ) 。 李文新、k o d a l l i f t 等i z 5 i 在研究水稻病害防御机制过程中确认：1 8 碳氧 化型不饱和脂肪酸( h y d r o p e r o x ya c i d ，r 0 0 h ) 是水稻p a 生成的内因性诱 导子。 k o d a m a 、田母等 2 6 2 7 1 ，研究发现r 0 0 h 加氧生成的茉莉酸 ( j a s m o n i ca c i d ，j a ) 和甲基化荣莉酸( j a s m o n i ca c i dm e t h y le s t e r ，m e j a ) ， 2 5 0 “m o l l 。可诱导水稻代表p a ( s a ，m a ) 生成，因而指出j a 和 m e j a 也属于p a 生成的内因性诱导物。 m u r a l 等1 ：8 i 发现活性氧h 2 0 ：可能是p a 生成的一种动态引发剂。他们 观察到被土豆疫病菌( p h y t o p h l h o r ai n f e s t a n s ) 感染的块茎表面生成了 h ：0 2 ，且其产生伴随着土豆代表p a ( r i s h i t i n ) 的积累，并且证实h 2 0 2 是 由宿主植物产生而不是真菌的产物。进二一步外施o 7 5 7 5 0um o l l _ j h ：0 ： 于土豆切片上，观察到r i s h i t i n 的诱导生成。此外，用病原菌接种感染豆 科、旋花科植物时，h ，o ，的含量也增加，并随之积累相应p a i ”i 。外施 h ：o ：处理甜椒和茄子，也能诱导相应p a 生成。在上述实验的基础上， m o n d e n 等口0 】试图分离h 2 0 ：作用中的内源性诱导子。他们在去皮土豆切片 上打7 l ，并喷雾i m h ：o ：水溶液，于2 3 的暗处培养6 h 后收集孔中水提 液，经过萃取、减压浓缩和低压冻干获得粗提物，进一步纯化，首次成功 分离得到植物自我诱导产生的酸性多糖( m w ：9 ，2 0 0 ) ，并仍在开展这 一内源性诱导子的化学和生物定性工作。 植物p a 是诱导抗性的一种重要化学成分。p a 形成过程中，中间代谢 化合物的合成关连酶群、抗菌性化合物骨架形成的参与酶群等，作为p a 生物合成蛋白具有重要的生理机能。目前，p a 生物合成研究仅在前体生 成和关连酶分析方面取得进展，而p a 化合物骨架的合成、代谢关连酶遗 传子解析均未获得成功。因此，有关p a 生物合成途径的报道，多是由人 工合成化学物或植物体酶蛋白活性推定的成果( 图2 ) 。 6 对于豆科、茄科、桑科植物p a 化学结构及生物合成推定，得出如下 结论： l 、同种植物可产生结构极类似的p a ，p a 生成具有多重性，这种现 象说明可能是植物体某种代谢途径或支路的关连酶活化生成p a ； 2 、不同科植物的p a 化学结构一般不同； 3 、p a 合成途径是多样的。 三、寡糖素的特点及其主要应用 植物一微生物相互作用的研究，首次表明在植物细胞内的信息传导系 统中，寡糖类物质作为一种信息传递分子存在 3 1 - 3 2 1 ，可以调节植物生长、 发育和在环境中的生存能力。最初人们诱导p a 一般使用病原物直接感 染，以后随着对诱导子分离纯化工作的深入，发现病原菌细胞壁中的糖蛋 白和支链寡糖成分是诱导p a 生成的重要有效成分。美国的a l b e r s h e i m t 3 3 】 在1 9 8 4 年发现：以1 叶61 3 连接为主链并带有1 - 31 3 侧链的寡糖，能作为植 物免疫系统的诱导子。寡糖素即植物或寄生物水解酶从植物或病原真菌细 胞壁多糖分解出来的导致寄主植物过敏反应的活性诱导子，是复杂的碳水 化合物，是特殊的寡糖。在豆类植物中寡糖诱导子通过增加苯丙基酶的代 谢而催化p a 的生物合成。研究还表明，寡糖诱导子的作用虽然首先是在 大豆中发现的，但它能够适用于多种高等植物m i 。y a m a d a 等1 3 s l 在水稻悬 浮细胞系中添加一系列的n 一甲酰壳聚糖( g i c n a c ) ，发现大于七糖的 g i c n a c 在低浓度下即能诱导m a 等5 种p a 生成，而低于三聚体的g 1 c n a c 及一系列水解的壳聚糖则无p a 诱导活性。由此推定：一定大小的 g i c n a c 对水稻是一种高潜能诱导子并能诱导显著水平的p a 。寡糖诱导 子是一类能在d n a 转录水平上调节特殊代谢、基因表达的分子。y a m a d a 、s h i b u y a 研究组口晒4 3 i 发现菌类细胞壁几丁质片断对水稻培养细胞p a 的 诱导作用，并在蛋白质磷酸化、活性氧( a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ，a o s ) 生 成、j a 合成及关连遗传子发现等的细胞应答中扮演重要角色。 真菌病原p m g ( p h y t o p h t h o r am e g a s p e r m a fs p g l y c i n e a ) 的菌丝体壁 上的1 3 连接的葡萄寡糖是首次被发现的寡糖诱导子，1 0 n g ( 1 0 4 9 ) 应用于 l g 植物组织即能产生足够的p a 。天然寡糖的分离步骤繁琐、成本高，国 际上知名的化学实验室虽然相继开展了人工寡糖诱导子的合成工作，但均 未能有重大突破。中国科学院生态环境中心孔繁祚研究员等人发明了合成 寡糖诱导子的新方法m l ，成功地合成了无毒、高效的寡糖诱导子六糖。由 于1 川1 3 ，1 嘶1 3 连接的葡聚糖存在于很多病原真翦中，因此寡糖激活剂能 7 抑制多种微生物，加之寡糖无毒、不污染环境，又能高效地激活多种高等 植物的免疫系统，抗病防害，以提高作物的品质和产量，是非常有希望的 最新一代绿色农药。 四、s o d 模型化合物的特点和主要应用 植物体在代谢过程中生成了一些不稳定的基团或分子，如超氧离子 ( 0 ，) 、过氧化氨( h 2 0 2 ) 和通过h a b e r w e i s s 反应产生活性更强的羟自 由基( o h ) 等，它们的化学活性很高，被称为a o s 4 5 - $ 4 1 a 当植物受到 干旱、水渍、盐渍、寒冷、高温等逆境胁迫或病原微生物入侵时，防御系 统会产生大量的活性氧，抗逆信息分子水杨酸1 5 5 5 ”，小分子肽和抗性蛋白 等。当活性氧浓度超过了“阂值”，导致生物大分子的氧化破坏，严重影 响植物细胞膜系统，干扰植物光合、呼吸及其他代谢过程，损伤d n a 结 构等。由于0 ，是生物体内活性氧自由基存在的主要形式，所以，0 2 的清 除对于机体免受自由基伤害是至关重要的。在正常情况下，需氧生物体内 活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。其清除主要通过酶促机制完成。 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 是其中一种重要的保护酶p ”，它 能催化反应2o i 十2 r h ：0 2 + 0 2 ，使o f 歧化为h = 0 2 和0 2 。 由于s o d 能清除植物体内过剩的活性氧，因此它能提高植物的抗 性。y a s u h a r u 等i ”用稻瘟菌菌丝成分刺激水稻叶片，发现其还原n b t 的 能力提高，证明感病条件胁迫下，s o d 活性增加；石雪晖等1 6 0 1 报道在一定 的时间经一定低温胁迫后，柑橘的s o d 活性出现上升；王建华等i 叫也报 道水分胁迫下植物体内s o d 活性与植物抗氧化胁迫能力呈正相关；李犁 等1 6 2 i 用m n 2 + 盐和氯霉素处理小麦，使s o d 活性提高，抗n 0 2 和s o ，2 毒害 能力增强。因此，提高抗性系统酶( 抗性蛋白) 水平就能从根本上提高作 物抗性。 8 0 年代以来，国内外开始广泛研究s o d 及其小分子模型化合物。其 中，廖展如等根据天然s o d 酶活性部位结构合成的s o d 模型化合物 ( m o d e lc o m p o u n do f s o d ，s o d m c ) 的光谱和电化学性质与天然s o d 极其相似，生化测试表明，s o d m c 能使棉花增产8 5 - 2 1 2 ，对棉花苗 期立枯病、后期黄萎病也有一定的抗性。扶惠华等i 。1 以7 8 7um o l l 1 的 s o d m c 浸种7 2 h ，并于低温胁迫前2 4 h 喷洒幼苗一次，有效提高水稻幼苗 对5 1 低温的抵抗力，促进低温胁迫后在2 5 1 86 c ( 昼夜) 下的恢复生 长。经处理的幼苗存活率提高2 1 6 ；幼苗高度、根长和根数均高于对 照。s o d m c 还能有效减轻低温胁迫对细胞膜系统的损伤王煜等啤佣不 、 _ ；t * 、 。9 1 c 4、c 同浓度的s o d m c 以喷洒和浸种与喷洒相结合两种方式处理油菜，发现在 一定范围内随着s o d m c 处理浓度的增加，两种处理的幼苗s o d 活性、 叶绿索含量均随之增高。认为用s o d m c 处理幼苗可在一定程度上提高油 菜抗寒性，减轻低温胁迫对膜的损伤。 五、本文研究目的 天然寡糖作为p a 生成诱导子，在大豆、水稻等多种高等植物中已有 报道。孔繁祚等人以新方法合成的人工葡萄寡糖在结构上同天然寡糖极为 相似，而它能否诱导p a 生成、进而提高植物抗性，是关系到它能否成为 新一代高效绿色农药的关键所在。本文即以1 0 6t o o l l 。人工葡萄寡糖的 水溶液喷雾重要粮食作物水稻的离体叶片，进行p a 诱导方面的研 究，试图证实人工寡糖在功能上也同天然寡糖一致。 研究表明，逆境条件胁迫下，植物体内s o d 水平提高，表明它的抗 逆作用：另一方面，对作物外施一定浓度的s o d m c 水溶液可提高其抗逆 性。s o d m c 同天然s o d 一样，能歧化0 2 为h ：0 ：，消除其毒害性，而 h ：0 ：被证实在豆科、茄科的些植物中与p a 生成诱导有关，因此作者以 水稻、小麦和莴苣三种离体叶片为材料，喷雾1 0 p p m ( 约l o - s t o o l l 。) c u m s o d 水溶液，试图诱导相应p a 生成，从而解释s o d m c 抗逆的可能 机理即是诱导p a 生成。 纹枯病感染的稻叶是本文中未知结构p a 的来源。作者分别用纹枯菌 培养物的各组分和培养菌液的盐析蛋白处理稻叶，以期确认病原菌中p a 诱导的有效成分。 图】主婴植物p a 的化学结构 +t一，j 挎一 c e l lw i 1 2 - o x op d l t 10 1 1 _ d i h y d 一2 m o _ p d t 。 a s n i c l d j 、圳 ，一 、一。、 、一- g e n e a c t i v a t i o n 图2 水稻p a 诱导生成推定 p h y t v a l e x i n s f p 1 p r o t e i n b i o - s y n t h e s i s 胁 o h e x ij t i d p 材料与方法 一、实验材料 “球、 理化性质：溶于水、甲酰胺，微溶于醇；遇葡萄糖苷酶分解；在中性 ， 吼z 卜c h 2 】、( ： ) 扣) 4 3 h 0 理化性质：微溶于水，易溶于n ，n 二甲基甲酰胺( d m f ) ；熔点高 于2 0 0 ； 使用浓度：1 0 4 t o o l l 。( 含o 8 氮酮) 。 3 、纹枯菌源诱导子 ( 五) p a 标样 1 、已知结构p a 标样 水稻p a ( m a 、s a ) 由日本茨城大学k o d a m a 教授提供 ( 1 ) 名称：m o m i l a o t o n e a ( m a ) 化学名：6 一羟3 氧一7 ，1 5 海松二烯一1 9 一油酸 化学种类：双萜类 ( 2 ) 名称：s a k u r a n e t i n ( s a ) 化学名：5 ，4 - 二羟甲氧基黄烷酮 化学种类：黄烷酮类 2 、未知结构p a 标样 由本实验室研究生张智强从纹枯菌侵染的水稻中分离得到。 二、实验方法 ( 一) 纹枯菌源诱导子的获得 1 、纹枯菌培养基配制( 1 0 0 0 m 1 ) 称取马铃薯2 0 0 9 ，加适量水煮至汁渗出，以洁净纱布过滤取滤液 部，加入蔗糖2 0 9 ，酵母膏5 9 ，加热煮沸，加水定容；再分装于若干 1 0 m l 指形试管和若干5 0 0 m l 锥形瓶中，灭菌( 1 2 1 ) 3 0 m i n 后供用。 2 、纹枯菌预培养 用接种针取少量菌丝接种于上述试管分装的培养液中，振荡( 1 5 0 r p m ，2 5 ) 培养3 d 。 3 、纹枯菌扩大培养 将上述预培养的培养物转入上述锥形瓶分装的培养液中，振荡 ( 1 5 0r p m ，2 5 ) 培养3 d 。 + 4 、纹枯菌培养物的分离 将上述扩大培养物离心( 6 ，0 0 0 r p m ，4 ) 3 0 m i n ，收集上清代谢 液；沉淀部加适量蒸馏水稀释，用组织匀浆器高速匀浆( 3 ，0 0 0 r p m ) 3 m i n 后离心( 6 ，0 0 0 r p m ，- 4 ) 3 0 r a i n ，分别收集上清菌体内液和沉淀 菌体部。 5 、代谢清液盐析 代谢清液中加入适量硫酸铵 ( n h 4 ) ：s 0 4 使溶液分别达到3 0 、5 0 及7 0 饱和度，磁力搅拌器搅拌、盐析3 0 m i n ，略静置后离心( 6 0 0 0 r p m ，- 4 ) 3 0 m i n ，取鬣白部分( 沉淀部) 加入p b s ( 3 6 0m l o 2 m - 。0 靖一小；， ， ， 。， 。 l ， n a 2 f i p o 。水溶液+ 1 4 0 m l0 2 mn a h 2 p 0 4 水溶液+ n a c l 至o 1 5 m ，p h 7 2 ) 溶 解备用。 p a 的生成诱导、分离纯化及检测流程图 新鲜离体水稻、小麦和莴苣叶片 眦f 脱f 坐攀卜 纯样 轻度失水 d 、寡糖水溶液 2 ，0 0 0 l u x 日照 加活性碳振荡( 1 8 0 r p m ，1 2 h ) 脱色并过滤 t l c c l c 分离纯化 t l c i i p l c g c m s 检测 ( 二) p a 的生成诱导 l 、生物诱导 t 4 ( 1 ) 代谢清液、菌体内液和菌体( 添加0 8 氮酮) 使用 将离体叶片用清水洗净，室温晾干，平铺于置有纱布的托盘内，轻 度失水( 约2 0m i n ) 。分别在叶面均匀喷雾代谢清液、菌体内液和菌体 ，待叶面吸收后重复喷雾2 次，然后向纱布上加适量清水保湿。塑料膜 封盖，培养( 2 5 ；相对湿度8 5 ；2 ，0 0 0 l u 墨日照1 2 h ) 7 2 h 1 1 “， 观察其叶面颜色变化。对照组用清水喷洒叶面，相同条件培养。 ( 2 ) 代谢清液盐析后的蛋白溶液使用同上法。 2 、物理诱导 将叶片用清水洗净，室温晾干，平铺于置有保湿纱布的托盘内，置 于u v 灯( 1 5 w ) 下2 0 c m 处照射3 0m i n ，塑料膜封盖后，培养( 2 5 ； 相对湿度8 5 ；2 ，0 0 0 l u x 日照1 2 h ) 7 2 h i ”】，观察其叶面颜色变化。 未经u v 照射的叶片为对照组，相同条件培养。 3 、化学诱导 将叶片用清水洗净，室温晾干，平铺于置有纱布的托盘内，轻度失 水( 约2 0 r a i n ) 。分别在叶面均匀喷雾1 0 - 5 m o l l c u m s o d 水溶液和 1 0 6t o o l l 寡糖水溶液，待叶面吸收后重复喷雾2 次，然后向纱布上 加适量清水保湿。塑料膜封盖，培养( 2 5 ；相对湿度8 5 ；2 ，0 0 0 l u x ，日照1 2 h ) 7 2 h f i “，并观察其叶面颜色变化。对照组用清水喷洒叶面 ，相同条件培养。 ( 三) p a 分离、纯化 1 、提取 取等量( 1 0 9 ) 上述5 种处理培养后的叶片，剪碎后分别放入洁净 锥形瓶中，加入1 0 0 m 1 7 0 甲醇( m e t h a n o l ，m o o h ) ；置1 0 0 水浴锅中 加热煮沸5 m i n 。冷却后用双层纱布过滤，取滤液减压馏去m e 0 h ，保留 水相。水相中加入4 0 m l 乙醚( e t h e r ) ，振荡( 1 5 0 r p m ) l h 后静置 3 0 m i n ，收集e t h e r 相1 2 4 , 6 5 i ：重复3 次。e t h e r 相添加活性炭适量，振荡 ( 1 8 0 r p m ) 1 2 h 脱色后，水浴( 6 0 c ) 蒸去e t h e r ，即得分离粗样。对 照组叶片同法处理。 2 、薄层层析法( t h i n 1 a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，t l c ) ： 硅胶板( 2 4 5 2 3 c m ) 按硅胶g ( 粒度：l o 一4 0um ) ：0 5 羧甲基纤 维素钠= l ：3 ( w v ) 制作，硅胶厚度0 5 m m 。上述分离粗样溶于5 0 0l a 1 e t o h ，在预先活化硅胶板( 1l o 。c ，0 5 h ) 上点样，按苯一氯仿 ( b e n z e n e t r i c h l o r o m e t h a n e ) ( 1 ：5 ，v v ) 展层分离。层析完毕后 自然晾干，碘缸显色。标出分离后的样品位置，计算r f 值。然后按所标 位置刮下分离样品，装入洁净试管中，添加4 m l a c e t o n e ，超声波洗脱后 离心( 5 0 0 0r p m ) 3 0 m i n ，上清液用n 。吹干后即为纯化的样品。对照组 粗样同法分离纯化。 3 、柱层析法( c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ，c l c ) ： 在c l c 用玻璃管( m = 3 c m ，l = 6 0 e m ) 内填充适量硅胶( 粒度：1 0 4 0um ) 并活化。分别将寡糖诱导的分离粗样( 洗脱剂：b e n z e n e ：t r i e h l o r o m e t h a n e = 7 ：3 ) 和纹枯病诱导的分离粗样( 洗脱剂：b e n z e n e ：t r i c h l o r o m e t h a n e = 1 ：5 ) 过柱( 4 5 滴m i n ，1 5 m l 管) 。分组t l c 确认后 再收集各组分，浓缩备用。 ( 四) p a 检测 1 、t l c 法 ( 1 ) 寡糖诱导粗样和纹枯病诱导粗样检测 硅胶板( 5 0 l o o m m ) 点样，展层( b e n z e n e ：t r i c h l o r o m e t h a n e = 7 ：3 ) ，碘显色，计算呈色物r f 值。 ( 2 ) c u m s o d 诱导水稻粗样和纹枯病诱导粗样检测 硅胶板( 5 0 1 0 0 m m ) 点样，展层( b e n z e n e ：t r i c h l o r o m e t h a n e = l ：5 ) ，后碘显色，计算呈色物如值。 ( 3 ) 菌液、菌体上清液及菌体诱导粗样检测 硅胶板( 5 0 1 0 0 m ) 点样，展层( b e n z e n e ：t r i c h l o r o m e t h a n e = l ：5 ) ，碘显色，计算呈色物r ，值。 ( 4 ) 3 0 、5 0 及7 0 饱和度硫酸铵盐析所得蛋白诱导粗样检测 硅胶板( 5 0 l o o m m ) 点样，展层( b e n z e n e ：t r i c h l o r o m e t h a n e = 1 ：5 ) ，碘显色，计算呈色物r f 值。 ( 5 ) c u m s o d 诱导小麦粗样和u v 诱导粗样检测 硅胶板( 5 0 x1 0 0 m m ) 点样，展层( b e n z e n e ) 物艮值。 ( 6 ) c u m s o d 诱导莴苣粗样和u v 诱导粗样检测 硅胶板( 5 0 l o o m m ) 点样，展层( b e n z e n e ) ， 物艮值。 碘显色，计算呈色 碘显色，计算呈色 上述各相应对照样品与各诱导子诱导分离粗样同法经t l c 检测。 2 、高效液相色谱法( h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 将经t l c 法纯化的寡糖诱导纯样加入适量m e o h 溶解，经有机滤膜 ( o 4 5um ) 过滤盾 2 4 , 6 6 l ，注入h p l c 检测各样品中的p a 诱导。对照样品 同法检测。 h p l c 检测条件： 流动相：7 0 m e 0 h ； 流速：l m l m i n ； u v 波长：2 3 0 n m ； 进样量：2 0 u1 。 3 、气相色谱质谱联用法( g a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y ，g c m s ) 将经t l c 法纯化的c u m s o d 和纹枯菌诱导纯样分别加入适量e t o h 溶解，经有机滤膜( o 4 5pm ) 过滤后，n 2 吹干，溶于1 0 0u1 t r i c h l o r o m e t h a n e 中，做g c - m s 检测；m a 、s a 标样和相应对照样品同时送检。 一、g c m s 检测条件： 交联石英毛细管柱：2 5 m x 0 2 m m 0 3 3um ； 检测温度：由1 2 0 保持2 m i n 后以1 5 m i n 速度升至2 7 0 再保持 1 0 m i n ； 汽化温度：2 5 0 ； m s 离子源温度：2 0 0 ； 电子能量：7 0 e v ： 进样量：1ul 。 。j 羚7 一、水稻p a 生成诱导 结果 ( 一) 寡糖诱导 1 0 。om 0 1 l 寡糖水溶液诱导时，2 4 h 后叶面开始呈现浅褐色斑点至 4 8 h 再观察时可见斑点扩大，斑点数增多，且颜色加深；对照组叶面无明 显变化。 分离粗样经t l c 检测( 图3 ) 可见，与对照相比，寡糖诱导水稻生 成的化学物有3 种，它们的值同纹枯菌诱导生成的3 种p ar ，值近似，因 此，可视为寡糖诱导水稻生成了3 种p a ( p a 。、p a ：、p a ，) 。 经t l c 分离纯化的纯样p a ，进一步进行h p l c 检测( 图7 ) 可见， 与清水对照的4 个微弱吸收峰相比，寡糖诱导p a 呈现2 个较强的吸收 峰，且峰形完全不同。对保留时间和峰面积( 表1 ) 进行的比较表明：寡 糖诱导生成了p a 。h p l c 结果显示，被检测p a 在2 1 0 2 5 0 n m 处有较强吸 收，根据化合物的紫外吸收特性i “i ，说明该p a 可能属于共轭双烯类或 a 、1 3 不饱和酮、醛等类化合物。 ( 二) c u m s o d 诱导 1 0 4 m o l l 1 c u m s o d 水溶液诱导时，2 4 h 后叶面开始呈现深褐色斑 点，至4 8 h 再观察时可见斑点扩大，斑点数增多，且颜色加深；对照组叶 面无明显变化。 分离粗样经t l c 检测( 图4 ) 可见，与对照相比，c u m s o d 诱导水 稻生成的化学物有2 种，它们的r f 值同纹枯菌诱导生成的2 种p ar f 值近 似，因此，可视为c u m s o d 诱导水稻生成了2 种p a ( p a 。、p a 2 ) 。 经t l c 分离纯化的纯样p a 进一步进行g c m s 检测( 图8 ) 可见， c u m s o d 诱导水稻生成的一种p a 与己知结构的双萜类p a s a 为同分 子量物质：其最大荷质比( 2 8 5 l ，表示分子量) 一致，且碎片峰荷质比 也很近似，几乎可以认定由c u m s o d 诱导生成的p a ，就是s a 。 经t l c 分离纯化的纯样p a 2 进一步进行g c m s 检测( 图9 ) 可见， c u m s o d 诱导水稻生成的一种p a 与未知结构的纹枯病p a 为同分子量物 质：其最大荷质比( 2 5 6 1 ，表示分子量) 一致，且碎片峰荷质比也很近 似，几乎可以认定由c u m s o d 诱导生成的p a 2 就是纹枯病pa 1 ，经检索 可能是一种十六碳烯酸，进一步的结构确认因纹枯病感染水稻材料有限尚 未进行。 ( 三) 纹枯菌源物诱导 1 、代谢清液、菌体内液和菌体诱导 代谢清液诱导时，2 4 h 后叶面开始呈现深褐色斑点，至4 8 h 再观察时 可见斑点扩大，斑点数增多，且颜色加深；另二组分诱导及对照组叶面均 无明显变化。 分离粗样经t l c 检测( 图5 ) 可见，与对照相比，菌体内液和菌体没 有诱导水稻生成新化学物，代谢清液诱导水稻生成的化学物共2 种，它们 的r f 值同纹枯菌诱导生成的2 种p ar t , 值近似，因此，代谢清液诱导水稻 生成的2 种p a ( p a 。、p a ：) 可能是纹枯菌诱导生成的2 种p a 。 2 、纹枯菌代谢清液硫酸铵盐析蛋白诱导 各饱和度硫酸铵盐析蛋白诱导时，叶面自2 4h 后均开始呈现斑点，但 7 0 饱和度盐析蛋白诱导的叶面斑点最多，颜色最深，且至4 8h 再观察时 可见斑点扩大，斑点数增多，颜色加深；另二饱和度盐析蛋白诱导叶面斑 点较少，颜色较浅；对照组叶面色无明显变化。 分离粗样经t l c 检测( 图6 ) 可见，与对照相比，7 0 饱和度硫铵盐 析蛋白诱导水稻生成2 种化学物，其r f 值同纹枯菌诱导生成的2 种p ar ， 值近似，因此，7 0 饱和度硫铵盐析蛋白诱导水稻生成的2 种p a ( p a 、 p a ，) 可能是纹枯菌诱导生成的2 种p a ；3 0 、5 0 饱和度硫铵盐析蛋白诱 导水稻各生成1 种化学物，其r f 值同纹枯菌诱导生成的1 种p ar ，值近 似，因此，3 0 、5 0 饱和度硫铵盐析蛋白诱导水稻生成的1 种p a ( p a ) 可能是纹枯菌诱导生成的其中1 种p a 。说明只有用7 0 饱和度硫酸铵盐 析才能诱导活性蛋白完全分离出来。 二、小麦p a 生成诱导 1 0 。m o l l 1 c u m s o d 水溶液诱导时，2 4 h 后叶面开始呈现深褐色斑 点，至4 8 h 再观察时可见斑点扩大，斑点数增多，且颜色加深；u v 诱导 时，1 6 h 后叶面即开始呈现深褐色斑点，至2 4 h 再观察时斑点扩大，斑点 数增多，且颜色加深；4 8 h 再观察时斑点继续扩大，斑点数继续增多，且 颜色继续加深：对照组叶面色无明显变化。 分离粗样经t l c 检测，与对照分离粗样呈色物( 1 种，r ，= o 7 5 5 ) 相比，c u m s o d 诱导小麦生成的新化学物有2 种( r f = o 8 9 7 、o7 8 4 ) ，u v 照射诱导小麦生成的化学物也有2 种( r f = o 8 4 3 、0 5 3 4 ) 。 三、莴苣p a 生成诱导 1 0 5 t o o l l 。c u m s o d 水溶液诱导时，2 4 h 后叶面开始呈现深褐色斑 点，至4 8 h 再观察时可见斑点扩大，斑点数增多，且颜色加深；u v 诱导 时，1 6 h 后叶面( 尤其是沿主茎处) 即开始呈现深褐色斑点，至2 4 h 再观 察时斑点扩大，斑点数增多，且颜色加深；4 8 h 再观察时斑点继续扩大， 斑点数继续增多，且颜色继续加深；对照组叶面色无明显变化。 分离粗样经t l c 检测，与清水对照分离粗样呈色物( 2 种，r ，= o 7 0 7 、o 2 7 3 ) 相比，c u m s o d 诱导莴苣生成的化学物有2 种( r ，= 08 6 3 、 o 7 6 1 ) ，u v 照射诱导莴苣生成的化学物有1 种( r ，= 0 6 2 4 ) 。 ( 注：上述各t l c 结果为点样量、展层剂均一致的情况下重复3 次 的一致结果；h p l c 和g c m s 结果为在同等检测条件下各重复2 次的一 致结果。) i 色斑r f 值 l0 9 4 i 寡糖诱导 2 0 6 s 分离粗样 3 0 3 5 40 1 5 l0 9 4 纹枯菌 206 3 诱导分离 粗样 30 3 5 40 1 6 对照l0 9 l 分离粗样 2 08 l 图3 t l c 检测寡糖诱导水稻p a 生成结果 ( 展层剂：苯：氯仿= 7 ；3 ) 1 ：寡糖诱导分离粗样；2 ：纹枯菌诱导分离粗样；c ：对照分离粗样。 色斑r ，值 10 8 7 6 c