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利用宏基因组技术克隆和鉴定堆肥环境中的纤维素酶基因 摘要 纤维素的生物降解是一个有待于解决的难题。作为地球上储量最高 的生物质，纤维素的生物降解并被发酵利用是解决当前能源危机的良 方。纤维素具有异于其他生物质的致密的晶体结构，这个结构使纤维素 能抵御各种理化作用的侵蚀，也阻碍了对它的降解应用。而纤维素的生 物降解，一般认为，是由一组纤维素酶协同作用进行的，这组酶由外切 纤维素酶、内切纤维素酶和p 一葡萄糖苷酶这三类酶组成。但是人们在 利用这组酶进行纤维素的实际水解实验，却发现水解效率很低，人们无 法在人工条件下来完全模拟微生物的高效降解纤维素的过程。在目前的 知识水平下，人们还没有完全理解纤维素酶的水解机理；另一个方面， 我们通常所认为的三个酶( 外切纤维素酶、内切纤维素酶、d 一葡萄糖 苷酶) 协同降解纤维素的理论有待完善。 在本文中，我t l 禾l j 用免培养的宏基因组技术对堆肥环境中和纤维素 降解有关的纤维素酶资源进行研究，试图获知在这样的环境中对纤维素 降解起主导作用的纤维素酶是什么以及在这样的环境中是否存在有特 性异于已报道的纤维素酶。 我们成功地构建了一个好氧堆肥的宏基因组c o s mid 文库，文库有约 十万个克隆，文库平均插入片段大小为3 4k b ，文库的总容量为3 4 x 10 9b p 。 利用活性筛选法，我们从文库中获得四个表达纤维素酶活性的克隆， 依据克隆对c m c 平板水解圈的大小，这四个克隆中表达的纤维素酶由大 到小分别是3 个糖基水解酶家族9 的纤维素酶和1 个糖基水解酶家族5 的纤维素酶。我们选择了水解圈最大的三个克隆中的基因进行下一步的 研究。这三个基因分别命名为u m c e l 9 a ，u m c e 9 b 和u m c e l 9 c o 这三个基因在核苷酸序列上和g e n b a n k 数据库里的任何序列都没有 同源性。这三个基因编码的产物u m c ei9 a 、u m c ei9 b 和u m c e i9 c 都为具 有两个结构域( i g - i k ed o m a i n 和c a t a i y t i cd o m a i n ) 的糖基水解酶 家族九的纤维素内切酶。从b la s t x 的结果来看，u m c el9 a 和来自 c e i v i b r i oj a p o n i c u s 的c e i9 b 同源性最高( id e n titie s 6 9 。 p o sitiv e s8 1 ) ；u m c ei9 b 也是和来自c e l l v i b r i oj a p o n i c u s 的c ei9 b 同源性最高( id e n titie s5 1 ，p o sit iv e s6 7 ) ；u m c ei9 c 和来自 x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i sp v c a m p e s t r i ss t r a t c c3 3 9 13 的e g l 2 有 最高的相似性( id e n t itie s5 8 ，p o sitiv e s7 1 ) 。 在进化树分析中，这三个酶和来自x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i sp v c a m p e s t r i s 、f i b r o b a c t e rs u c c i n o g e n e 、c y t o p h a g ah u t c h i n o s o n i i 以 及白蚁肠道宏基因组的纤维素酶归到了一个分支上，它们具有类似的蛋 白质序列和结构。 但是u m c ei9 a 、u m c el9 b 和u m c e l9 c 并不是来自同一个基因的拷贝复 制，它们是由不同基因的趋同进化得到的。u m c e l 9 c 的基因的g c 含量高 达7 1 ，明显异于u m c e l9 a 和u m c ei9 b 的5 5 ，而u m c e i9 b 是个多聚 i i 体的蛋白质这点又异于u m c e l9 a 。 u m c el9 a 、u m c ei9 b 和u m c el9 c 都是属于中温、p h 中性作用的纤维素 内切酶，不具有p r o c e s siv e 活性。但是却可以把非结晶纤维素直接水 解成纤维二糖和葡萄糖，并以纤维二糖为主要产物。这样的水解纤维素 特性和普通的纤维素内切酶把纤维素水解成寡糖链的特性差异极大。这 样的酶在已报道的文献中只发现有t r i c h o d e r m ar e e s e i 的c e i7 b 和 t h e r m o b i f i d af u s c a 的e 1 。而在和我们克隆的三个酶在同一个进化树 分支上的酶中有f i b r o b a c t e rs u c c i n o g e n e 的内切酶，这个酶在文献中 被报道它的特性也是类似的产生单糖和二糖，但是以单糖为主要产物。 结论：我们利用宏基因组技术研究堆肥环境中的纤维素酶。在我们 构建的d n a 文库中获得了相似的一类纤维素内切酶。这些纤维素酶的核 苷酸序列差异极大但是由趋同进化产生的具有相似结构和功能的酶，在 选择压力下趋同进化产生的酶具有独特的水解纤维素的作用方式。 关键词：宏基因组堆肥纤维素酶克隆表达趋同进化 i i i c l o n i n go fc e l l u l a s eg e n e sf r o m c o m p o s te n v i r o n m e n tb ym e t a g e n o m i c a p p r o a c ha n dc h a r a c t e n i z a t i o no f t h e i r t r a n s l a t e dp r o d u c t s a b s t r a c t t h eb i o l o g i c a ld e g r a d a t i o no fc e l l u l o s ei ss t i l la nu n s o l v e dp r o b l e m c e l l u l o s e ，t h em o s tc o n s e r v e db i o m a s so ne a r t h ，i st h eb e s tm a t e r i a lf o r c a r b o h y d r a t er e u s e da n dt os e r v ef o rb i o e n e r g y b u tt h es p e c i a lc r y s t a l l i n e s t r u c t u r e so fc e l l u l o s e ，w h i c hp r o t e c t i n gi tf r o md e g r a d a t i o n ，h i n d e rt h e i n d u s t r i a lh y d r o l y s i so fc e l l u l o s et og l u c o s ea n dt h ef o l l o w i n gv a l u e - a d d e d f e r m e n t a t i o n a saw i d e l yh e l db e l i e f , t h eb i o d e g r a d a t i o no fc e l l u l o s ei s c a t a l y z e db yab a t t e r y o fc e l l u l a s e ( e x o g l u c a n a s e ，e n d o g l u c a n a s ea n d 1 3 - g l u c o s i d a s e ) ，t h ea c t i o no f w h i c hi ss y n e r g i s t i ch y d r o l y s i so fc e l l u l o s e b u t t i l ln o w , s c i e n t i s ts t i l lc a n ta c h i e v et h eg o a lo fh i g h e f f i c i e n t l yh y d r o l y s i so f c e l l u l o s ei nm a n m a d ec o n d i t i o n o n eo ft h er e a s o n si st h a tt h es e c r e to f c e l l u l o s eh y d r o l y s i si s n tc o m p l e t e l yu n c o v e r e d ，a n dt h et h e o r yo fs y n e r g yo f t h r e ek i n d so fc e l l u l a s en e e dt ob ei m p r o v e d w i nt h i sw o r k ，w ee m p l o i e dm e t a g e n o m i ct e c h n i q u e st oe x p l o r et h e r e s o u r c e so fc e l l u l a s e f o rt h e b i o d e g r a d a t i o n o fc e l l u l o s ei n c o m p o s t e n v i r o n m e n t t h i sw o r kt r i e dt of i n do u tw h a ta r et h em a i nf a c t o r so f c e l l u l o s eb i o d e g r a d a t i o ni nc o m p o s te n v i r o n m e n ta n dw h e t h e rt h e r ea r e s p e c i a lc e l l u l a s e sw h i c hh a v ed i f f e r e n tc h a r a c t e r i s t i c sf r o mo t h e rr e p o r t e d c e l l u l a s e s w es u c c e e di nc o n s t r u c t i n gam e t a g e n o m i cc o s m i dd n a l i b r a r yo f a e r o b i cc o m p o s t t h i sl i b r a r yc o n t a i n e da b o u tt e nt h o u s a n dc l o n e sh a v i n ga c a p a c i t yo f 3 4x10 9b pw i t ha v e r a g ei n s e r ts i z ea t3 4k b l o n g w ei s o l a t e df o u rc l o n e se x p r e s s i n gc e l l u l a s ea c t i v i t yb ya c t i v i t y b a s e d s c r e e n i n go ft h el i b r a r y a n dt h r e ec l o n e sw e r ec h o s e nf o rf u r t h e ra n a l y s i s b a s e do nt h e i rh i g ha c t i v i t yi na c t i v i t ys c r e e n i n g a l lt h e s et h r e ec l o n e s h a r b o r dac e l l u l a s eb e l o n g i n gt ot h eg l y c o s i d eh y d r o l a s e sf a m i l y9 t h e s e t h r e eg e n e sw e r er e s p e c t i v e l yn a m e du m c e l 9 a ，u m c e l 9 ba n du m c e l 9 c n oh o m o l o g o u ss e q u e n c e sf o rt h r e eg e n e sw e r ef o u n di nt h eg e n b a n k d a t a b a s e t h ee n c o d i n gp r o t e i n ，u m c e l 9 ah a v eh i 曲h i 曲i d e n t i t yw i t h c e l 9 bf r o mc e l l v i b r i o j a p o n i c u s ( i d e n t i t i e s6 9 ，p o s i t i v e s81 ) ，u m c e l 9 b h a v eh i g hh i g hi d e n t i t yw i t hc e l 9 bf r o mc e l l v i b r i oj a p o n i c u s ( i d e n t i t i e s 51 ，p o s i t i v e s6 7 ) ，u m c e l 9 ch a dh i g hi d e n t i t yw i t he g l 2f r o m x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i sp v c a m p e s t r i ss t r a t c c3 3 9 1 3 ( i d e n t i t i e s5 8 ， p o s i t i v e s71 ) a l lo ft h e ma r ec o m p o s t e do ft w od o m a i n s ，a ni g 1 i k e d o m a i na n dc a t a l y t i cd o m a i nw h i c hb e l o n gt og l y c o s i d eh y d r o l a s e sf a m i l y9 v i nap h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i s ，t h e s et r e ee n z y m e sh a v e g r o u p e d t o g e t h e r w i t hc e l l u l a s e sf r o mx a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s p v c a m p e s t r i s ， f i b r o b a c t e r s u c c i n o g e n e ，c y t o p h a g ah u t c h i n o s o n i ia n dt e r m i t em e t a g e n o m e t h i se v i d e n c es h o w e dt h a ta 1 1t h e s ee n z y m e sh a dt h es i m i l a r p r o t e i n s e q u e n c ea n ds t r u c t u r e g e n eu m c e l 9 ch a dah i g hg cc o n t e n to f71 ，w h i c hd i s t i n g u i s h e s u m c e l 9 cf r o mu m c e l 9 aa n du m c e l 9 bw h i c hh a dag cc o n t e n to f5 5 a l s o ， u m c e l 9 bw a sd i f f e r e n tf r o mu m c e l 9 ai nt h a tu m c e l 9 bc a nf o r mm u l t i m e r s a l lt h e s e d a t ai n d i c a t e dt h a tu m c e l 9 a ，u m c e l 9 ba n du m c e l 9 cw e r e n t d e r i v e df r o ma s i n g l ea n c e s t r a lg e n e ，a n dt h e s ep r o t e i n sw e r et h ep r o d u c to f c o n v e r g e n te v o l u t i o na n dh a v ed i f f e r e n td e r i v e da n c e s t r a lg e n e t h o u g ht h e s ed i f f e r e n c e se x i s ta m o n gt h e s et h r e ee n z y m e s ，t h e yw e r e a l lm e s o p h i l i ce n z y m ea n dm o s ta c t i v ea tn e u t r a lp h t h e yc a nh y d r o l y z e n o n c r y s t a l l i n e dc e l l u l o s et oc e l l o b i o s ea n dg l u c o s e ，w h i c hc e l l o b i o s ea s m a j o rp r o d u c t t h i se n z y m a t i c c h a r a c t e r i s t i c si sd i f f e r e n tf r o mo t h e r e n d o g l u c a n a s e sp r o d u c i n gc e l l o d e x t r i n sf r o mc e l l u l o s e i na d d i t i o nt h e s e e n z y m e sd i dn o ts h o wa np r o c e s s i v ea c t i v i t y i np u b l i s h e dl i t e r a t u r e ，o n l y t w oe n z y m e sw e r er e p o r t e dp o s s e s s e st h es a m ec h a r a c t e r i s t i c sa st h et h r e e e n z y m e s w h i c hw e r ec e l 7 bf r o mt r i c h o d e r m ar e e s e ia n de1f r o m t h e r m o b i f i d af u s c a a n da n o t h e re n z y m e ，t h ee n d o g l u c a n a s ef r o m f i b r o b a c t e rs u c c i n o g e n ew h i c hw a si nt h es a m eb r a n c hw i t ht h et h r e e e n z y m e s i nt h e p h y l o g e n e t i ct r e e ，h a d b e e n f u l l yb i o c h e m i s t r i c a l l y v i c h a r a c t e r i z e da n dw a sf o u n dt o p r o d u c eg l u c o s ea n dc e l l o b i o s ef r o m c e l l u l o s eb u tw i t hg l u c o s ea sm a i np r o d u c t s c o n c l u s i o n ：w ee m p l o ym e t a g e n o m i ct e c h n i q u e st o e x p l o r e t h e r e s o u r c e so fc e l l u l a s ef o r t h e b i o d e g r a d a t i o no fc e l l u l o s ei nc o m p o s t e n v i r o n m e n t t h r e ee n d o g l u c a n a s e sw a sw i t ld i f f e r e n ta n c e s t r a lw e r ef o u n d t os h o wf o u n ds i m i l a re n z y m a t i cc h a r a c t e r i s t i c s ，w h i c hm a yb et h er e s u l to f c o n v e r g e n te v o l u t i o n t h e s ee n z y m e sp o s s e s sas p e c i a la c t i o nm o d ei n h y d r o l y s i so f c e l l u l o s e k e yw o r d sm e t a g e n o m e ；c o m p o s t ；c e l l u l a s e ；c l o n i n ga n de x p r e s s i o n ； c o n v e r g e n te v o l u t i o n v i l 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果 和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表 过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作 提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 一：僦馐 q “耐日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：就喏 导师签名：场家叶弦口年6 月1 日 广西大学博士掌位论文利用宏基因组技术克隆和鉴定堆肥环境中的纤维素酶基因 1 1 纤维素酶的重要意义 第一章前言 1 1 1 纤维素能源是生物质能源的必由之路 每年，太阳辐射到地球表面的能量为2 6x1 0 2 1 千焦耳，这个能量大部分通过光 合作用以碳源的形式储藏起来。这个以碳源形式储藏的能量大大超过了目前人类每 年所消耗的2 1 1 0 1 7 千焦耳的能量 1 。植物光合作用每年贮存的能量约相当于世 界主要燃料消耗的1 0 倍；而目前作为能源加以利用的量还不到其总量的1 。这些 未加以利用的生物质，在自然界的碳循环中，绝大部分自然腐解并将能量和碳素释 放，回到自然界中 2 1 。 纤维素是世界上储量最大的生物质，占地球总生物质的量的4 0 。这么大的生 物质来源，可以提供取之不尽的能源供应 3 ，4 。而且纤维素是一个可再生的自然 资源，每年通过光合作用产生的纤维素高达1 5 5 1 0 9 吨，其中有近8 0 没有被人 类所利用。因此纤维素能源是很有潜力的待开发能源 1 。 相对于目前全球利用和待利用的能源来说，纤维素能源有其独到的优势： 如表1 - 1 所示，在目前全球的各种能源利用中，纤维素有着不可忽略的优势。 广西大学博士掌位论文利用宏基因组技术克隆和鉴定堆肥环境中的纤维素嗣 基因 表1 - 1各种能源优劣势比较 t a b l e1 - 1 c o m p a r i t i o no fe n e r g ys o u r c e s 木目前没有确切的数据 第一，在排位第一的石油和煤炭，是目前利用最为广泛的能源，也是目前全球 能源利用的支柱。但是石油和煤炭的储量在日益减少，按目前的全球消耗量，这些 能源只能维持使用不到百年，作为各种交通工具使用的主要能源一石油，储量下降 更是严重，目前探明的石油储量只够使用5 0 年。而且石油和煤炭的使用有严重的缺 点一使用中释放大量的二氧化碳，二氧化碳是引起全球变暖的主要罪魁祸首( 温室 气体) 。世界继续使用地壳中储藏的石油和煤炭，就会继续释放亿万年来通过植物 的光合作用封存于地底的二氧化碳，大量的二氧化碳的释放将会引起地球的气温持 续上升，导致人类的生态灾难 2 。京都议定书的签订明确了各个国家二氧化碳限量 排放的义务。对于很多国家，寻找石油和煤炭的替代能源已经是迫在眉睫的事情。 第二，核能。核能曾经被认为是一种清洁的能源，虽然核电站的建造需要巨大 的一次性投资，但是后期的能源产出是非常低成本的。因此很多国家都把核能作为 国家的主要能源来源，并建设了大量的核电站。但是随着早期核电站的使用寿命的 到达，核能利用的最大的难题也是致命的难题摆在了所有人的面前，这个就是核废 2 j m 宏基因组技术克隆和喾；定堆肥环境中的纤维素酶基因 物的处理问题，目前没有一个妥善的核废物处理的方法，陆续增加的核废物将又是 人类面临的一个生态危机 5 。在核能利用最发达的国家之一，美国( 另外的国家是 苏联和法国，核能供应几乎占全国的5 0 以上的电量) 目前已不兴建新的核电站， 而运行寿命周期到的核电站都进行了逐步的拆毁处理，不再维持核电的生产。在核 电的利用技术中，显然只有核聚变发电这样的“绿色技术 才能给我们带来可靠， 安全的能源供应。但是核聚变技术目前没有看到任何可以应用的曙光。 第三，水力发电。水力发电的优势和缺点是并存的。优势在于，这个能源的利 用是简便易行的。缺点是水电的利用需要当地有合适的河流。而且目前各种针对水 力发电破坏生态平衡、影响气候变化的讨论也多了起来。在能源利用大国一美国， 他的做法是：废弃水电站 6 。 第四是各种处在发展阶段，没有大规模利用的能源。太阳能、氢能等能源具有 非常大的利用潜力和优势，但是这些技术都不成熟，还在处于研究阶段，大规模利 用的成本非常高 7 。 最后是同样处于发展阶段的生物质能源。生物质能源的利用是对游离状态的二 氧化碳的原位循环，它不会导致温室效应的加剧。生物质能源大的来说有：沼气发 电、垃圾燃烧发电、裂解气化发电、液体燃料 8 。而最重要的就是后一个：液体燃 料( 乙醇和生物柴油) 。沼气发电是比较成熟的技术，但是这个技术的效率低，而 且难于推广。而利用燃烧、裂解生物质来发电的技术需要很高的能耗，最终产生的 净能量并不高。剩下的生物柴油和乙醇是最有利用价值的生物质能源利用技术。生 物柴油使用各种动物和植物油脂进行裂解得到，实现起来比较简单，但是不管是动 物还是植物油脂的获得都需要占用耕地，和粮食抢夺资源。而纤维素乙醇就没有这 个问题，它可以用废弃纤维素进行生产，所以更受关注。 生物质燃料乙醇的生产可以有四种形式：一是用玉米淀粉作原料发酵产酒精。 这样的酒精生产技术非常成熟。美国的玉米产量高，这个国家一直在作玉米产酒精 的生产研究。按美国的经验，玉米酒精的能量投入产出比在1 2 5 2 之间 ( h t t p ：w w w e t h a n 0 1 g e c o r g c o m _ e t h h t m ) 9 ，1 0 。二是各种非粮食作物，如木薯、 红薯等。在这些原料中，从粮食到非粮，原料能量密度越来越低。比如，3 3 吨玉米 可以生产1 吨燃料乙醇，生产同样重量的乙醇则分别需要7 吨木薯、1 0 吨红薯、1 5 吨一1 6 吨的甜高粱秆 3 利用宏基因组技术克隆和盈；定堆肥环境中的纤朔浔 酿翻& 因 ( h 郇：伽n 椭r f o o d q s c o m n e w s g n s p z s 0 1 2 0 0 7 1 0 1 7 1 3 4 9 4 1 8 4 0 h t m ) 。这意味着生产同 样的酒精，需要更多的非粮作物，投入的能量更多，那么非粮作物的这个能量投入 产出比要比玉米更低。目前的观点是，在中国的条件下非粮酒精的能量投入产出比 只有1 2 7 。三是蔗糖酒精。这个目前只有巴西进行了大规模生产。在巴西的条件下， 最好的能量比是8 。这个是目前得到的生物质能源中投入产出比最高的【1 1 】。但是值 得注意的是这样的能量比是在热带地区这样的高阳光辐射条件下得到的，其他地区 并没有可复制性。四是纤维素酒精。由于目前并没有工业化的纤维素酒精生产线， 目前没有一个定论的纤维素酒精的投入产出比统计值。而美国一项研究表明，使用 s w i t c h g r a s s 这种草作为纤维素酒精的原料得到的能量产出比是6 4 1 2 。而将来的纤 维素酒精使用各种粮食生产的副产品或废弃物进行生产，不需要专门的投入去生产 原料，因此大规模的纤维素燃料酒精的成本预计将非常低。( 能量投入产出比在这 里是指：计算蕴藏在生产得到的一吨酒精里的能量，这个是产出；投入是，为了发 酵酒精耗费的原料所蕴藏的能量，以及这个原料的种植、运输等环节耗费的能量) 根据国家的发展战略，生物燃料乙醇将是我们国家未来的一个重要能源。在2 007 年9 月4 日，国家发改委发布中国可再生能源中长期发展规划。规划 中提出，到2020 年，以能源作物为主要原料的燃料乙醇、生物柴油等生物液体 燃料将达到替代石油10o0 万吨的能力。因此，在我国也将逐渐形成以燃料乙醇 为主要运输动力能源的状况。 但是，目前世界各国的运输动力能源仍然是来自矿物质能源。显然进一步发展 生物质能源是一个急迫的任务，而纤维素燃料乙醇又是重中之重 1 3 ，1 4 。 1 1 2 纤维素能源利用的现代历史 纤维素能源利用的历史最早可以追溯到人类首次学会使用火。而在现代，利用 各种科学技术对纤维素能源进行利用研究的历程是随着石油价格的变化而变化的。 1 9 2 3 年，德国的费希尔和托普希发明了“费托反应 的技术，用来把煤炭一天 然气等转化为液体燃料，这样的技术也被用来将秸秆、木屑等生物质原料转化为液 体燃料。这样的技术在第二次世界大战期间，在德国得到了广泛的应用。这个应该 是最早的现代意义上的生物质能源的利用。但是这个“费托反应 的成本过高，而 4 利用宏基因组技术克隆和- x - 定堆肥环境中的纤维素备簪基因 且在反应中会产生大量的二氧化碳副产物 8 。因此这样的技术在世界上并没有大规 模应用。只是在特定时期，石油缺乏的情况下才得到应用。 而自从美国陆军在二次大战时期发现了里氏木霉的纤维素酶系统后，利用纤维 素酶进行纤维素的葡萄糖转化进而生产燃料乙醇的技术成为了科学研究和工业化研 究的热点。这个时候也恰逢中东国家的动荡时期，石油的生产不稳定，石油价格高。 寻找石油替代能源成为当时的研究热点，纤维素酶的发现引发了一轮燃料乙醇研究 热潮。 在里氏木霉酶降解技术研究的同时，前苏联也开展了纤维素的酸、碱降解研究， 并进行了小规模的产业化实验。 但是随着7 0 年代后期石油的价格下降，这些研究都被搁置下来。 近年来，由于石油储量的下降，以及人们对温室气体效应的担心，纤维素生物 质燃料又受到了重视。美国能源部生物质能源实验室投资2 0 0 0 万美元委托诺维信和 杰能科公司研发新一代的纤维素酶。按美国能源部公布的消息，这个计划的研究获 得了巨大的进展。他们成功的使纤维素酶的使用成本降低了3 0 倍。利用这样的纤维 素酶生产的酒精价格是( 0 1 0 1 8 美元每加仑) ，这样的价格已经可以和石油的 价格相持平 1 5 。但是，值得注意的是，有人认为美国能源部的这个研究只是针对 经过特定处理的纤维素得到的结果，并没有普遍性 1 6 。 同时在现在，各种针对新的纤维素降解微生物、新的纤维素酶和新的纤维素降 解方法的研究也层出不穷 1 7 2 0 。 随着研究投入的增加，人们对纤维素酶降解纤维素的机制的理解不断加深。直 到2 0 0 6 年，新的纤维素降解、利用和发酵研究机理也有见报道 2 1 ，2 2 。 1 1 3 纤维素能源利用面对的难题 纤维素能源面对的最大难题就是纤维素的降解问题。将天然结晶纤维素高效降 解成葡萄糖一直是一个理论上和技术上的难题 2 3 2 6 。 利用宏基因组技术克隆和鉴定堆肥环境中的纤维素酶基因 a b 图l l 纤维素的结构 1 6 】 a ：纤维素的组成成员一纤维二糖多聚物链；b ：纤维素的晶体结构 f i g u r e1 - 1 t h es t r u c t u r e o fc e l l u l o s e 1 6 l a ：p o l y m e ro fg l u c o s e - t h ec o m p o n e n to fc e l l u l o s e ：b ：t h ec r y s t a l l i n es t r u c t u r eo f c e l l u l o s e 纤维素是由吡喃型- d - 葡萄糖通过1 3 1 ，4 糖苷键连接而成纤维二糖，纤维二糖 再组成的多聚物，纤维素一般由7 ，0 0 0 1 5 ，0 0 0 个葡萄糖组成。在纤维素中，葡萄 糖的吡哺环平面之间通过氢键面对面的堆积在一起，从而使纤维素形成了紧密结合 的晶状结构( c r y s t a l l i z a t i o n ) 。图1 1 中a 示出葡萄糖形成的多聚体长链，b 示出这个 长链经由吡喃环平面紧密结合形成的晶状结构。而葡萄糖链依次组成原纤维 ( e l e m e n t a r yf i b r i l ) 、微细纤维( m i c r o f i b r i l ) 、细纤维( f i b r i l ) ，细纤维再集合成纤 维 1 6 】。 在纤维素的纤维之间，杂合有半纤维素和木质素。半纤维素是由数种不同的单 糖构成的异质多聚体，这些糖是木糖、阿伯糖、甘露糖和半乳糖等五碳糖和六碳糖， 5 0 0 - - 3 0 0 0 个这些糖由糖苷键连接形成长链，而且还有支链的形成，从而组成了一 个网络状的多聚物 2 7 ，2 s 。而木质素是结构更为复杂的有机化合物，木质素是由 四种醇单体( 对香豆醇、松柏醇、5 一羟基松柏醇、芥子醇) 形成的一种复杂酚类聚 合物，可以把木质素看成是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，分 子量一般在1 0k d a 以上。木质素是一个不定型的大分子，不同来源的木质素的结构 是不同的，分子大小也是不同的 2 9 ，3 0 。它与纤维素、半纤维素一起，形成植物 骨架的主要成分。木质素和半纤维素杂合在纤维素的各种细纤维间，互相紧密结合。 6 月女 i 自* z 4 z * 十* 4 t h 目 形成了对纤维素的一种保护层( 见图1 - 2 ) 。同时纤维素内部除了紧密的晶体结构以 外，也有排列散落的非结晶区，这些非结晶区容易被水侵入，是属于可以“溶解” 的区域。这些区域相对来说容易被化学作用和酶作用破坏。 a bcd 学秽嘎 图1 - 2 植物细胞壁中生物质的分靠 a 整体结构b 示意半纤维索成分c 不意小质素成分d 示意纤维素成分 ( 陶片来游rh t t p ：l l w w wo g r e sn e f i a b o u t u s a b o u t u s b i o f u e l sc 日b oh t m l ) f i g u r e l - 2 t h eb i o m a s s i np l a n tc e l l w a l l aw h o l es t r u c t u mbs e m i c e l l u l o s ecl i g n i ndc e l l u l o s e f t h i sf i g u r ew 鹅f r o mh t t p ：l l w w wg e r c sn e f i a b o u t u s a b o u t u s b i o f u e l s - c “b oh t m l l 纤维索的晶状结构非常紧密，有很强的抗机械、化学作用的能力。而且这个致 密的晶状体阻碍了水分子的渗透，以及半纤维素和木质素的隔绝导致水解酶无法 接触到多聚物的0 一l ，4 糖苷键。这就是纤维素在自然界中很难被降解的原困 1 6 ， 3 1 3 2 。 要对纤维素进行降解利用，就必须找到合适的方法破坏这个晶体结构。 利用宏基因组技术克隆和鉴定堆肥环境中的纤维素酶基因 1 1 4 纤维素酶在纤维素能源利用中的作用 纤维素的性质很稳定，不溶于水，在常温下不发生水解，在高温下水解也很慢。 目前发现，有两种工艺可以有效的降解纤维素：一是酸水解工艺，另一种是酶水解工 艺 3 3 。 酸水解工艺是利用浓酸或稀酸浸泡粉碎的纤维素颗粒。溶液中的氢离子可和纤 维素上的氧离子相结合，导致b - 1 ，4 糖苷键不稳定，纤维素长链断裂。为了使酸水 解反应能顺利进行，一般是采取在1 0 0 - - 2 0 0 。c 进行反应。酸水解工艺可以完全水解 纤维素，得到1 2 一1 5 浓度的糖液。结合酸回收步骤，如离子排斥法等分离方法， 可以得到纯度9 8 以上的糖。但是酸水解工艺的缺点也是非常明显：酸水解不但降 解纤维素，也降解葡萄糖，并且有醋酸等副产物生成，这些副产物严重的抑制后期 的发酵过程。所以酸水解工艺都需要多加一个酸回收步骤，回收酸并纯化产物。此 外酸水解工艺对设备要求高，产生的废酸对环境的污染非常大。因此酸水解工艺在 纤维素酒精生产中并不受重视 8 。 酶水解工艺是利用纤维素酶直接在常温下酶水解纤维素。它具有非常突出的优 点：在常温下进行，过程耗能少，没有化工处理过程中的废糖副产物，水解产物不 需提纯。酶水解工艺没有环境污染，不需考虑各种化工处理过程中使用的各种试剂 的回收利用和无害化处理 3 ，3 4 。 1 2 纤维素酶的研究进展 1 2 1 微生物的纤维素酶 游离组分形式 在好氧微生物中所发现的纤维素酶都是以单个酶的形式行使作用的( 图卜3 a ) 。 这些酶分泌到细胞外，每个酶都是呈现游离的方式( 这里包含了两层意思，一是游 离于细胞；二是酶和酶之间互相游离) 行使酶水解功能。通过各个酶之间的协同作 用，把纤维素降解成葡萄糖 3 5 ，3 6 。 8 利用窜基目蛆拄丰克陆和鉴定堆肥环境中的纤雎素辞墓目 纤维素酶小体 大部分厌氧菌的纤维索酶毗一种特殊的形式结合在一起，所有的和纤维素降解 有笑的各种酶互相组合成为一个超分子体系，称为纤维素酶小体( c e l l u l o s o m e ) ( 圈 1 3 b ) 。纤维素酶小体由一个叫s c a f f o l d i n 的支架蛋白质和各种与纤维素水解有关的 酶结合而成。支架蛋白质这个基座提供了各个酶结合在一起的基础，在这个蛋白质 的上面有很多的叫c o h e s i n 的结合位点；而在纤维索酶小体罩的各种纤维索水解酶蛋 白都具有d o c k e f i n 的蛋白质区域，这个区域可以和c o h e s i n 结合位点结合，从而把纤 维素水解酶蛋白固定到支架蛋白质上 3 7 3 8 1 。 a * q 一分“ - 一一 o “”5 蜘器黼” 8 m ”l 黜茹铲 8 蹄螺嚣邑勰一e 一 口一_ 占器蹬。署”。8 一 凸“m m 一m m 【c b m ) 图13 好氧卣和厌氧菌的纤维素酶系统的区别1 3 1 l a 女r 年【曲的游离纤维索酶；b ：厌氧茸的纤维素酶小体 f i g u r e1 - 3d i f f e r e n c e si no f c e l l u l a s es y s t e mb e t w e e na e r o b i ca n da n a e r o b i c m i c r o o r g a n i s m s 3 1 a n o n c o m p l e x e dc e l l u l a s es y s t e mo f a e r o b i c r ”r g 肌1 s m s ；bc e l l u l o s o m e o f a n a e r o b i cm i c r o o r g a n i s m s 广西大学博士掌位论。文利用宏基因组技术克隆和鉴定堆肥环境中的纤维素萄 基因 1 2 2 纤维素酶的家族分类 由h e n r i s s a t 倡导，根据糖苷水解酶蛋白质序列的差异和作用方式的不同，对糖 苷水解酶进行分类 3 9 4 1 】。这样的分类方式大大方便了对糖苷类水解酶的研究，获 得了广泛的认同。根据这个分类方法( h t t p ：w w w c a z y o r g f a m a c c _ g h h t m l ) ，纤 维素酶按蛋白质序列和作用方式的不同在1 1 0 个糖苷水解酶家族中( 实际列出1 1 2 个，其中2 个被取消) 占有2 2 个家族。内切酶分布于十四个家族( 家族5 、6 、7 、 8 、9 、1 0 、1 2 、2 6 、4 4 、4 5 、4 8 、5 1