（基础兽医学专业论文）几种动物Musclin基因的克隆与表达.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论几种动物m u s c l i n 基因的克隆与表达 学位 硕士 文题目 级别 学生 王伟杰 学科导师 姓名专业 基础兽医 杨国宇 姓名 学位论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 。 研究生签名：乒纬生新躲哆璐 日匆咖年( 夕月n 日日期： d ，髫 6 月o 日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 l 囱，二jj 研究生签槲t 翩虢冷瞒学院领导签穹面善； l 玉一m： ：二。 r 短棚彩月向同期渺z 月同 同期：渐臼 t f l 致谢 本研究及学位论文是在导师杨国宇教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。导 师严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励 着我。从课题的选择到研究的最终完成，杨老师都始终给予我悉心的指导和不懈 的支持。三年来，导师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给 我以无微不至的关怀，在此谨向恩师致以诚挚的谢意和崇高的敬意! 在论文的完成过程中，得到导师杨国宇教授、王月影副教授、韩立强老师、 对我的指导和帮助，在此致以最诚挚的谢意! 特别感谢中心实验室的周青云老师、卫丽老师给予的热心帮助! 感谢和我一起做试验，一起探讨问题的李卫华、林茂旺、都军霞同学! 感谢张小强、王东方、郭小参等牧医工程学院全体2 0 0 5 级研究生! 感谢师姐惠永华、张岚，师兄胡广超，师弟张志强、台玉磊、卫学青，师妹 王静、武字晓、臧猛等在我实验和学习过程中给予的无私帮助。 借此机会，向我的父母表示最深情的谢意，焉得谖草，言树之背，养育之恩， 无以回报，你们永远健康快乐是我最大的心愿! 在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完 成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的 谢意! 再次感谢以上各位以及由于本人疏忽未提到的亲人、同学和好友! 感谢所有 给予我帮助的人们! 王伟杰不同动物m u s c l i n 基因的克隆与表达 摘要 为了研究m u s c l i n 在畜禽骨骼肌中的作用，本文以猪、鸡、牛、羊和兔为研究对象，依 据报道的人、小鼠和大鼠m u s c l i n 基因序列对猪、牛、羊、兔和鸡的e s t s 库和u n i g - e n e 进行 搜索，利用搜索的e s t s 拼接序列设计引物进行r t - p c r ，成功克隆了各种动物的m u s c l i n 基因。 最后选择猪的m u s c l i n 基因进行原核表达、蛋白纯化和w e s t e r nb l o t t i n g 鉴定。主要结果如下： 羊m u s c l i n 基因的克隆与序列分析 克隆的羊m u s c l i n 基因包含一个完整的开放阅读框架( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) ，全长 为4 1 3 b p ，编码由1 3 2 个氨基酸残基组成的m u s c l i n 前蛋白，其中酸性氨基酸为1 9 个，碱性氨 基酸为2 4 个，分子量为1 4 5 3k d a ，等电点为1 0 9 2 6 。预测的信号肽区为2 7 2 8 个氨基酸成 熟的m u s c l i n 由1 0 4 - 1 0 5 个氨基酸组成。通过预测的氨基酸序列分析，在序列中含有“k k k r ” 结构和与小鼠a n p 、b n p 、c n p 蛋白的同源性区域。 兔m u s c l i n 基因的克隆与序列分析 克隆的兔m u s c l i n 基因包含一个完整的开放阅读框架，其全长为4 0 9 b p ，编码有1 3 2 个氨基 酸。克隆的m u s c l i n 基因与小鼠、大鼠、人、猪和鸡的同源性分别为7 8 2 、7 9 、8 7 9 、 9 8 2 和4 6 7 ，推测的氨基酸序列同源性分别为7 3 1 、7 4 2 、8 7 9 、9 6 2 和5 6 8 。 氨基酸序列含有“k k k r ”结构和与小鼠a n p ，b n p ，c n p 蛋白的同源性区域。 鸡m u s c l i n 基因的克隆与序列分析 克隆测序结果表明，克隆的鸡m u s c l i n 基因序列中包含了完整的o r f ，其o r f 长度与 人基因一致( 4 0 2 b p ) 。基因序列与哺乳类人、大鼠、小鼠相比较，同源性分别为7 4 ，7 3 ， 7 0 。鸡m u s c l i n 推测编码氨基酸序列长度为1 3 3 a a ，s i g n a l p 预测信号肽为n 一端l 一3 0 a a ，氨 基酸序列中含有“k k k r ”结构和与小鼠a n p ，b n p ，c n p 蛋白的同源性区域说明鸡m u s c l i n 结构特征与人、大鼠和小鼠m u s c l i n 相一致。氨基酸序列与哺乳类人、大鼠、小鼠的基因相 比较，同源性分别为5 8 ，5 4 ，5 0 。 牛m u s c l i n 基因的克隆与序列分析 克隆的牛m u s c l i n 基因包含一个完整的开放阅读框架( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) ，全长 为4 1 3 b p ，编码由1 3 2 个氨基酸残基组成的m u s c l i n 前蛋白，其中酸性氨基酸为1 9 个，碱性氨 基酸为2 4 个，分子量为1 4 5 3k d a ，等电点为1 0 9 2 6 。预测的信号肽区为2 7 2 8 个氨基酸成 熟的m u s c l i n 由1 0 4 - 1 0 5 个氨基酸组成。通过预测的氨基酸序列分析，在序列中含有“k k k r ” 结构和与小鼠a n p 、b n p 、c n p 蛋白的同源性区域的结构特征。牛m u s c l i n 基因预测的氨基 酸序列与人、大鼠、小鼠、猪和鸡的同源性分别为9 3 2 、8 0 3 、7 8 5 、8 4 1 和6 0 6 。 其中牛的信号肽与人、大鼠、小鼠、猪和鸡的同源性分别为8 9 3 、8 4 6 、8 0 8 、8 2 1 和3 5 7 。牛的成熟肽与人、大鼠、小鼠、猪和鸡的同源性分别为9 3 3 、7 8 8 、7 6 、 8 4 6 和6 7 6 。 猪m u s c l i n 基因的克隆与序列分析 电子克隆后序列长度6 5 1 b p 。0 r f 开放阅读框分析表明，开放阅读框长3 9 9b p ( 5 4 - 4 5 2b p ) 编码1 3 2 个氨基酸。与人、小鼠和大鼠的骨骼肌肌肉素基因c d n a 编码区有较高同源性，同 源性分别为8 7 2 、7 7 6 和7 7 9 。猪肌肉素推测编码氨基酸序列长度为1 3 2 a a ，s i g n a l p 预测信号肽为n 端1 2 7 a a ，氨基酸序列中含有“l ( 】 k r ”结构和与小鼠a n p ，b n p ，c n p 蛋白 的同源性区域说明猪肌肉素结构特征与人、人鼠和小鼠肌肉素相一致。与人、小鼠和人鼠的 骨骼肌肌肉素蛋白序列同源性分别为8 7 1 、7 2 3 和7 2 7 。在开放阅读框两端设计特异 引物，以胃骼肌总m r n a 为模板进行r t p c r 实验验证，结果与电子克隆结果完全一致。将 构建好的原核表达载体转入b l 2 1 人肠杆菌中进行表达，表达的蛋向条带人约3 8 5 9k d a ，和 王伟杰不同动物m u s c l i n 基因的克隆与表达 2 预期融合蛋白g s t m u l i n 的分子量一致。通过w e s t c mb l o t t i n g 撇，证明得到的蛋白的 确是融合蛋白。 关键词：m u s c l i m 猪：鸡；牛；羊：兔；克隆；表达；纯化；鉴定 王伟杰 几种动物m u s l i n 基因的克隆与表达3 1 文献综述 骨骼肌是人体主要的运动器官，其运动和代谢功能主要受神经和体液因素的调节，是神 经系统和内分泌系统调控的重要靶器官。近年大量实验研究资料表明骨骼肌能表达、合成和 分泌多种生物信号分子，包括调节肽、细胞因子和生长因子等，以旁分泌和或自分泌方式 调节骨骼肌的生长、代谢和运动功能；甚至以血液循环内分泌的方式调节机体远隔器官组织 的功能。骨骼肌生成和分泌的活性物质在运动系统疾病和某些全身性疾病的发病中具有重要 的作用。因而有学者认为骨骼肌也是人体的重要内分泌器官【”l ，并且按其重量计算骨骼肌 约占人体体重的4 0 ，也可被视为人体最大的分泌器官。本文将对骨骼肌分泌的主要活性 物质及其生理和病理生理学意义进行综述。 1 1 骨骼肌分泌的活性物质 1 1 1 骨骼肌分泌的细胞因子 1 1 1 1 白介素- 6 ；( i n t e f l e u k i n - 6 ，i l - 6 ) ：o s t r o w s k i ( 1 9 9 8 ) 等对人肌肉进行活组织检查发现， 在静息状态时，骨骼肌的i l - 6m 鼬叮a 水平极低，而运动后骨骼肌i l - 6 的表达上升幅度高达1 0 0 倍，在大鼠也观察到同样的现象。j o n s d o t t i r ( 2 0 0 0 ) 等利用电击诱导一侧大鼠后肢肌肉收缩， 不管向心性还是离心性肌肉收缩均引起骨骼肌1 i , - 6m r n a , - g 平显著升高，而静止侧的后肢则 无变化，提示运动时1 1 _ , - 6 的产生只在收缩的肌肉增多，并非整体效应。k e l l e r 等提取活检的 骨骼肌组织的细胞核，发现运动后骨骼肌细胞i l - 6 基因的转录速率显著增快，亦证实运动时 血浆i l - 6 水平的升高是由收缩的骨骼肌产生的。 骨骼肌合成、分泌的i l 广6 参与了机体能量代谢【4 】。甚至有学者认为骨骼肌来源的1 i - 6 起 着能量感受器的( e n e r g ys e n s o r ) 作用。骨骼肌收缩时，肌糖元含量下降诱导了1 0 6 的表达上调 j ，而i i 6 的表达上调促进运动的肌肉葡萄糖摄取增加。生理剂量的i l - 6 对机体糖代谢的影响 不显著，但运动诱导的i l - 6 的大量表达对运动时机体糖代谢稳态的调节有积极意义。l l 广6 还 有强大的促脂肪分解作用，给大鼠注射i l - 6 后呈剂量依赖地升高血浆脂肪酸和甘油三酯的浓 度。此外，运动诱导的i l 0 6 的高表达还是运动发挥抗炎作用的主要介质j 。i i , - 6 抑制肿瘤坏 死因子a 的表达，同时促迸其他抗炎因子l - l - i r a 和i l - 1 0 的作用，在与慢性炎症相关的疾病如 动脉粥样硬化、糖尿病等的发生中有重要的防治意义1 5 。 1 1 1 2 肿瘤坏死因子a ( t n f - a ) ：t n f a 是一种前炎症因子，以往认为其主要由巨噬细胞分 泌，具有刺激脂肪分解和抑制糖元合成等异化作用。近来有研究表明脂肪细胞也表达t n f - a ， 并且在肥胖的人群和啮齿类动物中脂肪细胞的肝a 呈高表达( h o t a m i s l i g i l 1 9 9 4 ) 。利用可 溶性t n f - a 结合蛋白( s o l u b l et n f - ab i n d i n gp r o t e i n ) 作为其抑制剂注射人肥胖动物模型f a f a 小鼠后，发现脂肪组织和骨骼肌的胰岛素敏感性显著升高，提示在骨骼肌中可能也有t n f - a 的分泌。s a 曲i z a d e h ( 1 9 9 6 ) 等刚r t - p c r 的方法证实在人、人鼠骨骼肌和培养的成肌纤维、人 骨骼肌细胞都有t n f a 的表达，w e s t e r nb l o t 检查也表明在培养的骨骼肌细胞有t n f a 的表 达。 王伟杰几种动物m u s c l i n 基因的克隆与表达 4 t n f - a 不仅是炎症介质，且在机体能量代谢中也有重要意义。研究发现在肥胖、胰岛素 抵抗及糖尿病的人群，骨骼肌t n f - a 的表达水平显著上调。t n f - a 降低葡萄糖转运蛋白 g l u t 4 的表达( s t e p h e n s 1 9 9 1 ) ，抑制胰岛素受体底物磷酸化，以自分泌方式在骨骼肌的胰 岛素抵抗中发挥重要作用。 1 1 1 3 胰岛素样生长因子( i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r - 1 ，i g f - 1 ) ：i g f - 1 是一种生长因子，主要 由肝脏合成、分泌，能有效地刺激肌肉体积的增大。t u r n e r 等( 1 9 8 8 ) 发现，生长激素( g i - 0 不 仅刺激肝脏i g f - 1 的表达，还能促进骨骼肌i g f - i 的表达有学者报道骨骼肌i g f - 1 的表达和 分泌对骨骼肌肥大更有意义，在肝脏特异性的缺失i g f - 1 基因的小鼠，虽然循环血液中i g f - 1 的含量下降t 8 0 ( y a k a r 1 9 9 9 ) ，但骨骼肌的体积并未改变，提示骨骼肌自身合成的i g f - 1 对肌原纤维的肥大有实质性的作用【6 】。 在炎症、外伤及肿瘤的恶液质等消耗性疾病时。骨骼肌i g f - 1 表达均下调。反之骨骼肌 局部过表达i g f 1 则会诱导肌肉肥大( c o l e m a n 1 9 9 5 ，m u s a r o 1 9 9 9 ) 。i g f - 1 通过多种途径 促进骨骼肌肥大：i g f 1 延长肌肉干细胞的复制寿命( c h a k r a r a r t h y 2 0 0 0 ) ，保护衰老骨骼肌 的肥大和再生能力等；最重要的是i g f 1 促进骨骼肌蛋白质的合成、抑制蛋白质的降 解( b a r k 1 9 9 8 ，f r o s t 1 9 9 9 ) 。i g f - 1 促进骨骼肌纤维体积的增加，而非肌纤维数目增多。 骨骼肌合成和分泌i g f - 1 的作用在骨骼肌萎缩性疾病的防治中具有积极的意义。 除了上述三种细胞因子之外，骨骼肌还表达有白介素1 和白介素1 5 等多种细胞因子。 p e t e r s e n 等【5 1 将骨骼肌合成和分泌、并作用于其他器官的细胞因子命名为肌肉因子 ( m y o k i n e s ) ，认为这些物质不仅参与了运动对健康的多种有益效应，并且在与慢性炎症相关 的疾病如动脉粥样硬化、糖尿病等的发生中可能也有重要的防治作用。 1 1 2 骨骼肌分泌的脂肪因子 1 1 2 1 瘦素( 1 e p t i n ) ：瘦素是1 9 9 4 年从脂肪细胞中分离出的一种活性物质，在正常小鼠，瘦 素有减少摄食、减轻体重的作用；在肥胖小鼠外源性给予重组的瘦素则增加能量消耗，升高 血浆胰岛素和葡萄糖水平。骨骼肌不仅存在有瘦素受体，w a n g 等( 1 9 9 8 ) 的研究还发现骨骼 肌组织有瘦素的表达，葡萄糖胺可以迅速促进骨骼肌瘦素基因高表达及瘦素蛋白水平的升 高。 骨骼肌生成瘦素的意义尚不清楚，已知瘦素对骨骼肌代谢有多种作用。m u o i o 等( 1 9 9 7 ) 研究表明大鼠给予瘦素后，其骨骼肌脂肪酸氧化增强，脂肪酸合成甘油三酯减少。瘦素对骨 骼肌糖代谢有类似于胰岛素的作用( c e d d i a 1 9 9 9 ) ，瘦素刺激c 2 c 1 2 细胞葡萄糖的摄取，长 期给予瘦素使胰岛素诱导的骨骼肌的葡萄糖摄取和转运增强，骨骼肌糖元合成及乳酸生成增 加，此外瘦素还能改善骨骼肌的胰岛素反应性。c a r b o 等( 2 0 0 0 ) 报道了瘦素对骨骼肌肌纤维 的蛋白质的合成有显著的抑制作刚。可见，瘦素对骨骼肌糖、脂及蛋白质代谢都有重要的凋 ：诲意义。 1 1 2 2 脂联素( a d i p o n e c t i n ) ：脂联素是由脂肪组织分泌的小分子蛋向质，参与糖脂代谢调1 y 、 王伟杰几种动物m u s c l i n 基因的克隆与表达 5 具有抗动脉粥样硬化及抗糖尿病等效应。d e l a i g i e 等【7 l 研究表明小鼠注射脂多糖2 4 小时后， 胫前肌脂联素的表达升高近l o 倍，脂联素含量升高7 0 。在干扰素吖和t n r f - a 共同孵育c 2 c 1 2 细胞4 8 , 1 , 时后，呈现时间和浓度依赖的脂联素表达和分泌水平的升高，免疫组化结果表明骨 骼肌中脂联素主要位于肌纤维膜上f 7 】。脂联素能诱导脂肪细胞快速分化，在完全分化的脂肪 细胞，过表达脂联素使细胞内的脂滴的数量增多，体积增大，并同时促进g l u t 4 的表达和 转位骨骼肌也是脂联素作用的靶器官，骨骼肌富含脂联素的i 型受体和中度表达i i 型受体 ( s t a i g e r 2 0 0 4 ) ，表明脂联素可以自分泌方式发挥调节作用，但骨骼肌源的脂联素对骨骼肌 脂代谢的调节作用还未见报道。 此外，有报道骨骼肌还能合成和分泌纤溶酶原激活物抑制剂i ( p a i 1 ) 【9 1 ，但其生理和病 理生理意义尚不清楚。 1 1 3 骨骼肌分泌的肌肉因子 1 1 3 1 肌肉抑制素( m y o s t a t i n ) ：肌肉抑制素是肿瘤生长因子( t u m o rg r o w t hf a c t o r - b ，t g f - b ) 超家族中的成员，最初由p h e r r o n 等于1 9 9 7 年在小鼠骨骼肌内发现。研究表明，肌肉抑制素 在人及鼠、猪、牛、鸡等脊椎动物体内均有表达，且高度保守。在胚胎期骨骼肌发育的整个 过程中均有肌肉抑制素表达，在成年动物，几乎所有的骨骼肌都表达肌肉抑制素，并且经血 液循环至全：身( m c p h e r r o n 1 9 9 7 ) 。 肌肉抑制素是骨骼肌生长的负调控因子，在肌肉抑制素基因敲除的小鼠出现肌纤维增生 和肥大。研究表明肌肉抑制素对发育过程中肌纤维的最终数目及出生后肌纤维的生长有直接 调节作用( m c p h e r r o n 1 9 9 7 ) ，有人认为肌肉抑制素是促进肌肉生长及再生的首选药物 ( w a g n e r z ) o s ) 。z h a o 等 1 0 】在高脂饮食( 4 5 的能量由脂肪提供) 喂养的骨骼肌特异表达肌肉 抑制素前体基因的转基因小鼠发现，肌肉抑制素的功能被显著抑制，并且与高脂喂养的野生 型小鼠相比，转基因小鼠的血糖水平、胰岛素敏感l 生均显著改善。此外，肌肉抑制素对脂 代谢及脂肪组织的功能也有强大的调节作用：在过表达肌肉抑制素的成年小鼠表现出整体的 衰竭综合征( s y s t e m i cw a s t i n gs y n d r o m e ) ，除肌肉体积剧烈减少外，脂肪组织体积也大幅度减 少；在肌肉抑制素基因敲除的纯合子小鼠也出现了脂肪组织体积显著下降的状况【1 l 】。l e e 等 【1 2 】认为上述情况主要是因肌肉抑制素的作用方式不同导致的，前者是肌肉抑制素的直接作 用，后者则是肌肉抑制素间接作用的结果。 l 1 3 2 肌肉素( m u s c l i n ) ：肌肉素是日本学者n i s h i z a w a 等1 1 3 j 于2 0 0 4 年利用信号序列捕集技术 在小鼠骨骼肌中新发现的小分子蛋白质。n o r t h e r nb l o t t i n g 结果表明肌肉素的m r n a 仅特异表 达于骨骼肌。在成肌细胞系c 2 c 1 2 细胞，利州免疫沉淀和w e s t e r nb l o t t i n g 技术在其细胞裂解 液和培养基质中都检测到了分泌的肌肉素蛋向。骨骼肌分泌肌肉素的生理意义还不清楚，可 能参与了骨骼肌的糖代谢调节【”l 。在链脲霉素诱导的i 型糖尿病小鼠，腓肠肌肌肉素的m r n a 水平显著降低。而在i i 型糖尿病小鼠模型上则观察到腓肠肌肌肉素表达显著升高。在c 2 c 1 2 细胞上，肌肉素明显地抑制胰岛素促进的葡萄糖的摄取及糖原的合成。转染肌肉素的腺病毒 王伟杰几种动物m u s c l i n 基因的克隆与表达 - 6 - 可引起小鼠血浆肌肉素蛋白水平升高，并且小鼠脂肪组织体积明显下降，提示骨骼肌分泌的 肌肉素可能对脂肪组织的代谢有调节 作用。 1 1 4 骨骼肌分泌的心血管活性物质 1 1 4 1 血管紧张素i i ( a n g i o t e n s i ni i ，a n g i i ) ：a n g i i 是缩血管物质，并且对心室重塑和血管平 滑肌的增殖均有促进作用。在心血管和脂肪组织均有独立的局部肾素血管紧张素系 ( r e n i n a n g i o t e n s i ns y s t e m ，g a s ) 存在。j o n e s 等【1 4 1 报道，在骨骼肌也存在独立的r a s ，包括肾 素、血管紧张素及血管紧张素转换酶( a n g i o t e n s nc o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 。d a n s e r 等( 1 9 9 2 ) 从猪的左心室恒量注射1 2 5 l - a n g l ，检测流经骨骼肌血管床后静脉血中a n g i 和a 卫g i i 水平，发 现1 血q a 6 7 的a n g i 和5 9 的p m g 是骨骼肌产生的，表明骨骼肌能合成和分泌a m g 。 在骨骼肌，a n 醴i 具有促进细胞肥大、增殖和增强肌力的作用。h l a i n g 等【1 5 】报道，a 蝉皿 浓度依赖地刺激肌原细胞c 2 c 1 2 细胞的肥大；g o r d o n 等( 2 0 0 1 ) 利用超负荷诱导骨骼肌肥大时 发现，由a n - i 的l 型受体介导a n g i i 的效应，a c e 抑制剂及a t 1 受体阻断剂都显著抑制超负荷 诱导的跖肌和比目鱼肌的肥大。但在充血性心衰患者或老年性肌肉萎缩患者，使用a c e 抑制 剂r a t - 1 受体阻断剂则能显著改善肌萎缩和肌肉力量的下降。s o n g 等 1 6 】研究表明a n g 显著 下调骨骼肌的蛋白激酶b 磷酸化和增加c a s p a s e 3 活性，导致肌动蛋白裂解，促进骨骼肌细胞 凋亡的发生。可见。在不同的生理和病理情况- f a n g l i 对骨骼肌萎缩或肥大的调节作用并不 相同。 a n g i i 在骨骼肌糖摄取中也有重要调节作用，不管是其受体阻断剂，还是其转换酶抑制剂 均能有效的增强骨骼肌对胰岛素的敏感性。s h i u c h i 等( 2 0 0 4 ) 研究表明，a ，r - 1 型受体阻断剂显 著增强骨骼肌对2 砸】脱氧葡萄糖的摄取，并发现胰岛素诱导的g l u t 4 转位增多；h e n r i k s e n 等( 1 9 9 9 ) 研究发现a i 理抑制剂能有效促进胰岛素抵抗大鼠骨骼肌葡萄糖的摄取，对其机制研 究认为a c e 抑制剂一方面可抑制a ni 的生成，另一方面激活缓激肽，通过其2 型受体，促进 n o 生成，增强骨骼肌对葡萄糖的转运能力。 s t r a z z u u o 等( 1 9 9 9 ) 发现成熟脂肪细胞产生的a m g n 能抑制前脂肪细胞的分化，从而降低 脂肪组织脂质储存的能力，体内多余的脂肪便会在肝脏和肌肉中储存，引起胰岛索抵抗的发 生，而g o o s s e n s 等( 2 0 0 4 ) 的研究则认为a n g l i 在骨骼肌亦有抑制脂肪分解的作用。 可见，a n g l i 对骨骼肌肥大、骨骼肌糖脂代谢均有显著的调节作用，但骨骼肌分泌的a n g l l 对全身机体的作用还不明确。 1 1 4 2 a p e l i n ：a p e l i n 是t a t e m o t o 等利用反向药理学的方法从牛胃的分泌物中提取并纯化出 的g 蛋白偶联受体a p j 的天然配体，其前体为含7 7 个氨基酸残基多肽。a p e l i n 具有增强心肌 收缩力、舒张血管、降低血压、利尿( 减少抗利尿激素释放) 、调节摄食、摄水、乖体激素释 放和生物一肖律等多种生物学效应。a p e l i n 及其受体在体内分布j 泛，如胃、肺脏、心脏、肾 脏、卵巢、脑、脂肪细胞等。0 c a r r o l l 等【l7 】利n o r t h e r nb l o t t i n g 的方法证实在骨骼肌有a p e l i n 王伟杰几种动物m u s c l i n 基因的克隆与表达7 及其受体a p j 的高表达。 最近研究发现a p e l i n 也是一种代谢激素，在脂肪细胞有a p e l i n 的表达，并且在肥胖、胰岛 素抵抗等代谢性疾病时，a p e l i n 水平发生了很大的变化。此外邸e i i n 还是一种免疫调节肽， 可通过与其受体棚结合抵抗病毒的入侵，抑制淋巴细胞胆碱能活性，参与免疫缺陷疾病和 获得性免疫缺陷综合征( a c q u i r e di m m u n ed e f i c i e n c ys y n d r o m e ，a i d s ) 的免疫反应。骨骼肌表 达a p e l i n 及其受体a p j 的意义尚未见报道，推测对骨骼肌脂代谢及炎症反应亦可能有调节作 用，尚需实验验证。 1 1 4 3 生长素( g h r e l i n ) ：生长素是生长激素促分泌素受体( g h s - r ) 的内源性配体，能刺激垂 体分泌生长激素。生长素也是一种心血管调节肽。具有维持动脉血压稳定、改善心功能和保 护心肌细胞等作用在不同种属动物的中枢神经系统如下丘脑、垂体、脑干及周围组织如 心肌、血管、肾和内分泌器官等都能分泌生长素。目前骨骼肌是否表达生长素还未见明确报 道，但骨骼肌高表达其受体g h s r 是生长素作用的靶器官。 生长激素能促进肌肉蛋白质的合成，增加萎缩肌肉的体积，改善肌肉功能等。x i e 等( 2 0 0 4 ) 给大鼠肌肉注射含全序列的猪生长素的e d n a ，发现在注射后2 0 天，血清生长激素的水平显 著升高，同时大鼠体重显著增加，提示在骨骼肌表达的生长素可以促进生长激素的合成和分 泌，促进骨骼肌肥大。 此外生长素能减少机体脂肪的利用，促进肥胖；但生长素对骨骼肌脂质代谢却有相反的 调节作用。b a r a z z o n i 等【1 9 l 研究表明，连续4 天皮下注射4 0 0 r i g 生长素后，大鼠腓肠肌甘油三 酯含量显著降低，线粒体氧化酶的活性显著增强，同时核转录因子过氧化物酶体增殖物激活 受体吖的表达增强，但对大鼠比目鱼肌的脂代谢没有影响，提示生长素骨骼肌脂代谢的调节 作用还与肌纤维类型相关。 1 1 4 4 内皮素( e n d o t h e l i n ，z o - 内皮素是人们熟知的心血管活性多肽，由血管内皮合成， 具有缩血管、促进细胞增殖等心血管效应。内皮素是否表达于骨骼肌还没有很明确的报道， 但文献报道内皮素受体a ( e a ) 在骨骼肌有高度表达。w i l k e s 等( 2 0 0 3 ) 研究发现，在离体孵 育的大鼠肌肉条用e t - 1 预处理1 小时后，胰岛素刺激引起的骨骼肌葡萄糖摄取下降2 3 ， 而利用e t a 受体阻断剂后，上述效应被阻断，提示e t - 1 通过e t - a ，受体发挥其作用。对 正常大鼠采用渗透泵给与e t - 1 5 天后，机体出现明显的胰岛素抵抗症状，并且分离出的比目 鱼肌对葡萄糖的转运能力显著降低，研究还发现e t - 1 的上述作用与胰岛素受体的级联反应 效应减低显著相关。 1 1 4 5 尾加压素i i ( u r o t e n s i ni i ，u i i ) u i i 含1 2 个氨基酸，在体内分布广泛，在脑、脾、小肠、 心血管系统均有表达，是一种强人的缩血管物质。e l s h o u r b a g y 等 2 0 】石开究表明在小鼠及猴的 骨骼肌均有u i i 及其受体的表达，并且骨骼肌表达的u i i 受体与1 2 5 i 标记的u i i 早高亲和力结合。 但骨骼肌表达u i i 的意义并不清楚。有研究报道，在糖尿病患者血浆u i i 水平显蔫升高，u i i 是否与骨骼肌胰岛素抵抗有关，还需研究证实。 王伟杰几种动物m u s c l i n 基因的克隆与表达 - 8 - 1 2 骨骼肌表达的活性物质的病理生理意义 长期以来，骨骼肌被认为是一种效应器官，接受神经和体液的调节，从上述归纳表明骨 骼肌也具有分泌活性物质的功能，不仅是效应器官，还是一种内分泌器官，其分泌的活性物 质不仅以旁自分泌的方式作用于肌肉自身、调节骨骼肌功能，还可通过血液循环作用于远 隔器官组织，调节机体功能。骨骼肌合成和分泌的活性物质主要有以下生物学效应： 1 2 1 对骨骼肌自身的作用 1 2 1 1 对骨骼肌萎缩或肥大的影响：很多疾病都会伴发骨骼肌萎缩，如癌症、艾滋病、心 衰及长期卧床患者，此外老年人还易发生骨骼肌的退行性萎缩，骨骼肌负荷下降可引起废退 性萎缩和骨骼肌营养不良性萎缩等。骨骼肌萎缩不仅使机体运动能力降低，还易诱导胰岛素 抵抗的发生。骨骼肌分泌的多种促肥大因子最终都通过上调i g f - 1 的表达刺激骨骼肌肥大； 而肌肉抑制素是骨骼肌特异分泌的生长负调节因子，在艾滋病、肿瘤等恶变质等状况时，其 表达和水平均升高，而在运动诱导的骨骼肌肥大时，肌肉抑制素的表达则显著下调。i g f - 1 与肌肉抑制素间的平衡决定了骨骼肌生长状态，骨骼肌自身分泌的因子已成为防治骨骼肌萎 缩的新靶点。 1 2 1 2 对骨骼肌糖摄取的影响：研究表明，胰岛素诱导的机体耱的摄取有7 5 由骨骼肌完 成，因此骨骼肌对糖的摄取异常会直接导致机体胰岛素抵抗的发生。骨骼肌对糖的摄取受多 种因素调节，如胰岛素、糖皮质激素等，骨骼肌分泌因子对骨骼肌自身的糖摄取也有重要的 调节作用。骨骼肌i l - 6 表达上调促进肌葡萄糖的摄取，并且i l - 6 还可抑制n 寸f a 的作用，改 善骨骼肌胰岛素抵抗。反之，肌肉素则抑制胰岛素促进的骨骼肌葡萄糖的摄取及糖原的合成。 此外a n g u 、内皮素也参与糖代谢的调节，但它们通过旁自分泌的途径直接调节骨骼肌糖 代谢的意义还需进一步证实。 1 2 1 3 对骨骼肌脂代谢的影响：对骨骼肌脂肪构成及含量的研究表明，筋膜下脂肪、肌间 隙脂肪及肌细胞内脂质均受骨骼肌分泌因子的调控，并与肥胖及胰岛素抵抗等代谢性疾病相 关。骨骼肌脂质分布与含量异常，即骨骼肌异位脂肪的过多沉积( 主要是沉积于肌间隙与肌 细胞内的脂肪) ，被认为是发生胰岛素抵抗的关键因素之一。骨骼肌源的i l , - 6 是一种强大的 促脂肪分解因子，生长素在骨骼肌能促进甘油三酯的分解，瘦素促进骨骼肌脂肪酸氧化，反 之，t n f - a 、a n g l i 对骨骼肌脂肪的异位沉积具有促进作用，可见，在骨骼肌存在一个调节 骨骼肌脂质代谢的平衡体系，纠正和维持这个体系的动态平衡可能对骨骼肌脂代谢异常有积 极的意义。 1 2 2 对其它器官组织功能的影响 1 2 2 1 对心血管功能的影响：骨骼肌分泌多种具有心血管调节作用的活性物质在生理情 况下，表达处在较低的水平，但在病理情况下，他们的表达有显著地改变，除对局部微血管 作刚外，对心脏和全身血管的调：肖作j 4 还未见报道，尚需进一步研究。 1 2 2 2 对脂肪组织脂质代谢的影响：骨骼肌分泌的活性物质参与了脂肪组织的脂质代谢调 王伟杰几种动物m u s c l i n 基因的克隆与表达 9 节。f e r n a n d e z - r e a l 等t g l 认为在骨骼肌和脂肪组织间存在“对话”( c r o s s - t a l k ) ，细胞因子e l - 6 、 1 n f - a 仅等在其对话中起主导作用。此外，a p e l i n 、脂联素等既是脂肪因子，又在骨骼肌表 达，他们在对话中也发挥作用。骨骼肌分泌因子和脂肪因子作为这两种组织间对话的信使， 共同调节这两种组织间代谢的稳态。 1 2 - 2 3 对骨质疏松的影响：研究表明，i g f - 1 对骨骼的生长发育以及维持骨量和骨密度具有 十分重要的作用，而i g f - 1 水平下降是导致骨质疏松的机制之动物实验和临床研究发现应用 i g f - 1 可以改善骨密度、有利于促进骨折愈合。骨骼肌与骨骼相互依存，骨骼肌分泌的活性 物质是否可以通过旁分泌的方式作用于骨骼，参与骨质疏松的防治呢? 目前还未见报道。 综上所述，骨骼肌分泌多种活性物质，具有内分泌功能，也是内分泌器官；并且就其质 量而言，骨骼肌可被认为是机体最大的内分泌器官。骨骼肌分泌的活性物质通过自分泌或旁 分泌途径主动调节骨骼肌的生长和运动及代谢功能；通过血液循环的分泌途径，参与其它组 织器官的功能调节。骨骼肌内分泌功能紊乱参与了运动系统和多种全身性疾病的发病过程， 可能成为这些疾病防治的新靶点，值得予以高度关注。 王伟杰几种动物m u s e l i n 基因的克隆与表达1 0 2 引言 继脂肪组织和血管的内分泌功能发现后，传统的内分泌概念被打破，推测分泌活性物质 的功能是各种组织细胞固有的生物学行为之一。近年来，许多试验研究表明骨骼肌能表达、 合成和分泌多种生物信号分子，包括调节肽、细胞因子和生长因子等，以旁分泌和或自分 泌方式调节骨骼肌的生长、代谢和运动功能，甚至以血液循环内分泌的方式调节机体远隔器 官组织的功能。因此提出了“肌肉因子( m y o k i n e s ) 的概念【2 1 1 。目前已证实骨骼肌分泌的细 胞因子有l l - 6 、t n f - a 、i g f - 1 、m y o s t a t i n 等【2 2 彩】。 m u s c l i n 是f 1 3 n i s h i z a w ah ，e ta 1 ( 2 0 0 4 ) t 2 1 j 利用信号序列捕集( s s t ) 技术，在小鼠骨骼肌发 现的一种新的活性多肽。小鼠、大鼠、人m u s c l i n 含有1 3 0 - - 一1 3 3 个氨基酸残基，分子量为1 1 k d a ，其n 端含有一个3 0 个左右氨基酸残基的信号肽，在c 末端还存在与利钠利尿肽家族高 度同源的蛋白质片段及“k k k r ”模序的丝氨酸蛋白酶切位点；小鼠m u s c l i n 的氨基酸序列与 入、大鼠的同源性分别为7 5 9 和9 0 2 。n o r t h e r nb l o t t i n g 结果表明，小鼠m u s e l i nm r n a 仅 特异表达于骨骼肌，m r n a 的表达受机体营养状况及胰岛素等激素水平的调节。b a n z e ts ，e t a 1 ( 2 0 0 7 ) 1 2 2 采用r e a l t i m ep c r 检测了m u 虻l i nm r n a 在大鼠骨骼肌中的分布及其与肌纤维 类型的关系，证实m u s c l i n 主要在快缩、糖酵解型( f a s t g l y c o l y t i cf i b e 0 肌纤维中表达，且随 着纤维类型的转换其表达量有所变化。 目前，尚未见有关于m u s e l i n 基因在畜禽方面的研究报道。本试验利用r t - p c r 技术克隆 了猪、鸡、牛、羊和兔的m u s e l i n 基因，并进一步设计了猪m u s c l i n 基因的表达引物，构建表 达载体p g e x 4 t - 1 m u s e l i n ，在b l 2 1 大肠杆菌中成功表达纯化了融合蛋i 刍g s t - m u s c l i n ，并 通过w e s t e r nb l o t t i n g 检测做了进一步的证明。 王伟杰几种动物m u s c t i n 基因的克隆与表达 3 材料与方法 3 1 羊m u s d i n 基因的克隆 3 1 1 材料与方法 3 1 1 1 仪器与试剂 主要仪器：温度梯度p c r 、电热恒温水浴锅、台式高速冷冻离心机、电热鼓风干燥箱、 三洋灭菌锅、制冰机、凝胶成像分析系统、超净工作台等；主要试剂：通用引物、反转录酶、 r n a 酶抑制剂、p m d l 9 - t 载体、d n t p - m i x 、t a k a r aa g a o s eg e ld n ap u r i f i c a t i o nk i tv e t 2 0 购于宝生物( 大连) 有限公司。动物r n a o u t 购于绵阳高新区天泽基因工程有限公。2 x t a q p c rm a s t e r m i x ( 含染料) 购于t i a n g e n 公司。实验样本来自郑州新大牧业有限公司提供的 大白和长白杂交的二元健康猪。 3 1 1 2m u s c l i n 基因的克隆1 3 9 4 3 ( 1 ) 引物设计与合成 依据牛电子克隆的o s t e o c r i n 基因序列( x m _ 5 8 8 3 9 0 ) 设计了上下游引物，分别为： f 1 ：5 c a c a a g a r g c t g g a c t l 3 旧a g a 丌 a g - 3 ： r 1 ：5 g g a 戊i c k 【 【a g c c r c i g g a a i ，i t g - 3 ； 引物在宝生物( 大连) 有限公司合成。 ( 2 ) 肌肉组织中总r n a 的提取 取o 1 9 羊的骨骼肌组织，采用r n ao u t 提取总r n a ，溶解于1 5 y ld e p c 水中备 用。 ( 3 ) r t - p c r 扩增 反转录体系：d e p c 水鲰l d n t p - m i x 铋l 、5 x a m vb u f f e r 舡l 、 o l i g od 1 8 ( 5 0 p m 0 1 ) 耻l 、r i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r ( 4 0 u l ) 耻l 、犁la m vr e v e r s e t r a n s c r i p t a s ex l ( s u a l ) 、t o t a lr n a 劫l 。反应程序为：2 5 c1 0m i n ，4 2 c6 0m i n ，7 2 ( 21 5 m i n ，后冰浴2m i n ，得到c d n a ，以此为模板进行p c r 扩增目的基因。反应程序为： 9 5 预变性5 m i n ，然后9 5 ( 2 交性3 0 s ，5 0 退火3 0 s ，7 2 延伸4 5 s ，最后7 2 延伸1 0 m i n 。p c r 产物用1 0 的琼脂糖凝胶电泳检测，用t a k a r aa g a o s eg e ld n ap u r i f i c a t i o nk i t v e r 2 0 进行纯化。 ( 4 ) d n a 序列测定 将p c r 扩增产物纯化后连接到p m d l 9 - t v e c t e r 上，转化到通c a c l 2 法制备的大肠 杆菌e s c h e r i c h i ac o l id h 5 a 感受态细胞。序列测定由北京三博远志生物技术有限公司完成。 ( 5 ) d n a 序列分析 在n c b i 网站中运行b l a s t 、s i g n a l p3 0s e r v e r 、d n a s t a r 及b i o x m 软件分析。 3 2 兔m u s c l i n 基因的克隆 3 2 1 材料与方法 王伟杰几种动物m u s c l i n 基因的克隆与表达 1 2 3 2 1 1 仪器与试剂 同3 1 1 1 3 2 1 2m u s c l i n 基因的克隆 3 9 - 4 3 ( 1 ) 引物设计与合成 依据大鼠的m u s c l i n 基因序列( n m _ 2 0 7 6 1 2 ) 设计了上游引物，牛电子克隆的o s t e o e r i n 基 因序列( x m _ 5 8 8 3 9 0 ) 设计了下游引物，分别为： f i ：5 a g 汀g c 肼a c r g g a g a i r ( g c - 3 ： r l ：5 g g a a k c 戌兀a g c c t i ：【i g g aa p r i g - 3 ： 引物在宝生物( 大连) 有限公司合成。 ( 2 ) 肌肉组织中总r n a 的提取 取0 i g 兔的骨骼肌组织，采用r n a o u t 提取总r n a ，溶解于1 5 z l d e p c 水中备用。 ( 3 ) r t - p c r 扩增 反转录体系：d e p c 水鲰l 、d n t p - m i x4 p l 、5 x a m vb u f f e r 铷l 、o l i g od ( d1 8 ( 5 0 p m 0 1 ) 耻l 、r i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r ( 4 0 u 比l ) 扯l 、弘la m v r e v e r s et r a n s c d p t a s ex l ( s u 比l ) 、t o t a l r n a 劾l