（园艺学专业论文）柠檬形克勒酵母349对柑橘意大利青霉抑菌机理的研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密否 如需保密，解密时间年月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特另0 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名： 罗丽 时间：2 口，。年二月8 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密，商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：罗丽 导师签名：触 签名日期：幻扣年二月易日 签名日期：幽c 口年6 月9 日 注：请将本表直接装订在学位论义的扉页和目录之问 华中农业人学2 0 1 0 届硕士学位论文 目录 摘要1 a b s t r a c t 3 1 引言5 1 1 柑橘产业状况5 1 2 柑橘采后主要病害5 1 2 1 柑橘采后损失及主要病害5 1 2 2 柑橘青霉病发病症状6 1 2 3 柑橘青霉病发病规律6 1 3 柑橘青霉病防治研究现状6 1 3 1 物理防治6 1 3 2 化学防治7 1 3 3 生物防治7 1 4 拮抗酵母菌作用机理的研究8 1 4 1 营养或空间竞争9 1 4 2 对病原菌的直接寄生作用1 0 1 4 3 诱导寄主产生抗性1 0 1 4 4 产生抗生性代谢物质1 1 1 5 课题来源及意义1 2 2 材料与方法1 4 2 1 拮抗菌1 4 2 2 病原菌1 4 2 3 供试果实1 4 2 4 培养基1 4 2 5 拮抗菌3 4 9 对柑橘意大利青霉作用1 4 2 5 1 离体条件下抑菌试验1 4 2 5 2 活体条件下抑菌试验15 2 6 营养竞争15 2 6 1 拮抗菌3 4 9 和病原菌在离体条件下的营养竞争作用1 5 2 6 。2 病原菌孢子活力检测16 柠檬形克勒克酵母( 3 4 9 ) 对柑橘意大利青霉抑菌机理的研究 2 6 3 拮抗菌3 4 9 和病原菌在活体上的营养竞争作用1 6 2 6 3 1 不同外源营养物质对拮抗作用的影响1 6 2 6 3 2 不同浓度氨基酸溶液对拮抗作用的影响1 7 2 7 1 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实系统诱导抗性的评价试验1 7 2 7 1 1 处理不同时间对柑橘果实系统诱导抗性的评价1 7 2 7 1 2 不同距离处理对柑橘果实系统诱导抗性的评价1 7 2 7 2 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实抗性相关酶活性的影响1 7 2 7 2 1 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实s o d 活性的影响1 8 2 7 2 2 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实p o d 活性的影响1 8 2 7 2 3 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实c a t 活性的影响1 8 2 7 2 4 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实p p o 活性的影响1 8 2 7 2 5 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实b 1 ，3 葡聚糖酶活性的影响1 9 2 7 2 6 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实p a l 活性的影响1 9 2 8 粗提抑菌活性物质的研究2 0 2 8 1 不同浓度粗提抑菌活性物质对病原孢子萌发的影响2 0 2 8 2 粗提抑菌活性物质对病原菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定2 0 2 8 3 粗提抑菌活性物质对病原孢子质膜完整性( m i ) 的影响2 0 2 8 4 粗提抑菌活性物质在活体上的活性检测试验2 1 2 8 5 粗提抑菌活性物质对柑橘果实抗性相关酶活性的影响2 1 2 9 数据分析2 1 3 结果与分析2 2 3 1 拮抗菌3 4 9 对柑橘意大利青霉菌的抑制作用2 2 3 1 1 离体条件下抑菌作用2 2 3 1 2 活体条件下抑菌作用2 2 3 2 营养竞争2 3 3 2 1 拮抗菌3 4 9 和病原菌在离体条件下的营养竞争作用2 3 3 2 2 拮抗菌3 4 9 和病原菌在活体上的营养竞争作用2 4 3 3 诱导抗性2 5 3 3 1 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实的系统诱导抗性2 5 3 3 2 拮抗菌3 4 9 和病原菌处理对柑橘果实抗性相关酶活性的影响2 6 3 3 2 1 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实s o d 活性的影响2 6 i i 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 3 3 2 2 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实p o d 活性的影响2 6 3 3 2 3 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实c a t 活性的影响2 7 3 3 2 4 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实p p o 活性的影响2 8 3 3 2 5 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实p 1 ，3 葡聚糖酶活性的影响2 8 3 3 2 6 拮抗菌3 4 9 对柑橘果实p a l 活性的影响2 9 3 4 粗提活性物质的研究3 0 3 4 1 不同浓度粗提活性物质对病原孢子萌发的影响3 0 3 4 2 粗提活性物质对病原菌的m i c 和m f c 3 0 3 4 3 粗提活性物质对病原孢子质膜完整性( m i ) 的影响3 2 3 4 4 粗提活性物质在活体上的抑菌活性检测试验3 3 3 4 5 粗提活性物质对柑橘果实抗性相关酶活性的影响3 3 3 4 5 1 粗提活性物质对柑橘果实s o d 活性的影响3 3 3 4 5 2 粗提活性物质对柑橘果实p o d 活性的影响3 4 3 4 5 3 粗提活性物质对柑橘果实c a t 活性的影响3 4 3 4 5 4 粗提活性物质对柑橘果实p p o 活性的影响3 5 3 4 5 5 粗提活性物质对柑橘果实p 1 ，3 葡聚糖酶活性的影响3 5 3 4 5 6 粗提活性物质对柑橘果实p a l 活性的影响3 6 4 讨论3 7 4 1 拮抗菌3 4 9 对柑橘意大利青霉菌的抑制作用3 7 4 2 拮抗菌3 4 9 对柑橘意大利青霉菌的抑菌机理3 7 下一步研究计划4 l 参考文献4 2 附录5 l 附图及说明5 3 i i i 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 摘要 随着柑橘采后病害生物防治研究的兴起，国内外已筛选出多株柑橘采后生防菌， 但被实际生产应用的较少。其原因多是由于生防菌单独使用难以达到化学杀菌剂的 效果。因此，迫切的需要对生防菌的拮抗机理进行研究，以针对性地对生防菌进行 改良，提高其抑菌活性，指导开发应用。 本实验以拮抗菌柠檬形克勒克酵母( k l o e c k e r aa p i c u l a t a ) ( 3 4 9 ) 为材料，研究了 它对柑橘意大利青霉( p e n i c i l l i u mi t a l i c u m ) 的防治效果，发现离体活体上它对柑橘 意大利青霉( 尸i t a l i c u m ) 均具有明显的抑制作用，且抑制效果与接种拮抗菌和病原 菌的时间先后有关。并从营养竞争、诱导抗性和分泌抑菌活性物质三方面初步研究 了拮抗菌3 4 9 对意大利青霉的抑菌机理，主要结果如下： ( 1 ) 离体条件下用橘子汁模拟活体实验发现，单独培养病原菌2 4 h ，0 5 、5 、 1 0 橘子汁中，孢子萌发率均能达到9 4 。与拮抗菌3 4 9 共培养，孢子萌发率受 到抑制，橘子汁浓度越高，抑制作用越弱。0 5 、5 和1 0 橘子汁中，抑制率分 别为8 0 9 、4 0 3 和4 3 。拮抗菌3 4 9 在各浓度橘子汁中均大量繁殖，2 4h 后 分别增加到1 7 0 倍、6 2 5 倍和3 2 5 倍。将与拮抗菌3 4 9 共培养的病原菌孢子转移 至新鲜橘子汁中后，0 5 和5 橘子汁中孢子萌发率显著增加，1 0 橘子汁中孢 子萌芽率无明显变化。活体上，向果实伤口添加外源维生素和氨基酸后，拮抗菌3 4 9 对病原菌的抑制作用减弱，添加氨基酸的处理表现尤为明显。 ( 2 ) 拮抗菌3 4 9 在一定程度上能诱导果实产生抗性，与处理时间长短和处理位 点远近有关。拮抗菌3 4 9 处理2 4h ，柑橘果实系统抗性无显著变化，4 8h 后抗性显 著增强；距离拮抗菌3 4 9 处理位点越近的部位系统抗性越强。拮抗菌3 4 9 细胞能 在4 8h 内刺激柑橘果实p p o 、b 1 ，3 葡聚糖酶和p a l 活性升高。其产生的抑菌活 性物质能诱导果实s o d 、p o d 、c a t 、1 3 1 ，3 葡聚糖酶活性升高。抑菌活性物质处 理2 4h 后p o d 和8 1 ，3 葡聚糖酶活性达到最大值，分别为对照的1 8 倍和1 2 倍； 处理4 8h 后s o d 活性达最大值，为对照的1 4 倍；4 8h 后，c a t 活性维持在较对 照高的水平。 ( 3 ) 粗提活性物质在离体、活体条件下对意大利青霉都有很好的抑制作用。离 体条件下，对病原菌的最小抑菌浓度为3 7 51 t l m l ，最小杀菌浓度为1 0i _ t l m l 。病 原菌孢子用1 5 斗l m l 粗提活性物质处理后其质膜会发生破损，处理时间越长，破 柠檬形克勒克酵母( 3 4 - 9 ) 对柑橘意大利青霉抑菌机理的研究 损得越多。处理2h ，约5 发生破损；4h 后，增加到2 0 ；6h 后，又增加5 ； 8h 时3 0 孢子破损。用5p l m l 和1 0p 呲粗提活性物质处理柑橘果实，7 d 后 其腐烂率比对照分别下降5 0 和8 9 。 关键词t 柑橘；拮抗菌3 4 9 ；意大利青霉；抑菌机理 2 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 a b s t r a c t a sr e s e a r c ho nb i o c o n t r o lo fp o s t h a r v e s td i s e a s e so fc i t r u sf r u i t sh a sd e v e l o p e d ，m a n y b i o l o g i c a la g e n t sh a v eb e e nd i s c o v e r e db ys c i e n t i s t sa th o m ea n da b r o a d b u to n l yaf e w h a v eb e e np u ti n t oa p p l i c a t i o n t h i si sm a i n l yb e c a u s et h a tt h e i re f f e c t so nc o n t r o l l i n g p o s t h a r v e s td i s e a s e s a r en o ta sg o o da sc h e m i c a lf u n g i c i d e t h e r e f o r e ，i no r d e rt o i m p r o v et h e i rb i o c o n t r o le f f i c i e n c ya n dp u tt h e mi n t op r a c t i c a lu s e ，t h e r ei s a nu r g e n t n e e dt or e s e a r c ho nt h em e c h a n i s mo ft h ea c t i o no ft h e s eb i o c o n t r o la g e n t s k l o e c k e r aa p i c u l a t a ( 3 4 - 9 ) h a sb e e nf o u n dt oh a v eg r e a t i n h i b i t i o ne f f e c to n p p 门i c i l l i u mi t a l i c u mo fc i t r u si nv i t r oa n di nv i v o a n dt h ei n h i b i t i o ne f f e c t sa r ed i f f e r e n t w h e nt h eb i o c o n t r o la g e n ti si n o c u l a t e db e f o r eo ra f t e rt h ep a t h o g e n t h i sr e s e a r c hi s a i m e dt of i n do u tt h em e c h a n i s mo fi t sa c t i o n ，i n c l u d i n gw h e t h e ri tc o m p e t e sw i t h p a t h o g e nf o rn u t r i e n t ，i n d u c e s t h er e s i s t a n c eo fc i t r u sf r u i t s ，a n ds e c r e t sf u n g i s t a t i c c o m p o u n d s t oh u r to rk i l lt h ep a t h o g e n a n dt h er e s u l t sa r ea sf o l l o w e d ： ( 1 ) b yu s i n go r a n g ej u i c et os i m u l a t en a t u r a l e n v i r o n m e n ti nv i t r o ，w ef o u n dt h a t m o r et h a n9 4 c o n d i a lo ft h ep a t h o g e nc o u l dg e r m i n a t ew h e nt h e yw e r ei n c u b a t e di n 0 5 ，5 ，10 o r a n g ej u i c ew i t h o u tb i o c o n t r o la g e n t3 4 9 b u ti nt h ep r e s e n c eo f b i o c o n t r o la g e n t3 4 9 ，c o n d i a lg e r m i n a t i o nw a si n h i b i t e d a n da st h ec o n c e n t r a t i o no f o r a i l g ej u i c ei n c r e a s e d ，t h ei n h i b i t i o ne f f e c tb e c a m ew e a k e r i n0 5 ，5 a n d 10 o r a n g ej u i c e ，t h ei n h i b i t i o nr a t e sa r e8 0 9 ，4 0 3 a n d4 3 r e s p e c t i v e l y a n di ne a c h c o n c e n t r a t i o no fo r a n g ej u i c e ，t h ep o p u l a t i o ns i z e o fa n t a g o n i s t i cy e a s t3 4 - 9w a s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d t h ep o p u l a t i o ns i z e sa r er e s p e c t i v e l y1 7 0 ，2 6 ，3 2 5t i m e so f t h e o r i g i n a ls i z e a n dt h ei n h i b i t e dc o n d i a lc o u l dr e g a i nt h ea b i l i t yt og e r m i n a t ei nn e w f r e s h o r a n g ej u i c e c o n d i a lg e r m i n a t i o ni n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi n0 5 a n d5 o r a n g e j u i c e a r e ra na d d i t i o n a li n c u b a t i o no f2 4h ，b u ti ts h o w e dl i t t l ec h a n g ei n10 o r a n g ej u i c e a n dt h eb i o c o n t r o le f f e c ti nv i v oc o u l db ew e a k e n e db ya d d i n ge x o g e n o u sn u t r i e n tt o t h e w o u n do ff r u i t s ，e s p e c i a l l yb ya d d i n ga m i n oa c i d ( 2 ) t os o m ee x t e n t ，b i o c o n t r o la g e n t3 4 9i n d u c e dt h e r e s i s t a n c eo ff r u i t s t h e l o n g e rt h ef r u i tw e r et r e a t e db yb i o c o n t r o la g e n t3 4 9a n dt h en e a r e rt h es i t e w a st ot h e s p o tt r e a t e db yb i o c o n t r o la g e n t3 4 9 ，t h er e s i s t a n c eo ff r u i t sw a ss t r o n g e r w i t h i n2 4 h o u r s ，t h es y s t e m i cr e s i s t a n c eo ff r u i t sc o u l d n tb es t r e n g t h e n e db yt h ea n t a g o n i s t ，b u ti t 3 b e c a m em u c hs t r o n g e ra f t e r4 8h o u r s a n t a g o n i s t i cy e a s tc e l li n d u c e da ni n c r e a s ei nt h e a c t i v i t yo fp p o 、b - 1 ，3 - g l u c a n a s ea n dp a l b u ti t ss e c r e t i n gs u b s t a n c ec o u l di n d u c ea n i n c r e a s ei nt h ea c t i v i t yo fs o d 、p o d 、c a ta n d1 3 1 ，3 - g l u c a n a s e t h ef u n g i s t a t i c c o m p o u n d sp r o d u c e db yb i o c o n t r o la g e n t3 4 9m a d et h ep e a ko ft h ea c t i v i t yo f p o d ， 1 3 1 ，3 - g l u c a n a s ea n ds o da p p e a ra t2 4h ，2 4ha n d4 8h ，r e s p e c t i v e l y ，a n dt h e yw e r e1 8 t i m e s ，1 2t i m e sa n d1 4t i m e so fc o n t r 0 1 a f t e rb e i n gt r e a t e df o rm o r et h a n4 8 h ，t h e a c t i v i t yo fc a tk e p th i g h e rt h a nc o n t r 0 1 ( 3 ) c r u d ee x t r a c tc o u l de f f e c t i v e l yc o n t r o lpi t a l i c u mi nv i t r oa n di nv i v o i nv i t r o ， t h em i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o no fc r u d ee x t r a c tt op i t a l i c u mo fc i t r u sw a s 3 7 5 肛l m l ，a n dt h em i n i m u mf u n g i c i d a lc o n c e n t r a t i o nw a s1 0p l m l t h ep l a s m a m e m b r a n ei n t e g r i t yc o u l db eh u r tb yt h ec r u d ee x t r a c t t h el o n g e ri tw a st r e a t e db yt h e c r u d ee x t r a c t ，t h em o r es e r i o u s l yi tw a sh u r t a f t e rb e i n gt r e a t e df o r2h ，5 c o n d i a lw a s h u r t ；f o r4h ，i ti n c r e a s e dt o2 0 ；a n db e t w e e n4h a n d8h ，t h e r ew a sa n o t h e r10 t h e d e c a yi n c i d e n c eo ff r u i t sc o u l db er e d u c e dt o5 0 a n d8 9 r e s p e c t i v e l yw h e nt h e y w e r et r e a t e db y5 “l m la n d10 “l m lc r u d ee x t r a c t k e y w o r d s ：c i t r u s ；b i o c o n t r o la g e n t3 4 9 ：p e n i c i l l i u mi t a l i c u m ；i n h i b i t i o nm e c h a n i s m 4 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 1 引言 1 1 柑橘产业状况 柑橘是世界第一大果树品种，其营养、药用及保健价值高，深受人们的喜爱。 至2 0 0 2 年，柑橘成为世界第三大贸易农产品( 排名前两位为小麦和玉米) ( 邓秀新， 2 0 0 4 ) 。在世界百果中，其种植面积和产量均居首位。柑橘喜温暖湿润气候，世界 柑橘产区分布较广，主要分布在南、北纬4 0 。间土壤和气候条件适宜的热带和亚热 带地区。全球有1 3 5 个国家和地区生产柑橘，有4 0 多个国家主产柑橘( 陈仕俏， 2 0 0 8 ) 。 柑橘是我国南方栽培面积最广、经济地位最重要的果树之一。主要集中在浙江、 福建、江西、湖北、湖南、广东、广西、重庆、四川和台湾l o 个省( 谢金锋，2 0 0 5 ) 。 2 0 0 8 年中国柑橘总产量达到了2 3 3 1 万吨，第一次超过巴西，成为世界第一大柑橘 生产国( 祁春节，2 0 1 0 ) 。我国柑橘栽培仍以宽皮柑橘为主，约占7 3 1 ( 其中柑 类占3 6 、橘类占3 7 1 ) ，橙占1 3 5 ，柚占1 2 2 ，其它占1 2 ( 王j l i ，2 0 0 6 ) 。 而且成熟期相对集中，主要集中在1 1 1 2 月，早熟和晚熟比例偏低( 彭良志，2 0 0 0 ) 。 1 2 柑橘采后主要病害 1 2 1 柑橘采后损失及主要病害 据报道，柑橘果实采收后在贮运期间果实腐烂率达1 0 4 0 。其采后损失除 由生理性病害，如枯水病、褐斑病、水肿病和油斑病等造成损失外，由病原真菌微 生物侵染引起的侵染性病害造成的腐烂是柑橘采后损失的最主要因素( 刘艳， 2 0 0 9 ) 。 柑橘果实采后在贮藏、运输过程中可发生的真菌性病害有2 0 多种，主要是青 霉病( p e n i c i l l i u mi t a l i c u m ) 和绿霉病( p e n i c i l l i u md i g i t a t u m ) ( 刘艳，2 0 0 9 ；s m i l a n i c k e ta 1 1 9 9 9 ；p a l o ue ta 1 ，2 0 0 1 ，2 0 0 2 ) ，其次是黑色蒂腐病( d i p l o d i an a t a l e n s i s ) 、褐 色蒂腐病( p h o m o p s i sc y t o s p o r e l l a ) 、黑腐病( a l t e r n a r i ac i t r i ) 、炭疽病( c o l l e t o t r i c h u m g l o e o s p o r i o i d e s ) 、酸腐病( o s p o r ac i t r i a u r a n t i i ) 和褐腐病( p h y t o p h t h o r ac i t r o p h t h o r a ) 等( 赖传雅，2 0 0 3 ；李家庆等，2 0 0 3 ；黄振东，2 0 0 6 ；郎国良，2 0 0 7 ；刘艳，2 0 0 9 ) 。 柠檬形克勒克酵母( 3 4 9 ) 对柑橘意大利青霉抑菌机理的研究 1 2 2 柑橘青霉病发病症状 果实发病初期呈水渍状软腐，软腐边缘明显，较整齐。病部果皮略凹陷，容易 破裂，色泽比健果略淡。随后在病部开始长出白色霉状物( 菌丝体) ，接着形成青 色的粉状霉层，粉状霉层外围会出现一圈白色菌丝环，为粉状，较窄，一般为1 3 t o n i 。在条件适宜时，l 2 星期可导致全果腐烂，腐烂后病果有霉味( 李怀方等，2 0 0 1 ) 。 1 2 3 柑橘青霉病发病规律 引起柑橘青霉病的意大利青霉( pi t a l i c u m ) 属半知菌亚门。它们常腐生在各种 有机物上，可产生大量的分生孢子，通过空气传播到柑橘果实表面，当果实受伤时， 病菌孢子萌发从伤口侵入果实，引起果实腐烂( 李怀方等，2 0 0 1 ) 。曾有研究表明， 不论柑橘果实表面伤口或深或浅，只要有组织液渗出，病原菌均能侵染( 罗永兰和 张志元，1 9 9 6 ) 。在果实病部产生的大量分生孢子又能进行重复侵染。在贮运中， 青霉病菌还能分泌一种挥发性物质，将接触到的健果果皮损伤，引起接触传播( 李 怀方等，2 0 0 1 ) 。 当温度为1 0 时，病原菌潜育期达5 4h ：2 0 2 5 时潜育期仅为6 8h ( 陆宁 海等，2 0 0 5 ) 。青霉病发生所需的温度范围为3 3 2 ，最适温度为1 8 2 6 ，当相 对湿度达9 5 , - - 9 8 时，有利于发病( 欧阳菊英，2 0 0 2 ) 。在雨后或露水未干时采 果易引起柑橘青霉病发病增加。橘园发病一般始于果实蒂部，贮藏期发病部位没有 一定规律( 闵晓芳，2 0 0 7 ) 。 1 3 柑橘青霉病防治研究现状 要减少侵染性病害引起的腐烂，应从采前开始采取措施预防贮藏病害的发生。 采收前1 0 天左右对树冠果实喷药，减少果实带病。根据不同品种按果实成熟度进 行采收，避免下雨、雨后、重雾或露水未干时采果。采收及贮运期间应防止果实遭 受机械损伤。对贮藏库进行熏蒸消毒处理，待药气散采用单果包装贮藏，并根据柑 橘品种特性控制适宜温度、湿度、气体组成等环境条件( 郎国良等，2 0 0 7 ) 。另外， 还应采取措施抑制病原菌生长，防止病原菌侵染。目前柑橘采后病害防治主要有物 理防治、化学防治和生物防治法( 邓雨艳和曾凯芳，2 0 0 8 ) 。 1 3 1 物理防治 物理防治的基本根据就是为果实的采后贮藏尽量提供适宜的可控环境，其原理 6 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 主要是利用温度、湿度及气体成分等物理参数对果实进行作用，改变其原来的生物 规律，使之对环境反应迟缓，最终实现防腐保鲜( 邓雨艳和曾凯芳，2 0 0 8 ) 。研究较 多的物理防治方法就是热处理、涂膜保鲜和紫外线处理。比如通过热处理( 5 3 热 水浸泡2 3m i n ) ，可降低柑橘果实发病率和腐烂率，并且能降低果实对冷害的敏感 性( r o d o v , 1 9 9 5 ) ，还能延缓果实成熟和衰老、激发抗逆境和抗病性相关反应( p o r a t e ta 1 ，2 0 0 1 ；f a l l i k ，2 0 0 4 ；v i c e n t ee ta 1 ，2 0 0 6 ) 。若热处理后结合其他的防治方法，比 如加入防腐剂或者聚乙烯袋单果包装等能更好防治采后病害，并能延长果实软化， 提高商品价值( r o d o v , 2 0 0 0 ) 。紫外线可以直接杀菌，还能诱导果实p a l 、p o d 、几 丁质酶、b 1 ，3 葡聚糖酶等活性，使果实植保素、木质素、酚类物质积累( s h a m aa n d a l d e r s o n ，2 0 0 5 ；s h a m a ，2 0 0 7 ) 。涂膜中研究较多的是涂蜡及低分子的壳聚糖。涂蜡能 明显降低果实接种青霉病菌后的腐烂率，结合2 ，4 d 处理，效果更佳( 庞杰等，2 0 0 0 ) 。 c h i e n 等发现柑橘果实涂被壳聚糖后对青霉病防治效果比噻菌灵更好( c h i e n ，2 0 0 7 ) 。 此外低温贮藏、气调贮藏也能有效防治柑橘采后病害的发生( 邓伯勋，2 0 0 2 ) 。囊 1 3 2 化学防治 长期以来，控制采后病害的主要方法是使用化学杀菌剂( s p a d a r oa n dg u l l i n o ， 2 0 0 4 ) 。目前常用的柑橘杀菌剂有抑霉哇、噻菌灵、苯并咪唑的托布津、多菌灵等 ( p a l o ue ta 1 。2 0 0 1 ) 。由于长期和大量使用化学杀菌剂，使病原菌抗药性增强，降 低了药剂的防腐效果，日前已发现青霉病菌对其产生了抗性( 熊件妹，2 0 0 6 ) 。更为 严重的是，对环境造成污染，对人类健康造成威胁( s p a d a r oa n dg u l l i n o ，2 0 0 4 ) 。多 菌灵、双胍盐等用于果蔬采后处理的化学杀菌剂已被禁止使用( 庞学群，2 0 0 2 ) 。目 前国内外主要研究一些新型的高效低残留杀菌剂，比如甲基托布津( z h a n g ，2 0 0 7 ) 、 阿米西达可湿性粉剂( 赵国富，2 0 0 4 ) 、多菌灵有机酸盐( 李俊凯，2 0 0 0 ) 等。更 多的是将新型杀菌剂与传统农药混合使用，如2 0 咯菌腈和5 0 特克多配合使用 能显著降低柑橘青霉病的发病率( 谢永红，2 0 0 4 ) 。 1 3 3 生物防治 随着人们生活水平的日益提高，对果品内在和外在品质要求日益增强，化学杀 菌剂的诸多弊端迫使我们寻找一种可以替代化学杀菌剂的安全无毒高效的新型防 腐手段。生物防腐作为一种安全无毒的防腐手段日益已引起科学家的关注，将生物 防治技术在生产中有效的推广运用，是现今研究的热点( 田世平和范青，2 0 0 0 ) 。 7 柠檬形克勒克酵母( 3 4 9 ) 对柑橘意大利青霉抑菌机理的研究 生物防治是采用微生物菌株或抗菌素类物质，通过喷洒或浸渍果实处理防治果 实采后病害的方法。目前，柑橘采后侵染性病害的生物防治研究主要集中在筛选能 够抵抗由伤口侵染的病原菌的拮抗菌。具有拮抗作用的微生物有真菌、细菌和放线 菌。在拮抗菌中，特别引人注目的是酵母菌类。c h a l u t z 等从柠檬果实表面分离得到 的一株汉逊德巴利酵母( d e b a r y o m y c e sh a n s e n i i ) ，对柑橘青霉病有显著的防治效果 ( c h a l m z ，1 9 9 0 ) 。从柑橘根系附生土壤中分离出的柠檬形克勒克酵母( 3 4 9 ) ( 王华 利，2 0 0 6 ) ，从柚子皮表面分离得到的耐高渗透压、耐广泛温度的酵母菌株，如假丝 酵母属c a n d i d as a i t o a n a ，c a n d i d ao l e o p h i l a ，c a n d i d ag u i l l i e r m o n d i i ，c a n d i d as a k e 等( d r o b y , 1 9 9 8 ；d r o b y ；1 9 9 9 ；e 1 g h a o u t h ，2 0 0 1 ) ，以及季也蒙毕赤酵母( p i c h i a g u i h i e r m o n d i 0 ( w i l s o n ，1 9 8 9 ) 、粘红酵母( r h o d o t o r u l ag l u t i n i s ) 和罗伦隐球酵母 ( c r y p t o c o c c u sl a u r e n t i i ) ( q i ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 等对柑橘果实采后青霉病都具有很好的 防治效果，可开发作为柑橘采后病害的生物控制药剂。 应用生物防治控制柑橘采后病害，国内外已有不少报道，但除少数几种产品已 获得生产应用外，大多数还处于试验阶段( d r o b y , 1 9 9 8 ；e 1 g h a o u t h ，2 0 0 1 ) 。 “a s p i r e ”( c a n d i d ao l e o p h i l as t r a i n1 8 2 ) 已被注册为酵母类生物保鲜剂，并应用于美国 和以色列；“b i o s a v e10 0 ”，“b i o s a v el10 ”( p s e u d o m o n a ss y r i n g a es t r a i ne s c 10a n d e s c l l ) 已被注册为细菌类生物保鲜剂应用于美国( f r e d l u n de ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 目前情况下，单独采用生防菌的抑菌效果不及化学杀菌剂，从而限制了生防菌 的应用( 王雷等，2 0 0 8 ) 。所以将生防菌和其他手段联合使用也成为了一个研究热 点。以a s p i r e 和t b z 联合处理可有效抑制柑橘果实青霉病的发病率( d r o b y ，1 9 9 9 ) 。 郑晓冬等发现，粘红酵母与4 的低温条件结合使用，可以提高酵母对柑橘青霉病 的防治效果( 孙萍等，2 0 0 3 ) 。用c a n d i d as a i t o a n a 和2 脱氧d 葡萄糖配合处理橙、 柠檬，其抑制果实腐烂的效果与抑霉唑相似( e i g h a o u t h 2 0 0 1 ) 。 1 4 拮抗酵母菌作用机理的研究 酵母菌与其他拮抗微生物相比，其遗传稳定，抑菌谱广；安全性高，一般不产 生对人和寄主有害的代谢产物；对营养要求低，生长快；对逆境具有较强的耐受力， 对大多数杀菌剂不敏感，能与多种化学和物理方法相结合( j a n i s i e w i c za n dk o r s t e n ， 2 0 0 2 ；s p a d a r oa n dg u l l i n o ，2 0 0 4 ) 。而且拮抗酵母菌还能分解真菌毒素，己有研究证 明通过酵母发酵能分解9 0o 旷9 9 的棒曲霉素( m o a k ee ta 1 ，2 0 0 5 ) ；而且还能分解 降低扩展青霉分泌产生的棒曲霉素在果实上的积累( c a s t o r i ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。因此近几 8 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 年来，酵母菌用于生物防治越来越受到人们的重视。 但是从目前来看，拮抗酵母菌对病原菌的抑制效果与杀菌剂相比还是有很大的 差距，只有与其他物质结合使用才能达到较好的生防效果( f r a v e l ，2 0 0 5 ) 。从实验 室研究走向实际生产应用是一个艰难的历程，为了尽快达到这个目的，必须先弄清 拮抗酵母菌的作用机理，从而有目的地对它进行改良，提高其生防效力。但是拮抗 酵母菌的抑菌机理很复杂，很难确定其抑菌机理是单一的还是多种机理共同起作 用，而且有些机理可能还没发现。目前普遍认为拮抗酵母菌对果蔬采后病害的作用 机理只要包括以下几个方面( 张红印，2 0 0 3 ) ：( 1 ) 营养或空间竞争；( 2 ) 对病原 菌的直接寄生作用，产生胞外水解酶；( 3 ) 诱导寄主产生抗性。另外有少量关于拮 抗酵母菌产生抗生性代谢物的报道( 刘昱佳，2 0 0 8 ) 。 1 4 1 营养或空间竞争 大多拮抗酵母菌比病原菌对环境的适应性强，在温度、湿度、p h 值或渗透压 不利于病原菌生长的环境下，拈抗酵母菌也能生长，利用果蔬表面或伤口营养大量 繁殖，并消耗掉伤口营养，从而快速占领空间，使病原菌因没有生长繁殖所需的营 养和空间条件而死亡，从而抑制病害发生( d r o b y , 1 9 9 4 ；w i l s o na n dw i s n i e w s k i ， 1 9 9 4 ) 。 许多研究证明了营养或空间竞争是酵母菌产生生防作用的主要机制。 j a n i s i e w c i z 等报道，s p o r o b o l o m y c e sr o s e u s 喷果后l 下贮藏三个月拮抗菌的数量 增加了1 5 倍( j a n i s i e w c i ze ta 1 ，1 9 9 4 ) 。范青等研究发现，有病原菌存在情况下， 季也蒙假丝酵母( cg u i l l i e r m o n d i i ) 在桃果实伤口处2 5 下7 2 小时内数量能增长 4 5 6 倍。拮抗酵母菌的迅速繁殖能使它在短时间内占据空间，对病原菌的生存和繁 殖造成不利( 范青等，2 0 0 0 ) 。d r o b y 等早报道