（微生物与生化药学专业论文）ds16多糖微生物絮凝剂的制备及安全性评价.pdf

d s l 6 多糖微生物絮凝荆的制备及安全性评价 d s l 6 多糖微生物絮凝剂的制备及安全性评价 专业：微生物与生化药学 研究生：黄俊 导师：王世立研究员 中文摘要 微生物絮凝剂是一类由微生物产生的次生代谢产物，可以吸附、中和、絮凝、 沉淀水中不易降解的固体悬浮颗粒和胶体颗粒等特殊高分子代谢产物，被认为是 一种安全、高效、能自然降解的新型水处理剂，故研究与开发倍受关注。现在应 用的无机和有机化学絮凝剂在水处理中各具特色，但伴随经济发展和人们对良好 环境质量的渴求，为了人民健康和生态环境的可持续发展，开发低毒、高效、多 功能絮凝剂的研究一直在进行。微生物絮凝剂可大规模生产、产品无毒、处理效 率高，有替代其它类型絮凝剂产品的可能性与发展趋势。 研究目的：本课题组在前期的研究工作中筛选到一株微球菌d s l 6 ，其代谢 产物具有良好的絮凝活性。本项研究拟在前期研究的基础上，对d s l 6 发酵产生 的絮凝剂进行提纯分析，并对该产品的制备工艺和安全性进行研究，从而研发出 一种安全、高效的新型微生物絮凝剂。 研究方法：通过d e a e s e p h a r o s ef f 和s e p h a d e xg 2 0 0 对发酵生产的絮凝 剂进行提取纯化，利用紫外扫描、红外光谱和毛细管电泳对纯化样品进行分析， 通过急性毒性试验、a m e s 试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验三方面对纯化 样品做了安全性评价。通过定性及定量测定微生物絮凝剂的投加量、温度、p h 、 金属离子对微生物絮凝剂絮凝活性的影响，以了解微生物絮凝剂的絮凝特性。通 过正交试验对微球菌d s l 6 产絮凝剂的培养基成分及培养条件进行优化，获得发 酵生产的最优配方：用此配方进行放大试验，并对发酵液进行提取制备，找出适 合本产品并且收率最高的制备工艺。 研究结果：经d e a e s e p h a r o s ef f 和s e p h a d e xg 2 0 0 纯化后，s e p h a d e x g 一2 0 0 图谱中多糖活性峰为一对称单峰。紫外扫描确定纯化样品的特征吸收峰在 2 5 0 n m ，红外光谱图谱分析显示是一张典型的多糖光谱图，高效毛细管电泳结果 山东省医学科学院硕士学位论文 显示微球菌d s l 6 发酵产生的多糖絮凝剂主要由鼠李糖，葡萄糖，甘露糖，半乳 糖组成。毒理学试验的结果表明，急性经口毒性试验中实验动物无中毒及死亡现 象，样品属实际无毒；a m e s 试验中受试物各剂量组回变菌落数均未超过自发回 变菌落数的2 倍，亦无剂量一反应关系，结果为阴性；样品对小鼠骨髓嗜多染红 细胞无致微核作用。 微生物絮凝剂投加量在1 0 m g l 时絮凝效果最好，絮凝活性达到9 6 4 6 ；在 2 0 3 5 。c 絮凝活性相对稳定，3 0 时絮凝活性达到最高9 6 2 ；p h 值为7 0 时絮 凝活性最高；k + 、n a + 、c u 2 + 和f e 2 + 都对絮凝活性的展示有抑制作用，而c a “、 m 9 2 + 对微生物絮凝剂的絮凝活性有促进作用。 本研究确定了高效微生物絮凝剂产生菌d s l 6 的最佳发酵时间为1 8 h 。通过 正交试验确定的有利于微生物絮凝剂合成的最佳培养基成分为k 2 h p 0 40 4 5 、 n a h 2 p 0 40 1 4 、液糖1 8 、( n h 4 ) 2 s 0 4o 5 、酵母提取物0 0 4 、m 9 2 s 0 4 0 0 2 、c a c l 2 0 0 1 ；培养条件为温度2 9 、摇瓶转速1 7 0 r p m 、通气量o 2 v m i n 、 投料系数o 7 6 。通过向培养基中添加不同浓度m n 2 + 进行培养，发现m n 2 + 对絮凝 剂的产生有显著的促进作用，在添加量为6 m g l 时絮凝剂干重达到最高值，获 得最高絮凝活性的使用浓度仅为2 m g l 。通过补料分批发酵在1 8 h 时絮凝剂干重 达到了1 3 7 9 l ，絮凝活性达到9 7 2 6 。 通过3 0 0 0 升发酵罐的发酵动态分析及生产工艺研究确定了比较成熟的生产 工艺。发酵液用平板膜截留浓缩3 倍，浓缩液加入3 倍乙醇洗涤沉淀两遍，沉淀 用平板式吊袋洁净离心机离心，双锥回转真空干燥机干燥，然后粉碎包装成品。 结论：通过本研究建立了一套成熟可行的生产工艺，找出了絮凝活性的影响 因素，对该产品的毒理学研究证实了微球菌d s l 6 发酵产生的絮凝剂是无毒，安 全可靠的。 关键词：微球菌d s l 6 ；多糖微生物絮凝剂；提取纯化；毒理学；絮凝活性； 2 d s l 6 多糖微生物絮凝剂的制备及安全性评价 t h e p r e p a r a t i o na n ds a f e t ye v a l u a t i o no fd s 16 p o l y s a c c h a r i d eb i o f l o c c u l a n t m a j o r ：m i c r o b i o l o g ya n db i o c h e m i c a lp h a r m a c y g r a d u a t es t u d e n t ：h u a n gj u n a d v i s o r ：w a n g s h i l i p r o f e s s o r a b s t r a c t m i c r o b i a lf l o c c u l a n t ( m b f ) i sak i n d o fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e p r o d u c e db y m i c r o o r g a n i s m s i t c a n a d s o r b ，n e u t r a l i z e ，f l o c c u l a t ea n d p r e c i p i t a t es p e c i a l m a c r o 。m o l e c u l a r m e t a b o l i t e s ，s u c h a ss o l i d s u s p e n d e dp a r t i c u l a t e a n dc o l l o i d p a r t i c l e i tw a san e wt y p ew a t e rt r e a t m e n tc h e m i c a l ，a n dh a sm a n yg o o dc h a r a c t e r i s t i c s ， s u c ha ss a f e t y ，h i g he f f i c i e n c y ，b i o d e g r a d a b l e ，n o s e c o n d a r yp o l l u t i o na n dh i g h f l o c c u l a t i o na c t i v i t y ，w h i c hm a d ei tr e q u i r e m e n tf o r t h ew a s t e w a t e rt r e a t m e n t i ns p i t e o ft h ei n o r g a n i ca n do r g a n i cc h e m i c a lf l o c c u l a n th a v eb e t t e re f f e c tf o rt r e a t m e n to f w a t e r , w i t ht h ee c o n o m i cq u i c kd e v e l o p m e n t ，i ti su r g e n tt od e v e l o pl o wt o x i c ，h i g h p e r f o r m a n c ea n dm u l t i f u n c t i o nf l o c c u l a n t si no u rc o u n t r yt om e e tt h er e q u i r e m e n to f p e o p l ef o rg o o dh e a l t ha n dh i g hq u a l i t yo fl i f e b e c a u s em i c r o b i a lf l o c c u l a n th a s m a n yc h a r a c t e r i s t i c s ，s u c ha si n n o c u i t y , h i g he f f i c i e n c ya n dl a r g es c a l ep r o d u c t i o n ，i t h a sp o s s i b i l i t ya n dd e v e l o p m e n tt r e n dt os u b s t i t u t eo t h e rt y p ef l o c c u l a n t p r o d u c t o b j e c t i v e ：t h es t r a i no fm i c r o c o c c u sd s16w a si s o l a t e df r o me n v i r o n m e n ta n d i d e n t i f i e db yf o r m e rr e s e a r c hw o r k t h em e t a b o l i cp r o d u c t i o no ft h i ss t r a i ns h o w e d h i g ha c t i v i t yo ff l o c c u l a t i o n t h ef l o c c u l a n tw a se x t r a c t e d ，p u r i f i e da n da n a l y s e d ， r e l i a b i l i t yo fp r o d u c tw a ss t u d i e d p r a c t i c a la p p l i c a t i o no ff l o c c u l a n tp r o d u c tw a s d i r e c t e db yi n d e p t hr e s e a r c ho ff o c c u l a t i n ga c t i v i t y t h ef a c t o r so ff e r m e n t a t i o nw e r e t h o r o u g h l yi n v e s t i g a t e di no r d e rt oi n c r e a s et h ep r o d u c t i o no ff l o c c u l a n ta n dd e c r e a s e t h ec o s t ，af e a s i b l ec r a f tw a se s t a b l i s h e db a s e do nt h i sr e s u l t an e w t y p em i c r o b i a l f l o c c u l a n tw i l lb em a n u f a c t u r e dw i t hs a f e t ya n dh i g he f f i c i e n c y m e t h o d s ：t h eb i o f l o c c u l a n tw a se x t r a c t e da n dp u r i f i e db yd e a e s e p h a r o s ef f a n ds e p h a d e xg - 2 0 0 ，t h ep u r i f i e ds a m p l ew a sa n a l y s e db yu l t r a v i o l e ts c a n ，u l t r a r e d 气 山东省医学科学院硕士学位论文 s p e c t r u m a n dh i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s t h e n ，t h e t o x i c o l o g yo f p u r i f i e ds a m p l ew a ss t u d i e db ya c u t eo r a lt o x i c i t yt e s t ，a m e st e s ta n dm i c eb o n e m a r r o wp o l y c h r o m a t i ce r y t h r o c y t em i c r o n u c l e u st e s t e f f e c t so ft h eq u a l i t a t i o na n d q u a n t i t yo fb i o f l o c c u l a n ta d d i t i o n ，t e m p e r a t u r e ，p ha n dm e t a li o ns o l u t i o no nw h i c h f l o c c u l a t i n ga c t i v i t yw a si n v e s t i g a t e d ，a n dg a i nc o m p r e h e n s i v ec o m p r e h e n s i o nt o f l o c c u l a t i n gc h a r a c t e r i s t i c so fm i c r o b i a lf l o c c u l a n td s 1 6 t h ec o m p o u n do fm e d i u m a n dc u l t u r ec o n d i t i o no fw e r em i c r o c o c c u sd s16 p r o d u c i n g f l o c c u l a n tw e r e o p t i m i z e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h i so p t i m a lm e d i u mf o r m u l aw a su s e dt o a m p l i f i c a t o r ye x p e r i m e n t ，a n d b i o f l o c c u l a n tw a sa b s t r a c t e df r o mf e r m e n t a t i o n b r o t h ，a n dt h em a n u f a c t u r a lp r o c e s s e st h a tc o u l dg a i nm a x i m u my i e l dw a sg a i n e d r e s u l t s ：t h ep u r es a m p l eo fp o l y s a c c h a r i d eb i o f l o c c u l a n to fm i c r o c o c c u sd s16 w a so b t a i n e d t h ew a v e l e n g t ho f2 5 0a mw a sc o n f i r m e dt ob et h ew a v e l e n g t ho f c h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o nf o rt h ep u r es a m p l et h r o u g hu l t r a v i o l e ts c a n t h eu l t r a r e d s p e c t r u ma n a l y s i sr e s u l td e m o n s t r a t i o nw a s at y p i c a ls p e c t r u mo ft h ep o l y s a c c h a f i d e t h eh i 【g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sr e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tt h em a i n c o m p o n e n t so f t h ep o l y s a c c h a r i d eb i o f l o c c u l a n tw a s r h a m n o s e ，g l u c o s e ，m a n n o s e ，g a l a c t o s e a c u t eo r a lt o x i c i t yt e s to fp o l y s a c c h a r i d eb i o f l o c c u l a n tw a sc l a s s i f i e da s n o n - t o x i ca g e n t ，t h er e s u l t so fa m e st e s ta n dm i c eb o n em a r r o wp o l y c h r o m a t i c e r y t h r o c y t em i c r o n u c l e u st e s tw e r ea l s on e g a t i v e t h ee f f e c to ff l o c c u l a t i o nw a sb e s tb ya d d i n g1 0m g lf l o c c u l a n ta n dt h e f l o c c u l a t i n ga c t i v i t yr e a c h e d9 6 4 6 t h ee f f e c to ff l o c c u l a t i o nw a sb e s tu n d e r c o n d i t i o no f3 0 ( 2a n dt h ef l o c c u l a t i n ga c t i v i t yr e a c h e d9 6 2 t h e f l o c c u l a t i n g a c t i v i t yw a s b e s ta tt h ep h 7 0 k + 、n a + 、c u 2 + a n df e 2 + h a dt h ei n h i b i t o r ya c t i o nt ot h e f l o c c u l a t i n ga c t i v i t y ，c a 2 + a n dm 9 2 + h a dt h ep r o m o t e ra c t i o nt ot h ef l o c c u l a t i n g a c t i v i t y t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o np e r i o do fd s16s t r a i np r o d u c i n gf l o c c u l a n tw a s18 h f e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o nw a ss t u d i e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，a n dt h eo p t i m u m c o m p o n e n tp r o p o r t i o n so fm e d i u mo b t a i n e dw e r e ：0 4 5 k 2 h p 0 4 、0 1 4 n a h 2 p 0 4 、 1 8 l i q u i ds u g a r 、o 5 ( n i - h ) 2 s 0 4 、0 0 4 y e a s te x t r a c t 、0 0 2 m g s 0 4 、0 0 1 4 d s l 6 多糖微生物絮凝剂的制备及安全性评价 c a c l 2 ；t h eo p t i m u mc u l t u r ew e r eu n d e rt h ec o n d i t i o no f3 0 * ( 2 、a g i t a t i o nr a t e1 7 0r p m 、 0 2 v n 。m i na i rv o l u m e 、0 7 6l o a d i n gc o e f f i c i e n t 。b ya d d i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f m n “，i ti sf o u n dt h a tm n 2 + c a ns i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h ep r o d u c t i o no fm i c r o b i a l f l o c c u l a n t t h eh i g h e s to u t p u ti sa c h i e v e db ya d d i n g6m g lm n “，w h i l et h em a x i u m a c t i v i t yo ff l o c c u l a t i o n i so b t a i n e db ya d d i n g2 m g lm n “u n d e rt h ef e d b a t c h f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ，a f t e r1 8hf e r m e n t a t i o n ，t h ed r yw e i g h to ff l o c c u l a n tr e a c h e d 1 3 7 9 几a n df o c c u l a t i n ga c t i v i t yr e a c h e dt o9 7 2 6 t h ef e r m e n t a t i o nb r o t hw a sc o n d e n s e dt h r e e f o l db yf i l t e r i n gw i t hf l a tm e m b r a n e t h e nt h ep r e c i p i t a t i o nw a sw a s h e dt w i c eb ya d d i n gt h r e ev o l u m eo fe t h a n o lt o c o n c e n t r a t e ds o l u t i o n t h ep r e c i p i t a t i o nw a so b t a i n e db yc e n t r i f u g a t i o n ，d r y i n ga n d f i n a l l yc r u s h e di n t op a c k a g e c o n c l u s i o n ：af e a s i b l ec r a f tw a se s t a b l i s h e db yt h o r o u g h i n v e s t i g a t i o no f f a c t o r st h a ta f f e c t e dt h ea c t i v i t yo ff l o c c u l a n t t h et o x i c i t yt e s to fp o l y s a c c h a r i d e s p r o d u c e db ym i c r o c o c c u sd s 1 6p r o v e dt ob es a f e k e yw o r d s ：m i c r o c o c c u sd s l 6 ；p o l y s a c c h a r i d eb i o f l o c c u l a n t ；e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ； t o x i c o l o g y ；f l o c c u l a t i n ga c t i v i t y ； 5 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东省医 学科学院。山东省医学科学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及 申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论 文或成果时，署名单位仍然为山东省医学科学院。 论文作者签名：籁 导师签名：二二二! 竺生 日期： 年_ f 一月兰一日 ， 山东省医学科学院硕士学位论文 o - _ 触青 微生物絮凝剂( m i c r o b i a lf l o c c u l a n t 或b i o f l o c c u l a n t ) 是以特征性微生物菌 体经发酵、提取、纯化而获得的一种安全、高效、且能进行生物降解、无二次污 染的具有对污染物吸附、中和、絮凝功能的大分子产品。微生物絮凝剂主要包括 利用微生物细胞壁提取物的絮凝剂，利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂，直接利 用微生物细胞的絮凝剂和克隆技术所获得絮凝剂。微生物产生的絮凝剂物质为糖 蛋白、粘多糖、蛋白质、纤维素、d n a 等高分子化合物，分子量多在1 0 5 d a 以 上。并且从已报道的微生物絮凝剂来看，成分以多聚糖居多，在功能成分中大多 都含有氨基、羧基、羟基等亲水活性基团i 。由于微生物絮凝剂可以克服无机和 有机高分子絮凝剂本身固有的成本高，絮凝效果有限，存在二次污染且对人体有 害的缺陷。微生物絮凝剂的研究正成为当今世界天然可降解生物絮凝制品研究的 热门领域。 1 微生物絮凝剂的研究进展 1 1国外对微生物絮凝剂的研究进展 早在1 0 0 年前巴斯德( l o u i sp a s t e u r ) 在啤酒酵母中就观察到细胞絮凝现象【2 】。 1 9 7 6 年，n a k n m u r a 等【3 ，4 】从酵母、霉菌、细菌、放线菌等中筛选出1 9 种具有絮凝 能力的微生物，其中酱油曲霉( a s p e r g i l l u ss o j u e ) 产生的絮凝剂a j 7 0 0 2 效果最好。 2 0 世纪8 0 年代，日本仓根隆一郎等【5 6 】从旱田土壤中分离出红平红球菌s 1 ，并将 其产生的微生物絮凝剂命名为n o c 1 ，被认为是目前发现的最好的微生物絮凝 剂。1 9 8 5 年，t a k a g i 等同研究了拟青霉素产生的絮凝剂，并命名为p f l 0 1 。目前 国外仍然有许多科研工作者致力于微生物絮凝剂的研究，如朝鲜、伊朗和日本国 研究发现了一些新的絮凝剂产生菌”0 1 ，其产生的微生物絮凝剂有p y 9 0 、 a s 1 0 1 、a 9 9 、d p 1 5 2 ，其中比较有代表性的是s u h 等f l l 】发现的d p 1 5 2 絮凝剂， 首次发现杆状细菌也能产生絮凝剂。2 0 0 0 年，f u j i t a 刍荨1 1 2 j 由厨房排水沟的乙酸和 丙酸污水中分离到一株能产生物絮凝剂的细菌t k f 0 4 ( c i t r o b a c t e rs p ) ，根据形 态学、生理学及部分1 6 s r r n a 序列，该菌被鉴定为柠檬酸细菌属。2 0 0 1 年，s h i h 等【1 3 j 再次发现了一株杆状细菌c c r c l 2 8 2 6 可产絮凝剂，并指出该絮凝剂的分子 量达2 x 1 0 6 d a ，最适生长环境为中性。近年来，研究重点已从菌种选育等方面过 渡到结构功能及应用方面。2 0 0 3 年新加坡国立大学的d e n t 等f 1 4 】从土壤中分离出 6 d s l 6 多糖微生物絮凝剂的制备及安全性评价 一株粘质杆状细菌，研究了该菌产生的m b fa 9 的组成特性，其用于处理淀粉废 水可使s s 和c o d c r 分别降低8 5 5 矛h 6 8 5 。2 0 0 4 年，z o u b o u l i s l l 5 l 等研究发现一 种微生物絮凝剂能除去垃圾浸出液中的腐殖酸，在p h 7 7 5 ，2 0 m g l 的投加量时 能除去8 5 以上的腐殖酸。2 0 0 7 年，y i m 1 6 l 等发现一种新的絮凝剂p k g 0 3 ，其絮 凝活性达至j j 9 0 以上，p - k g 0 3 是一种高度硫酸化的多糖，凝胶过滤层析测定其平 均相对分子质量为1 8 7 x 1 0 3k d a ；半乳糖是p k g 0 3 主要的糖，其中还有糖醛酸 ( 2 9 ，w w ) 和硫酸基( 1 0 3 ，w w ) ；红外光谱显示羧基的吸收带；热重 分析表明其降解温度( t ( d ) ) 为2 5 0 。 1 2 国内对微生物絮凝剂的研究进展 我国在微生物絮凝剂的研究和应用方面与国外相比虽有很大差距，起步较 晚，但近年来经过中国科学工作者的不懈努力，也筛选出了不少菌株。2 0 0 1 年， 中科院微生物研究所刘紫鹃等【1 7 】分离筛选到一株产絮凝剂的细菌a 2 5 ，鉴定为芽 孢杆菌，研究了a 2 5 产絮凝剂的条件以及絮凝剂的分布情况。2 0 0 3 年，宫小燕【1 8 】 等从土壤中筛选到一株絮凝剂产生菌b y 2 8 ，该菌产生具有较高活性的絮凝剂， 对水中无机悬浮物和有机燃料具有较高的去除率。2 0 0 5 年，李剑等f 1 9 】通过菌种富 集、分离、纯化，从天然土壤中筛选出三株具有较高絮凝活性的微生物絮凝剂产 生菌( m b l 6 5 、m b 6 6 3 、m b 6 6 1 1 ) ，并对其中絮凝活性最高的m b 6 6 1 1 培养基成分进行了正交实验，找出了最佳培养基成分比例。经优化后，m b 6 6 1 1 对高岭土悬浊液的絮凝率可达9 3 6 。2 0 0 7 年，李旭等【2 0 】筛选得到一株对苯酚具 有一定耐受性的絮凝剂产生菌b 2 ( s e r r a t i as p ) ，其产絮凝剂的最佳培养时间 为4 8 h ，絮凝率高于8 0 ；苯酚浓度达0 6 9 r t , 时，b 2 菌的絮凝活性仍高于7 0 。纵 观以上研究成果，主要集中在菌种选育以及实验室小规模的应用研究，目前还没 有比较成熟的产品出现在市场上，也没有形成一定规模的应用。 2 微生物絮凝剂的絮凝机理 微生物絮凝剂是某些种类的细菌、放线菌、真菌、以及藻类等微生物在特定 培养条件下，生长至一定阶段时所产生的具有絮凝活性的代谢产物，其絮凝机理 和作用特点是一个复杂的物理化学过程，人们做过许多假说，现在大多数人认为 絮凝作用机理包括凝聚和絮凝作用过程。凝聚过程是胶体脱稳并形成细小的凝絮 的过程，而絮凝过程是所形成的絮凝在絮凝剂的桥联作用下生成大体积的絮凝体 7 山东省医学科学院硕士学位论文 的过程。总的来讲主要有桥联作用机理、电性中和机理、化学反应机理和卷扫作 用机理【2 。 2 1 桥联作用机理 桥联作用机理是指借助离子键、氢键和范德华力，同时吸附多个胶体颗粒， 在颗粒问起“中间桥梁”的作用，使悬浮物形成一种网状的三维结构而沉淀下来。 微生物絮凝剂是一种高分子线性结构化合物，具有能与胶体表面某些部位起作用 的化学基团，当微生物絮凝剂与胶体颗粒接触时，就起了“中间桥梁”这一作用。 据研究，c a “、础“、f e 3 + 等金属阳离子通过中和高岭土表面的负电荷和增加微 生物絮凝剂在高岭土颗粒表面的吸附而促进微生物絮凝剂的絮凝性能【2 2 j ，这是由 于微生物絮凝剂中暴露的羧基等官能团与这些金属阳离子的“架桥”效果，而羧 基等官能团暴露的数量，又受到由絮凝基因表达的相关酶水平的影响。有关文献 研究认为这些二价和三价离子是通过减少聚合物和颗粒表面的负电荷来增强生 物絮凝剂对悬浮颗粒的最初吸附，以此来增强絮凝的活性【2 3 1 。对于同样单元结构 和分子量的高分子絮凝剂，线型结构同支链结构相比，絮凝剂分子在溶液中的伸 展有效长度更长，这种结构有利于絮凝剂分子同溶液中的颗粒结构相互充分接 触，吸附颗粒。 2 2 电性中和机理 电性中和机理认为水中胶体一般带负电荷，当带有一定正电荷的链状生物大 分子絮凝剂或其水解产物靠近这种胶粒时，就会中和其表面部分电荷，使胶粒之 间、胶粒和絮凝剂分子之间发生互相碰撞而凝聚、沉淀下来。但是相对来说，高 分子絮凝剂的带电性差，对水中较小的颗粒难于捕集与絮凝，处理后的水中还有 些小的不能被吸附的颗粒，所以絮凝时形成的矾花虽然很大，但是处理后水的上 清液并不是很清，当加入一定量的阳离子后，由于异种离子的加入中和了胶体的 部分电荷，降低了其静电斥力，胶体的z e t a 电位降低，有利于发生吸附电中和。 王镇等人1 2 4 l 研究发现加入金属离子或调节p h 即可影响其絮凝效果，主要就是通过 影响其带电性而起作用的。 2 3 化学反应机理 该理论认为生物大分子中某些活性基团与被絮凝物质相应的基团发生了化 学反应变化，进而聚集成较大分子而沉淀下来【2 5 l 。采取物理或化学方法对生物大 8 d s l 6 多糖微生物絮凝剂的制备及安全性评价 分子进行改性，处理絮凝相关活性基团，使其添加或丧失某些活性基团，絮凝活 性就发生很大变化，通过此方法可以研究絮凝剂的絮凝机理是否为化学反应机 理。比如对蛋白、核酸类絮凝剂采取高温处理时，其絮凝活性就会降低，可能的 机理是高温改变了絮凝活性基团，使其不能与被絮凝物质的相应基团发生化学反 应，从而影响其絮凝活性。 2 4 卷扫作用机理 认为当微生物絮凝剂的投加量一定且形成小颗粒絮体时，可以在重力作用下 沉降，此时犹如一个过滤网，迅速网捕，卷扫水体中一些胶粒，从而产生沉淀1 2 6 1 。 3 微生物絮凝剂的絮凝特性 与传统的无机和有机高分子絮凝剂相比，微生物絮凝剂具有如下特点：( 1 ) 高效性，同等用量下，微生物絮凝剂的使用效率明显高于常规絮凝剂；( 2 ) 安 全无毒性，完全能用于食品、医药等行业的发酵后处理；( 3 ) 可生化性，即能 自行降解，不会带来二次污染； ( 4 ) 较高的热稳定性，如将p a e c i l o m y c e ss p 菌 株产生的絮凝剂煮沸后其活性几乎不型2 7 】；( 5 ) 用途广泛，脱色效果显著，对 多种絮凝颗粒以及合成高分子的可溶性色素物质都具有优良的凝聚能力； ( 6 ) 能产生絮凝剂的微生物种类多，生成快。易于采取生物工程手段实现产业化，且 生产成本低。 4 影响絮凝活性的因素 微生物絮凝剂的絮凝活性受多种因素的影响。 4 1 培养基中的营养成分 微生物培养基中主要有六大营养成分：碳源、氮源、能源、生长因子、无机 盐和水。不同微生物生长代谢过程中对六大要素的要求及各成分的含量是不一致 的，因而在不同的培养基条件下产生的絮凝剂是不一样的。过高的氮源会导致处 于潜伏期的微生物细胞获得充足的营养，从而大量分裂增殖，菌体数目快速增加， 而絮凝活性反而下降；过高的碳源可能会使絮凝活性有一定程度的提高，但由于 菌体缺少营养而过早进入停止期，从而不再分泌代谢产物。因而在培养过程中必 须给予合适的碳氮比。无机盐在培养过程中也起着非常重要的作用，可以提供一 定的缓冲能力，其中的一些金属离子还能促进酶活，进而影响絮凝活性。 4 2 培养条件 9 山东省医学科学院硕士学位论文 微生物的培养受温度、p h 、通气量、搅拌速度等因素影响，从而影响到絮 凝活性物质的产生【捌。当微生物处于合适的生长温度时，体内的各种酶都处于活 跃状态，促进代谢，刺激菌体生长；而当温度不适宜，过高或过低时，则导致微 生物的形态和代谢都发生相应的改变，或者使体内的蛋白质等大分子物质发生变 性失活从而使菌体死亡。p h 值对絮凝活性也有很大的影响，主要是改变絮凝物 质的带电能力。过高的通气量和搅拌速度可能会打断絮凝剂分子或者不利于高分 子絮凝剂的形成，而絮凝剂的分子量越大其絮凝活性在某种程度上越高。 4 3 絮凝剂自身的性质 微生物絮凝剂的分子构型以线性直链为佳，线性结构利于吸附胶体颗粒形成 大的絮块，而交联和支链结构会因空间位阻使吸附效率降低。分子量越大则分子 链就越长，所带电荷和活性吸附部位就越多，架桥效应、电中和效应和卷扫效应 就越显著，絮凝越彻底。但是分子量过大，分子链必然会因过长而折叠，反而会 影响胶粒的靠近，削弱絮凝效果【2 9 ，3 0 l 。微生物絮凝剂所带电荷多为负电荷，应用 于阳离子型废水的处理效果比较明显，而且在这种环境中更利于分子结构的伸 展，更容易形成分子与胶体颗粒间的架桥吸附；张永波等1 3 1 】研究发现微生物絮凝 剂适宜于处理阳离子型废水，对阴离子型废水作用不大甚至没什么作用。 4 4 使用微生物絮凝剂时所处的环境 使用微生物絮凝剂时的环境对絮凝效果有很大的影响。微生物絮凝剂的使用 有一个最佳投放量，过多过少都会影响絮凝效果。陈宗洪【3 2 】认为，絮凝剂的最佳 投放量应为固体颗粒表面吸附大分子化合物达到饱和时吸附量时的一半，因为此 时架桥机率最大。实际废水处理过程中所需剂量非常小，每升废液中微生物絮凝 剂的投放量一般在几百微克到几毫克之间。使用时的温度对絮凝活性的影响主要 是作用于化学基团，使某些大分子物质失活或变性，蛋白、核酸类絮凝剂较多糖 类更容易受温度的影响。环境中的p h 主要是影响絮凝剂的带电状况，进而影响 絮凝效果，使用时的最佳p h 多在2 1 0 之间。一定浓度的金属离子能够增强絮凝 活性，有人认为金属离子的存在降低了胶体颗粒的表面电荷，促进了絮凝剂分子 与颗粒以离子键结合；也有人认为是阳离子直接影响了细胞壁的通透性，改善了 絮凝剂自身性质1 3 3 j 。 5 微生物絮凝剂应用方面的研究 1 0 d s l 6 多糖微生物絮凝剂的制备及安全性评价 与有机高分子絮凝剂相比，微生物絮凝剂具有絮凝范围广、活性高、安全无 毒、不污染环境等特点，而且作用条件粗放，具有光谱絮凝活性，因此，可以广 泛用于给水和污水处理。 k a e w c h a i l 3 4 】等分离的b a c i l l u ds u b t i l i ss m 2 9 、w d 9 0 、s m 3 8 对棕榈油厂的废 水具有很好的絮凝效果，絮凝率分别达到9 4 2 9 、9 0 6 9 、8 7 8 4 ；在4 5 。c 和 好氧条件下，棕榈油厂的废水分别经过这3 株菌4 8 h 的处理后，能从黑棕色脱色至 浅黄色，并且分离不出油。柴晓利【3 5 1 等分离 1 钆4 z o m o n a ss p 产生的微生物絮凝剂 对n 盯废水处理后，c o d 去除率为2 3 9 ，色度去除率为2 6 2 ，对燃料废水c o d 和色度的去除率分别为3 2 2 和5 4 。 6 微生物絮凝剂的发展前景 目前，我国虽然有很多科学工作者从事絮凝剂方面的工作，而且也选育出不 少优良菌株，但大部分仍然停留在实验室阶段。鉴于国内外的研究现状，其主要 发展前景体现在以下几个方面： 6 1 微生物絮凝剂的理化性质及絮凝机理研究：不同微生物分泌的絮凝剂性质 不同，结构亦不同，为了减少研发中的盲目性，需要利用现代生物技术对其结构 组成，理化性质做更深入细致的研究，在系统深入研究的基础上准确揭示微生物 絮凝剂的絮凝机理，为其能够更广泛的应用打下理论基础。 6 2 微生物絮凝剂的应用研究：现在对絮凝剂的应用也都只是实验室小试阶段， 建议今后的工作重点是应用于废水的实际处理，逐步取代传统的絮凝剂，并大幅 提高废水处理效果及降低成本。深化微生物絮凝剂的基础理论研究，优化絮凝的 工艺参数，提高絮凝效果。研究微生物絮凝剂与其他絮凝剂的配合使用，优势互 补，缩短处理流程，减少絮凝剂的投加量。 6 3 微生物絮凝剂的生产工艺研究：研究并探索最优培养条件及生产条件，早 日实现工业化大生产。 7 本实验重点要解决的问题 实验室在研究中筛选到一株微球菌d s l 6 ，其代谢产物在城市自来水厂、煤 矿、炼钢厂等水体的处理中具有良好的絮凝活性，应用前景极为广阔。在前期工 作中对碳、氮源等培养基成分及条件进行了初步筛选，但是絮凝剂产率不是很稳 定，不适合大规模工业生产；对影响絮凝活性的因素研究的不够深入，并且没有 山东省医学科学院硕士学位论文 对产品在实际应用中的安全性进行研究。针对这些问题，本项研究拟在前期研究 的基础上，提高发酵产率和产品收率，降低生产成本，建立一套成熟的生产工艺； 同时对絮凝活性进行进一步研究以指导产品的实际应用；并对该产品的安全性采 取相关研究，从而研发出一种安全、高效的新型微生物絮凝剂。 1 2 d s l 6 多糖微生物絮凝剂的制备及安全性评价 第一章微球菌d s l 6 产絮凝剂的提纯分析及安全性评价 微生物絮凝剂( m i c r o b i a lf l o c c u l a n t ) 是一种对污染物具有吸附、中和和絮 凝作用的大分子产品，它具有安全、高效、易生物降解、无二次污染等特点。微 生物絮凝剂可应用于城市自来水厂、中水厂、污水处理厂等的水处理，还可应用 于医药制药、食品行业、发酵工程、煤矿、电厂等领域，有望替代传统的化学制 品。因此，微生物絮凝剂正成为微生物学研究的热门领域。由于研究本产品的目 的是用生物质代替化学品，其基本性质应该是无毒、无害。生物制品首先应使用 安全，进而在使