（微生物与生化药学专业论文）适体筛选过程中检测方法的初步探索.pdf

捅要适体筛选过程中检测方法的初步探索微生物与生化药学专业硕士研究生：陈号指导老师：李竞副教授、田晋红副教授摘要核酸适体是从随机序列中筛选出来的一段由d n a 或r n a 分子组成的寡核苷酸，能特异性地结合蛋白质、有机物小分子、金属离子等各种配体。通常是由2 0 6 0个碱基组成，通过指数富集配体系统进化( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i f le n r i c h m e n t ，s e l e x ) 技术从人工构建的随机单链寡核酸文库里筛选出来。在核酸适体筛选的过程中，适体的监测和核酸适体的分离是筛选的关键，也是目前的两大难题。如何在筛选过程中对核酸适体进行有效的监测，成为了影响适体筛选的一个重要因素。本文在范茂棉筛选核酸适体方法的基础上，以双链随机d n a 文库作为出发库，以不同的检测方法对可溶性和颗粒性靶标适体的筛选及筛选过程进行监测。文中探索了三种监测方法，其中酶活性抑制法效果不佳，血凝抑制试验及硫醇探针法可行。尤其是硫醇探针法是一种简单、灵敏、有效的监测方法，它不仅可用于适体筛选中的监测，还可用它建立所筛选适体快速检测靶标的方法，这为适体的筛选和应用拓宽了道路。1 酶活性抑制法监测p 内酰胺酶适体的筛选：用双链随机d n a 文库作为出发库，以b 内酰胺酶作为靶标，经过1 3 轮快速筛选，聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e )显示有目的核酸条带，用该条带的纯化的和没有纯化的p c r 产物作为检测对象。用碘量法测定了核酸对p 内酰胺酶活性的抑制试验，结果表明：筛选到的目的寡核苷酸片段不能有效抑制p 内酰胺酶的活性。2 凝血抑制试验监测人a 、b 和o 型红细胞表面膜适体的筛选：同样以双链随机d n a 文库作为出发库，人a 、b 和o 型红细胞表面膜结构为靶标，经过1 3 轮快速筛选，经p a g e 电泳显示有目的核酸条带。用a b o 血型定型试剂( 单克隆抗体) 对纯化的和没有纯化的p c r 产物进行检测，采用血凝阻断试验检测该目的寡核苷酸片段的亲和力和特异性，结果表明：所筛到的目的寡核苷酸片段在规定时间内并不能阻断血凝。3 硫醇探针监测家蚕微孢子表面结构适体的筛选：用家蚕微孢子作为靶标，从双链随机d n a 文库出发，经过1 3 轮筛选，通过p a g e 电泳证实在相应的位置有目的寡核酸条带。根据硫醇探针定性和定量检测硫醇的原理，建立了硫醇探针监v两南大学硕十学何论文测适体筛选过程的方法。优化了荧光素5 马来酰亚胺硫醇荧光探针传感体系，并利用该体系检测了家蚕微孢子目的寡核苷酸的特异性，结果表明：该方法能作为适体筛选中的有效监测手段。此方法为核酸适体筛选过程中适体的检测提供了新的思路，使检测更加快捷、方便，而且可以进行示踪检测。关键词：核酸适体快速法荧光探针检测t h qp l o r i n gp r o c e s so fd n aaptalh ee x p l o r i n gp r o c e s sa p t a m e r0 iu 刷s c r e e n i n 未m e t h o d sf o rd e t e c t i o nc a n d i d a t e ：c h e nh a os u p e r v i s o r ：l ij i n gt i a nj i n h o n ga b s t r a c ta p t a m e ri st h eo l i g o n u c l e o t i d es e l e c t e df r o mar a n d o ms e q u e n c ew h i c hi sc o m p o s e do fad n ao rr n am o l e c u l e s a p t a m e rc a l ls p e c i f i c a l l yb i n dp r o t e i n s ，s m a l lo r g a n i cm o l e c u l e s ，m e t a li o n sa n do t h e rl i g a n d s a p t a m e ru s u a l l yc o n s i s to f 2 0t o6 0b p ，s c r e e n e do u tf r o mt h ea r t i f i c i a lr a n d o ml i b r a r yo fs i n g l e - s t r a n d e do l i g o n u c l e o t i d e st h r o u g hs y s t e m a t i ce v o l u t i o nb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t d u r i n gt h ea p t a m e rs c r e e n i n gp r o c e s s ，a p t a m e rm o n i t o r i n ga n ds e p a r a t i o na r et h ek e yp r o b l e m sa n dt w od i f f i c u l tp r o b l e m s i nt h es e l e c t i o np r o c e s s ，h o wt om o n i t o ra p t a m e re f f e c t i v e l yi sa ni m p o r t a n tf a c t o rw h i c hc a l la f f e c ts e l e c t i o n t h i sa r t i c l ei sb a s e do nt h eb a s i cp r i n c i p l eo fs e l e xs c r e e n i n gt e c h n o l o g y , f u r t h e ri m p r o v et h es c r e e n i n gm e t h o d t h r o u g ho n e s t e ps c r e e n i n g ，u s i n gd o u b l e s t r a n d e di n i t i a t i o n , w es h o r t e n e dt h es c r e e n i n gt i m e ，s i m p l i f i e dt h es e l e c t i o np r o c e s sa n dp r o v i d e das i m p l e ra n dm o r ee f f i c i e n tw a yf o rt h es e l e c t i o no fa p t a m e r i nt h i sp a p e r , w es c r e e n e dd i f f e r e n tt a r g e tw h i c hc a ns p e c i f i c a l l yb i n da p t a m e ri no r d e rt oe x p l o r et h ea p t a m e rs e l e c t i o np r o c e s sm o n i t o r i n gm e t h o d t h ee x p l o r a t i o no fd i f f e r e n tm o n i t o r i n gm e t h o d sp r o v i d e san o v e li d e af o ra p t a m e rm o n i t o r i n ga n de n r i c h sm o n i t o r i n gm e t h o dd u r i n gt h ea p t a m e rs e l e c t i o np r o c e s s t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ：1 w ba p p l yo n e s t e pm e t h o dt os c r e e n1 3 - 1 a c t a m a s ea p t a m e r , a f t e ro n er o u n do fs c r e e n i n g ，s u c c e s s f u l l ys c r e e n e dt h ec o r r e s p o n d i n ga p t a m e r ,u s i n gp a g ee l e c t r o p h o r e s i st od e t e c tt h ea f f i n i t yo fa p t a m e r , a n du s i n gi o d o m e t r i cm e t h o dt od e t e c tt h es p e c i f i c i t yo fa p t a r n e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h es c r e e n e da p t a m e rh a v eag o o da f f i n i t y 埘廿l1 3 - 1 a c t a m a s e ，b u tc a n n o ti n h i b i tt h ea c t i v i t yo f1 3 l a c t a m a s e 2 w ea p p l yo n e s t e pm e t h o dt os c r e e nt h ea p t a m e ro fr e db l o o dc e l ls u r f a c em e m b r a n es t r u c t u r e ，a f t e ro n er o u n d o fs c r e e n i n g ，s u c c e s s f u l l ys c r e e n e dt h ec o r r e s p o n d i n ga p t a m e r , u s i n ga n t i - aa n da n t i bb l o o dg r o u p i n gr e a g e n t st od e t e c tt h ea f f i n i t yo fa p t a m e r b l o c k i n gb l o o dc l o t t i n gu s i n gc o a g u l a t i o ni n h i b i t i o nt e s tt od e t e c tv l i两南大学硕士学位论文a p t a m e rw h e t h e rc a nb l o c kb l o o dc l o t t i n go rn o ta n db yt h i st od e t e c tt h ea f f i n i t ya n ds p e c i f i c i t yo fa p t a m e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：硼1 es c r e e n e da p t a m e rw i t h i nt l l ep r e s c r i b e dt i m ed i dn o tb l o c kt h eb l o o dc l o t t i n g ，a n dh a v eal o wa f f i n i t y 谢t l lr e db l o o dc e l ls u r f a c em e m b r a n es t r u c t u r e 3 w ea p p l yo n e s t e pm e t h o dt os c r e e nn o s e m aa p t a m e r , a f t e ro n er o u n do fs c r e e n i n g ，s u c c e s s f u l l ys c r e e n e dt h ec o r r e s p o n d i n ga p t a m e r b a s e do nf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o np r i n c i p l e ，w eo p t i m i z et h ef l u o r e s c e n t 一5 一m a l e i m i d ea n dt h i o lf l u o r e s c e n c ep r o b es e n s i n gs y s t e mp r e l i m i n a r i l y , d e t e r m i n i n gt h es y s t e mv o l u m ea n dc o n c e n t r a t i o no ft h ev a r i o u sc o m p o n e n t s ，t h ee l u t i o nt i m e so ft h ea p t a m e rw h i c hc a n n o tb i n d 、i t l lt h et a r g e t ，t h ee l u t i o nt i m e so ff r e et h i o lp r i m e ra n de x c i t a t i o nw a v e l e n g t ho p t i m i z a t i o n w eu s e dt h i ss y s t e mt od e t e c tt h ea f f i n i t ya n ds p e c i f i c i t yo fn o s e m aa p t a m e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h i sa p t a m e rh a dag o o da f f i n i t y 、析n ln o s e m a t h i sm e t h o dp r o v i d ean e ww a yt oa p t a m e rd e t e c t i o nd u r i n gt h ea p t a m e rs e l e c t i o np r o c e s s ，m a k i n gd e t e c t i o nf a s t e ra n dm o r ec o n v e n i e n t ，a n dc a nt r a c ed e t e c t i o n k e yw o r d s ：a p t a m e ro n e r s t e pm e t h o df l u o r e s c e n c ep r o b ed e t e c t i o主要缩略语表主要缩略语表_ l _ l _ l - _ _ _ _ _ _ _ i - l l _ 一l缉量一英文中文一一：d n ad e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸r n ap a g es s d n ad s d n aa r gl y sf m nc a m pp c rk db pk de l i s ae m s af c mq c ma f mp b so dp hr i b o n u c l e i ca c i dp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i ss i n g l e - s t r a n d e dd n ad o u b l e s t r a n d e dd n aa r g i n i n el y s i n ef l a v i nm o n o n u c l e o t i d ec y c l i ca d e n o s i n em o n o p h o s p h a t ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nk i l o d a l t o nb a s ep a i rd i s s o c i a t i o nc o n s t a n te n z y m e - l i n k e di m m u n o s p e c i f i ca s s a ye l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a yf l o wc y t o m e t r y核糖核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳法单链脱氧核糖核酸双链脱氧核糖核酸精氨酸赖氨酸黄素单核苷酸环磷腺苷聚合酶链式反应千道尔顿碱基对解离常数酶联免疫特异性测定电泳迁移率变动分析流式细胞计q u a r t zc r y s t a lm o n i t o r石英晶体监控器a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y原子力显微镜p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n eo p t i c a ld e n s i t yp o w e ro fh y d r o g e n磷酸盐缓冲盐水光密度酸碱度d m s od i m e t h y ls u l p h o x i d e二甲基亚砜- _ _ _ _ _ - _5 7独创性声明本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者：1 好一，签字日期：沙，口年6 月j 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密期限至年月止) 学位论文作者签名：彳砑、骂签字日期：加j 口年多月f 日导师签名：多套乞签字日期：扣d 年彭月j 日第一苹文献综述第一章文献综述1 1 核酸适体研究进展1 1 1 核酸适体核酸适体【1 i 是从随机序列中筛选出来的一段由d n a 或r n a 分子组成的寡核苷酸，能特异性地结合蛋白质、有机物小分子、金属离子等各种配体。核酸适体通常是由2 0 - - 6 0 个碱基组成，通过指数富集配体系统进化( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ，s e l e x ) 技术从人工构建的随机单链寡核酸文库里筛选出来。在筛选之前，能与靶标结合的分子数日很少，但是在经过多次筛选和扩增后，与靶标分子高度特异结合的d n a 或r n a 分子即呈指数级增长1 2 1 。经s e l e x 筛选出来的寡核苷酸称为“a p t a m e r ，它包括单链d n a 、双链d n a 、r n a等多种形式的寡核苷酸，其配体的性质各异。a p t a m e r 源于拉丁语a p t u s t 3 1 ，即钟，适应配对之意，也可翻译为核酸识体、核酸适配子、核酸适配体等。核酸适体与一般寡核苷酸组成相同，它不是携带遗传信息的线性分子，和t r n a 一样，它是具有一定空间构像的球形分子1 4 1 。稳定的三级结构是其与靶标高效特异结合的基础。在大多数情况下，溶液中的单链d n a 或r n a 的空间构像是不确定的，当靶标分子存在时，单链d n a 或r n a 发生适应性折叠，形成发夹( h a i r p i n ) 、假结( p s e u d o k n o t ) 、凸环( b u l g e ) 、g 一四分体( g - q u a r t e o 等特殊三维空间结构，通过氢键、疏水堆积作用、范德华力等与靶分子紧密结合【5 1 。这种特性能使核酸适体识别靶标分子间如一个甲基、羟基或d l 镜像体间的极其细微的差别。核酸适体与靶标分子的结合不依靠常规的核糖磷酸骨架的亲和力，而是通过“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、静电作用和形状匹配等产生高效特异的结合力1 6 】。“假碱基对”的堆积是指配体的芳香环部位与核酸分子的碱基平面平行，并有重叠，类似于核酸分子里的碱基堆积作用。在多数的核酸识体一配体复合物里，尤其是核酸识体一蛋白质复合物，堆积作用扮演一个关键角色，其次是氢键作用1 7 1 。图1 1 所示的是凝血酶s s d n a a p t a m e r 的空间结构示意图，它主要由2 9 个脱氧核糖核苷酸组成，形成了含有两个g 四分体结构的特殊三维结构f 8 j 。凝血酶a p t a m e r 与凝血酶的结合主要是通过a p t a m e r 特殊的g 四分体结构与凝血酶侧链上的a r 9 1 2 6 、l y s 2 3 6 、l y s 2 4 0 和a r 9 9 3 ，这几个在生理条件下带正电荷的氨基酸之间的静电相互作用【9 1 ( 图1 2 ) 。n g u y e nd h t l 0 1 等人在利用磁共振波谱法研究孔雀绿与其r n a 适体相互作用时发现，孔雀绿( 配体) 在适体的诱导下产生了电荷分布及构像的变化，提示适配体间的识别是相互诱导的适应性识别。核酸适体与靶标分子的结合是结构依赖性，即只识别与其互补的空间结构，而不是序列依赖性，这一特性同抗原和西南大学硕士学位论文抗体结合的特性很相似。核酸适体与靶标分子问的亲合力通常要强于抗原抗体之间的亲合力，解离常数在皮摩和纳摩之间【1 1 i 。凡是涉及到抗体的应用领域，几乎都可以用核酸适体来替代。核酸适体的出现，冲破了传统意义上关于核酸只是遗传信息存储和转运载体的认识，利用核酸适体结构的多样性，可使它与各种靶标分子产生高选择性的结合。由于核酸适体具有易台成、易存储、易修饰等优点，它在蛋白质一核酸诊断和治疗、传感器、分子开关等诸多方面的应用引起了人们的极大兴趣。圈1 1 凝血酶s s d n a - a p t a m e r 的空间结构示意圉( 其主体结构两个g 一四分体已犏上号) 圈1 2 凝血醇a p t a m c r 与凝血酶结合复合物的空闻结构m第一苹文献综述1 1 2 核酸适体的特点和优势核酸适体和靶标分子的结合和抗原抗体间的结合相似，但它具有许多明显优于抗体的优势【1 2 1 。1 1 2 1 适体亲和力和特异性好经多次筛选获得的核酸适体与靶标分子有很高的特异性和亲和力，解离常数经常在p m o l l 和n m o l l 之间，高于其它类型的配体，有些甚至强于其天然配体，几乎完全可以避免非特异性结合。核酸适体能够分辨不同靶标分子结构上一个基团的细微差别，甚至能识别同一蛋白分子的不同构像、不同功能状态。核酸适体与靶标分子之间有较大的接触面积( 3 0 4 0 i m l 2 ) ，靶标分子方面极其细微的变化即可被核酸适体感知，形成了识别的高度特异性【1 3 1 。1 1 2 2 适体靶分子结合范围较广寡核苷酸随机区的每个核苷酸种类都存在4 种可能性( a 、t 、c 或g ) ，如果随机区有n 个核苷酸，那么随机序列的多样性有4 n 种。假设随机区域长度为3 0个核苷酸左右，文库的含量就能达到1 0 1 4 - 1 5 1 3 】。另外单链寡核苷酸很容易形成各种形状的二级结构和三级结构。随机文库中寡核苷酸随机序列的多样性决定了寡核苷酸立体构像的多样性，多达1 0 1 4 以上的随机寡核苷酸所蕴含的丰富的核苷酸立体构象可与自然界存在的几乎所有种类的分子发生作用。抗体只可以与抗原结合，酶只与其底物结合，单链d n a 只与其碱基配对的单链d n a 结合，而核酸适体除了能与蛋白质 1 4 , 1 5 , 1 6 1 、核苷酸( d n a 或r n a ) 等大分子结合外，还可以和染料【1 7 1 、金属离子 1 s , 1 9 | 、药物1 2 0 , 2 2 1 ( 如咖啡因和茶碱等) 、辅因子( 如f m n 和c a m p 等)1 2 3 , 2 4 1 、生长因子【2 卯、类固醇、糖类【2 6 ，2 7 1 、氨基酸( l 精氨酸) 1 2 8 等小分结合子，甚至可与超分子结构如完整的细胞1 2 9 1 、病毒【3 0 1 、孢子结合，就连很难用做半抗原的毒素和朊病毒也能被核酸适体特异性识别。相比之下，抗原性弱的蛋白很难获得其抗体，抗体的靶分子范围也窄得多【”1 。1 1 2 - 3 适体制备方便抗体的筛选和制备周期长，从免疫动物或细胞培养到蛋白纯化至少需要3 6 个月，且筛选和制备过程繁琐，成本昂贵。而适体是由体外筛选和扩增获得的，不需要免疫动物或培养细胞，有极佳的准确性和重复性，有很高的纯度，可以避免产生批间差异。s e l e x 筛选周期一般只需2 3 个月，目前，s e l e x 程已实现了自动化，随着b l a c k w e l l 、w e i n t r a u b 、b e c k m a nc o u l t e r 和b i o m e k2 0 0 0 等自动化西南大学硕七学何论文工作站的应运而生，适体的制备将更快速、更经济。1 1 2 4 适体稳定性好d n a 适体稳定性较好，r n a 适体在嘧啶戊糖2 位引入氨基或氟后，能抵抗r n a 酶降解，也有较好的稳定性，便于长期保存和运输【3 1 1 。适体在变性的条件下分离纯化，稳定性好，可长期保存，在常温下运输。适体耐受性好，可以在不同温度、盐浓度、变性剂等条件下反复变性和复性，可逆且速度快，可反复使用、长期保存和室温运输。1 1 2 5 其它除此之外，核酸适体还有许多优于抗体的优势。例如，无免疫原性，可在体内反复使用；在合成过程中，各种报告分子( 荧光素或生物素) 和功能集团可精确地结合在操作者能识别的核酸适体位点上；分子较小、稳定性好：适体( 8 x 1 0 3 1 5 x 1 0 3 ) 比抗体分子小，易于通透细胞膜进入细胞内，可以检测细胞内的靶分子，应用更灵活方便；易修饰性：适体为寡核苷酸片段，可进行精确的位点修饰，且修饰后的适体保持原有的生物活性【3 2 1 。1 2 核酸适体的筛选s e l e x ( 指数富集配体系统进化) 是筛选适体的主要方法，也是到目前为止最重要的筛选方法。s e l e x 是2 0 世纪9 0 年代初发展起来的一种新的组合化学技术。1 9 9 0 年，美国科罗拉多大学( u n i v e r s i t yo fc o l o r a d o ) 的t u e r k 和g o l d f 3 3 1 ，报道了一种新的体外筛选与p c r 扩增相结合的组合化学技术，他们成功地从随机寡核苷酸文库中筛选出具有高亲和力，特异性结合噬菌体t 4 聚合酶的寡核苷酸适体。同年，e l l i n g t o n 等【3 4 1 也采用相同的技术筛选到有机染料的寡核苷酸适体。因为这种组合化学技术的筛选流程包含和达尔文进化理论一样的三个过程，分别是自发突变、自然选择和大量增殖，因此命名为“指数富集配体系统进化”( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i e h m e n t ，s e l e x ) 技术f 3 5 】。1 2 1s e l e x 技术的原理s e l e x 的基本原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度在2 0 6 0 b p 左右，文库容量在1 0 1 4 1 0 ”之间。由于单链随机寡核苷酸片段特别是r n a 易形成发卡、口袋、假节、凸环、g 四聚体等二级结构，能与蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有机物，甚至金属离子结合，形成具有很强结合力的复合物。利用这一原理，将随机寡核苷酸文库与抗原或药物等靶标分子相互作用，洗脱筛选出特异寡核苷酸配基( a p t e m e r ) ，经p c r 或r t - p c r4及体外转录生成新的次一级文库，再与该靶标分子结合。反复数个循环，即可筛选出能与该靶标分子特异结合的寡核苷酸片段( 圈1 3 ) 。圈1 3s e l e x 技术路墟图州( i ) 桉酸库与靶物质孵育( i i ) 击除来结合靶物质的辕酸( i i i ) 将靶物质与结台的核酸分离( i v ) 将该部分核酸扩增1 2 2s e l e x 技术筛选的基本程序s e l e x 技术筛选各种分子的程序基本大同小异，大多采用亲和方法，即固定配体。一般分以下几个步骤t( 1 ) 在体外化学合成一个含有极多随机序列( 包括靶序列) 的单链寡核苷酸库，库容量在1 0 1 4 1 0 ”之间。随机寡核苷酸文库可以是d n a 文库，也可以是r n a 文库，一般以r n a 文库常见。合成的寡核苷酸文库中间为随机序列，中间随机序列不能太长也不能太短，太长可能由于全套文库单链寡核苷酸序列一定，导致降低了选择分离出来的配基的概率，并且会增加合成的难度，同时增加成本；太短可能会导致没有足够的二级结构和靶标分子结合，随机序列一般为2 0 6 0 b d 。随机寡西南大学硕十学何论文核苷酸文库两端为固定序列，固定序列是为增加文库的稳定性和扩增做准备，两端的固定引物序列作为p c r 引物的识别序列。如果筛选的是r n a 适体，需要在5 端固定引物序列前加一个加一段便于进行体外转录的t 7 启动子序列，可被t 7 r n a聚合酶识别，并合成相应的p c r 引物。为了提高适体的稳定性，增加其功能多样性及生物利用度，可以对寡核苷酸进行化学修饰，构建各种不同的s e l e x 修饰基团文库：如抗核苷酸酶修饰基团、有利于适体复制、扩增的修饰基团、结构类似物修饰基团等【3 7 1 。从理论上讲，自由核酸的长度越大，库容就越大，但一般说来与蛋白或其它分子相互作用的核酸序列不会超过1 0 0b p ，多集中于1 5 4 5 b p 之间。为保证p c r 扩增的效果，寡核苷酸两端应为a t 丰富区且不应有对称结构。p c r扩增时，为防止某些特殊序列的超比例扩增，循环次数一般不超过2 0 次，但为保证库容量，加大体系进行大规模扩增是必需的【3 8 】。表1 1 不同随机区域长度时随机寡核苷酸文库的容量随机区域长度随机寡核苷酸文库的容量( 2 ) 将随机寡核苷酸文库在特定缓冲体系和温度下和靶标物质温育，形成靶标物质核酸的复合物，根据靶分子的特性，一般选择室温或者3 7 c 1 3 9 1 。此步中，可以同靶标物质亲和作用的特异性序列非常少，只有通过物理分离技术加以纯化。靶标物质核酸的复合物通过洗脱、亲和层析法、硝酸纤维素膜过滤、变性凝胶电泳法或磁珠等分离技术与未结合的序列分离。( 3 ) 将筛选到的蛋白核酸复合物分离，分离出的结合序列经p c r 或r t - p c r扩增。p c r 产物变性成单链以准备进行下一轮筛选，若筛选对象为r n a ，则需先反转录为d n a ，然后扩增成为d s d n a 并进行体外转录生成次一级文库，这种扩增达到了达尔文进化论中的大量增殖的效果。次一级文库作为下一轮筛选使用的d n a 模板，然后继续循环进行相同的步骤，随筛选轮数的增加，寡核苷酸与靶分子的亲合力逐渐增强，最后得到亲合力和特异性很高的核酸适体，再与原靶目标温育，进入第二轮筛选。随着筛选严谨度( 温度、p h 值、金属离子、靶目标浓度、温育时间等) 的不断增加，低亲和力序列逐渐被淘汰。在每轮筛选的同时，设立平6第一章文献综述行的亲和力检测实验。经过大约8 1 5 轮筛选富集后，与靶目标高度特异结合的核酸适体呈指数级增长，k d 值逐渐下降，亲合力逐渐增加。( 4 ) 经过多次的选择性分离扩增后，达到了饱和状态。采用p c r 或r t - p c r扩增筛选出的适体分子，将其克隆入质粒载体，挑选若干克隆测序，分析适体分子可能形成的空间结构及其特征，并进一步鉴定不同适体分子与靶分子亲合力1 4 0 。1 2 3 快速法2 0 0 8 年范茂棉【4 l 】等人提出了一种与传统的s e l e x 技术筛选适体不同的方法，新方法用d s d n a 文库筛选，只需要进行1 2 轮便可筛选到适体。他们根据d e c的原理，建立了用双链随机d n a 快速筛选特异性适体的方法。图1 4 快速法流程图其机理是d s d n a 与靶标相遇时，如与d s d n a 有一个结合的切入点，则d n a双链就会像打开拉链样被彻底打开变成单链，其中一条s s d n a 会与靶标形成特异7西南大学硕十学位论文性结合关系。把它与d s d n a 分离，扩增s s d n a 就得到特异性的适体。图1 4 显示了快速法的筛选程序。将s s d n a 经过p c r 扩增为d s d n a 文库，靶标与d s d n a 文库在特定缓冲体系和选定的温度下作用，能与靶标特异性结合的d s d n a 被打开，形成s i n g l e s t r a n d e d ( s s ) 的d n a t a r g e t - b o u n d 复合物，然后通过水洗将s i n g l e s t r a n d e d ( s s ) 的。d n a t a r g e t b o u n d 复合物与游离的s s d n a ，d s d n a 分离开来，然后p c r , p c r 扩增产物即用于克隆测序。1 3 核酸适体监测方法的研究进展在经过多轮筛选过后，需要对核酸适体进行特异性和亲和力检测，以便分析适体的特异性和亲和力。目前，对核酸适体的检测，有如下几种方法：e l i s a 检测、斑点杂交、流式细胞仪、磁性纳米颗粒、传感器、原子力显微镜、凝胶迁移阻滞实验、分子信标等多种方法。1 3 1e l i s a 检测酶联免疫法( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 是最常用的检测适体与靶标亲和力的方法。酶联寡核苷酸适体分析方法的基本原理是酶分子与5 ，端生物素化的适体共价结合，此种酶标记适体可与吸附在固相载体上的靶标分子发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应。此种显色反应可通过e l i s a 检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和适体靶标复合物反应的特异性结合起来，使e l i s a 方法成为一种既特异又敏感的检测方法。祝军【4 2 】等，通过利用生物素和亲合素放大系统应用于e l i s a 试验，对a n e p i i i的s s d n a 寡核苷酸适配子亲合力进行了定量分析测定，与e m s a 凝胶阻滞定性分析寡核苷酸适配子亲合力的实验结果相同，证明该方法完全可以替代放射性荧光标记方法进行定量分析测定，克服了放射性同位素探针标记检测方法的许多缺点，实现了非荧光标记定量检测微量物质的实验目的，解决了s e l e x 筛选中寡核苷酸适配子亲和力定量分析问题，为构建s e l e x 筛选的技术平台奠定了基础。唐吉军【4 3 j 等，采用毛细管电泳技术筛选蓖麻毒素的核酸适体，为进一步分析获得文库的特异性，设计了基于适配子的酶联免疫实验，选择与蓖麻毒素结构、性质极为相似的相思豆毒素以及无关蛋白作为对照。结果证实富集得到的序列具有较好的特异性，而其它几种蛋白无特异性。8第一章文献综述1 3 2 斑点杂交斑点杂交( d o tb l o t ) 是指将待测的d n a 变性后点加在硝酸纤维素膜( 或尼龙膜，n c 膜) 上，用已标记的探针进行杂交，洗膜( 除去未接合的探针) ，放射自显影，判断是否有杂交及其杂交强度。唐吉军阳】等，还设计了基于适配子的斑点杂交实验检测适体的特异性，结果表明富集得到的序列具有较好的特异性，而其它几种蛋白无特异性，结果与酶联分析的结果完全一致。1 3 3 流式细胞术流式细胞术( f l o we y t o m e t r y , f c m ) 是借助流式细胞仪检测细胞等单分散颗粒的高通量细胞生物学分析方法，流式细胞术检测时常用荧光标记适体进行染色，以获得靶标分子的信息，识别不同靶标亚群。1 9 9 6 年d a v i s 等【4 4 】首次报道了适体用于流式细胞术检测的研究，他们筛选到了与中性粒细胞弹性蛋白酶( n e u t r o p h i le l a s t a s e ，h n e ) 高亲合力结合适体能象抗h n e 荧光标记抗体一样地有效检测h n e 包被的微珠。证实了适体代替抗体用于流式细胞术检测的可行性。b l a n k 等【4 5 】采用流式细胞术检测了适体与靶细胞( y p e n 1 血管内皮细胞) 结合情况，他们在适体筛选过程中，以5 端标记荧光素的引物p c r 扩增每一轮的d n a适体，用此p c r 产物对细胞进行荧光染色，上流式细胞仪检测，发现随着筛选轮数增加，适体与靶细胞的亲合力增加，细胞荧光强度也逐渐增强，并最后趋于稳定。他们的研究表明，不仅适体可象抗体一样用于流式细胞术检测，适体筛选中流式细胞术的应用也有利于获得适体与靶分子亲合力的信息。基于抗体流式细胞技术存在一定局限，抗体分子较大，不易进行细胞内结合，与f c 受体存在非特异性结合，核酸适体的应用可在一定程度解决这些问题，提高检测的可靠性，促进流式细胞术检测的推广应用【拍1 。1 3 4 基于纳米颗粒的检测方法徒永华【4 7 1 等利用凝血酶的两条核酸适配体与凝血酶的高亲和力构建了三明治结构，利用磁性纳米颗粒的磁性分离技术，设计并制作了一种新型的荧光纳米生物传感器，用其检测凝血酶。此法对凝血酶的响应线性范围为2 2 4 x 1 0 以1 - 4 0 3 x 1 0 。9 m o f l ，测得的荧光信号稳定，2 4 h 后测定并无衰减，具有很高9叠暮銮主2 土：竺鲨吝的检测特异性和灵敏度。i 悖胎迂配蛆r乙l ，_ - - i _ - -，。7 畦孵岱k 悼l l ，0o图1 5 识别凝血群反应的三骧泊结构示意圈张迟梆1 等利用a u n p 修饰的寡核苷酸适配子与蛋白质结合，同时另一个生物索化的寡核苷酸适体也结合于蛋白质，构成一个三明治形式的复合物，接着三明治复合物被卵自素结合于酶板上，然后以银离子强化法来放大三明治复合物上的蛋白质浓度信息，最后用比色法对蛋白质浓度信息进行检测。可以检测出lf m o l l 的靶蛋白质。以血小板源生长因子( p l a t e l e b - d e r i v e dg r o w t hf a c t o rb - c h a i n , p d g f b b l 作为检测样本来检验本方法的灵敏度与检出限。3 次重复实验结果表明，最低检出限为l f m 。这一结果表明检测的浓度范围可以达到5 个数量级，检出限低予现有的寡核苷酸适配子蛋白质检测方法( i f m ) 。该方法的检测限低于目前所报道的利用寡核苷酸适配子来进行蛋白质检测的方法，它可以检测1f m 0 1 l的靶蛋白质，该方法不需要复杂的仪器，易于操作。1 3 5 适体传感器适体传感器( a p t a m e rs e n s o r ) 是一种能够连续和可逆地进行分子识别的装置也可以视作信息采集和处理链中的一个逻辑组件。它主要是由接受器( r e c e p t o r ) ，换能器( t r a n s d u c e ) 和电子线路( e l e c l x o n i cc o n t l - o lc i r c u i t ) 三部分组成。当待测物质通过具有分子识别功能的接受器时，固定在接受器上的亲和配基与待测生物分子相互作用的瞬间发生能量转移，经过换能器。这种能量会以电或光等物理讯好的方式输出，经过电子系统的放大处理和显示，就可以对测出待测物质进行定性定量检测。研究人员分别将抗 g e 的核酸适体和i g e 的单抗周定在晶振片上了制各石英晶振天平( q c 旧传感器”q ，实验结果表明基于核酸识体的检测方式其线性范围优于单抗，再生能力也比单抗强。1 _ 3 6 原子力显微镜圈1 6 适体传麝器的组成忡1在扫描隧道显微镜( s c a i 血i l g i i n gm i c 叩x s n 田基础上发展起来的原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y , a f m ) ，不仅具有原子级的分辨率，能以1 0 4 2 n o n ) 的精度测量针尖与基底之间的相互作用力，还可毗对单个分子进行探测和操纵，并且能够在真空、超高真空、大气、液体、常温和低温等环境下工作1 。圈l 7 删研究校酸识体与凝血酶相互作用的示意圈吲西南大学硕士学拉论文金容1 5 1 基于a f m 力测定技术研究了a p t a m e r 对血管生成素与血管生成素结合组件( a m g i o g e n i nb i n d i n ge l e m e n t , a b e ) 间相互作用的影响。发现血管生成素a b e和血管生成素一a p t a e r 复合物，a b e 之间的相互作用力无明显差异-1 3 7 分子信标分子信标是一种设计巧妙的荧光探针。在长度为1 5 3 0 b 口寡核昔酸探针韵两端分别加上5 - 8 b p 序列互补的茎杆区。在自由状态时由于茎杆区互补序列的结合使探针分子形成发夹状结构，所以又被称为发夹探针。探针的5 端及弘端分别联用荧光素分子及猝灭剂分子。自由状态时，发夹结构的两个末端靠近，使荧光分子与猝灭分子靠近( 约为7 - l o n m ) 。此时发生荧光共振能量转移，使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。当分子信标与序列完全互补自僦标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和猝灭分子距离增大。根据f o e r s t e r 理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6 次方成反比，杂交后，信标分子的荧光几乎1 0 0 恢复。且所检测到的