（果树学专业论文）采后猕猴桃和番茄果实乙烯受体基因表达与调控.pdf

摘要 乙烯在植物生长发育和成熟衰老等过程中起重要调控作用，随着 拟南芥等模式植物乙烯信号转导模式的建立，乙烯信号研究已经成为 采后研究的热点。本研究通过对猕猴桃和番茄果实中乙烯受体编码基 因表达与调控的研究，以进一步探索乙烯调控果实成熟的机制。 研究主要结果如下： 1 采用r t - p c r 从成熟布鲁诺美味猕猴桃( a c t i n i d i ad e l i c i o s a ) 果实中获得2 个6 5 7 b p 大小e t r i 同源基因，即a d - e t r l 和a d - e t r 2 。 它们分别与番茄、桃、鳄梨、柿等多种果实e t r l 类乙烯受体相应氨 基酸和核苷酸序列的同源性分别在7 5 2 9 5 9 和7 2 3 - 8 6 5 。聚类分 析推断a d e t r l 和a d e t r 2 可能分别属于e t r l 家族中的不同亚类。 n o r t h e r n 杂交结果表明猕猴桃果实a 函e 豫l 表达模式与番茄果实n r 表达模式类似，可受乙烯诱导和a s a 抑制；乙烯对a d - e t r 2 的表达 有加强效应，但对其表达模式没有明显的影响，a s a 处理对a d - e t r 2 表达有明显抑制效应。 2 研究了1 - m c p 处理对不同成熟度卡罗番茄( l y c o p e r s i c o n e s c u l e n t u m ) 果实乙烯释放水平和乙烯受体l e e t r 4 表达影响。结果 表明：1 - m c p 处理可以降低跃变前期和跃变上升期果实乙烯释放量 和l e e t r 4 的表达水平；同样处理也降低了跃变高峰期果实l e e t r 4 表达水平，但对此期番茄果实乙烯释放量无明显影响。此外，t - m c p 处理对跃变下降期番茄果实l e e t r 4 表达无明显影响，却促进其乙烯 释放。根据这些结果推断，1 - m c p 可能是通过影响乙烯受体反馈调 节果实乙烯的生物合成和果实成熟。 关键词：乙烯受体，果实成熟，基因表达，番茄，猕猴桃 l a b s t r a c t t h ep l a n th o r m o n ee t h y l e n eh a sap r o f o u n de f f e c to nr e g u l a t i o no fp l a n tg r o w t h ， d e v e l o p m e n ta n ds e n e s c e n c e e t h y l e r i es i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a yw a sf i r s t l y e s t a b l i s h e di na r a b i d o p s i st h a l i a n a ，a n dh a sb e c o m ea na t t a a c t i v ea r e ai np o s t h a r v e s t s t u d y i nt h ep r e s e n ts t u d y , k i w i f r u i t 伪c t i n i d i ad e l i c i o s ac vb r u n o ) a n dt o m a t o ( l y c o p e r s i c o n e s c u l e n t u m c v k a l u 0 1f r u i tw e r eu s e da sm a t e r i a l st of u r t h e r i n v e s t i g a t et h ep o s s i b l em e c h a n i s mo fh o we t h y l e n er e g u l a t e d f r u i tr i p e n i n ga n d s e n e s c e n c e t h em a i nr e s u l t sw e r ed e s c r i b e da sf c l l l o w s ： t w o6 5 7b pe d n ac l o n e s ( a d - e t r la n da d - e r t 2 ) w i t hh o m o l o g yt oo t h e rr e p o r t e d e t r sw e r ei s o l a t e df r o mr i p ek i w i f r u i tu s i n gr t - p c rs t r a t e g y t h et w oe d n ac l o n e s s h a r e d7 5 2 9 5 9 a m i n oa c i di d e n t i t ya n d7 2 3 8 6 5 n u c l e o t i d ei d e n t i t yw i t h t o m a t o ，p e a c h ，a v o c a d oa n dp e r s i m m o n ，a n dw e r ep r o p o s e d t ob e l o n gt ot w od i f f e r e n t s u b f a m i l i e so fe t r if a m i l y n o r t h e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a te x p r e s s i o np a t t e r n o f a d - e t r iw a ss i m i l a rt ot h a to f t o m a t on rd u r i n gp o s t h a r v e s tf r u i tr i p e n i n g ，w h i c h w a se n h e n c e db ye t h y l e n et r e a t m e n ta n di n h i b i t e db ya s aa p p l i c a t i o n ；e t h y l e n e t r e a t m e n th a dn oe f f e c to na d - e t r 2e x p r e s s i o np a r e r ne x c e p tt h a ts t i m u l a t e d a d - e t r 2m r n aa c c u m u l a t i o n ，w h i l ea s aa p p l i c a t i o ns i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e d a d - e t r 2e x p r e s s i o nd u r i n gk i w i f r u i tr i p e n i n g 1 - m c p , a ne t h y l e n er e c e p t o rc o m p e t i t o r , w a su s e da st r e a t m e n tt os t u d yt h ee f f e c t0 1 2 p o s t h a r v e s tt o m a t of r u i te t h y l e n ep r o d u c t i o na n dt h ee x p r e s s i o no fe t h y l e n er e c e p t o r e n c o d i n gg e n el e e t r 4 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl m c pr e d u c e de t h y l e n ep r o d u c t i o n a n di n h i b i t e dl e - e t r 4m r n aa c c u m u l a t i o n o ft o m a t oa t p r e c l i m a c t e r i c a n d c l i m a c t e r i c - r i s i n gs t a g e ；f o rf r u i ta tc l i m a c t e r i cp e a ks t a g e , n os i g n i f i c a n te f f e c t0 1 3 e t h y l e n ep r o d u c t i o nw a so b s e r v e d ，h o w e v e r , t h ee x p r e s s i o no fl e e t r 4w a s r e d u c e d i na d d i t i o n ，w h e nf r u i tp a s s e de t h y l e n ec l i m a c t e r i c - p e a ks t a g e ，1 - m c pt r e a t m e n th a d n oo b v i o u se f f e c to nl e - e t r 4e x p r e s s i o n ，a n da c c e l e r a t e de t h y l e n ep r o d u c t i o n a c c o r d i n g ly i tw a ss u g g e s t e dt h a t1 - m c pm i g h ta f f e c te t h y l e n eb i o s y n t h e s i sa n d p o s t h a r v e s tr i p e n i n ga n ds o f t e n i n gt h r o u g he t h y l e n er e c e p t o rf e e d b a c kr e g u l a t i o n k e y w o r d s ：e t h y l e n er e c e p t o r , f r u i tr i p e n i n g , g e n ee x p r e s s i o n ，t o m a t o ，k i w i f r u i t 1 1 1 缩略词 a b b r e v i a t i o n 缩写英文全称 a s a a c e t y l s a l i c y l i ca c i d b pb a s e p a i r e d n a c o m p l e m e n t a r yd n a c t r c o n s t i t u t i v et r i p l er e s p o n s e d e p c d i 以y y l p w o c a r b o n a t e e b f e i n 3b i n d i n gf - b o x e d t a e t h y l e n ed i a m i n et e t r a c e t i ca c i d e i le i n 3 l i k e e i n e t h y l e n ei n s e n s i t i v e e r f e t h y l e n er e s p o n s ef a c t o r e t r e t h y l e n er e c t o r e r e b p se m y l e n e 托5 p o n 8 1 v e 。1 e m 咖b i n d i n g p r o t e i n s 1 - m c p 1 - m e t h y l c y c l o p r o p e n e m r n a m e s 姚g er n a i p t g i s o p o r p y b t h i o b - d g a l a c t o p y r a n o s i d e n r n e v e r - r i p e r a c e r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n a e n d s r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e r t - p c rr e ”。攀砸m s c d p t i o n p 0 1 y m e r a s 。h 8 i n s a s a l i c y l i ca c i d s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e t r t s 砸s ( h y d m x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e x 刊 i 慧盏枷3 。础坤卧0 。 中文名称 乙酰水杨酸 碱基对 互补d n a 组成型三重反应 焦碳酸二乙酯 与e i n 3 结合的f - b o x 蛋白 乙二氨四乙酸 e i n 3 类似物 乙烯不敏感型 乙烯反应调节因子 乙烯受体 乙烯反应元件结合蛋白 1 一甲基环丙烯 信使核槽核酸 异丙基1 3d 硫代半乳糖苷 永不成熟 c d n a 末端快速扩增 转数分 反转录聚合酶链反应 水杨酸 十二烷基磺酸钠 三( 羟甲基) 氨基甲烷 5 澳_ 4 氯3 一吲哚d ，d 半乳 糖 第一章乙烯及其信号转导研究的进展 乙烯是分子结构极简单的气体物质，它对植物生长发育的许多过 程，如种子萌发，幼苗生长、开花、结实，果实成熟和衰老等有着广 泛的影响( a b e l e s 等，1 9 9 2 ；k u l a e v a 和p r o k o p t s e v a ，2 0 0 4 ) 。乙烯 也是一个植物适应环境变化的信号，可以调节机械伤和病原反应等胁 迫反应( o d o n n e l l 等，1 9 9 6 ) 。研究表明，低浓度( 1 0 。1 0 0n l l ) 乙烯便可引发植物组织的生理反应。 植物激素信号可以通过内源水平和植物组织对其感受进行调节 ( b r a d f o r d 和t r e w a v a s ，1 9 9 4 ) 。果实对乙烯敏感性可随成熟进程发 生改变。通过控制乙烯的感受可使果实成熟的相关变化延缓或中断 ( h o e b e r i c h t s 等，2 0 0 2 ) 。 1 1 乙烯与果实成熟 成熟是果实生长发育的一个特定阶段，即果实生长停止后所发生 的一系列生理生化变化达到可食状态的过程。这些变化主要包括色、 香、味形成和质地等方面改变，与果品品质和商品性密切相关。 按照呼吸作用和乙烯生成特性可把果实分为跃变型和非跃变型 两大类。通常认为果实中存在2 个乙烯生物合成调节系统：系统l 乙 烯存在于非跃变型果实和未成熟的跃变型果实中，为低水平的基础乙 烯合成；系统i i 乙烯为跃交型果实成熟时乙烯自我催化大量合成的 乙烯。跃变型果实系统i i 乙烯的产生可被系统i 乙烯或外源乙烯启动。 乙烯在跃变型果实成熟过程中超重要作用，去除环境中乙烯或施加乙 烯合成作用抑制剂( 如a v g 、1 - m c p 和a 矿等) 能延缓或抑制跃变 型果实成熟过程；而施加外源乙烯或其同源物( 如丙烯) 则可以明显 加速其成熟进程。大多数非跃变型果实的成熟进程缓慢，没有呼吸强 度和乙烯释放的大幅度上升，但乙烯对于非跃变型果实同样具有促进 成熟衰老的作用。 通过对蛋白质体内和体外合成的研究表明，果实成熟期间蛋白质 和m r n a 水平发生了很大变化。施用r n a 合成抑制刹或蛋白质合成 抑制剂可廷缓果实成熟进程，表明果实成熟过程受基因及其表达产物 的调控。果实成熟相关基因表达分析显示果实中具有依赖于乙烯和不 依赖乙烯的发育调控两种途径( l e l i e v e r ，1 9 9 7 ；m o o r e 等，2 0 0 2 ； 恤i t e ，2 0 0 2 ) 。 生物化学和遗传学研究也表明乙烯与跃交型果实的成熟关系密 切，这方面的证据来自予对乙烯抑制剂的分析( y e n 等，1 9 9 5 ) 、抑 制乙烯生物合成的转基因植株( o e l l e r 等，1 9 9 1 ；h a m i l t o n 等，1 9 9 0 ) 以及番茄n r 突变体的分析( l a n a h a n 等，1 9 9 4 ；w i l k i n s o n 等，t 9 9 5 ) 。 虽然不能正常成熟的番茄突变体砌和n o f 不能生成自我催化乙烯， 在施周外源乙烯时也不能成熟，但它们也表现出一定的乙烯敏感性。 因此很可能是m 和n o t 在果实成熟的早期阶段参与了不依赖乙烯的 调节过程，这些现象表明在所有的果实成熟中可能存在某些共同的调 节机制( w 两t e ，2 0 0 2 ) 。 总之，果实的成熟是一个复杂的过程，包含一系列生理生化反应， 它受一系列基因相继活化的控制，乙烯是果实成熟过程基因表达调节 的最重要因素。运用生物技术手段调控果实乙烯生物合成已经获得成 功。随着乙烯研究的不断深入，人们开始由乙烯生物合成逐渐转向乙 烯感受和信号转导途径的研究。 1 2 乙烯信号转导的研究进展 乙烯的生物合成途径已经于2 0 世纪7 0 年代末被明确，蛋氨酸 ( m e t ) 为乙烯生物合成的直接前体，在s a m 合成酶的作用下合成 s 一腺苷甲硫氨酸( s a m ) ，a c c 合成酶( a c s ) 催化s a m 生成1 氨 基环丙烷一卜羧酸( a c c ) ，a c c 经a c c 氧化酶( a c o ) 催化生成乙 烯。a c s 和a c o 是乙烯生物合成过程的两个关键酶( z a r e m b i n s k i 和t h e o l o g i s ，1 9 9 4 ) ，它们均是由多基因家族编码的。目前，发挥乙 烯生理效应的乙烯信号转导研究已经成为采后研究的热点。 1 2 1 拟南芥乙烯信号转导途径 以黑暗条件下乙烯对幼苗的“三重反应”，即黑暗中生长的双子 叶植物幼苗在乙烯存在的条件下，发生的表型变化( 包括下胚轴膨胀 变短，顶端钩状芽弯曲加剧，茎杆偏向水平生长) 作为筛选手段，人 们从拟南芬中分离得到了许多乙烯合成和信号转导发生改变的突变 体，包括乙烯不敏感型突变体和组成型乙烯反应突变体两大类。 通过双突变体分析，推导出拟南芥中乙烯信号转导途径的初步轮 廓，即乙烯一e t r 家族一c t r l 一e 蹦2 一e i n 3 ( e i l s ) 一e r f ( e r e b p s ) 一乙烯反应( s o l a n o 等，1 9 9 8 ) ，其中e t r 是乙烯受体 ( c h a n g 和s t a d l e r ，2 0 0 1 ) ，c t r l 是乙烯信号转导途径和乙烯反应 的负调节因子( k i e b e r 等，1 9 9 3 ) ，e i n 2 是功能还不十分清楚的跨膜 蛋白( a l o n s o 等，1 9 9 9 ) ，e i n 3 ( e i l s ) ( c h a o 等，1 9 9 7 ) 和e r f ( s o l a n o 等，1 9 9 8 ) 都是乙烯信号转导过程中的转录因子，在细胞核中起作用。 1 2 1 1e t r 家族 c h a n g ( 1 9 9 3 ) 等人利用染色体步移和定位克隆方法第一次克隆 了拟南芥e t r l 基因，并获得其完整的基因序列。e t r i 基因编码一个 7 3 8 个氨基酸、分子量约为7 9k d 的蛋白质。e t r i 在酵母中的表达试 验显示，它有一个乙烯的高亲和结合位点( s c h a l l e r 等，1 9 9 5 ) 。目前 为止，从拟南芥中共分离出了5 个乙烯受体基因，分别为e t r i ( c h a n g 等，1 9 9 3 ) 、e t r 2 ( s a k a i 等，1 9 9 8 ) 、e r s l ( h u a 等，1 9 9 5 ) 、e r s 2 、 ( m e t ) 为乙烯生物合成的直接前体，在s a m 合成酶的作用下合成 s 一腺苷甲硫氨酸( s a m ) a c c 合成酶( a c s ) 催化s a m 生成1 氨 基环丙烷1 羧酸( a c c ) ，a c c 经a c c 氧化酶( a c o ) 催化生成乙 烯。a c s 和a c 0 是乙烯生物合成过程的两个关键酶( z a r e m b i n s k i 和t h e o l o g i s ，1 9 9 4 ) ，它们均是由多基因家族编码的。目前，发挥乙 烯生理效应的乙烯信号转导研究已经成为采后研究的热点。 1 2 1 拟南芥乙烯信号转导途径 以黑暗条件下乙烯对幼苗的“三重反应”，即黑暗中生长的双子 叶植物幼苗在乙烯存在的条件下，发生的表型变化( 包括下胚轴膨胀 变短，顶端钩状芽弯曲加剧，茎杆偏向水平生长) 作为筛选手段，人 们从拟南芬中分离得到了许多乙烯合成和信号转导发生改变曲突变 体，包括乙烯不敏感型突变体和组成型乙烯反应突变体两大类。 通过双突变体分析，推导出拟南芥中乙烯信号转导途径的初步轮 廓，即乙烯一e t r 家族一c t r l 一e i n 2 一e 1 n 3 ( e i l s ) 一e r f ( e r e b p s ) 一乙烯反应( s o l a n o 等，1 9 9 8 ) ，其中e t r 是乙烯受体 ( c h a n g 和s t a d l e r ，2 0 0 1 ) ，c t r l 是乙烯信号转导途径和乙烯反应 的负调节因子( k i e b e r 等，1 9 9 3 ) ，e i n 2 是功能还不十分清楚的跨膜 蛋白( a l o n s o 等，1 9 9 9 ) ，e i n 3 ( e i l s ) ( c h a o 等，1 9 9 7 ) 和e r f ( s o l a n o 等，1 9 9 8 ) 都是乙烯信号转导过程中的转录因子，在细胞核中起作用。 1 2 1 1e t r 家族 c h a n g ( 1 9 9 3 ) 等人利用染色体步移和定位克隆方法第一次克隆 了拟南芥e t r i 基因，并获得其完整的基因序列。e t r i 基西编码一个 7 3 8 个氨基酸、分子量约为7 9k d 的蛋白质。e t r l 在酵母中的表达试 验显示，它有一个乙烯的高亲和结合位点( s c h a l l e r 等，1 9 9 5 ) 。目前 为止，从拟南芥中共分离出了5 个乙烯受体基因，分别为e 豫1 ( c h a n g 等，1 9 9 3 ) 、e t r 2 ( s a k a i 等，1 9 9 8 ) 、e r s l ( h u a 等，1 9 9 5 ) 、e r s 2 、 等，1 9 9 3 ) 、e t r 2 ( s a k a i 等，1 9 9 8 ) 、e r s l ( h u a 等，1 9 9 5 ) 、e r s 2 、 e i n 4 ( h u a 等，1 9 9 8 ) 。五个受体中任意一个发生突变，都能够引起 植物组织对乙烯敏感性的改变，说明它们都参与了乙烯的感受( g u o 和e c k e r ，2 0 0 4 ) 。 乙烯受体蛋白的结构通常可分为三个区域，即感受器( s e n s o r ) 结构域，组氨酸激酶( h i s t i d i n ek i n a s e ，h k ) 结构域和响应调节器 ( r e s p o n s er e g u l a t o r ，r r ) 结构域( c i a r d i 等，2 0 0 1 ) 。感受器结构 域为高度保守区域，现在已知的所有引起乙烯不敏感受体突变位点都 处于这一区域，在乙烯不敏感突变体( 如e t r l 1 ) 中，乙烯不能与受 体蛋白结合，感受器结构域中也含有铜离子的结合位点( r o d r i g u e z 等，1 9 9 9 ；h i r a y a m a 和a l o n s o ，2 0 0 1 ) 。组氨酸激酶结构域由五个被 称为催化中心( h ，n ，g i ，f ，g 2 ) 的亚结构域组成，它比同源的 细菌双组分调节系统中的h k 序列大，其中g 1 和g 2 对组氨酸激酶 活性的维持和对乙烯信号的传递都是必需的。组氨酸激酶活性可能与 乙烯受体的定位，蛋白稳定性以及信号输出的精细调节有关( g u o 和e c k e r ，2 0 0 4 ) 。响应调节器结构域中具有自我磷酸化的a s p 残基。 与细菌双组分系统相类似，植物的乙烯受体家族的一些成员中缺乏响 应调节器结构域，如拟南芥中e r s l 和e r s 2 受体，而e t r l 、e t r 2 和e i n 4 则包含有响应调节器结构域。 根据蛋白结构特征可把拟南芥乙烯受体分为两个亚族。一个亚族 ( e t r l 家族) 由e t r l 和e r s l 组成，另一个亚族( e t r 2 家族) 由 e r s 2 、e t r 2 、e t n 4 组成( h u a 和m e y e r o w i t z ，1 9 9 8 ；g u o 和e c k e r ， 2 0 0 4 ) 。在乙烯受体基因家族中，亚族内的成员同源性比亚族之问的 同源性要高，e t r l 家族内的成员序列相似性为7 9 ，而e t r 2 家族 为6 8 7 4 ，两个亚族之间的相似性为5 7 * 6 5 ( h u a 和m e y e r o w i t z ， 1 9 9 8o 这五个成员之间在序列上有一定的相似性和偏差，但它们在 显性突变的表型上是完全相似的，除了在强度上的差别，其突变之间 不存在组织特异性( h u a 和m e y e r o w i t z ，1 9 9 8 ) 。 所有的e t r l 突变体都表现出乙烯不敏感表型。实验表明，在拟南 芬五个乙烯受体中，单个或两个乙烯受体基因被敲除( k n o c k o u t ) ， 对其表型( p h e n o t y p e ) 无明显影响，这可能与乙烯受体之闻存在的 功能补偿( f u n c t i o n a lc o m p e n s a t i o n ) 有关；与单个或两个基因敲除 相比，三个基因敲除的突变体则表现出乙烯组成型三重反应，四个基 因敞除的突变体表现更明显( h u a 和m e y e r o w i t z ，1 9 9 8 ) 。根据这些 实验结果得出的模式推测：在无乙烯状态下受体应该是有活性的，下 游的c t r l 组分也有活性，乙烯诱导相关基因的表达处于被抑制状 态；而乙烯与受体的结合则会使受体及c t r l 失活，基因表达的抑制 作用也相应被解除。不能结合乙烯的受体是不会失活的，因此当受体 数量少时会增加组织对乙烯的敏感性，反之，受体数量多时则会降低 敏感性。然而，因为e t r 2 类受体无h k 活性，所以受体活性的精确 调节目前还不是清楚的。 早期研究一直认为乙烯受体是定位于细胞膜上，而最近在研究乙 烯受体方面的一个重大突破是发现乙烯受体和信号转导是在细胞内 质网上完成。无论是蔗糖密度梯度离心还是显微电镜结果，均证实拟 南芥e t r l 受体是与内质网结合( c h e n 等，2 0 0 2 ) ，推测e t r ln 末 端跨膜的感受器结构域能够与内质网结合，乙烯处理或e t r l 1 突变不 影响它们之间的结合。长期以来，由于缺乏高度纯化的乙烯受体蛋白， 阻碍了对其生物化学和结构的深入了解。最近，v o e t v a 1 v o r m i z e e l e 和g r o t h ( 2 0 0 3 ) 获得了高效表达e t r l 的大肠杆菌，能够大量分离 纯化该蛋白质，这将有助于乙烯受体蛋白质功能的进一步深入研究。 1 2 1 2c t r l c t r l 基因是用t d n a 标签法从插入突变引起的一个突变体中克 隆出来的，失去功能的c t r l 突变体表现出组成型乙烯反应，表明c t r l 基因编码蛋白是乙烯信号传递途径中的负调控因子。c t r l 的n 末端 类似于哺乳动物r a f 蛋白激酶家族的催化区域，但c 。端与r a f 激酶家 族的相似性很低( j o u a n n i c 等，1 9 9 9 ) ，在拟南芥基因组中，共有8 个 基因编码的蛋白质与c t r l 激酶催化区域有高度的相似性，并且包含 一个保守的氨基酸基元，含有一个突变i 均g l y 3 5 4 ( f r y e 等，2 0 0 1 ) 。 c t r l 是乙烯信号转导途径的中心组分。上位性分析表明c t r i 作用于乙烯受体的下游，通过遗传学或生物化学方法在乙烯受体和 c t r l 激酶之间没有鉴定到中间物，而且通过生化和酵母双杂交体系 研究表明c t r ln 末端直接与乙烯受体c 末端区域相互作用( c l a r k 等，1 9 9 8 ) 。这些结果表明在无乙烯存在下，e t r 家族可直接激活 c t r l 的激酶活性，而有活性的c t r l 通过磷酸化下游组分关闭乙烯 生理反应。乙烯与受体的结合会抑制受体活性，从而引起c t r l 失活， 促使乙烯效应的发挥。 最近研究发现，c t r l 也是定位在细胞内质网上。对拟南芥细胞 内质网膜组分的亲合纯化会导致e t r l c t r l 复合体同时被分离，说 明e t r l 和c t r l 同时存在于一种蛋白复合体系中( g a o 等，2 0 0 3 ) 。 遗传学的证据也支持c t r i 功能实现可能是通过与位于内质网上的 乙烯受体结合分离进行调节。如果这种情况确实存在，与乙烯受体 结合的c t r ln 末端结构域的过表达可能会阻止c t r l 与乙烯受体 的结合，从而会表现出一种功能丧失( l o f ) c t r l 突变体表型。作为 对照，n 末端结构域发生突变的c t r l 8 过表达不会出现c t r l 表型， 因为这种n 末端结构域是不能- 9 乙烯受体结合的( h u a n g 等，2 0 0 3 ) 。 1 2 1 3e i n 2 e i n 2 是乙烯信号传递途径中的一个重要组分，它介导了蛋白激 酶c t r i 和转录因子e i n 3 e i l 之间的信号传递。e i n 2 是乙烯和胁迫 反应共有的一个双功能蛋白质。e i n 2 连接了不同的激素信号途径， 植物可能拥有一个组合机制通过启用一套共有的信号传递分子来调 节不同的胁迫( a l o n s o 等，1 9 9 9 ) 。 e i n 2 编码一个跨膜蛋白质( a l o n s o 等，1 9 9 9 ) ，e i n 2n 末端疏 水区域类似于n r a m p 蛋自家族。n r a m p 蛋白家族存在于从细菌到入 的所有生物中，其中一些具有传导二价阳离子的功能。e i n 2 的c 一末 端亲水域虽然有一些参与蛋白质间相互作用的典型基元，但它与已知 蛋白质没有同源性。过量表达全长e i n 2 或n 末端( 氨基酸1 - 4 8 0 ) 的植株没有表现出组成型乙烯反应或乙烯过敏反应。在e i n 2 突变体 中过量表达e i n 2 的c 末端导致组成型激活一些而不是全部的乙烯反 应，并且恢复了突变体对除草剂和茉莉酸( j a ) 的反应。这些结果 表明e i n 2n 末端对于从上游感受乙烯信号是必需的，乙烯信号传递 到下游组分需要e i n 2 的c 末端，并且说明e i n 2 参与了胁迫反应。 生理学研究表明乙烯感受还需要一些过渡金属如c u 或z n 参与，已 经证实了铜离子对于乙烯与受体蛋白的可逆结合是必需的，e i n 2 与 n r a m p 蛋白家族的相似性表明e i n 2 可能还具有离子载体的功能。为 了验证这个假设，在几个异源体系如非洲爪蟾卵母细胞、酵母等细胞 中表达e i n 2 或其截短的形式，虽然可检测到e i n 2 的表达，但没有 观察到运输离子的能力( a l o n s o 等，1 9 9 9 ) 。e i n 5 和e i n 6 基因还没 有被克隆，还不能确定它们是否影响乙烯调节的事件，或者是否它们 是泄露的等位基因。 1 2 1 4e i n 3 和e l l s 乙烯反应伴随着许多基因的表达( d e i k m a n ，1 9 9 7 ) 。拟南芥e i n 3 突变体不表现三重反应，并且依赖乙烯的基因表达降低，表明e i n 3 是乙烯信号传递途径中的一个重要调节因子。e i n 3 基因克隆为早期 乙烯信号转导途径中的细胞核调控提供了直接证据( c h a o 等，1 9 9 7 ) 。 e i n 3 是一个可与d n a 结合的核定位蛋白质，被认为是转录因 子。在这个多基因家族成员中，肼3 、e l l l 和e i l 2 等3 个成员可 以拯救e i n 3 的突变表型。这表明e i n 3 ，e i l i 和e i l 2 均参与了乙烯 的信号转导，同时也解释了为什么e i n 3 突变体只能引起部分乙烯不 敏感。在e i n 2 突变体中过量表达e i n 3 可导致组成型乙烯反应，证实 了e i n 3 作用于e i n 2 的下游。 e i n 3 e i l s 蛋白家族在结构上有几个明显的特点：( 1 ) n 末端有 一个富含酸性氨基酸的结构域；( 2 ) 有一个脯氨酸富集区；( 3 ) 一个 回文结构；( 4 ) 几个高度碱性区域；( 5 ) 靠近c 末端几个多聚天冬 酰氨或多聚谷氨酰氨重复。这些结构被认为是转录激活结构域所具有 的特征( m i t c h e l l 和t j i a n ，1 9 8 9 ) 。拟南芥e i n 3 e i l 基因的表达不受 乙烯诱导，它们可能是在蛋白水平上受乙烯调控( c h a o 等，1 9 9 7 ) 。 此外，从烟草( r i e u 等，2 0 0 3 ) 、绿豆( l e e 等，2 0 0 3 ) 等其它植物 中也分别分离出了多个腿转录因子。最近研究表明，e i n 3 e i l s 家 族基因在植物各个器官中普遍表达，尽管在表达水平和模式上存在微 小的差异( g u o 和e c k e r ，2 0 0 3 ) 。 1 2 。1 。5e r f ( e r e b p ) e r f i 是利用烟草乙烯反应元件结合蛋白e r e b p l ( o h m e t a k a g i 和s h i n s h i ，1 9 9 5 ) 的互补片段从拟南芥的e d n a 文库中筛选得到的， 它是一个受乙烯诱导的基因，并且依赖于e i n 3 ，在e i n 3 1 突变植株 中检测不到e r f l 的表达，认为e r f l 是在e i n 3 下游起作用( s o l a n o 等，1 9 9 8 ) 。e i n 3 二聚体能够与e r f l 的启动子区域特异结合，在转 录水平上调控e r f l 表达。无论e i n 3 的来源如何，它都能识别e r f l 上的特异目标位点( s o l a n o 等，1 9 9 8 ) 。e r f l 过表达植椿与e i n 3 过 表达植株在乙烯反应方面表现很大的相似性，表明e r f l 调节只有 e i n 3 介导的乙烯反应这一条信号转导途径( s o l a n o 等，1 9 9 8 ) 。 e r f l 能特异结合位于拟南芥的几丁质酶基因和大豆几丁质酶 5 b 基因启动子区域的g c c b o x 。g c cb o x 是一个1 1b p 序列的 t a a g a g c c g c c ，含有结合需要的核心序列g c c g c c 。e r f i 能启 动下游的乙烯应答，在植物体内过量表达e r f l 基因会产生组成型乙 烯反应表型，如部分的三重反应和几丁质酶基因的表达等( s o l a n o 等，1 9 9 8 ) 。f u j i m o t o 等( 2 0 0 0 ) 从拟南芥中分离了e r f 基因家族的 5 个成员，它们受乙烯和非生物胁迫( 如低温、高盐、干旱) 的差异 调节。最近研究发现，e r f l 也调节了其它激素反应，特别是j a 调 节的防御反应( l o r e n z o 等，2 0 0 3 ) 。 值得注意的是，并非所有的e r f 成员都编码转录活性因子，还有 一些基因编码抑制型转录因子。从诸多乙烯反应来看i 乙烯相关的表 型变化应是由一些基因的激活和一些基因的抑制引起的。也就是说， 还有一些乙烯反应相关基因没有e i n 3 结合元件，其启动子上也没有 g c c b o x ，即转录因子与e i n 3 和e r f i 都没关系，而是有另外不阉的 特异结合因子。或许它可参与乙烯信号的更下游反应，这些证据可能 对完成乙烯调控的基因表达研究极为重要。 1 2 1 6e b f e b f l 和e b f 2 是两个定位于细胞核上，并且与e i n 3 蛋白专一 结合的f b o x 蛋白，它们在拟南芥各种器官中组成型表达；最新研究 结果表明，拟南芥泛素介导的蛋白质降解通路参与了乙烯反应的调 节，它是通过调节作为转录因子的e i n 3 水平雨实现的( g u o 和e c k e r ， 2 0 0 3 ；p o t u s c h a k 等，2 0 0 3 ；k e p i n s k i 和l e y s e r ，2 0 0 3 ) 。在无乙烯条 件下，e i n 3 是一种半衰期仅为3 0m i n 的蛋白质，很不稳定，乙烯或 a c c 处理可增加e i n 3 稳定性。e i n 3 除受乙烯调节外，还可以通过 e b f l 、e b f 2 参与的s c f 蛋白酶体( p r o t e a s o m e ) 降鳃通路进行调节。 当e b f l 或e b f 2 发生突交后，植物会相应表现出对乙烯反应增强，这 与e i n 3 稳定性增加有关，而当e b f l 和曲f 2 双突变会因e i n 3 高表达 而导致植株发生乙烯组成型反应。两者中任意一个f - b o x 过表达植株 由于造成e i n 3 降解而相应表现出对乙烯敏感性降低。s c f 复合体通 路的专一抑制荆( m g l 3 2 或m g l l 5 ) 也会造成植株中e i n 3 的增加， 而作用广谱的蛋白质生物合成抑制荆p e f a b l o c 则对e i n 3 水平没有影 响( g u o 和e c k e r ，2 0 0 3 ) 。这些结果说明f b o x 蛋白参与的e i n 3 降 解途径在乙烯信号转导过程中起调控作用，这一过程如图1 1 所示。 3 瑚瞒瞄嘲 曰 戋 茹。m ，+ m ，一拳撇”脚i d p k ，粥6 - ， 嚣。o 件娓 c 扎一盯r l c t r l s l 瞰+ 野6 ! 啪妒1 3 马e 挣薅 日蒋 异档舒n 啪巾k i a 撇p i k m 解嘱p o s l t r a n s i t i o n 崎髀啪落 瓣o f 图1 1 乙烯信号转导的一种模式 f i g 1 1ap r o p o s e dm o d e lo fe t h y l e n es i g n a lt r a n s d u c f i o n ( g u oa n de c k e b2 0 0 3 ) 1 2 2 番茄乙烯信号转导的研究进展 番茄是研究果实成熟衰老机制的一个理想模式材料。由于拟南芥 对于果实成熟衰老作用机制研究的局限性，所以随着拟南芥中乙烯信 号转导轮廓的提出，人们迅速展开了对番茄乙烯受体及信号转导的研 究，并已取得了很大的进展。 1 2 2 1 番茄乙烯受体基因及表达特性 番茄丰富的生理生化和分子遗传学知识背景，使其成为研究乙烯 反应和果实成熟衰老的理想模式植物( a l e x a n d e r 和g r i e r s o n ，2 0 0 2 ) 。 目前，番茄的6 个乙烯受体基因( l e e t r l 6 ，j 已分别被分离和定性 ( l a s h b r o o k 等，1 9 9 8 ；t i e m a n 和k l e e ，1 9 9 9 ；w i l k i n s o n 等，1 9 9 5 ； z h o u 等，1 9 9 6 a b ) ，其中l e - e t r 3 ( 印n r ) 基因定位在番茄的第9 号染色体上，序列分析发现n r ( n e v e r 啦e ) 突变体就是由于n r 蛋 白质3 6 位上单个碱基突变而使p r o 变成l e u 造成的。n r 突变体除果 实不能正常成熟外，还显示出乙烯不敏感突变株的多效突变效应，具 体表现为：不表现乙烯的三重反应，叶柄不易脱落，叶和花瓣衰老进 程明显推迟等( l a n a h a n 等，1 9 9 4 ) 。 研究表明，番茄乙烯受体家族成员的结构与拟南芥乙烯受体家族 十分相似，但番茄乙烯受体的各成员在蛋白质水平上差别较大，在基 本序列上表现出5 0 以下的同源性，其中只有n r 受体蛋白缺少响应 调节器结构域。l e e t r 4 和l e e t r 5 两个成员的蛋白序列中推测似 乎存在第4 个跨膜结构域，这个结构域可能是一个信号序列或者起到 把信号由n 末端直接传递到细胞质的作用。l e - e t r l 3 被认为是乙 烯受体e t r l 家族成员，而l e e t r 4 6 三个乙烯受体蛋白可能没有完 整的h k 结构域( 图1 2 ) ，因此被认为是e t r 2 家族成员。 i 土e t r i l 蠢e t 冀2 涨 i e l 汛i j l e 肌r 5 i a l 背r 6 t h et o m a t oe t rf a m i l y g a fw , d i d i o e h # p t m ” k i n a - 蛐r t 譬- b r 图1 0 番茄乙烯受体蛋白结构示意圈 f i g 1 2s c h e m a t i cr e