（植物病理学专业论文）水稻纹枯病菌（Rhizoctorzia+solani）转化体系的建立.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果， 并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不 包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了 明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：日期： 指导教师亲笔签名：日期： 福建农林大学硕士学位论文 摘要 由立枯丝核菌( r h i z o c t o n i as o l a n ik i k h n ) 弓l 起的水稻纹枯病是世界性水稻三大病 害之一，几乎没有稻田不发生纹枯病，全世界平均每年因该病造成的损失达数十亿 公斤稻谷。但目前为止人们对该病的致病机理了解不多，还未发现相应的抗病基因 和对此病免疫或高抗的水稻品种，发现的中抗以上的品种也寥寥无几，因而只能任 其肆虐。为从分子水平上揭示立枯丝核菌的致病机理，本研究参照稻瘟病菌 ( m a g n a p o r t h eg r i s e a ) 原生质体遗传转化体系建立起了立枯丝核菌的原生质体遗传转 化体系，并进一步将组蛋白增强型绿色荧光蛋白( h i s t o ne n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n ，e g f p ) 成功表达于纹枯菌。 本研究首先使用裂解酶( 源自木徽菌，t r i c h o d e r m ah a r z i a n u m ) 和o 8 mn a c l ( p h 5 8 ，作为渗透压稳定剂) 处理纹枯菌菌丝，成功分离出了其原生质体。随后通 过实验确定了纹枯菌原生质体在固体t b 3 培养基上的再生条件及8 0 低温冻存条 件。接着参照稻瘟菌原生质体的遗传转化体系，建立了纹枯菌的原生质体遗传转化 体系。通过p c r 验证和测序验证，证实外源的潮霉素抗性基因己整合到转化子后代 中。 构建了针对纹枯茵和稻瘟菌的组蛋白增强型绿色荧光蛋白( h i s t o ne n h a n c e d g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，e g f p ) 载体。首先根据基因库中稻瘟菌的组蛋白h 3 序列 ( g e n e b a n k 登录号为g i3 9 9 7 3 3 8 9 ) 设计引物，应用p c r 方法获得了稻瘟菌和纹枯 菌中可能的组蛋白h 3 基因组序列和编码序列。经b l a s t p ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t b l a s t c g i ) 分析，显示该序列所编码的蛋白质为 组蛋白h 3 。接着将其连接到绿色荧光蛋白( g f p ，g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ) 的c 末端，组成了g f p 。h 3 融合蛋白，并进一步将其接入p s m 5 6 5 载体，构建成e g f p 载体。荧光显微镜观察结果表明，携带该载体的转化子能发出绿色荧光。 关键词：立枯丝核菌( r h i z o c t o n i as o l a n ik o h n ) 、原生质体转化、e g f p 福建农林人学硕士学位论文 a b s t r a c t r i c es h e a t hb l i g h t ，w h i c hi sc a u s e db yr h i z o c t o n i as o l a n ik i ) h n ，i sc o n s i d e r e dt o b et h em o s td e s t r u c t i v ed i s e a s eo fr i c ew o r l d w i d e b u ts of a r , p e o p l es t i l lh a v ek n o w n l e s sa b o u tt h ep a t h o g e n e s i so fr s o l a n i ，a n dh a v en o ti d e n t i f i e dt h er e s i s t a n c e g e n e si n r i c ev a r i e t i e s i no r d e rt or e v e a lt h ep a t h o g e n i cm e c h a n i s mo fr i c es h e a t hb l i g h tp a t h o g e no n m o l e c u l a rl e v e l ，ag e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mw a sc o n s t r u c t e du s i n gp r o t o p l a s t s a c c o r d i n gt ot h em e t h o do f r i c eb l a s tp a t h o g e n ( m a g n a p o r t h eg r i s e a ) f i r s f l y ，t h e p r o t o p l a s t so fr s o l a n iw e r er e l e a s e df r o mi t sm y c e l i ab yt r e a t i n gw i t ll y s i n ge n z y m e f r o mt r i c h o d e r m ah a r z i a n u mi nt h es o l u t i o no f0 8 mn a c l ( p h5 8 ，a so s m o t i cs t a b i l i z e r ) ， a n dt h ec o n d i t i o n so fp r o t o p l a s tr e g e n e r a t i o na n ds t o r a g ew e r eo p t i m i z e d s e c o n d l y ，t h e g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo fp r o t o p l a s tw a sc o n s t r u c t e db yu s i n gp e g m e d i u m t r a n s f o r m a t i o nm e t h o da n dp s m 5 6 5 ( c o n t a i nh y g r o m y c i nr e s i s t a n c eg e n e ) v e c t o rd n a w a si n t e g r a t e di n t og e n o m eo ft h ef u n g u s 。ap a i ro fp r i m e rw a su s e dt oa m p l i f yt h e c o r r e s p o n d i n gr e g i o no fh y g r o m y c i nr e s i s t a n c eg e n eb yp c r t oc o n f i r mt h es u c c e s s f u l i n t e g r a t i o n t w ov e c t o r st h a tc o n t a i nh i s t o ne n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( e g f p ) f o r 尼 s o l a n ia n d 必g r i s e at r a n s f o r m a t i o nh a v eb e e nc o n s t r u c t e d t h eh i s t o nh 3g e n eo ft h i s t w of u n g u sw e r ec l o n e d b yp c ra c c o r d i n gt ot h eg e n es e q u e n c eo fmg r i s e af r o m g e n e b a n k t h ep c rp r o d u c tf r o m 兄s o l a n iw a ss e q u e n c e da n d a n a l y s e db yb l a s t p ( h r t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t j b l a s t c g i ) t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eg e n ee n c o d ea p r o t e i nw i t hh i g h th o m o l o g yt oh i s t o nh 3 t h e r e f o r e ，t h eh 括t o nh 3g e n eo fr s o l a n iw a s l i g a t e dw i t ht h ec t e r m i n a lo fg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) g e n e ，a n da s s e m b l e di n t o p s m 5 6 5v e c t o r e x p r e s s i o no fe g f pi nt h ec o r r e c tt r a n s f o r m a n t sw a sd e t e c t e du n d e rt h e f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e k e y w o r d s ：r i c e s h e a t h b l i g h tp a t h o g e n ( r h i z o c t o n i a s o l a n i k l j h n ) ，p r o t o p l a s t t r a n s f o r m a t i o n ，e g f p 2 福建农林大学硕士学位论文 1 1水稻纹枯病概况 1 1 1 水稻纹枯病菌简介 1 前言 纹枯病病原菌的无性阶段属半知菌亚门，无孢目，称立枯丝核菌( r h i z o c t o n i a s o l a n ik f ) h n ) ，是非常普遍的土传和种传的半腐生真菌。它不产生无性孢子、以菌丝 或菌核形态存在于自然界的土壤中。该菌的每条菌丝均由多细胞组成，不同细胞内 的细胞核数量变化较大，一般在2 7 个之间。其有性阶段为t h a n a t e p h o r u sc u c u m e r i s 佃r a n k ) d o n k ，属担子菌亚门，胶膜菌目，称瓜亡革菌。 立枯丝核菌( ( r s o l a n o 生长的温度范围为1 0 4 2 ，p h 范围为2 5 7 8 。最 适生长温度为2 8 3 2 ，最适生长p h 值为5 4 - - 一6 7 。菌核存活力很强，可在不 同生态条件下安全过冬。经过1 1 年以上的茵核仍能保持1 2 的萌发率。菌核无休 眠期和后熟期( 檀根甲等，2 0 0 0 ) 。菌核在田间相对湿度大于9 0 时开始萌发，当 相对湿度小于8 5 时，菌核萌发受到抑制。 立枯丝核菌( ( 尺s o l a n i ) 的寄主范围很广，能侵害2 0 0 多种植物，如水稻、小麦、 大麦、玉米、高梁、花生、棉花等，引起根腐、立枯和纹枯病。其种内分类主要采 用菌丝融合法。其原理为同一融合群的不同菌株间，菌丝体接触时可相互融合，而 不同融合群的菌株间菌丝体接触时则菌丝体局部死亡。迄今为止，立枯丝核菌已被 分为了1 4 个菌丝融合群( a n a t o m o s i sg r o u p s ) ，为a g l a g l 3 和a g b i 及众多亚 群。各融合群间在形态、生理、生化及致病性等方面均存在着差异。其中a g l 融和 群中的菌株的寄主范围最广，致病力最强，根据致病性，可将其进一步分为a g l i a 、 a g l i b 和a g l i c 三个亚群。我国分离得到的立枯丝核菌大都属于a g l - a g 5 这5 个融合群，引起水稻纹枯病的主要是a g l i a 亚群( 周而勋，2 0 0 2 ) 。 1 i 2 水稻纹枯病的危害 水稻纹枯病是世界性的水稻三大病害之一，几乎没有稻田不发生纹枯病，全世 福建农林火学硕上学位论文 界平均每年因该病造成的损失达数十亿公斤稻谷。水稻纹枯病也是我国稻区，特别 是华南及长江流域的高温高湿地区的重要病害，在1 9 8 5 至1 9 9 0 年期间，受害面积 达水稻栽培总面积的4 7 ，由此造成的损失每年超过2 亿公斤( 屠艳拉，2 0 0 6 ) 。 根据九十年代中期对我国南方稻区的调查，水稻纹枯病的发病面积是稻瘟病的2 0 7 倍，造成的损失是稻瘟病的1 9 7 倍( 左示敏，2 0 0 6 ) 。 近年来随着氮素化肥用量的增加，矮杆、多蘖品种和密植高产栽培技术的采用， 水稻纹枯病的危害逐年加重。但目前为止对人们对该病的致病机理了解不多，还未 发现相应的抗病基因和对此病免疫或高抗的水稻品种，发现的中抗以上的品种也寥 寥无几。我国水稻每年因此减产l o - - 2 0 ，发生严重时减产超过5 0 ( 孟庆忠等， 2 0 0 1 ) 。在我国南方稻区的很多地方纹枯病己经成为水稻的第一大病害。 1 1 3 纹枯菌侵染水稻的过程 水稻纹枯病是一种叶鞘病害，最初发生于稻株靠近水面的基部叶鞘上，也会感 染叶片和谷壳，并可危及茎秆。菌丝侵染水稻叶鞘时，先在叶鞘表面沿鞘脉方向生 长，形成伸长菌丝( r u nh y p h a s e ) ，数小时后开始分枝。一些分枝的顶端膨大形成裂 瓣状附着胞( 1 0 c a t ea p p r e s s o r i u m ) ；另一些分枝继续重复分枝，并相互聚集在一起 形成侵染垫( i n f e c t i o nc u s h i o n ) 。一般认为，上述2 种侵染结构在立枯丝核菌的侵染 过程中均会出现。在这两种侵染结构垂直于叶鞘的下表面形成侵入钉( p e n e 仃a t i n g p e g ) ，并以侵入钉方式穿透植物的角质层和细胞壁，进入细胞间隙和细胞内。菌丝 侵入组织后，2 0 小时后便出现暗绿色水渍状小斑，以后逐渐扩大呈卵形或椭圆形病 斑，4 0 小时后叶鞘的气孔中即有成丛的菌丝体出现( 陶家凤，1 9 9 2 ) 。病斑不断扩 大后会互相融合成不规则的云纹状大斑，其中心部位呈灰白色而周围呈棕褐色或棕 色，并在病健交界处形成深褐色的坏死线，造成被侵染部位局部组织枯死。在叶鞘 组织大面积坏死后，常造成叶身乃至幼嫩稻穗失水死亡( 张红生等，1 9 8 9 ) 。 1 1 4 纹枯菌侵染水稻的特点 纹枯菌的致病力越强，其所形成的侵染垫的数量就越多。水稻品种的抗病性越 4 福建农林大学硕士学位论文 强，纹枯菌在其叶鞘表面的菌丝生长量就越少，所形成的侵染结构的数量也越少。 在纹枯菌侵染垫的基部会产生细瘦的侵入钉，侵入钉在突破水稻的表皮细胞时明显 变细，进入细胞后又会恢复原先大小。但纹枯菌在侵染水稻时并不一定要形成侵染 结构，其菌丝更多的是由水稻的气孔及表皮细胞的间隙进入水稻体内( 周而勋等， 2 0 0 2 ) 。 纹枯病菌在水稻上的蔓延主要靠菌丝在稻株表面伸长，以找到新的适合部位进 行再侵染。这种生长方式对田间小气候特别是湿度要求很高，因此，尽管纹枯病在 水稻的一生均可危害，但通常只有2 个主要危害时期。第一个时期在水稻分蘖盛期 至拔节初期，第二个时期是孕穗至抽穗后1 5 天。其中第二个时期是危害的最主要时 期，特别是孕穗至籽粒灌浆初期，如遇阴雨天气，病情发展将非常迅速，甚至造成 病原菌从剑叶鞘发展到正在抽穗的谷壳上。在这2 个时期之间的圆秆拔节期，由于 株高迅速增加，水稻叶片的空间分布趋向合理，田间小气候改善，因而不利于病情 的发展，是水稻从生理上讲相对抗病的时期。此时，病原菌菌丝体或形成菌核，或 沿叶鞘内侧表面发展，或甚至潜伏于叶鞘内侧。 水稻纹枯病是在近水面叶鞘开始发生的，但叶片和叶鞘的直接相连部位一一叶 枕却不发病。叶鞘和叶片上的病斑不能直接相互扩展。离体接种实验发现，在高湿 条件下，叶鞘或叶片病斑的菌丝可以攀过叶枕，从而再次侵染叶片或叶鞘( 童蕴慧 等，2 0 0 0 ) 。 纹枯病菌抵御外界不良环境条件的基本对策是形成菌核。当环境气候适宜时， 菌核会再次萌发出菌丝体继续侵染。成熟的菌核有2 种存在状态：下沉式菌核和上 浮式菌核。前者不萌发，落入土壤后可在土壤中存活达数年之久，是后续危害的主 要菌源；后者漂浮在水面上，接触稻株基部叶鞘便萌发侵染，并可随农事操作时灌 溉水流或风的作用而扩大危害范围( 檀根甲等，2 0 0 0 ) 。 1 1 5 纹枯菌的致病机理 纹枯病菌的致病机理相当复杂，其致病能力是毒素，细胞壁降解酶和菌丝的机 械压力这些因子共同作用的结果。至于以哪种因子为主，以及各因子间如何相互协 调作用还有待于进一步研究。 福建农林大学硕士学位论文 对于纹枯病菌产生的毒素，一些学者认为是一种非寄主专化性毒素，主要成分 为苯乙酸( p h e n y l a c e t i ca c i d ，p a a ) 及其衍生物。x i e 等( 1 9 9 2 ) 发现水稻纹枯菌 的培养液中含有p a a ，它可使水稻生病，但并不能使其产生典型的纹枯病症状。 b e t a n c o u r t ( 2 0 0 0 ) 等用分光光度测定法和高效液相色普法( h p l c ) 分析了马铃薯 纹枯病病斑部位及从中分离出的纹枯病菌的培养液的组分，发现其中都含有苯乙酸 和间羟基苯乙酸。它们可抑制马铃薯幼苗根系生长，并使其初生和次生根坏死。但 随后的研究却发现在无致病力的马铃薯纹枯病菌的培养液中也含有p a a ，并且p a a 的含量和纹枯病菌的毒性高低及有无无关。 v i d h y a s e k a r a n 等( 1 9 9 7 ) 认为纹枯病菌的毒性代谢产物是一种含有葡萄糖，甘 露糖，n 一乙酰半乳糖胺和n 一乙酰葡萄糖胺的碳水化合物。用从纹枯病菌培养液 中获得的毒素接种水稻叶片，发现它能诱发叶片产生类似纹枯病的典型症状。在受 侵染的部位中也发现了上述组分，他们还发现不同的纹枯菌产生的毒素的成分相似。 纹枯菌产生的毒素具有寄主专化性，且毒素量与纹枯病菌的致病力呈正相关。 陈夕军等( 2 0 0 6 ) 发现水稻纹枯病菌在m a r c u s 培养液中能产生多聚半乳糖醛酸 酶、纤维素酶、果胶甲基半乳糖醛酸酶、多聚半乳糖醛酸反式消除酶和果胶甲基反 式消除酶这五种细胞壁降解酶。它们无论单独还是混合处理都能引起水稻叶鞘的细 胞膜损伤和组织浸解作用，并且病斑部位细胞壁降解酶的活性显著高于健康组织。 这表明细胞壁降解酶在纹枯病菌的侵染和扩展过程中起着重要作用，因而其也是水 稻纹枯病菌的一个重要的致病因子。 1 2 丝状真菌遗传转化系统简介 目前多使用由细菌质粒改造而成的载体进行丝状真菌遗传转化。携带目的片段 的载体进入丝状真菌细胞后，既可独立存在于其染色体外自主复制，称为复制型转 化；又可整合到丝状真菌染色体上随之一道复制，称为整合型转化。s o u t h e r n 杂交 分析发现丝状真菌转化绝大多数是整合型转化，目前仅在柄孢壳( p o d o s p o r a a n s e r i n a ) 和卷枝毛雷( m u c o rc i r c i n e l l o i d s ) 中发现有自主复制质粒的转化( 唐国敏， 1 9 9 2 ) 。 转化d n a 以三种方式整合到丝状真菌基因组中：( 1 ) 转化d n a 与受体染色 6 福建农林大学硕士学位论文 体d n a 同源序列之间重组，通过单交换导致转化d n a 整合到受体染色体d n a 上； ( 2 ) 转化d n a 与受体染色体d n a 发生异源重组，通过单交换导致转化d n a 整 合到受体染色体d n a 上；( 3 ) 转化d n a 与受体染色体d n a 发生同源重组，通过 双交换导致转化d n a 中的基因取代受体染色体中的基因。这三种整合方式发生的 频率随菌株或者载体上选择标记的不同而不同。其中第二种整合方式在丝状真菌遗 传转化中最为常见，在此转化过程中，转化d n a 和丝状真菌染色体d n a 间不需要 序列同源性。( 闫培生等，1 9 9 9 ) 丝状真菌细胞壁结构组分复杂，不易接受外源遗传物质，因而转化效率较低， 一般每微克d n a 约产生l 3 0 个转化子( 唐国敏，1 9 9 2 ) 。为顺利进行丝状真菌的遗 传转化，人们陆续发明了针对其原生质体的p e g 介导法、电击转化法、限制性内切 酶介导转化法，和针对其完整细胞的醋酸锂转化法、基因枪转化法和根癌农杆菌介 导转化法。但如果不存在任何选择压力，转化子在有丝分裂过程中也会表现出高度 的不稳定性，其原因可能有部分重复d n a 的甲基化，d n a 被降解或d n a 序列重排等。 1 2 1 丝状真菌原生质体的制备 原生质体是指被除去细胞壁的细胞，或者说是一个仅被质膜所包被的裸露细胞。 它具有活细胞的一切特征，并能在适宜的培养条件下再生成与其亲本相似的个体。 由于原生质体能够比较容易的摄取外源遗传物质，如外源细胞器、质粒等，因而是 进行遗传转化理想的受体材料。 获得高质量的原生质体是确保遗传转化实验成功的先决条件。人们曾尝试使用 研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质体，但效果都不理想。目前通常 采用相应的溶壁酶来降解细胞壁以获得原生质体。 真菌的菌龄、培养条件、菌丝预处理方式、溶壁酶、渗压稳定剂的性质及浓度 都会影响原生质体的得率和质量。现将它们的影响分别综述如下： ( 1 ) 菌龄：不同生长阶段的菌体其细胞壁结构，菌体代谢水平和菌体活力都不 相同。一般来说从幼嫩菌丝中所获得的原生质体的产量较高，质量也较好。随着菌 龄的增大，原生质体的得率明显降低，在超过一定菌龄的菌丝中就很再分离出原生 质体( 张志光等，1 9 9 8 ) 。 7 福建农林大学硕士学位论文 ( 2 ) 培养条件：培养基成分的不同会导致真菌细胞壁结构的差异，使其对溶壁 酶的敏感度发生变化，从而影响原生质体的得率。 ( 3 ) 菌丝预处理方式：不同的预处理方式会影响真菌的细胞壁结构，从而影响 它对溶壁酶的敏感度。酶解前用适量二硫苏糖醇或p 一巯基乙醇处理菌丝，可还原 细胞壁蛋白质中的二硫键，使酶容易渗入。另外，酶解前用含e d t a 的溶液预处理 菌丝，可螯和溶液中对酶有害的金属离子，提高酶解效率( 谭文辉等，2 0 0 6 ) 。 ( 4 ) 溶壁酶：目前研制的溶壁酶很多，主要是纤维素酶和d 一1 ，3 一d 一葡聚 糖酶。丝状真菌的细胞壁结构复杂，且不同的丝状真菌对溶壁酶的敏感性差异很大， 因而使用多种酶的混合溶液处理菌丝比使用单一酶的效果好( c h e n g 等，2 0 0 0 ) 。此 外，溶壁酶的浓度、p h 值、酶解温度、酶解时间、摇床的转速都会影响原生质体的 得率和质量，需进行一系列实验以确定它们的最佳值。 ( 5 ) 渗压稳定剂：酶解释放的原生质体需在合适的渗透压稳定剂中以维持细胞 内外渗透压的平衡。一般选用无机盐、糖或糖醇作为真菌原生质体的渗透压稳定剂， 不同真菌需要的渗透压稳定剂不同。 1 2 2 针对丝状真菌原生质体的转化方法 1 2 2 1p e g 介导转化法 p e g ( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，聚k , - 醇) 介导法的主要原理目前尚无定论，一般 认为p e g 能和m 矿+ 、m n 2 + 、c a + 等二价阳离子及外源d n a 在细胞表面形成沉淀，从 而改变质膜的通透性，以利于外源d n a 的进入。p e g 的分子量、浓度和原生质体的 培养方式都可影响转化效率。p e g 介导法操作简单，但转化效率较低，并且p e g 对 原生质体具有一定毒性，会提高原生质体的变异率。 1 2 2 2 电击转化法 电击转化法可以原生质体或完整的细胞做为受体。其原理是利用直流短电脉冲 在原生质体膜或细胞膜上形成可逆的瞬间通道，以利于外源d n a 进入。电击转化法 福建农林大学硕士学位论文 的转化率和p e g 介导转化法的转化率相差不大( c h e n 等，2 0 0 0 ) ，但电击转化法比 p e g 介导转化法的操作更为简单方便，并且所需d n a 的量更少。 1 2 2 3 限制性内切酶介导转化法 限制性内切酶介导转化法( r e s i s t a n c ee n z y m e - m e d i a t e di n t e g r a t i o n ，r e m i ) 是在 限制性内切酶的介导下用质粒d n a 转化相应真菌，通过质粒d n a 的异源插入使外源 d n a 整合到受体基因组的相应酶切位点上，从而获得转化子的方法。其主要步骤是 在p e g 和c a 2 + 存在的情况下，限制性内切酶和d n a 连接酶可进入原生质体中，限制 性内切酶切开染色体d n a 的相应位点，接着在d n a 连接酶的作用下使得外源d n a 有机会插入其中。目前该技术已成功地应用于一些丝状真菌的转化( 王政逸等， 2 0 0 3 ) 。 1 2 3针对丝状真菌完整细胞的转化方法 1 2 3 1 醋酸锂转化法 i t o 等( 1 9 8 3 ) 发现用l i a c 或其它一价金属离子，如n a + 、k + 等，处理对数期的 细胞可以增强细胞壁的通透性，经过热休克处理，再在p e g 的帮助下外源d n a 可以 进入完整的细胞中并形成转化子。用该法转化丝状真菌时，一般要使用其分生孢子 萌发后的细胞。 醋酸锂转化法最初的转化效率很低，用于酵母细胞转化时，每微克d n a 仅能产 生4 0 0 个转化子( i t o 等，1 9 8 3 ) 。后来通过减少l i a c 预处理细胞的时间、在转化液中 加入单链载体d n a 、将转化细胞在涂板前预培养l d 时，使转化率提高n 7 1 0 6 个转 化子m gd n a ( 郑荣等，1 9 9 7 ) 。 该法简单易行，对外源d n a 的纯度要求不高，并且转化子也不会出现多倍体现 象，但用l i + 处理细胞可能引起某些基因的突变。 1 2 3 2 基因枪转化法 福建农林大学硕士学位论文 基因枪法的原理是在d n a 溶液i i ) k c a 2 + 和亚精胺等，使d n a 可吸附在微小的 金粒或钨粒表面，制成“d n a 微弹”。随后，微弹在基因枪的动力系统作用下射入 受体细胞中，以对其进行转化。目前基因枪的动力系统有火药引爆、高压放电和压 缩气体三种。该法的突出优点是受体材料广泛且操作简单，但它的缺点也非常明显： 价格昂贵、嵌合体不易排除、不易选择转化体、转化频率低并且转化予再生困难。 1 2 3 3 根癌农杆菌介导转化法 利用根癌农杆菌介导转化法可将外源d n a 直接导入丝状真菌的完整细胞中，并 最终获得转化子。它同其它丝状真菌转化方法相比具有以下特点：( 1 ) 转化所用受 体来源简单。真菌的孢子和菌丝都可以直接用于转化，无需制备原生质体，这减少 了转化影响因素，增加了转化稳定性；( 2 ) 转化子稳定性好。选择单核的分生孢子 作为受体可以得到后代不分化的转化子，这避免了用多核的真菌菌丝作为受体时造 成的转化子不稳定问题；( 3 ) 该法的转化效率比其它常用的真菌转化方法要高得多， 在使用真菌分生孢子作为受体时表现得特别明显；( 4 ) t 一聊怕可以单拷贝地随机 插入到真菌染色体中( d eg r o o t 等，1 9 9 8 ) ，能携带大片段的外源d n a ，并可连接 不同的启动子使外源d n a 在不同组织里特异表达，这使得根癌农杆菌介导转化法在 基因标记、启动子捕获和基因活化等研究中有着广泛的应用。 由于有着上述的优点，目前根癌农杆菌介导转化法己经成为最常用的真菌遗传 转化方法( 李娟等，2 0 0 6 ) 。 1 2 4 用于丝状真菌原生质体转化系统的载体 目前用于丝状真菌原生质体转化的载体一般都是由细菌质粒改造而成的，并在 其中分别加入了使它能在丝状真菌和大肠杆菌中自主复制的元件。除此之外，载体 还应包括两个基本元件：( 1 ) 表达元件。包括基因的启动子、翻译起始区、信号肽 的编码序列、转录终止和聚腺苷酸作用的信号序列。外源基因表达的启动子有诱导 型和组成型两种，目前大都采用强诱导型启动子。( 2 ) 转化元件。主要是一个选择 标记，可使外源d n a 在宿主中稳定存在并可用于转化子的筛选。 l o 福建农林大学硕士学位论文 1 2 5 用于丝状真菌遗传转化系统的选择标记 1 2 5 1 营养缺陷型标记 营养缺陷型标记包括碳源、氮源、硫源等的代谢基因，它们能与相应的营养缺 陷型丝状真菌遗传互补，转化后可通过在基本培养基上筛选原养型生长菌落而获得 转化子。目前常用的营养缺陷型标记基因有：( 1 ) a r g b ，来自构巢曲霉，编码鸟氨 酸氨甲酰基转移酶，可在几乎所有的曲霉菌属( a s p e r g i l l u s ) 、脉孢茵属( n e u r o s p o r a ) 和木霉菌属( t r i c h o d e r m a ) 的菌种中表达； ( 2 ) p y r 4 ，来自颚突脉孢霉菌，编码 乳清苷5 磷酸脱羧酶，可在曲霉菌属和青霉菌属( p e n i c i l l i n ) 中表达。 营养缺陷型标记能引导载体整合到受体染色体中与其同源的部位，并且转化背 景很低，易于筛选。但由于特定营养缺陷型受体菌株分离困难，从而限制了它的实 际应用。 1 2 5 2 药物抗性标记 药物抗性标记包括抗生素抗性基因、b i a l a p h o s ( x 2 丙氨磷，一种除草剂) 抗性 基因和c a r b o x i n ( 萎锈灵，一种杀真菌剂) 抗性基因。用含药物抗病标记的载体成 功转化丝状真菌后，可使其获得相应的药物抗性，从而能在添加该药物的培养基上 生长。 目前使用的抗生素抗性标记主要为：潮霉素( h y g r o m y c i n ) 、寡霉素 ( o l i g o m y c i n ) 、博来霉素( b l e o m y c i n ) 、腐草霉素( p h l e o m y c i n ) 、卡那霉素 ( k a n a m y c i n ) 等，其中以潮霉素b 抗性标记的应用最为广泛。 b i a l a p h o s 抗性基因( b a r 基因) 和c a r b o x i n ( c b x r 基因) 已在植物遗传转化系统 中广泛使用。它们在真菌遗传转化系统中主要是作为一些对抗生素不敏感的真菌的 筛选标记。 使用药物抗性标记不用去筛选真菌的营养缺陷型突变体，十分方便，但却容易 出现假阳性现象，并可能给环境带来一系列生物安全隐患。 福建农林大学硕士学位论文 1 2 5 3 功能标记 这类标记是将外源功能基因导入受体中，并在其中表达，从而使受体获得某些 新功能。目前常用的功能标记有：( 1 ) 营养基因。例如a m d s 基因，来源于构巢曲 霉( 么n i d u l a n s ) ，编码乙酰胺酶。黑曲霉( 么n i g e r ) 等许多丝状真菌中不含此酶， 该基因能使转化子在以乙酰胺或丙烯酰胺为唯一碳源的筛选培养基上生长 ( d i a l l i n a s ，1 9 8 9 ) ； ( 2 ) 报告基因。例如b r a k h a g e 等( 1 9 9 5 ) 在研究构巢曲霉 ( 彳n i d u l a n s ) 中调控青霉素合成的基因时，将大肠杆菌中的肠c z 和目的基因组成融 合蛋白，从而使转化子能在含有x g a l ，并以乳糖为唯一碳源的培养基上显蓝色。 功能标记可以克服一些真菌对已有的药物抗性标记不敏感的问题，但却同样可 能带来生物安全隐患。 1 3 增强型绿色荧光蛋白( e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，e g f p ) 简介 1 3 1 绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的分子量为 3 0 k d 的生物发光蛋白。当受虱j 3 9 5n l t l 近紫外光或4 7 0n i n 蓝光激发后能发出波长为 5 0 9n l t l 的绿色荧光。绿色荧光蛋白使用方便，对细胞没有毒性，结构稳定，作用 持久，并可以在活体组织、细胞内部直接检测到，因而被作为报告基因，广泛应用 于蛋白质表达检测、蛋白质和细胞荧光示踪分析和蛋白质之间相互作用和构象变化 的研究中。 1 3 2 组蛋白增强型绿色荧光蛋白( h i s t o ne n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ) 生物的核小体是由四种序列保守的组蛋白( h i a o n ) 组成的八聚体。它们分别 是：h 2 a 、h 2 b 、h 3 和h 4 。此外，许多真核生物的染色质中还含有一种序列不太保 守的“连接组蛋白”( 1 i n k e r h i s t o n ) 。其中最为特别的是h 1 ，它构成了染色质的高级 结构( f o l c o 等，2 0 0 3 ) 。f r e i t a g 等( 2 0 0 4 ) 报道，将粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 1 2 福建农林大学硕士学位论文 中的h i s t o nh 1 ( h h l ) 、b e t a - 微管蛋白同g f p 一起组成融合蛋白，可增强g f p 的表达。 c l a i r e 等( 2 0 0 6 ) 在此基础上，利用由稻瘟菌( m a g n a p o r t h eg r i s e a ) 中的h i s t o nh 3 和g f p 组成的融合蛋白成功观察到了稻瘟菌侵染水稻过程中它的细胞核的迁移过 程。 1 4本研究的目的和意义 立枯丝核茵( r h i z o c t o n i as o l a n ik # h n ) 致病机理复杂，危害范围广，防治困难。目 前人们对其致病相关基因研究甚少，极少见到立枯丝核菌遗传转化体系的相关报道。 为从分子水平上揭示立枯丝核菌的致病机理，以达到最终控制其危害的目的，本研 究依据已经成熟的稻瘟病菌( m a g n a p o r t h eg r i s e a ) 原生质体转化体系( 采用p e g 介 导转化法) ，通过改良相关条件，最终建立起了水稻纹枯菌的遗传转化体系。本研究 还根据稻瘟菌中的h i s t o nh 3 ( g e n e b a n k 登录号为g i3 9 9 7 3 3 8 9 ) 的序列，采用同源克 隆方法成功克隆到了水稻纹枯菌中的h i s t o nh 3 ，并进一步成功构建了稻瘟菌和水稻 纹枯菌的e g f p 载体，在荧光显微镜下观察到了e g f p 的表达。本研究成果为深入研 究水稻纹枯菌致病相关基因打下了坚实的基础。 福建农林大学硕士学位论文 2 1材料 2 材料与方法 2 1 1 所用水稻纹桔菌( r h i z o c t o r z i as o l a n o 和稻瘟菌( m a g n a p o r t h eg r i s e a ) 水稻纹枯菌r h 9 由扬州农业大学提供。 稻瘟菌k j 2 0 1 由中国科学院国家基因研究中心的周波老师提供。 2 1 2 载体 p g e m te a s y z h b 载体、g f p 载体、p e n t r - - a t t r 载体由由中国科学院国家基因研 究中心的周波老师提供。 g a t e w a yp e n t r t m 载体购自i n v i t r o g e n 公司。 p s m 5 6 5 【含潮霉素( h y g r o m y c i n ) 抗性基因】由福建农林大学真菌实验室保存。 2 1 3 大肠杆菌菌种 ec o l id h i o b 和ec o l id b 3 1 由中国科学院国家基因研究中心保存。 2 1 4主要试剂，酶类和试剂盒 e xt a g ，r t a g ，io xe xt a gb u f f e r ，io xp c rb u f f e r ，d n t pm i x t u r e ， 加n ah i n d l i im a r k e r ，d l 2 0 0 0m a r k e r 购自t a k a r a 公司。 p f ud n a p o l y m e r a s e ，10 xp f ub u f f e r 购自p r o m e g a 公司。 d r i s e l a s e ，l y s i n ge n z y m e ( f r o mt r i c h o d e r m ah a r z i a n u m ) 购自s i g m a 公司 限制性内切酶购自n e we n g l a n db i o l a b ( n e b ) 公司 p e g 3 3 5 0 购自s e e b i ob i o t e c h n o l o g y 公司 1 4 福建农林大学硕士学位论文 q i a p r e ps p i nm i n i p r e pk i t ( 2 5 0 ) ，q i a q u i c kg e le x t r a c t i o nk i t ( 2 5 0 ) 购自q i a g e n 公司 b i g d y et e r m i n a t o rv 3 1s e q u e n c i n gs t a n d a r dk i t 购自a b i 公司 s e q u e n c i n gl o a d i n gb u f f e r 购自上海尤肯生物技术有限公司 2 1 5 主要仪器 细菌过滤器购自m i l l i p o r e 公司，c a tn o s c h v u l1 i 迮 p c r 仪：g e n ea m pp c rs y s t e m9 7 0 0 ，m jr e s e a r c hp t c - 2 0 0 电泳仪：b i o r a d 公司的凝胶电泳系统 凝胶成象系统：复日科技的f r 2 0 0 紫外与可见分析装置 离心机：h e r a e u sb i o f u g ef r e s c o ，h e r a e u sb i o f u g ep i c o ，b e c k m a nc o u l t e r a v a n t i t mj 2 5 ，b e c k m a ng s 15 r 水浴锅：j u l a b of 1 0 电转仪：l i f et e c h n o l o g i e sc e l l p o r a t o r 恒温培养箱：h e r a e u sl i n e 测序仪：a b i3 7 3 0 x ld n a a n a l y z e r 显微镜：m e i j ij y - y 2 0 0l 荧光显微镜：o iy m p u sp r o v i s 纯水机：m i l l i p o r e 公司的m i l l i q 纯水机 2 2方法 2 2 1 稻瘟菌( m a g n a p o r t h eg r i s e a ) 原生质体转化 2 2 1 1 稻瘟菌原生质体的制备 1 挑取已长好的菌丝块，捣碎后放入5 0 m l 液体5 x y e g ( 含5 0 心m ls t r ) 中，2 8 c 下振荡培养2 - 3 天，吸取2 一3 m l 培养液至l o o m l 液体c m 培养基( 含5 0 r t g 础 s t r ) 中，2 8 。c 下振荡培养2 - 3 天。 1 5 福建农林大学硕：t 学位论文 2 用灭过菌的尼龙膜过滤出菌丝，并用镊子取出菌丝中的琼脂块。 3 用无菌水冲洗菌丝至白色。 4 用1 ms o r b i t o l 冲洗菌丝两次。 5 用灭菌的滤纸将菌丝稍压干后，刮于裂解液( 包含8m g m ld r i s e l a s e ) 中。 6 2 8 - - 3 0 ，1 0 0 转分，裂解2 5 3 小时。 7 用灭过菌的尼龙膜过滤裂解液，再用1 ms o r b i t o l 冲洗残渣两次，4 * c ，4 5 0 0 转 分，离心6 分钟。 8 弃上清，用1 0 一- 1 5 m ls u t c 重悬原生质体，4 。c ，4 5 0 0 转分，离心6 分钟。 9 弃上清，用l m ls u t c 重悬原生质体，保存于- - 8 0 。 2 2 1 2稻瘟菌原生质体的转化 1 用s u t c 将原生质体稀释至1 0 5 1 0 6 个刎。 2