（微生物学专业论文）辅酶q10高产菌株理性选育与发酵优化.pdf

此基础上，进行l o l 发酵罐分批发酵与补料发酵的放大实验，结果表明：对于辅酶q l o 合成，补料发酵优于分批发酵，前者辅酶q l o 发酵水平可达7 0 4 9 m g l ，比分批发酵( 辅酶q l o 发酵水平3 5 8 5m g l ) 提高t 9 6 6 。关键词：辅酶q l o ；理性选育；发酵优化；发酵动力学模型；补料发酵i ia b s t r a c ta b s t r a c ti i i il li lli ii llll uliily 18 0 6 8 7 8t h es t r a i nx m 0 2 3p r o d u c i n gc o q l 0w a ss c r e e n e df r o ms t r a i n sp r e s e r v a t e di nt h el a b o r a t o r y ，i t sf e r m e n t a t i o nl e v e lo fc o q t 0w a su pt o18 8 0 m g l f i r s tt h r o u g ht h eo b s e r v a t i o no fc o l o n ym o r p h o l o g y ，c e l lm i c r o s c o p y ，l i q u i dc u l t u r ea n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，i tw a sf o u n dt h a tt h i ss t r a i nw a sg r a m n e g a t i v eb a c t e r i aw i t hr i c hp i g m e n ti nc e l l ，w h i c hw a sp r e l i m i n a r i l yj u d g e dt ob eo n et y p i c a lo f p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a t h e1 6 sr d n ao fs t r a i nx m 0 2 3w a ss e q u e n c e da n da n a l y z e df o rs i m i l a r i t i e sw i t hr e l a t e db a c t e r i a ls p e c i e s r e s u l t ss h o w e dt h a ts t r a i nx m 0 2 3w a sam e m b e ro ft h er h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s x m 0 2 3b e i n gas t a r t i n gs t r a i nw a sm u t a g e n i z e dt w i c ew i t hu va n dl i c l b ys c r e e n e i n gt h em u t a n t sr e s i s t i n gp h ba n dr o x i t h r o m y c i n i d ，am u t a n tx mi i13 6w a so b t a i n e d ，t h ec o q l 0p r o d u c t i o nr e a c h e dt o31 7 9 m g l ，w h i c hw a s6 9 。1 0 h i g h e rt h a nt h eo r i g i n a ls t r a i n a f t e rf i v et i m e so fc o n t i n u o u sc u l t u r e ，t h ey i e l do ft h em u t a n tw a sr e m a i n e da t2 9 m g l 一3 3 m g l r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo b t a i n e dm u t a n tx mi i13 6w a ss t a bles t r a i nt h a tw a sw o r t h w h i l et ob es t u d i e df u r t h e r t h ef e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o no fx mi i13 6w a ss t u d i e d t h r o u g hs i n g l ef a c t o rt e s to fm u t a n tx mi i13 6 ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eb e s tc a r b o nw a sg l u c o s e ，t h eo p t i m u mn i t r o g mw a st o ms t e e pp o w d e r ；t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw a so b t a i n e db a s e do nt h es i n g l ef a c t o rt e s t ，i ts h o w e dt h eo p t i m a la m o u n to fi n o c u l a t i o nw a s10 ，t h eo p t i m u mi n i t i a lp hw a s6 8a n dt h eo p t i m a ll i q u i dv o l u m ew e r e5 0 m lc u l t u r ei n2 5 0 m ls h a k ef l a s k s ap1a c k e t t b u n n a nd e s i g nw a su s e dt os e l e c t3i m p o r t a n tf a c t o r sf r o m9i m p a c tf a c t o r sw h i c ha f f e c t e dc o q l 0f e r m e n t a t i o ni nc u l t u r em e d i u m t h e yw e r eg l u c o s e ，n a c la n dg l u t a m i ca c i d t h eo p t i m u mc o m p o n e n t so b t a i n e db yt h er e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sm e t h o d ( r s m ) w e r eg l u c o s e 3 4 2 9 l ，n a c l2 4 2 9 l ，g l u t a m i ca c i d1 9 8 9 l a f t e rt h e s eo p t i m i z a t i o n ，t h ef e r m e n t a t i o nl e v e lo f x mi i1 3 6r e a c h e d1 2 9 2 1 m g l ，w h i c hw a s3 0 6 h i g h e rt h a nt h a to f n o n - o p t i m i z e df e r m e n a t a t i o n b a s e do nt h es t u d i e so ft h em e t a b o l i cc h a r a c t e r so fc o q i 0b a t c hf e r m e n t a t i o nw i t hm u t a n tx mi i13 6 ，t h ek i n e t i cm o d e lf o rc e l lg r o w t h ，c o q s 0f o r m a t i o n ，s u g a ri i i福建师范大学王娅学位论文c o n s u m p t i o nw e r ep r o p o s e da c c o r d i n gt ot h el o g i s t i ce q u a t i o na n dl u e d e k i n g p i r e te q u a t i o n t h ec a l c u l a t e dr e s u l t so fm o d e l sw e r ec o m p a r e ds a t i s f a c t o r i l yw i t ht h ee x p e r i m e n t a ld a t a t h em o d e le q u a t i o n sc o u l dr e a l l yr e f l e c tt h ec o q l of e r m e n t a t i o np r o c e s sa n dk i n e t i cm e c h a n i s m t h ee f f e c to fv i t a m i no nc o q i op r o d u c t i o nw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tv a r i o u sv i t a m i n sh a dd i f f e r e n te f f e c t e n c eo nc o q l op r o d u c t i o n t h em o s th i 曲一y i e l dw a s1 7 9 8 5m g lw h e nb e t a c a r o t e n ew a sa d d e d ，3 2 3 i n c r e a s eo f t h ey i e l d sc o m p a r e dw i t hn o ta d d i n gb e t a c a r o t e n e i na d d i t o n ，a d d i n gv b i ，c h o l i n ec h l o r i d e ，b i o t i n h a dc o u l db r i n g1 1 2 ，1 3 3 ，1 0 8 i n c r e a s eo f t h ey i e l d sr e s p e c t i v e l yc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r a s t t h eo p t i m u mt i m et oa d dd i f f e r e n ta d d i t i v e sw a sa l s od i f f e r e n t ，b i o t i n ，b lw e r ea d d e db e t t e ri ne a r l yf e r m e n t a t i o n ，w h i l e1 3 - c a r o t e n e ，c h o l i n ec h l o r i d ea d d e di nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s ss h o w e de f f e c t i v e s o y b e a no i la d d e dt ot h ec u l t u r em e d i u mc o u l di n c r e a s e d7 6 c o q l op r o d u c t i o nc o m p a r e dt ot h ec o n t r 0 1 u n d e rt h ec o n d i t i o n so fs h a k e f l a s k ，t h ee f f e c t so fa d d i n gt i m e ，a d d i n gv o l u m ea n da d d i n gm e t h o do fg l u c o s eo nc o q i op r o d u c t i o nw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta d d i n gs u g a ra t3 6 hw a sb e t t e rt h a ni nt h ei n i t i a lf e r m e n t a t i o n ，t h eo p t i m u ma d d i n ga m o u n to ft o t a lg l u c o s ew a s3 0 9 la n du s i n gm u l t i a d d i i n gm e t h o da c c e s s e dt ot h el a r g e s to f c o q l 0p r o d u c t i o n2 1 8 7 8 m g l o nt h i sb a s i s ，t h ea m p l i f i c a t i o ne x p e r i m e n to fb a t c hf e r m e n t a t i o na n df e d - b a t c hf e r m e n t a t i o ni n1o lf e r m e n t a t i o nt a n ki n d i c a t e dt h a tf e d b a t c hf e r m e n t a t i o nw a ss u p e r i o rt ob a t c hf e r m e n t a t i o nf o r t h es y n t h e s i so fc o q l o c o q , op r o d u c t i o nb yf e d - b a t c hf e r m e n t a t i o nw a su pt o7 0 4 9 m e g l ，i n c r e a s e d9 6 6 c o m p a r e dw i t hb a t c hf e r m e n t a t i o n k e y w o r d s ：c o q l o ；r a t i o n a lb r e e d i n g ；f e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n ；f e r m e n t a t i o nk i n e t i c s ；f e e d i n gf e r m e n t a t i o ni v11中文文摘中文文摘辅酶q o 作为一种极具医疗价值的生化药物的良好材料，对各种疾病有治疗功效，现已成为世界生物技术医药领域的一个新宠。近年来，在保健品和食品中的应用也相当广泛。随着辅酶q l o 的需求量不断攀升，越来越多国内外学者加入到研究辅酶q 。的行列。国外学者在利用基因工程改造菌种方面以及发酵过程中的条件控制方面做了许多研究。他们主要从辅酶q 。o 生物合成途径及调控机制等方面进行深入研究，应用代谢工程的方法选育高产菌株，构建工程菌株，改造原菌株，从而进一步优化生产工艺。国内的研究主要侧重于利用传统的诱变育种进行菌种选育以及配方优化方面，尽管获得了一系列产量提高的突变株，但还存在总体产量水平达不到工业化生产的要求，工业化发酵生产工艺落后等问题。本研究从产辅酶q l o 菌种入手，在筛选到1 株产辅酶q l o 菌株的基础上，根据辅酶q l o 的合成途径以及代谢调控机制，建立了合理的高产菌种理性筛选模型，成功选育1 株辅酶q l o 高产菌株，并对其发酵进行优化，进一步提高菌株的发酵水平，旨在为辅酶q l o 的工业化生产提供一定理论依据。一、辅酶q o 高产菌株筛选、鉴定及理性选育( 1 ) 菌株的筛选与鉴定通过摇瓶发酵从实验室现有菌种中筛选获得一株高产辅酶q 1 0 的潜力菌x m 0 2 3 ，产辅酶q l o 达1 8 8 0 m g l 。对该菌形态进行观察，并进行了相关的生理生化实验，初步判定该菌属于光合细菌紫色非硫菌科。在形态学鉴定基础上，通过比对菌株x m 0 2 31 6 sr d n a 与其他细菌1 6 sr d n a 序列表明，该菌的1 6 sr d n a 与r h o d o b a c t e rs p h e r o i d e s 的1 6 sr d n a 同源性达到9 9 ，因此，该菌确定为类球红细菌( r h o d o b a c t e rs p h e r o i d e s ) 。( 2 ) 辅酶q l o 高产菌株的理性选育以x m 0 2 3 为出发菌株，采用紫外线、l i c i 进行诱变，通过p h b 抗性筛选获得突变菌株x mi2 1 8 ，辅酶q l o 水平达到2 5 6 5 m g l ，较出发菌株x m 0 2 3 提高3 7 4 ；在获得抗p h b 突变株x mi2 1 8 的基础上，再次进行诱变，获得一株抗p h b 、罗红霉素的突变菌株x m i i1 3 6 ，最终辅酶q l o 水平达到3 1 7 9 m g l ，比突变株x mi2 1 8提高了2 3 9 。对该菌株进行遗传稳定性试验，连续传代5 次，每代的辅酶q l o 发酵水平均保持在2 9 m g l 3 3 m g l ，比出发菌株x m 0 2 3 ( 1 8 8 m g l ) 提高了6 9 1 0 。稳定性实验结果表明该突变株具有优良的遗传稳定性，是一株工业化生产辅酶q 1 0v福建师范大学王娅学位论文的潜力菌。二、辅酶q l o 发酵优化( 1 ) 通过单因素实验可知最佳氮源为玉米浆，初始浓度为4 9 l ，最佳碳源为葡萄糖，初始浓度为3 0 9 l ，n a c l 的最适浓度为3 9 l 。( 2 ) 采用p l a c k e t t b u r m a n 实验进一步优化培养基，从9 个影响因素中筛选出最显著的3 个因素：葡萄糖 谷氨酸 n a c l ，再通过响应面分析法对该3 因素进行3水平的优化。整体优化后，最终辅酶q l o 发酵水平达到1 2 9 2 1 m g l ，实验值与预测值( 1 3 1 1 1r a g l ) 只有0 9 2 的误差。优化后的发酵培养基最佳组合为：a2 9 l ，葡萄糖3 5 9 l ，玉米浆4 9 l ，n a c l2 5 9 l ，谷氨酸2 9 l ，磷酸氢二钾1 5 9 l ，磷酸二氢钾1 5 9 l ，b0 2 9 l ，c0 2 9 l ，碳酸钙5 9 l 。( 3 ) 通过发酵条件实验得到优化后的最适培养条件为：装液量为5 0 m l 2 5 0 m l三角瓶；接种量为1 0 ；初始p h 6 8 ，培养基中添加碳酸钙后，并采用氨水调节p h效果较好。三、辅酶q 。o 摇瓶发酵动力学模型的构建通过分析辅酶q l o 摇瓶发酵过程，初步构建辅酶q l o 摇瓶发酵动力学模型，对动力学模型进行实验拟合，求解相关动力学参数，成功构建辅酶q l o 发酵菌体生长、底物消耗、产物生成的动力学数学方程。菌体生长动力学模型：x = f 去号薯0 _ 2 9 筠e5 6 4 +。“产物生成动力学模型：尸= 意器- 1 2 4 5 6 i n5 6 4 + 0 2 9 xe ( 0 2 2 4 t ) 、)底物消耗动力学模型：s ：塑丝型竺+ 1 7 9 一o 2 1 8 1 n 5 6 4 - 0 2 9 x e ( 。- 2 2 4 0s2 0 9 1 4 + 0 0 4 7 x e ( 。 2 2 4 0 + 1 。7 9 一o 2 1 8 1 n 亏l 函_ 一四、添加物对辅酶q l o 发酵影响与q - o 补料发酵的研究( 1 ) 在各种维生素中，b 胡萝卜素效果最为明显，比对照提高了3 2 3 ，v b l 、氯化胆碱、生物素分别比对照提高了1 1 2 、1 3 3 、1 0 8 。不同添加物的最适添加时间也不同：生物素、b l 等有利于促进细胞生长的物质在发酵初期添加较好；而1 3 胡萝卜素、氯化胆碱等有利于辅酶q 。积累的物质在发酵过程中添加效果较好。向培中文文摘养基中添加豆油发现，豆油对辅酶q 。o 合成有促进作用，其产量与对照相比提高了7 6 。2 ) 在摇瓶条件下考察了葡萄糖补加时间、补加量和j b l j n 方式对辅酶q l o 的影响，结果表明发酵3 6 h 补加糖液比发酵起始补糖效果要好，补加总糖量为3 0 9 t , ，少量多次补加可获得最大辅酶q l o 产量( 2 18 7 8 m g l ) 。3 ) 在转速3 2 0 r m i n ，通气量为2 0 l m i n ，发酵温度为3 2 c 的发酵条件下，进行i o l 发酵罐分批发酵培养，结果表明：辅酶q l o 最大积累量达到3 5 8 s o m e t , ，比摇瓶分批发酵提高了6 3 9 ；在分批发酵的基础上，进行发酵罐补料验证实验，结果表明：对于辅酶q l o 合成，补料发酵优于分批发酵，辅酶q ：o 最大积累量可达到7 0 4 9 0 m g l ，比实验罐分批发酵提高9 6 6 。v i ilrroi福建师范大学王娅学位论文v i l i，j1j目录目录摘要。ia 】 i s t r a c t i i i中文文摘v目录i x绪论1 1 辅酶q l o 的概述1 -1 1 辅酶q l o 的发现- l 一1 2 辅酶q l o 的结构与功能一l 1 3 辅酶q l o 的应用一l _2 辅酶q 1 0 的生产- 2 2 1 直接提取法生产辅酶q l o - 0 一2 2 2 化学合成法生产辅酶q l o 一2 -2 3 微生物法生产辅酶q l o 一3 3 辅酶q l o 的代谢合成路径及代谢控制策略4 4 辅酶q 1 0 高产菌株选育6 4 1 应用代谢调节理论推理选育高产菌6 4 2 应用代谢工程理论构建辅酶q l o 工程菌一8 5 辅酶q l o 发酵工艺一8 5 1 发酵培养基对辅酶q 1 0 发酵的影响9 5 2 发酵培养条件对辅酶q l o 发酵的影响- 1 0 -5 3 数学和统计学方法在微生物发酵优化中的运用- 1 1 -5 4 辅酶q 1 0 补料发酵- 13 6 本论文的选题依据和意义1 3 7 本研究的主要内容1 4 第l 章辅酶q l o 高产菌的筛选、鉴定及理性选育- 1 7 -1 材料与方法一17 -1 1 实验材料17 1 2 实验方法1 9 2 结果与分析一2 3 2 1 菌体筛选2 3 2 2 传统生物学菌种鉴定2 3 2 316 sr d n a 分子鉴定2 5 2 4 辅酶q l o 高产菌株的理性选育一2 8 -3 小结。3 2 第2 章x mi i1 3 6 产辅酶q l o 摇瓶发酵优化3 3 1 材料与方法3 3 1 1 实验材料3 3 i x福建师范大学王娅学位论文1 2 实验方法3 3 2 结果与分析3 5 2 1 单因素实验3 5 2 2 发酵条件的优化3 9 2 3p l a c k e t t b u r m a n 设计筛选影响辅酶q l o 发酵的重要因子4 1 2 4 响应面实验优化培养基组成4 3 3 小结4 8 第3 章x m 1 3 6 产辅酶q i o 动力学模型构建4 9 1 材料与方法4 9 1 1 实验材料4 9 1 2 实验方法4 9 2 结果与讨论5 0 2 1x mi i13 6 辅酶q l o 摇瓶发酵代谢特性5 0 一2 2 茵体生长动力学模型5 1 2 3 产物生成动力学模型5 2 2 4 底物消耗动力学模型5 3 3 小结5 5 第4 章添加剂对辅酶q l o 发酵的影响及补料工艺优化5 7 1 材料与方法5 7 1 1 实验材料5 7 1 2 实验方法5 7 2 结果与讨论5 8 2 1 维生素类物质对辅酶q l o 发酵的影响5 8 2 2 维生素添加量对辅酶q l o 发酵的影响5 9 2 3 维生素添加时间对辅酶q l o 发酵的影响6 1 2 4 豆油对辅酶q l o 发酵的影响6 1 -2 5 摇瓶补糖工艺的研究6 2 2 610 l 发酵罐辅酶q l o 分批发酵6 5 2 71 0 l 发酵罐辅酶q l o 补料分批发酵6 6 3 小结6 6 第5 章结论与展望6 9 1 研究结论6 9 1 1 辅酶q l o 高产菌的筛选、鉴定及理化选育。6 9 1 2 辅酶q l o 摇瓶分批发酵优化6 9 1 3 辅酶q l o 动力学模型构建6 9 1 4 添加剂对辅酶q l o 发酵的影响及补料工艺优化7 0 2 展望7 1 一参考文献7 3 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果8 1 x，目录翌贮谢。一8 3 一个人简历- 8 5 x i，ii li绪论绪论1 辅酶q l o 的概述1 1 辅酶q l o 的发现辅酶q ( c o e n z y m eq ) 广泛存在于自然界之中，其组成包括一个醌环和一个聚异戊二烯侧链。根据其侧链异戊二烯数量的不同，可分为q 7 、q 8 、q 9 、q 1 0 等，不同的物种中，其细胞中辅酶q 的类型有所不同，如大肠杆菌q a 捌c o q 8 为主【l 】。辅酶q l o ( c o q l o ) 最早是由美国学者e l c r a n e 在1 9 5 7 年从牛心肌的线粒体中发现【2 】p r o f e s s o rk a r lf o l k e r 和他的同事于1 9 5 8 年正确的定义出辅酶q l o 的结构，并且第一个利用发酵法来生产辅酶q l o 【3 1 。19 6 5 年日本的p r o f e s s o ry a m a m u n 首次采用口服辅酶q l o 来治疗心脏病【钔。1 2 辅酶q l o 的结构与功能辅酶q t 0 化学名称为2 ，3 二甲氧基5 甲基6 癸异戊烯基1 ，4 二苯醌( 2 ，3 d i m e t h o x y - 5 m e t h y l 6 p o l y p r e n y l - 1 , 4 b e n z o q u i n o n e ) ，别名泛醌。结构与维生素k 类似，分子量为8 6 3 3 6 ，分子式为c 5 9 h 9 0 0 4 ，其熔点为4 7 5 00 c ，从化学结构上看，辅酶q l o 是以2 ，3 二甲氧基5 甲基1 ，4 苯醌为核心，连上一个聚异戊二烯的侧链。辅酶q l o 的生理功能主要来自于醌基的氧化还原化学特性和聚异戊二烯侧链的物理特性。x 射线分析证明，醌分子中虽然存在碳氢双键间的p p 共扼体系与碳碳双键，却不是芳香烃，不属于芳香族化合物。它具有典型的碳基化合物和烯烃的反应性能，可以进行多种形式的氧化还原反应和加成反应。研究表明【5 】，细胞中的辅酶q l o 有三种氧化还原状态。其还原态的、异戊二烯单体全为反式结构的辅酶q t o 比氧化态、异戊二烯单体全为顺式结构的辅酶q 。o 具有更高的活性和理化作用。辅酶q 1 0 的功能已经被广泛的研究，其各项功能与两种生化作用有关：一是所具有的抗氧化能力，二是在电子传递链上的角色。在电子传递链中，辅酶q ，o 由氧化还原的反应将两个电子和质子由n a d 转移到线粒体膜上的细胞色素，并顺着氧化还原电位将电子转移到氧分子与质子合成水，并产生a t p 。1 3 辅酶q 。o 的应用1 3 1 在医药领域中的应用辅酶q l o 主要应用于心血管疾病如心脏病的治疗【6 7 1 ，对药物副作用的预防及促福建师范大学王娅硕士学位论文进免疫功能上具有相当的疗效，心脏手术患者在手术前后服用c o q i o ，能保护心肌、缩减病人恢复时间、减少心肌损伤及减少病人手术后并发症【8 】，在心脏外科手术中具有重要作用。另外，它是细胞自身合成的天然抗氧化剂和细胞代谢的激活剂，具有提高机体免疫力的功能，因而是一种临床价值很高的生化药物【9 1 。它可用于治疗病毒性肝炎、坏血病【1 0 1 ；还具有抗肿瘤、治疗圆形脱发和肺气肿的功能【1 1 ，1 2 1 ；对艾滋病和帕金森症有显著的辅助治疗【1 3 】；对听觉障碍也有一定治疗效果【1 0 】。1 3 2 在食品领域中的应用辅酶q l o 可作为代谢激活剂激活细胞呼吸，在细胞能量转换中具有重要作用，常作为人体或运动等的体能增强剂【1 4 】。同时辅酶q l o 还可以增强免疫力，因此常作为一种食品营养添加剂添加到食品中【1 5 】。1 3 3 在化妆品行业中的应用实验表明，随着年龄的增加皮肤胶原蛋白抵御紫外线等氧化刺激物损伤的能力下降，而辅酶o 。o 可以保护皮肤免于损伤，有效防止皮肤衰老，减少眼部周围的皱纹【l 们。广泛的研究认为辅酶o l o 还可以抑制脂质过氧化反应，抑制氧化应激反应诱导的细胞凋亡，具有显著的抗氧化、延缓衰老的作用【1 7 ，18 1 。因此，辅酶q l o 对延缓衰老和提高机体免疫力有着不可代替的作用，被大量运用于女性化妆品领域。随着生活水平的提高，近年来人们对它的需求量不断攀升，从而促进了辅酶o l o 产品生物加工的发展。2 辅酶q 。o 的生产辅酶q - o 的生产方法一般分为直接提取法、化学合成法、微生物发酵法等。2 1 直接提取法生产辅酶q 1 0目前国内外从动植物中提取辅酶q 。的报道不多，主要是从大豆、烟叶或动物内脏中进行分离和提取。辅酶q l o 提取方法主要有溶剂萃取法【1 9 1 、皂化法【2 0 2 1 1 、吸附层析法等 1 7 , 2 2 - 2 4 】。提取法制备工艺较简单，但提取成本高，且受原料及季节等的限制，不适合于现代化工业大生产。2 2 化学合成法生产辅酶q 1 0长期以来辅酶q l o 的合成一直是化学家们研究的热点【2 5 2 6 1 ，所采用的方法主要有以辅酶q o 和2 ，3 ，4 ，5 四甲氧基甲苯为主环原料的合成策略。金文虎等【2 7 1 ，以2 ，3 ，4 ，5 一四甲氧基甲苯为原料，经溴化、生成格氏试剂后在碘化亚铜存在下与( e ) 一4 氯2 绪论甲基1 苯磺酰基2 丁烯缩合得到合成辅酶q l o 的关键中间体6 ( e 一3 甲基4 - 苯磺酰基2 丁烯基) 2 ，3 ，4 ，5 四甲氧基甲苯。此中间体与茄尼基溴缩合、脱砜基化反应和氧化三步反应，最终制得辅酶q l o ，以2 ，3 ，4 ，5 四甲氧基甲苯计总收率达3 1 3 。李全等【2 引，首次实现了母体格氏试剂与侧链偶联合成辅酶q l o 。合成法制得辅酶q l o 为顺反异构体混合物，生物活性低，同时化学合成所用的原料一般是以化工产品中间体或通过其他途径制备的提取物，合成过程步骤多、反应复杂、且转化效率低、往往还存在许多副产物，这些因素都严重影响了其产业化的发展。2 3 微生物法生产辅酶q 。o微生物发酵法是目前生产辅酶q l o 最主要的生产方法。该生产方法由于原料廉价丰富，产物分离过程相对简单，产物为天然品，不存在手性问题，生物活性好，易被人体吸收，且可以通过发酵罐实现规模化工业化生产，因此成为最有发展潜力的辅酶q l o 生产方法。迄今为止，国内外报道的辅酶q l o 产生菌大多为细菌【2 9 - 3 2 ，表l列出主要的产辅酶q l o 微生物。通常微生物发酵生产辅酶q l o 的产量在3 0 1 3 0 m g l ，据估计要实现商业化生产辅酶q l o 的产量应该高于5 0 0 m l 【3 3 1 。在国际上，日本是最早开发辅酶q l o 的国家，近几年来，韩国在辅酶q l o 领域的研究也较为深入。表1辅酶q l o 主要产生菌! 垒q ! 宝! 垫! 翌垒i 翌! 堕璺i 翌! p 翌璺旦! i 呈g9 2 q ! q堕堡竺2 q ! q 堕壅翌吐9 2 9 ! q 鱼量翌凼：里竺里叁垄塞堕烟曲霉( a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s )3 7 84 2【3 4 】荚膜红细菌( r h o d o b a c t e r c a p s u l a t u )一5 3【3 5 】类球红细菌( r b s p h a e r o i d e s )9 7 22 7【3 5 】类球红细菌( r b s p h a e r o i d e s )3 5 08 7【3 3 】突变株c 0 2 2 1 1根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s )放射型土壤杆菌( a b r a d i o b a c t e r )8 7 66 0 o 3 6 】 3 3 】墼箜型垡堕! 丝竺竺! 竺! 生丝塑竺竺：兰：垒q ：堑【i ：】目前，我国也有多家企业参与开发和生产辅酶q l o ，其中南京伊贝加科技、厦门金达威集团、天辰神舟已经大量投入工业化生产，所生产的辅酶q l o 产品已经占据市场相当大的份额。表2 、表3 列出了国匹g j , b 具备开发潜能生产菌株及其发酵水平。tk福建师范大学王娅硕士学位论文表2 国外辅酶q l o 发酵水平三生! 宝：坠宝! 宝堡12 19 2 q i - o - f e 珊e n t i o ni nf o r e i l 鲤i t ! 垒翌曼_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _国家发酵水平m g ，l菌株参考文献日本7 7 0球红假单胞菌【3 7 】( r h o d o p s e u d o m o n a ss p h e r o i d e s )3 5 0类球红细菌c o - 2 2 一ii【3 3 】韩国6 2 6根癌农杆菌k c c m l 0 4 1 3【3 8 】美国5 0 0大肠杆菌工程菌2 9 1表3国内开发辅酶q l o 主要菌种! 呈! ! 宝i! 垒宝翌璺i 翌! 塑i 翌! p 翌垫呈i 坠gg 鲤i q ! 坐璺i 盟垫璺2 巴! ! 垒! ! 竺璺单位发酵水平m g l菌株备注江南大学5 2 4放射型根瘤菌w s h 2 6 0 17 l 发酵罐中国药科大学1 5 6 2酵母菌h y - 0 55 l 发酵罐流加补糖南京理工大学l o 8热带假丝酵母c 1摇瓶培养浙江工业大学1 1 2季也蒙假丝酵母摇瓶培养9 6 8 8鞘氨醇菌摇瓶培养s p h i n g o m o n a ss p z u t e 0 3第三军医大学2 0 3 6 5光合细菌r c a p s u l a t u sm t i l 3 1摇瓶培养沈阳农业大学4 8 4 4葡萄汁酵母摇瓶培养3 辅酶q 。o 的代谢合成路径及代谢控制策略辅酶q l o 化学结构组件主要包括：苯醌( 芳香环) 、异戊二烯侧链与芳香环上甲氧基，图1 为辅酶q l o 的结构简式。r u d n e y 于1 9 7 6 年在关于辅酶q l o 的国际会议上，提出了辅酶q l o 的微生物合成途径【2 1 ，其合成大致可分为三个部分：芳香环前体对羟基苯甲酸( p h b a ) 的合成( 见图2 ) ，主要由莽草酸途径产生；聚异戊二烯侧链的前体聚异戊二烯焦磷酸( p p p ) 的合成( 见图3 ) ，聚异戊二烯侧链是通过m e p途径合成的【3 9 】；甲基的供体s 腺苷甲硫氨酸( s a m ) 的合成是由甲硫氨酸合成途径中的甲硫氨酸转化而来的。在原核生物和真核生物合成过程中，其合成的物质是相近的，主要差别是在合成次序的不同【4 0 】。如图4 所示，在真核生物的合成过程中，4 一羟基3 癸异戊烯基苯甲酸先经氧化、甲基化之后再脱去羧基，而在原核生物中则绪论相反，先脱去羧基后再氧化、甲基化。c h 厂oc h 广o3下 kc i i ：- c ! i = c c h 2n图1 辅酶q l o 的结构简式e p 斗呻唧硝酸赤藓糖卜卜硇霹哪g l t l t l3 1 1 ； 氧弘阿拉伯糖型庚酮糖酸7 - 磷黼d a h p )ll色氯酸一支酸抽蹬嫩i预苯酸ll 苯丙氨酸对羟基苯丙酮酸斗4 羟基苯甲酸l 未鳓1 0 叩帆瑙麟酸l 酪氯酸i辅酶q l o图2 对羟基苯甲酸( p h b a ) 的合成路线f i g 2t h ep a t h w a yf o rt h es y n t h e s i so fp h b a嘲c 巩3乙醮c o a ( e 跚途径产生)i3 羟基3 甲基戍二酸簟酰c o a ( e m g - c o = a )加c 还暮一i b i g r ii甲羟戍酸( m v a )j3 异戍烯基焦磷酸舞晚蟠基童鼻童转善童tl 脯，i糍牛j l 基焦磷酸( g p p )卿一i 晃晚垮转龋层：甲一lio、胆麟聚十戍二烯焦磷酸4 麟傩蒜蕊舛。黼类固薛激素胆酸图3 聚异戊二烯侧链化合物合成路线f i g 3t h ep a t h w a yf o rt h es y n t h e s i so fs i d ec h a i no fi s o a m yg r o u p图4 辅酶q 在原核细胞与真核细胞合成次序上的差异f i g 4t h eo r d e rd i f f e r e n c eo fc o qp r o d u c eb e t w e e np r o k a r y o t e sa n de u k a r y o t e s5 福建师范大学王娅硕士学位论文在对辅酶q l o 生物合成途径及其调控机制研究基础上，利用代谢工程的定向选育，优化代谢途径，可达到提高辅酶q i o 发酵水平的目的。目前主要代谢控制策略有：( 1 ) 强化辅酶q l o 组件的生物合成，即强化莽草酸途径、m e p 途径与甲硫氮酸合成途径【4 l 】；( 2 ) 强化葡萄糖代谢流量，解除葡萄糖分解代谢阻遏，实现高浓、高效转化。( 3 ) 切断或减弱支路通量，解除其末端产物对辅酶q l o 代谢流的分流与反馈抑制，例如莽草酸途径也产生芳香族氨基酸、类胡萝卜素等。4 辅酶q 。o 高产菌株选育4 1 应用代谢调节理论推理选育高产菌4 1 1 选育营养缺陷型突变株在工业育种中，要获得高产的菌株必须要突破或解除细胞自身的代谢调控机制，通过选育分支点酶的营养缺陷型突变菌株可切断或减弱不必要的代谢支路，解除反馈抑制或直接提高目的产物产量。o l s o n 和r u d n e ) ：2 】发现胡萝卜素合成和辅酶q l o合成具有共同的前体，胡萝卜素分支是辅酶q l o 合成中的一股强大的代谢流( 如图3 ) 。胡萝卜缺陷型菌株可以切断p 胡萝卜素的代谢流，从而增加与辅酶q o 合成的共同前体g g p p 的积累与供给，提高辅酶q l o 的产量。h a j i m ey o s h i d a t 3 3 】等获得尺s p h a e r o i d e s 绿色突变株( 即胡萝卜素缺陷型) 的q l o 胞内含量为8 7 m g g d c w ，比野生型提高3 6 倍。研究表明，通过选育苏氨酸、色氨酸、【广酪氨酸缺陷或l 苯丙氨酸缺陷等营养缺陷型突变株以阻断不必要的代谢支路，增加甲硫氨酸和s 腺苷蛋氨酸合成途径中各酶基因尤其是限速酶的拷贝数及表达量，可以提高s 腺苷蛋氨酸的产量，为合成辅酶q l o 提供富足的前体t 4 2 。4 1 2 选育抗反馈调节的突变株( 1 ) 耐前体突变株选育在辅酶q l o 生物合成中，每合成一分子产物需要一分子对羟基苯甲酸( p h b a ) ，一分子聚异戊二烯焦磷酸( p p p ) ，还需要s 腺苷蛋氨酸( s a m ) 和氧气的供给，因此要提高辅酶q l o 产量必须保证前体的协同供给。l 乙基硫氨酸是l 蛋氨酸的结构类似物，选育抗前体【广乙基硫氨酸突变株，可以解除蛋氨酸对高丝氨酸转乙酰基酶的反馈抑制和对胱硫醚裂解酶和转甲基酶的阻碍，有利于蛋氨酸的合成，保证了前体物s a m 的供给，从而促进辅酶q l o 的大量合成。王普【4 3 】等，对实验室筛选的季也蒙假丝酵母( c a n d i d ag u i l l i e r m i n d ) c g l 0 8 进行c 0 6 0 2 丫射线辐照、微波诱变、紫外照绪论射、紫外线、l i c l 处理等复合诱变，并结合l - 乙基硫氨酸耐前体突变株的理性化筛选，获得一株辅酶q l o 高产菌株p n 2 5 1 。突变菌株经摇瓶发酵生物量达到6 2 1 9 l ，辅酶q l o 产量为1 1 2 m g a 。，较出发菌株提高了2 5 6 。菌株传代五次后其辅酶q 1 0 产量为10 9 m g l ，遗传性能稳定。( 2 ) 耐终产物突变株选育在辅酶q l o 的合成途径中，过量终产物可能会产生反馈抑制。维生素k 3 是辅酶q l o 的结构类似物，利用维生素k 3 等辅酶q l o 结构类似物进行筛选耐终产物的突变株，可获得辅酶q l o 高产菌。选育抗类似物突变株是目前代谢控制育种的主要方向【删。张向i j h 4 5 1 等通过一系列的诱变处理，获得乙硫氨酸和( 3 双抗性突变株，与出发菌株相比，诱变株在优化后的发酵条件下辅酶q 1 0 产量达到2 9 5 m g l 。( 3 ) 解除葡萄糖分解阻遏突变株当发酵培养基中葡萄糖浓度提高到一定时，会抑制菌体的生长与产物生成，这可能是由于某些酶的合成被容易分解利用的碳源所阻遏。因此选育解除葡萄糖分解阻遏突变株，可增加葡萄糖代谢通量，促进辅酶q l o 的合成。文献报道【4 5 】在获得双抗性突变株的基础上，再进行诱变处理，进而获得一株x g a l 禾l j 用能力提高的突变株，与出发菌株相比，突变株的辅酶q l o 产量提高幅度达5 0 6 。4 1 3 应用细胞毒性物质筛选高产菌株由于辅酶q 。o 是胞内的一种生物活性物质，对细胞毒性物质具有“解毒 作用。因此在培养基中添加放线菌素d 、罗红霉素等毒性物质对菌体细胞产生胁迫毒害作用，诱变后如果能得到抗毒性物质的突变株，表明该突变株对毒性物质的抵抗能力增强，则胞内的辅酶q l o 等生理活性物质的积累量可能较高。因此以细胞毒性物质作为筛选模型，可得到辅酶q 。o 胞内含量高的菌株。潘春梅【4 6 】等，以放射型根瘤菌( r h i z o b i u mr a d i o b a c t e r ) w s h 2 6 0 1 为出发菌株，经紫外线和亚硝基胍复合诱变，获得遗传稳定性好的抗放线菌素d 突变株w s h f 0 6 。通过诱变和优化发酵条件，突变株w s h f 0 6 1 拘辅酶q l o 产量达至u 3 4 m g l ，