（动物遗传育种与繁殖专业论文）次黄嘌呤对昆明白小鼠卵母细胞减数分裂调控作用的研究.pdf

y 6 0 1 8 1 2 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行 科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮 助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本 声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文 的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送 交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：办士参 导师签 目 山东农业人学硕上研究生学位论文( 2 0 0 4 ) 中文摘要 目前，胚胎工程技术研究和开发需要大量高质量的成熟卵母细胞，但 利用屠宰动物卵巢卵母细胞经过体外成熟培养而获取的卵母细胞质量还 远不如体内成熟卵母细胞，其原因一般认为是缺乏体内主卵泡阶段的获能 作用。因此，近年来人们开始探讨人工控制卵母细胞核成熟，以提高卵母 细胞胞质成熟度。本实验研究了卵泡内生理性减数分裂抑制剂次黄嘌呤 ( h x ) 对昆明白小鼠卵母细胞减数分裂的调控作用和影响因素，并着重 研究了次黄嘌呤阻止减数分裂恢复的可逆性问题。结果表明： 1 、从18 2 3 同龄幼鼠卵巢表面获得的卵母细胞总数和a 类卵丘卵母 细胞复合体( c u m u l u s - o o c y t e sc o m p l e x e s ，c o c ) 数目都高于7 1 0 周龄的 成鼠，不同年龄小鼠体外成熟卵母细胞的成熟率和孤雌激活率差异也不显 著。 2 、4 m m h x 可有效抑制小鼠卵母细胞生发泡破裂( g e r m i n a lv e s i c l e b r e a k d o w n ，g v b d ) 的发生，但抑制效果随时间延长而下降，到1 8 h 之 后g v 率显著低于0 h 。 3 、1 9 2 1 日龄小鼠卵母细胞中s n 型比例显著低于7 1 0 周龄成鼠。 t - i x 抑制0 h ，1 9 2 1 日龄小鼠s n 型卵母细胞比例为3 8 1 ，到6 h ，上升 到9 3 ( p 0 0 5 ) ，说明h x 抑制可以使n s n 型转化为s n 型。在体内和 体外成熟3 h ，s n 型比例下降到2 7 5 和1 5 5 ( p 0 0 5 ) ，说明s n 型卵 母细胞发生g v b d 的时间要快于n s n 型。 4 、h x 抑制时间短于2 4 h ，恢复成熟培养时卵母细胞成熟率与对照组 ( 9 5 ) 差异不显著，但抑制时间再长，成熟率显著下降。说明h x 是一 种可逆性抑制剂，但若抑制时间过长，会造成对卵母细胞的损伤。 5 、在h x 抑制过程中卵丘基本不扩展，大部分处于0 级和l 级。抑 制6 h 后恢复培养1 4 h ，卵丘扩展能力不受影响，而抑制2 4 h 后再成熟9 7 的卵丘只发生二级扩展。 6 、h x 抑制6 h 使g v b d 和排出第一极体的时间由正常成熟时的2 4 h 和9 - 1 2 h 分别提前到1 3 h 和6 9 h 。说明h x 抑制使减数分裂进程加快， 排出第一极体的时间同步。 7 、体外成熟卵母细胞的激活率( 2 0 ) 和桑椹胚囊胚发育率( 1 7 ) 了下：h x 对昆叫白小鼠卵母细胞减数分裂的调= | 本 作用 都明显低于体内成熟卵母细胞( 8 6 和6 4 ) 。抑制6 h 再成熟的卵母细 胞激活率有显著提高( 4 2 v s 2 0 ) ，但胚胎不能发育到桑椹胚。 8 、体外成熟卵母细胞和抑制6 h 后再成熟的卵母细胞的受精率和桑椹 胚囊胚率显著低于体内成熟卵母细胞。抑制6 h 组的受精率( 1 6 ) 显著 低于正常体外成熟组( 3 5 ) ，桑椹胚囊胚率也较低( 1 2 v s 2 2 ) ， 差异接近于显著( p = 0 1 9 ) 。 9 、a 类c o c 和脱卵丘卵母细胞( d e n u d e do o c y t e s ，d o ) 体外成熟 1 4 h 的成熟率无显著差异。h x 抑制2 4 h 后，a 类c o c 和d o 的g v 率差 异不显著，表明卵丘的有无对抑制效果无影响，h x 不需要通过卵丘来起 作用。但抑制2 4 h 后，d o 的成熟率显著低于c o c ( 3 0 v s 8 8 ) ，说 明卵丘可减缓h x 对卵母细胞造成的损害作用。 关键词：卵母细胞，减数分裂，染色质构型，次黄嘌呤，小鼠 山东农业 学顶j ：研究生学位论文( 2 0 0 4 ) s t u d i e so nh y p o x a n t h i n ec o n t r o lo f m e l 0 s i so fo o c y t e so fl ( u n m i n g c e a b s t r a c t e m b r y ot e c h n o l o g yn e e d sl a r g eq u a n t i t i e so fh i 【曲q u a l i t yo o c y t e s h o w e v e r , t h eq u a l i t yo fi nv i t r om a t u r e do o c y t e si sg e n e r a l l y1 0 w e rt h a nt h a t o ft h ei nv i v om a t u r e d t h ep o o rq u a l i t yo fi nv i t r om a t u r e do o c y t e sw a s t h o u g h tt ob ed u et ot h el a c ko fc a p a c i t a t i o nd u r i n gd o m i n a n c yo ff o l l i c u l a r d e v e l o p m e n ti nv i v o t h e r e f o r e ，p e o p l ea t t e r r l p t e dt oi m p r o v et h eq u a l i t yo f i v mo o c y t e sb yi n h i b i t i n gn u c l e a rm a t u r a t i o n h y p o x a n t h i n e ab i o l o g i c a l i n h i b i t o r si nt h ef o l l i c u l a rf i u i d w a su s e dt oc o n t r o lm e i o s i so f m o u s eo o c y t e s a n di n f l u e n c i n gf a c t o r sa n dt h er e v e r s i b i l i t yo fh xi n h i b i t i o n w e r e i n v e s t i g a t e di nt h i ss t u d y t h er e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t h et o t a ln u m b e ro fo o c y t e sa n dt h en u m b e ro ft y p eac o c s r e c o v e r e df r o mm i c eo f18 2 3d a y so fa g ew e r eh i g h e rt h a nt h o s ef r o mm i c e 7 一1 0w e e k so fa g e b u t 也ea b i l i t yo fm a t u r a t i o na n dp a r t h e n o g e n e t i c a c t i v a t i o no f o o c y t e sw a sn o td i f i e r e n tb e t w e e nt h et w oa g eg r o u p so f m i c e 2 h ) ( a tt h ec o n c e n t r a t i o no f4m m o l l i n h i b i t e dt h em e i o t i cm a t u r a t i o n o fm o u s eo o c y t e se f f i c i e n t l y , b u ti n h i b i t i o nr a t e sd e c r e a s e dw i t ht i m e a n dt h u s t h ep e r c e n t a g eo fo o c y t e sw i t hg vw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e ra t 18 ht h a n0 ho f i n h i b i t i o n 3 t h ep e r c e n t a g eo fs no o c y t e sw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e ri nm i c eo f 1 9 2 1 d a y so l dt h a l li nm i c eo f7 一1 0w e e k so fa g e t h ep e r c e n t a g eo fs n o o c y t e si um i c eo f1 9 2 l d a y si n c r e a s e df r o m3 8 1 b e f o r eh xi n h i b i t i o nt o 9 3 偿 7 0 p r o ) ，卵 丘完整而且致密，层数在三层以上，卵母细胞形状规则，胞质均匀无颗粒， 胞质颜色正常，呈均匀的浅黄色，仔细调节显微镜可见核仁和生发泡。( 2 ) b 类c o c ：卵丘松散，只有少数几层卵丘或只带有部分卵丘，生发泡和 核仁清晰，其余指标同a 类卵。( 3 ) n o ( 天然裸卵) ：基本不带卵丘， 生发泡和核仁清晰，其余指标同a 类卵。( 4 ) 退化卵：以下条件只要符 2 山东农业大学硕士研究生学位论文( 2 0 0 4 ) 合一项就记为退化卵：胞质不均匀，出现颗粒；胞质颜色发黑或过浅：卵 丘已扩展；生发泡破裂；带第一极体；卵周隙过大或消失。( 注：有小部 分卵母细胞未达到最大直径，可能来自小的有腔卵泡，不记入以上分类) 。 记录每只小鼠获得的各类卵母细胞的数目。部分a 类c o c 用适当口径的 口吸管反复吹打，机械法脱去卵丘后获得d o 。本实验只采用a 类c o c 和d o 用于培养。 2 3 2 体内成熟卵母细胞的获取 超排方法是1 5 ：0 0 腹腔注射p m s g l oi u 只小鼠，4 8 小时后腹腔注 射h c g l 0i u 只。注射h c g 后不同时间，利用颈椎脱臼法处死小鼠，打 开腹腔取输卵管于m 2 操作液中，在体视显微镜下用眼科镊子撕开输卵管 壶腹部释放出卵丘卵母细胞复合体团，用口吸管吹打几次，把c o c 团分 散开。 2 4 山羊卵母细胞的获取 山羊的卵巢取自的山东省泰安市随机屠宰的山羊，在3 0 3 5 的无菌 生理盐水( 添加1 0 0 i u m l 的青霉素和硫酸链霉素) 中3 小时内带回实验 室。用生理盐水充分清洗后，用带有2 m l 左右d p b s 的1 0 m l 注射器抽取 卵巢表面直径1 5 2 5 m m 卵泡内的卵丘卵母细胞复合体( c o c ) ，然后在 实体显微镜下收集c o c 。选取卵丘细胞层完整、卵母细胞胞质均匀的 c o c ，用d p b s 洗3 - 4 次后，再用h x 培养液洗两遍，与小鼠c o c 进行 共培养。从开始取卵到培养的全部操作在1h 内完成。 2 5 卵母细胞的培养 2 5 1 培养方法 采用微滴培养体系，严格控制培养条件，培养滴大小为8 0ul ，表面 覆盖薄层石蜡油，预平衡2 h 后用于培养，每滴培养1 5 枚左右卵母细胞。 将用操作液洗4 遍，培养液洗两遍的卵母细胞移入已平衡好的培养液滴 中，置于3 7 5 ，5 c 0 2 ，9 5 空气，1 0 0 湿度的c 0 2 培养箱内进行 培养。 成熟培养液为t c m 1 9 9 添加1 0 ( v v ) f b s 、2 m m 谷氨酰胺、0 2 3 m m 丙酮酸钠、1 0 i u i i l l p m s g 。t c m 1 9 9 添加2 m m 谷氨酰胺，0 2 3 m m 丙酮 酸钠，4 m g m l b s a ，4 m m h x 配制成h x 1 9 9 培养液。由于i - i x 不易溶解， 了玉：h x 对昆明白小鼠卵母细胞减数分裂的涮控作用 应在磁力搅拌器下搅拌助溶。操作液为m 2 ，添加4 m m 的h x 。所有的培 养液和操作液都加入5 0 i u m l 的青霉素和链霉素。从杀鼠至培养的全部操 作限制在4 0 m i n 内完成。所用的操作液中添加4 r a m 的h x ，以防止操作 过程中的卵母细胞自发成熟。 抑制一段时间后，部分卵母细胞脱卵丘观察抑制效果，余下的转入成 熟培养，在不同时间观察细胞核成熟进程( 卵母细胞减数分裂各阶段的染 色体形态见图版i i i ) 。成熟1 8 h 后的卵母细胞脱卵丘作孤雌激活，成熟1 4 h 后的卵母细胞不脱卵丘进行体外受精，观察激活率、受精率，所得胚胎继 续培养，记录其发育情况。 2 6 卵母细胞核成熟情况的观察 2 6 1 小鼠 c o c 培养结束后，把c o c 移入0 1 透明质酸酶( 无钙p b s 配制) 中 作用l m i n ，用适当口径的口吸管反复吹打，将卵丘细胞脱净。记录处于 g v 、g v b d 和m i i 阶段的卵母细胞数，观察时应把卵母细胞轻轻转动， 两侧都要观察到，防止漏掉第一极体位于视野另一侧的卵母细胞。 2 6 2 山羊 c o c 用0 1 透明质酸酶作用2 3 分钟，把去掉卵丘细胞的卵母细 胞放到四角滴有石蜡油：凡士林( 1 ：1 ) 的载玻片上，加盖玻片，轻轻按 压，将卵的位置固定。放入无水乙醇：冰乙酸( 3 ：1 ) 固定液中固定2 4 h 以上，再用1 的乙酸地衣红( 4 0 乙酸配制) 染色1 1 2 分钟，相差显微 镜下观察卵母细胞核形态。 2 7 卵母细胞成熟质量检测 2 7 1 孤雌激活 采用乙醇结合6 - d m a p 法激活：将c o c 用0 1 的透明质酸酶处理 l m i n ，用口吸管反复吹打，脱去卵丘细胞。洗去透明质酸酶，选择排出 第一极体的卵母细胞用含1 0 乙醇的m 2 液中处理5 m i n ，洗去乙醇，置 于含2 m m 6 一d m a p 的无糖c z b 培养液中培养6 h 。6 - d m a p 用d m s o 配 成4 0 0 r a m 的浓贮液，分装并在2 0 贮存，用前用无糖c z b 稀释为2 m m 的浓度。6 h 后在倒置显微镜下观察激活情况。只有出现1 原核1 极体( 1 p n ， 1 p l o ) 、l 原核2 极体( 1 p n ，2 p b ) 、2 原核1 极体( 2 p n ，l p b ) 或2 一细胞 4 山东农业人学钡l 研究生学位论文( 2 0 0 4 ) 各具一原核的卵母细胞判断为激活。卵质膜破裂者判断为死亡。胞质分裂 一次或多次但不出现原核者判断为碎裂( f r a g m e m a t i o n ) 。本实验将碎裂 卵均归为未激活卵。 2 7 2 体外受精 、遘取缝成熟( 湖碍龄) 基疆自| 瀣鼠，a 通过交酲宴验迁礴其有受精 能力，颈椎脱臼法处死，打开腹腔，将附睾尾部和输精管剪下，剔除脂肪， 在实体显微镜下，用镊子和针头配合，挤出输精管内精子，针头刺破附睾 尾部上皮，用针头挤压出精子，马上收集精子团块，置于1 5 m l 离心管中， 加入l m l 含1 0 m g m l b s a 的t 6 液，轻微振荡几次，使精子团分散开，用 封口貘封口，于3 7 5 ，5 c 0 2 ，9 5 空气，1 0 0 湿度的c 0 2 培养箱 内中孵育1 5 h 左右，在此期间用细胞计数板检测精子密度。将成熟的c o c 移入已经平衡2 h 的受精滴中( t 6 + 2 0 m g m l b s a ) ，加入适量体积的获能 精子，使精子密度在1 1 0 6 左右，受精8 h ，观察原核形成和第二极体排 出，计算受精率。 2 7 3 胚胎培养 将孤雌激活或体外受精所得胚胎换液于不含6 - d m a p 的无糖c z b 继 续培养。胚胎培养液过阻断之前为不含葡萄糖的c z b ，过阻断之后为含 葡萄糖的c z b ，换液时间在有l 3 的胚胎到达4 细胞后进行。在活化或 受精后2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 各观察一次，记录2 细胞、4 一细胞、桑椹胚 和囊胚的发育情况。 2 8 生发泡染色质构型的观察 用上述方法脱掉卵丘细胞，选择g v 未破的卵母细胞置于含l 肛g m l 活体荧光染料h o e c h s t3 3 3 4 2 的培养液中染色，3 7 5 c 避光孵育1 5 m i n ， 洗去染料，放到四角滴有石蜡油：凡士林( 1 ：1 ) 的载玻片上，加盖玻片， 轻轻按压，先在相差显微镜下观察核仁和核膜的状态，然后用荧光镜( 紫 外激发波长为3 4 6 n m ) 观察观察生发泡内染色质构型，将卵母细胞分为 两类。s n 型：围绕核仁有一明亮的环状荧光，核质荧光不均匀，发光部 分主要位于核的边缘和核仁周围，许多不规则丝状荧光伸展于核膜与外周 之间。n s n 型：核仁周围没有明亮的环状荧光，核质荧光比较均匀，有 些有几个随机分布的大小不一的颗粒状荧光( 见图版i ) 。 王了= 玉：h x 对昆明自小鼠卵母细胞减数分裂的调控作用 2 9 卵丘扩展的观察 在正常成熟、h x 抑制后不同时间和解除抑制后成熟1 4 h 时观察卵丘 状态，根据v a n d e r h y d e n ( 1 9 9 3 ) 的标准将卵丘扩展的程度分为为0 4 级。 0 级：无扩展；1 级：最外层的约1 2 层卵丘有扩展；2 级：外面的几层 细胞开始呈放射性扩展；3 级：内层的卵丘细胞也已经扩展，只有放射冠 未扩展；4 级：包括放射冠在内的全部卵丘都扩展，而且外周部分细胞已 开始脱落( 见图版i i ) 。 2 1 0 数据统计分析 实验数据利用s p s s 统计软件( s p s si n c ) 的a n o v a 模块分析。数 据先经l s d 转换后进行单因素方差分析，p 0 ，0 5 为差异显著。所有实验 都重复3 次以上。 3 结果 3 1 小鼠年龄与获得卵母细胞数目和质量的关系 3 1 1 小鼠年龄和超排后从卵巢获得各类卵母细胞数目的关系 本实验比较了幼鼠( 1 8 2 3 日龄) 和其它年龄小鼠的获卵数目。1 8 2 3 日龄代表初情期前后，还未达到性成熟的幼鼠；4 - 6 周代表达到性成熟但 未达到体成熟的青年鼠；7 一i o 周龄代表既达到性成熟，又达到体成熟， 可以用于繁殖的成年鼠。结果( 表1 ) 表明，无论是获卵总数还是a 类 c o c 数目，1 8 2 3 日龄幼鼠都要高于4 6 周龄的青年鼠和7 1 0 周龄的成 年鼠。 表1 不同年龄小鼠获得各类卵泡卵母细胞的情况 t a b l e1n u m b e ro f d i f f e r e n tt y p eo o c y t e sr e c t l v g r e df r o mm i c eo f d i f f e r e n ta g e s 注：同列中含不同字母的各项之间差异显著p 0 0 5 ) ，说明卵丘并不是小鼠大腔卵泡中的 卵母细胞核成熟所必需的。 表1 1 卵丘对小鼠卵母细胞体外成熟的影响 t a b l e1 1e f f e c t so f c u m u l u sc e l l so ni v mo f m o u s eo o c y t e s 3 4 2 卵丘对h x 抑制小鼠卵母细胞减数分裂的影响 结果( 表1 2 ) 表明，h x 抑制2 4 h 后，a 类c o c 的g v 率( 6 6 0 和d o 的( 6 7 ) 差异不显著。这表明卵丘的有无对抑制率无影响，h x 对卵母细胞减数分裂的抑制作用不需要通过卵丘来介导。 表1 2 卵丘对h x 抑制小鼠卵母细胞减数分裂恢复的影响 t a b l e1 2e f f e c t so f c u m u l u sc e l l so nh xi n h i b i t i o no f m o u s eo o c y t e s 3 4 3 卵丘对i - i x 抑制后小鼠卵母细胞再成熟能力的影响 抑制2 4 h 后的a 类c o c 和d o 再成熟1 4 h ，观察其成熟率。结果( 表 1 3 ) 表明，d o 抑制2 4 h 后再成熟的成熟率显著低于c o c ( 3 0 v s 8 8 ，p o ，0 5 ) 。在实验中还发现，性成熟前小鼠激素处理后卵巢表面全为透 明度高、大小均匀的卵泡，易于操作。而成鼠卵巢的卵泡不清晰，大小不 均匀，卵泡液粘，卵母细胞易粘到一起。由于幼鼠还可节约饲养和管理成 本，故它们是更好的卵母细胞来源。徐平( 2 0 0 1 ，a ；2 0 0 1 ，b ) 用三种不 同品系的小鼠证明，h c g 后从壶腹部获得的成熟卵母细胞数目，2 8 日龄 小鼠要显著高于5 6 日龄和1 1 2 日龄的。o n a d e r a 等( 1 9 8 7 ) 的研究表明， 从l o 1 2 月龄小鼠壶腹部所得到的退化卵比从2 - 9 月龄所采集到的要多。 我们发现，小于1 5 日龄的小鼠在激素处理后卵巢无反应，不出现大卵泡。 所以实验中采用的小鼠年龄不宜过大或过小。 4 2h x 对小鼠卵母细胞减数分裂的抑制作用 卵母细胞减数分裂阻滞是一个复杂过程，需要一系列因子参与，涉及 r n a 转录、蛋白质合成、磷酸化及去磷酸化等许多生化过程。在卵母细 胞成熟过程中，卵母细胞内c a m p 水平发生明显改变。b o m s l a e g e r 等 ( 1 9 8 6 ) 研究发现，在g v b d 之前有一个c a m p 浓度突然下降的过程， 说明卵母细胞内c a m p 浓度与减数分裂的恢复有密切关系。a t p 在腺苷 酸环化酶( a c ) 作用下合成c a m p ，c a m p 在磷酸二脂酶( p d e ) 作用下 降解为无活性的5 a m p 。h x 是磷酸二脂酶抑制剂，可抑制c a m p 的降 解，使卵母细胞内维持较高的c a m p 水平( d o w n s ，1 9 9 3 ；d o w n s ，1 9 9 7 ) 。 小鼠卵泡液内的次黄嘌呤浓度为2 - 4 m m ，这种浓度能在体外抑制小鼠卵 母细胞恢复减数分裂( d o w n se ta 1 ，1 9 8 5 ) 。 本实验证实，4 m m h x 可有效抑制小鼠卵母细胞g v b d 的发生。在 正常体外成熟4 h 时，绝大部分卵母细胞已经发生g v b d 。而h x 抑制2 4 h 仍有6 6 维持在g v 期。但抑制效果随时问延长而下降，到1 8 h 之后处 于g v 期的卵母细胞比例显著低于0 h 。在抑制1 2 h 时，有部分卵母细胞 已经排出第一极体，到2 4 h 时成熟比例已达2 3 。说明h x 并不能完全 抑制卵母细胞的g v b d ，有部分卵母细胞会自发成熟到m u 期。 生发泡染色质构型可以大体反应出卵母细胞所处的发育阶段和发育 能力( d e b e ye ta 1 ，1 9 9 3 ：孙兴参，2 0 0 1 ) 。小鼠卵母细胞生发泡染色质 构型分为s n 型和n s n 型两种( d e b e ye ta 1 ，1 9