（微生物学专业论文）赖氨酸突变对人类干扰素调节因子7结合dna能力的影响.pdf

摘要 摘要 干扰素调节因子7 ( i n t e r f e r o nr e g u l a t o rf a c t o r s7 ，i r f 7 ) 是调控i 型干扰素表达 的关键因子，因此在宿主抗病毒反应中起关键的作用。在病毒感染细胞的过程中， i r f 7 除了诱导干扰素的产生，其本身也能直接与病毒基因启动子相互作用，对 病毒基因的表达加以调节。i r f 7 作为干扰素调节因子家族( i n t e r f e r o nr e g u l a t o r f a c t o r s ，i r e s ) 的成员，是通过与启动子中的干扰素刺激应答原件( i f n s t i m u l a t i o n r e s p o n s ee l e m e n t s ，i s r e ) 结合来调控靶基因的转录。其活性很大程度上受其d n a 结合能力的影响。 i r f 7 蛋白分子中一共有1 5 个赖氨酸，分布在蛋白质d n a 结合结构域，组成 型激活结构域，信号应答结构域和抑制结构域中。本文对i r f 7 中的赖氨酸突变 对其结合i s l 也能力的影响进行了研究。首先，本文构建了一个原核表达质粒： p e t 2 8 a f l a g i r f 7 ，能诱导表达带h i s 和f l a g 双标签的蛋白，其中h i s 标签用于 纯化，f l a g 标签用于检测。而后，将1 5 个i r f 7 的赖氨酸突变体的编码序列亚克 隆到这个质粒中。利用构建的1 6 个原核表达质粒，本文纯化了i r f 一7 的野生型蛋 白和1 5 个赖氨酸突变体蛋白用于结合d n a 活性的测定。 利用建立的d n a 蛋白质结合检测系统，本文检测野生型及赖氨酸突变体的 i r f 7 对i s r e 的结合能力。i s r e 探针序列来源于人类8 型疱疹病毒( h u m a n h e r p e s v i r u s8 ，h h v 8 ) 的开放读框5 7 ( o r f 5 7 ) 启动子中的i s r e 元件。结果表 明赖氨酸残基突变成精氨酸后会对i r f 一7 的d n a 结合能力产生一定的影响。其 中4 5 、6 1 、9 2 、1 2 0 位点赖氨酸突变成精氨酸会使i r f 7 完全丧失与i s r e 的结 合。本文的研究为探讨i r f 7 通过结合i s r e 对靶基因的调控机制奠定了基础。 在研究赖氨酸突变对i r f 7 的d n a 结合能力影响的同时，本文利用大肠杆 菌s u m o 修饰系统研究了i r f 7 野生型及各赖氨酸突变体蛋白的s u m o 修饰情 况。结果表明i r f 7 可以被s u m o 修饰，但是各赖氨酸突变对i r f 一7 的修饰状 态无明显影响。 关键词：干扰素调节因子7 赖氨酸突变干扰素刺激应答元件d n a 结合 a b s t r a c t a b s t r a c t i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o r7 ( m f - 7 ) i sac r i t i c a lp r o t e i ni n v o l v e di nt y p ei i n t e r f e r o ns y n t h e s i s ，a n dp l a y sac r i t i c a lr o l ei nt h eh o s ta n t i v i r u sr e s p o n s e d u r i n g v i r u si n f e c t i o n ，i r f 一7i si n v o l v e di nt h ei n d u c t i o no ft y p eii n t e r f e r o ng e n e s ，a n dt h e r e g u l a t i o no fs o m ev i r u sg e n e st h r o u g hd i r e c ti n t e r a c t i o nw i t hp r o m o t e r so ft h e s e g e n e s d n ab i n d i n ga b i l i t yi sr e q u i r e df o ri t sf u n c t i o n t h e r ea l ef i f t e e nl y s i n er e s i d u e si nt h ei r f 一7 ，w h i c hl o c a t ei nd n a - b i n d i n g d o m a i n ，c o n s t i t u t i v e a c t i v a t i o nd o m a i n ，s i g n a lr e s p o n s ed o m a i n , a n di n h i b i t o r y d o m a i n i nt h i ss t u d y , t h er o l eo fl y s i n er e s i d u e si nt h ed n a b i n d i n ga b i l i t yo fi r f 一7 w a si n v e s t i g a t e d a ne x p r e s s i o np l a s m i do fi r f 一7w a sc o n s t r u c t e dw h i c hc a ne x p r e s s r e c o m b i n a n ti r f 一7p r o t e i nf u s e dw i t hb o t hh i s t a ga n df l a g t a gi ne c o l i h i s t a g i su s e df o rp u r i f i c a t i o no fp r o t e i na n dt h ef l a g - t a gi su s e df o rd e t e c t i o n t h e nt h e c o d i n gr e g i o n so ff i f t e e nl y s i n e m u t a n t sw e r es u b c l o n e di n t ot h i sp l a s m i d u s i n g t h e s e16e x p r e s s i o np l a s m i d s ，h i sa n df l a g - t a g g e dw i l dt y p ea n dl y s i n er e s i d u e m u t a n t sw e r ee x p r e s s e da n dp u r i f i e d d n ab i n d i n ga b i l i t yo fw i l dt y p ea n dl y s i n e - m u t a n t so fi r f - 7t oi s r ew a s e v a l u a t e d ，u s i n gt h ed n a b i n dp l a t e b a s e dm e t h o d t h ei s r ep r o b ew 8 5d e s i g n e d a c c o r d i n gt oi s r ef r o mh h v - 8o r f 5 7p r o m o t e r t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t l y s i n er e s i d u e sa f f e c t e dt h ed n ab i n d i n ga b i l i t yo fi r f 7 k 4 5 r ；k 61r ；k 9 2 ra n d k 12 0 rc o u l dn o tb i n dt oi s r ep r o b e t h i sf i n d i n gi sv a l u a b l ef o rm e c h a n i s ms t u d i e s 0 1 3i n t e r a c t i o no fi r f - 7w i t hi s r et om o d u l a t et h ee x p r e s s i o no ft a r g e tg e n e s t h es u m o y l a t i o no fi r f 一7a n dl y s i n em u t a n t sw a sa l s oa n a l y z e du s i n ge c o l i s u m o y l a t i o ns y s t e m i tw a so b s e r v e dt h a ti r f 一7c o u l db em o d i f i e db ys u m o ，a n d s i n g l el y s i n em u t a t i o nc o u l dn o tc h a n g et h ep a t t e r no fs u m om o d i f i c a t i o n k e y w o r d s ：i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o r7 ( i r e - 7 ) ；l y s i n er e s i d u em u t a g e n e s i s ； i f n - - s t i m u l a t i o nr e s p o n s ee l e m e n t s ( i s r e ) ；d n a - b i n d i n g 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 年月日 南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：h 2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 2 0 + 年月日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 姓名学号 答辩日期年月日 论文类别 博士口 学历硕士口硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系所专业 联系电话e m a i l 通信地址( 邮编) ： 备注： 是否批准为非公开论文 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 第一章引言 第一章引言 第一节干扰素调节因子7 是宿主抗病毒防御反应的关键性调节因子 干扰素( i n t e r f e r o n ，吲) 是一类具有广泛抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用 的细胞因子。根据产生干扰素的细胞和干扰素的受体类型，将干扰素分成三个类 型：i 型干扰素、型干扰素和型干扰素。i 型干扰素包括n q 和i f n 一1 3 ， 是由病毒感染的细胞分泌；i f n y 是型干扰素，主要由t 细胞、自然杀伤细 胞和巨噬细胞分泌；干扰素被命名为干扰素入。不同类型的干扰素作用不同的 受体系统【l 】。i 型干扰素的表达主要受干扰素调节因子( i n t e r f e r o nr e g u l a t o rf a c t o r s 。 i r f s ) 的调控，其中人类干扰素调节因子7 ( i n t e r f e r o nr e g u l a t o rf a c t o r s7 ，i r f 7 ) 是 诱导产生i 型干扰素的关键性调节因子。i r f 7 最早在1 9 9 7 年被发现；z h a n g 等 人在研究e p s t e i n b a r r 病毒( e b v ) 感染细胞后所呈现的潜伏状态时，发现一个宿 主蛋白可以抑制e b v 的q p 启动子的活性从而抑制病毒核抗原l 的表达。随后 发现这个蛋白与干扰素调节因子家族高度同源，并将其命名为干扰素调剂因子 7 【2 】。而后人们迅速认识到i r f 7 在病毒刺激的i f n q 表达调控中的作用。 1 1 1 干扰素调节因子7 的结构 人类i r f 7 基因位于第1 l 号染色体上，转录出的e d n a 有不同的剪接形 式，翻译后可分别产生i r f 7 a ，i r f 7 b ，i r f 一7 c 和i r f 7 h4 种蛋白【2 3 】。其 中i r f 7 a 为全长蛋白，共有5 0 3 个氨基酸。i r f 一7 b 比i r f 7 a 在组成型激活结 构域中少2 9 个氨基酸。i r f 7 c 只有一个完整的d n a 结合结构域和1 3 个不同 于i r f 7 a 的氨基酸。i r f 一7 h 只在其n 端有1 8 个不同于i r f 一7 a 的氨基酸。由 于i r f 7 c 在结构上的特殊性，当i r f 7 a 和i r f 一7 b 依靠羧基末端执行功能时， i r f 7 c 可能成为它们的负调节因子【z j 。i r f 7 a 的结构见图1 1 。蛋白质的n 端 是d n a 结合结构域( d n a b i n d i n gd o m a i n ，d b d ) ，c 一端为激活和调节结构域， 进一步可划分为组成型激活结构域( c o n s t i t u t i v ea c t i v a t i o nd o m a i n ，c a d ) ，信号 应答结构域( s i g n a lr e s p o n s ed o m a i n ，s a d ) ，抑制结构域( i n h i b i t o r yd o m a i n ， m ) 和病毒激活结构域( v i r u s a c t i v a t e dd o m a i n ，v a d ) 。d n a 结合结构域位于 第一章引言 蛋白质的1 1 5 1 氨基酸，含有5 个高度保守的色氨酸重复序列，形成螺旋转角 螺旋模序，t r f 7 能够借助该模序结合d n a 。有报道表明位于i r f 一7 的d n a 结 合结构域中的第9 2 位赖氨酸是乙酰化修饰的位点，并且乙酰化修饰会抑制i r f 7 的d n a 结合能力，从而使其激活i f n 启动子的能力下降。1 5 2 2 4 6 氨基酸为i r f 7 的组成型激活结构域，其具有组成型的反式激活能力。病毒激活结构域位于i r f 一7 最末端的4 6 8 5 0 3 氨基酸，该区域中含有病毒诱导后i r f 一7 磷酸化的靶位点。 抑制结构域是抑制i r f 7 反式激活功能的结构域，位于4 1 6 4 6 7 氨基酸之间，。 此区域缺失可解除对i r f 7 对自身本底活性的抑制，显著提高i r f 7 的激活靶基 因的能力。信号应答结构域位于i r f 7 的2 4 6 3 0 5 氨基酸，此区域具有提高病毒 诱导后i r f 7 活性的功能1 4 j 。需要指出的是这个结构模型是研究i r f 7 在病毒诱 导i f n 的过程中总结出来的。这些结构域的功能可能在不同细胞类型中或不同病 毒入侵时会有所改变。 i r f 7 aid b d l c a d i s r d i dl iiiii| 11 5 12 4 63 0 54 6 85 0 3 irf-7brf【：d；!blidl!卫【： - ll li o 一_ irf-7c【：l口-旦 i r f r f 7 h 二二二二二二二二二二二二二二二二 i ll 图1 1 干扰素调节因子7 的结构 1 1 2 干扰素调节因子7 调控i 型干扰素表达的过程 细胞被病毒感染后会诱导许多细胞因子的产生，如干扰素，其能够通过自分 2 第一章引言 泌或者旁分泌的形式与细胞表面特异性受体结合，诱导干扰素靶基因的表达，行 使干扰素的生物学功能，包括抵御病毒感染，调节细胞生长和调节免疫活性等等。 细胞被病毒感染后，能够激发i 型干扰素基因的转录。i 型干扰素基因可以 分为两类：一类是应答病毒感染的立即早期基因，包括1 3 干扰素基因和鼠的q4 干扰素基因，这类基因的激活不依赖于蛋白质的从头合成。另一类是延迟干扰素 基因，包括干扰素的其它亚型，它们依赖蛋白质的从头合成【6 ，7 】。病毒感染激 活i f n 表达的过程如下：首先，细胞经病毒感染或者双链r n a 刺激后，通过不 同的信号转导途径，细胞内组成型表达的i r f 3 ，n f kb 和a t f 2 c j u n 被磷酸 化激活。被激活的这些转录因子进入细胞核协同c b p p 3 0 0 和h m g 蛋白，诱导 i f n 1 3 和i n f a4 基因的转录表达并分泌到细胞外瞵1 u ；这是立即早期基因的表 达过程。分泌到细胞外的i f n 通过自分泌或旁分泌的方式，与细胞表面的i f n 受体结合。通过j a k - s t a t 通路，i f n 激活干扰素刺激基因因子3 ( i n t e r f e r o n s t i m u l a t e dg e n ef a c t o r3 ，i s g f 3 ) 复合物产生，之后i s g f 3 进入细胞核诱导i r f 7 基因的表达，从而细胞质中积累大量的i r f 7 【1 2 , 1 3 】。如果此时细胞被病毒持续感 染，通过一系列的信号转导，新合成的i r f 一7 最终被t b k l i k k i 磷酸化【1 5 , 1 6 , 4 6 1 。 磷酸化的i r f 7 发生核定位，结合于干扰素基因及其它靶基因启动子上游的i s r e 序列上，并协同其他的转录因子参与晚期干扰素基因的激活，大量的i f nq 和i f n b 表达，抵御病毒的感染【1 4 , 1 7 】( 图1 2 ) 。 i r f 7 的表达除了受i f n 受体下游的j a k - s t a t 通路调控，还有研究发现了 一条不依赖于i f n 信号通路而激活i r f 7 表达的新途径 1 9 ，如图1 3 所示：仙 台病毒感染细胞之后，可以刺激i r f 3 和i r f 7 与共激活因子c b p 和p 3 0 0 形成 病毒激活因子复合物v a f ( v i r u sa c t i v a t e df a c t o r ) ，结合在i r f 7 基因的 i s r e ( i f n s t i m u l a t i o nr e s p o n s ee l e m e n t s ) 和i r f e ( i r f b i n d i n ge l e m e n t ) 序列上， 直接激活i r f 一7 的表达。因此，病毒感染激活i r f 7 表达有两条不同的途径：一 条是i f n 信号通路，另一条是直接诱导i r f 一7 表达。然而在生物体内究竟哪条通 路占主要的作用，可能与细胞的种类以及感染的类型有关。 第一章引言 图l2 病毒感染细胞后i r f 7 诱导i 型干扰桑基因的表达8 1 w 巍。 器旷觜、 器 j ，一 电，一焉” ；基矗 b 图1 3 病毒感染激活i r f * 7 表达的两条不同的途径”9 l 第一章引言 第二节与ls r e 的结合是ir f - 7 实现其功能的关键步骤 i r f 7 作为干扰素调节因子家族的成员，是通过与i s r e 的结合来调控靶基 因的表达。其活性转录激活的能力很大程度上受其d n a 结合能力的影响。 1 2 1l r f - 7 通过与i s r e 的结合来调节细胞内靶基因的转录 干扰素调节因子蛋白家族是一类转录因子，人类细胞中已经发现了1 0 个 成员：时1 碌f 1 0 【2 0 j 。这1 0 个成员具有高度同源的n 端d n a 结合结构域； 其中5 个色氨酸重复序列在各家族成员中高度保守，形成螺旋转角一螺旋模序被 认为是i r f 与d n a 结合的关键。i r f 7 蛋白n 端1 1 5 1 个氨基酸是其d n a 结 合结构域。i r f 7 c 虽然只有1 6 4 个氨基酸的长度，由于其具有与i r f 7 a 相同的 d n a 结合结构域，所以仍能与i s r e 结合【2 】。与i r f 结合的d n a 序列被称为干 扰素刺激应答元件( i f n s t i m u l a t e dr e s p o n s ee l e m e n t ，i s r e ) 、干扰素调节因子结 合元件( i r f b i n d i n ge l e m e n t ，i r f e ) 、正调节因子( p o s i t i v er e g u l a t o r ye l e m e n t ， p r e ) 以及干扰素共有序列( i f nc o n s e n s u ss e q u e n c e ，i c s ) 等，其特征是具有 保守的g a a a 重复序列 2 m 4 1 。对i r f 的晶体结构分析表明，此g a a a 序列与i r f 的d n a 结合结构域中的螺旋结构产生直接的相互作用，此相互作用是i r f 结合 d n a 的关键【2 纠 i r f 一7 的主要功能是调节i 型干扰素的表达。i 型干扰素分为i f n 。q 和 i f n 1 3 两种亚型，其中大多数成员基因的转录受i r f 7 调控己成为共识【2 , 5 , 2 6 捌。 l i n 等人在2 0 0 0 年的一篇文章【2 8 j 中就i r f 7 对i f n a 和i f n b 基因启动子的激活 能力做了系统的研究和比较。发现i f n b 、i f n a i 、i f n a 2 、i f n a 4 、i f n a 7 、i f n a l 4 均可被i r f 7 明显地激活。而且i r f 7 的d n a 结合结构域在激活效应中起着关 键的作用，并且i r f 7 与靶基因启动子中的i s r e 元件的结合能力将直接影响激 活靶基因的效果。除了干扰素家族，i r f 7 还可激活细胞中其他基因的转录。例 如，i r f 7 可以通过与启动子中i s r e 结合激活r a n t e s 基因的转录。 1 2 2 被ir f - 7 识别的is r e 的序列特征 l i n 等人对 t n 基因中与 x f 7 结合的i s r e 序列特征的做了一系列系统的 比较研究【2 8 1 。e m s a 结果显示i r f 7 可以与i f n b 启动子中的p r d i ( 5 一g a g a a 第一章引言 g g c 涓c a g t c g ( 订_ g 1 a 1 g c aaa c g a a a g t g g a a a c t a a c a g c l r g a a 下c a 下g g c a c a g g a a a c t g a a c g c a g o c a a c e t c g c t c t a g a 6 a a l 。碥a a a g a 1 1 ( j c c t a g 触渤c a f g g ( 玎a g g a a a a g c g a a a g 蕾g g g a a c t a ( 订a a g aa t t c a a a a lg g a e g ，i g c j 淞( j 了a g a o g a a a a l a a a c r ( 冲a c c t g l 6 a t c o t a t g c t g 1 a c 谳a c g a a a c c g a a l l g a a a a t c c a a t t a c g c t g c a c g a c a g g g a a r l - c g a a aa t c t ( 汀a t a l 了t a c t a c c 6 a a t t c g a a a c t g c a g g c a c g a g g c g l - c a a c g a a a c t g a a a c a g 赋c 粼a g c a g g g 下a o g c a g t t c c a c f aaaa c g a a t g t ( ；a c ( 淞a c a a t c c g a a a t c g c g c a l r l c g g ( ；( 叮o c c a a t a a a a f g c a a a a c a g c g g a a a g t t a a g a 戳删a c 硒t o a c t a o g a g a a a g t g a a t g t t g c r 啪a 1 t g c c r g a g a a t i g a a a t g a a c 0 胃眄“：1 1 。研a g o a g a a l r c g 从a c t c g 羽g 1 0 g c 0 弘g a t c 配a g a a l l - c 6 从t g l g g a o c a a t g h 呵1 e c g ( 玉a t t c 6 a c g t 吖a c e a a a c g g g r r r f c g a a 1 1 + ( ：g a a a g ? r c x i a t t g e a e t a e 丁t a g a a a c g a a a a v ! a c a a c ( ；o t a a c g a a c c g a a c 警g t a a c c r r r a e g g 6 1 e a a o c o c g 6 a a l ”r c 6 a a a g l 广r a g r r 珏c a g a a a g g a g g a a l t c g a a a g t t a ( 玎r r l a c t aa g t t c g g a a a g i a a r c 弧c 侬刭：；( 了c a a c c a g g a a a a ( 2 虻aaa ( ：r h 到跨c t a t 粥t a a c i g g c 0 1 1 5 e ! 1 8 u $ 图1 4i s r e 的序列口8 】 g t g a a a g t g 31 探针、p r d i p r d i i i ( 5 g aa aa c t g a aa g g g a g a a g t g a a a g t g 3 1 序列产生较强的结合；与p i i ( 5 g a a a a c t g a a a g g g 3 的 结合力较弱。而且i r f 7 对i f n a l 、w n a 2 、i f n a l 4 基因启动子中的p r d i 类 似序列( 序列分别为：w n a l 启动子的p r o m o t e r 中的p r d i l i k e 序列为：5 6 i 2 捻7 眦 n 4 7 6 n 2 射4 l a o 撕o 2 a o 弱l l a 鹪2 l i g 4 o 9 俘叩 6 s 屹5 nr o n o m o 舱o 9 a l 撕o i a m 2 l l g g a t c 第一章引言 g g a a a g c a a a a a c a g a a 汀g g a a a g t g g 一3 ；n a 2 启动子中的为5 g a a a g c a a a a a g a g a a g t a g a 从g t aa 一3 ；i f n a l 4 启动子中的为5 g g a a a g c c a a a a g a g a a g t a g a a a a a a a 3 ) ，有较强的结合。荧光素酶活性检测 结果与d n a 蛋白质体外结合测定结果相吻合，这说明了i r f 一7 的d n a 结合能 力是实现其基因调控功能的关键。 随后为了进一步寻找与i r f 7 结合的i s r e 的共有序列特征，作者利用分子 定向进化的方法筛选出了2 8 个i s r e 探针克隆，然后对其进行序列分析和比对。 其序列如图1 4 所示。结果表明1 r f 7 结合位点的d n a 与序列i r f 一3 很相似， 为5 g a a a n n g a a a n n 一3 ；然而与i r f 3 相比，i r f 7 结合位点的序列似乎更 为灵活：i s r e 中的任何一个g a a a 模序发生突变将会较大程度地降低i r f 3 对 其结合的能力，并降低i r f 3 对靶基因的激活效果；然而i r f 一7 更能够容忍g a a a 中的突变 2 8 , 6 8 】。 1 2 3 某些病毒基因中含有is r e 在病毒感染细胞的过程中，i r f 7 除了调控干扰素的表达来帮助宿主抵抗 病毒感染，其本身也能直接与病毒基因启动子相互作用，对病毒基因的表达加以 调节。 i r f 7 最早是z h a n g 等人在研究e b v 感染细胞后所呈现的潜伏状态时发 现的【2 1 。文章报道i r f 7 可以结合到e p s t e i n b a r r 病毒的q 启动子上来来抑制病 毒核抗原1 基因的表达。序列分析表明q 启动子中含有一段i s r e 序y u - 5 g c g a a a a c g a a a g t - 3 ，i r f 一7 是通过结合到此序列上来发挥其功能的。 e p s t e i n b a r r 病毒感染细胞后，利用q 启动子表达病毒的核抗原i ，使病毒处于i 型潜伏态，此时胞内i r f - 7 的表达量很低，核抗原i 表达正常。而在型潜伏 态的细胞中，i r f 一7 的表达量要比i 型潜伏态细胞中高很多，它能够与q 启动子 中的i s r e 结合，使该启动子失活，从而抑制核抗原i 基因表达。 w a n g 等人发现i r f 7 对人类8 型疱疹病毒( h u m a nh e r p e s v i m s8 ，h h v - 8 ) 的开放读框5 7 ( o i 心5 7 ) 基因具有调控作用。h h v - 8 在细胞中可以以潜伏状态 存在，在某些因素的诱导下，病毒可以由潜伏态进入裂解态。病毒复制与转录激 活子( r e p l i c a t i o na n dt r a n s c r i p t i o na c t i v a t o r ，r t a ) 的表达是病毒进入裂解状态 的必要且充分条件。其中r 1 r a 激活o r f 5 7 基因的表达是病毒从潜伏到裂解状态 7 第一章引言 的关键事件【8 】。r t a 是通过结合到病毒o r f 5 7 启动子中的一段模序中即r t a 效 应元件( r t ar e s p o n s ee l e m e n t ，r r e ) 上来激活o r f 5 7 基因的表达。通过对 o r f 5 7 的启动子中的r r e 序列进行分析，发现其中w a n g 等人发现了一个潜在 的i s r e 位点，序列为5 a r t t t t c g t t t g 3 ( 图1 3 ) 。而后作者证明了i r f 7 可以结合到此序列上并抑制r t a 与r r e 的结合。由此我们可以想象：病毒感染 可以激活i r f 一7 的表达，i r f 7 能够与r t a 竞争结合o r f 5 7 启动子中的r r e 元 件，抑制r t a 对下游基因的表达和病毒裂解复制的激活，病毒则可能借助宿主 细胞因子i r f 7 维持潜伏与裂解两种复制状态之间的平衡 2 9 】。 由于i r f 7 在宿主抗病毒反应中的重要作用。某些病毒建立了抗i r f 7 的 作用机制来逃避宿主的免疫监视。例如，已发表的文献表明h h v - 8 编码一种i r f 类似物v i r f 3 ，其可以抑制i r f 3 和i r f 7 的活性，从而对干扰素启动子的转录 激活起到抑制的作用【3 川；再如，h h v - 8 的立即早期基因o r f 4 5 可以抑制i r f 一7 的核定位，而抑制病毒刺激引起的干扰素的表达，从而起到免疫逃避的作用【3 l 】。 以上例子从另一方面说明i r f 7 在抗病毒感染方面起了重要作用。 童l 铆n p - , d lt a t a lf 霉2 嘲 c 酬8 2 8 z 蠢a c a a z 茂a 霄岛t 翻0 弧c g g c c c a t t t t t c g 坌t t g t 舀g t a c c 丸 g 1 9 嘲c 置c a t z 缎r 叛c a 囊g g g t g c c g g g z a a a 螽螽g e 曩aa c a e c a 鬻g g ；鬻 8 1 9 0 4 鑫1 溺 翔瞧耱躺鞠落搬r r e x i i 撑- 7b l 磊d i n 8s k ， 图1 3h h v - 8o r f 5 7 启动子的r r e 和i s r e 模序四1 1 2 3 研究d n a - 蛋白质相互作用的方法 d n a 蛋白质相互作用的检测是用于研究转录因子活性、筛选d n a 结合蛋白 以及寻找蛋白质的d n a 结合元件等目的。目前比较通用方法有电泳迁移率变动 8 第一章引言 分析( e l e c t r o p h o r e s i sm o b i l i t ys h i f ta s s a y ，e m s a ) 、d n a p u l l d o w n 技术、d n a s e i 足迹法( d n a s eif o o t p r i n t i n g ) 、 酵母单杂交技术( y e a s to n eh y b r i ds y s t e m ) 、染色 质免疫共沉淀( c h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o na n a l y s i s ，c h i p ) 等。这几种检测技 术在目的上有不同的侧重。 e m s a 是一种在体外检测d n a 探针与蛋白质相互作用的技术。在e m s a 实 验中，纯化的d n a 结合蛋白、细胞提取液或细胞核提取液与标记d n a 探针一 同温育进行结合反应，在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离蛋白质d n a 复 合物和游离的探针。蛋白质一d n a 复合物的迁移率比游离的d n a 慢得多，从而 在凝胶上形成滞后带。根据滞后带的有无和量的多少，来反映d n a 结合蛋白与 d n a 探针的结合活性。传统的e m s a 分析通常采用放射性同位素( 如p 3 2h 3 ) 标 记的寡核苷酸探针，该方法灵敏性高、特异性强。目前，人们已采用了地高辛和 生物素标记的寡核苷酸来代替传统的放射性同位素标记的寡核苷酸，并在e m s a 试验中获得成功【3 2 1 。e m s a 技术曾被用在i r f 7 与d n a 的结合能力的研究中 【2 ，3 ，4 ，1 7 ，2 9 1 。 d n ap u l l d o w n 技术也是在体外检测d n a 探针与蛋白质相互作用的方法。 此方法可以用来检测目的蛋白与d n a 探针的结合能力，但是d n a p u l l d o w n 技 术也可方便的用来鉴定与某启动子中的某段d n a 直接或间接结合的未知蛋白。 其基本原理是，生物素标记的d n a 探针与亲和素包被的磁珠在体外结合后，再 与待检测的纯化的d n a 结合蛋白、细胞提取液或细胞核提取液进行结合反应。 结合到d n a 探针上的目的蛋白也将被沉降下来。用s d s p a g e 分离并检测被 d n a 探针沉降下来的蛋白。 d n a s ei 足迹法也是在体外对d n a 蛋白质相互作用进行鉴定的方法【3 4 】 但与e m s a 的侧重点不用。e m s a 主要用于与特异性d n a 结合的目标蛋白的 检测，而d n a s ei 足迹法则是寻找或证明与蛋白结合的相应d n a 元件序列。其 原理是用d n a s ei 部分消化已进行单链末端标记的待测双链d n a ，形成在变性 聚丙烯酰胺凝胶上以相差一个核苷酸为梯度的d n a 条带。但当d n a 片段与其 特异性结合的蛋白结合后，d n a 结合蛋白就阻碍d n a s ei 在结合位点及其周围 部位的结合，形成切割梯中的空白区域，结合d n a 化学测序法，就可知该结合区的 碱基序列。 酵母单杂交技术是由“和h e r s k o w i t z 妒5 】从酵母双杂交技术发展来的。主 要用于d n a 结合蛋白的筛选。其基本原理为：用于酵母单杂交系统的酵母g a l 4 9 第一章引言 的d n a 结合结构域靠近羧基端，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点( u a s ) ， 而转录激活结构域可与r n a 聚合酶或转录因子t f i i d 相互作用，提高r n a 聚 合酶的活性。据此，可将g a l 4 的d n a 结合结构域置换为文库蛋白编码基因， 只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活 r n a 聚合酶，启动下游报告基因的转录。 染色质免疫共沉淀是用于研究体内d n a 与蛋白质相互作用的方法。其原理 是在活细胞状态下利用交联剂固定蛋白质d n a 复合物，经超声破碎、特异性 抗体沉淀复合体，而后解除偶联、纯化目的片段并检测等步骤来获得蛋白质与 d n a 相互作用的信息。c h i p 能捕捉到发生在染色质水平上的基因表达调控的瞬 时事件，如实、完整地反映d n a 与蛋白质的动态结钭3 6 1 。但该方法尚存些不足， 如：难以同时得到多个因子对同一序列结合的信息，或当目标蛋白不是直接地与 染色质结合时则无法检测等。而e m s a 和d n a p u l l d o w n 等技术则能用来检测 d n a 蛋白质复合物的结合。 第三节类泛素化修饰的简介 近年来各种类似泛素的修饰蛋白不断被发现，这些修饰蛋白分为两类，一类 与泛素的氨基酸序列的相似性大于3 5 ，另一类与泛素氨基酸序列的相似性低 于2 0 ，s u m o ( s m a l lu b i q u i t i n 1 i k em o d i f i e r ) 便属于第二类蛋白。s u m o 蛋白 最初于1 9 9 5 年首先在酿酒酵母中被m e l u h 等人发现，命名为s m t 【3 7 1 。随后， 哺乳动物s u m o 家族的不同亚型陆续被报道。1 9 9 6 年，第一个人s u m oe d n a 被克隆，命名为s u m o 一2 。随后，s u m o 1 的基因序列被鉴定。人的s u m o 一3 于1 9 9 7 年也被发现。人的s u m 0 4 在2 0 0 4 年被发现。 3 8 , 3 9 】。s u m o 可逆修饰在 细胞的生理过程中发挥重要的作用。 1 3 1s u m 0 的分类与结构 s u m o 蛋白分布广泛，存在于各种真核生物细胞中，在酵母、线虫、果蝇 及培养的脊椎动物细胞中都有表达。哺乳动物中含有4 种s u m o 分子，分别为 s u m o 一1 、s u m o 2 、s u m o 3 和s u m o - 4 4 0 1 。其中s u m o 1 、s u m o 2 3 在各 种组织中均有表达，而s u m o - 4 则主要