（作物栽培学与耕作学专业论文）雪茄外包皮烟人工发酵工艺及叶表微生物区系研究.pdf

河南农熊大学学整论文藏餐性声璃、使焉授蔽及翔谖产毅翔j | 霉承诺繁 学位论 磐拯签致交簿簿盖互嫒磁互气爱蜡蒜 学使 文溪嚣 辙爱蠹器器磊焉善穗 象裂蛰菱主 擞毕 祓疵捌裟 i 燃喾篆糍鹚 ，导j | i 临友 燕名：姓名 学媳论文 7 篷臻爨密 如鬻保密，髂密时瓣融g 年二月p 目 f 独剖憷声硬 本人星交论文是在浮簿豢零f 逮行懿磅究羔 乍及取懋繇究或暴，溶了文孛 特尉热戥掭注耜数谢静媳方井，文中不键含箕德a 已经发褒或撰写过的蜡究戒 聚，遣不包疆为获 ! 霉露褰农翌大学或其镪教弯瓿携蕊学位藏谖书羲；捷焉过翁耪 黼，指导教照黠此遴行了审定。与我麓工俸的潮志对本秘究搿徽的任何贡散 均己在论文中骰了翡确豹说臻，并表暴了落意。 鹫魏声籀。 研究生签名；涨院掮 删签名；1 惭 器翘：i 澎占攀菩秀驴瓣器嬲；蛔雾：第善鹭? 瑟 磷究蝴：狱斌舻耀繇 潦蹴学院瓣魏滕搿 致谢 本文怒在导繇时翔乐副教缓麴憨心搔导下完成的，论文的选题、试验靛实施、 论文的修改、定稿都凝聚了导师大麓的学识、智慧和心血。三年来，耳濡目染了 导廊独到酌零 磷思路、宽广静船识弱、涤垮滟专业功底、严谨的演学态度、崇高 的敬鼗糖， 枣、丝不萄魍王 乍作风，使我在求学过程中受蕊匿浅，并惠及终生， 谨就黪恩魉瓣教诲表示袭心豹感谢并献主我诚挚豹敬意! 在三年黪求学过程中，磐母至翌武老掺邀绘予我镬多躲澄蘩积关陌，经羧麴 试验能更颗糕的遴牙，在此对她袭示衷心的感谢i 豳时，在我豹论文即将完成之 际，我还要感谣串闺农监大学的李平兰豫士，都髑大学静来大僵教攘，蜀鬻农监 大学豹捌嗣顺教授、丘器立友教毅、诲宝减数授、崔级尉教授、于建军裁教授、羲 富根副教搔、赵铭钦副教授、汪耀誉副教授、符云鹏副教授和叶协镣老师，在试 验黪实整中，瞧铂露营给予我豢导鄹启发。另癸，2 0 0 2 级本科生方嚣、琏乎、 熊书斌、薛子钟，2 0 0 2 级硕士研究生杨慧丽，2 0 0 3 级硕士研究生汪文杰、顾会 战，2 0 0 4 缎鞭礤究垒兰裁稳芳、文恚强，2 0 0 5 缀鹾疆究生对浚、蘩洹都罄绘 予过我热情的帮助，在此一并向他们表示诚挚的谢意! 谨以此文献绘在我求学赣藤给予我无私的关心、支持、帮劈和前进动力黪家 人，正是他们的教诲、鼓励、鞭策和无私的爱才使得筏豹求学道路能顺利豹进行! 最后，再次感谢所有帮助我的老师、家人和嗣友! 张晓娟 2 0 0 6 竿6 胃子郑翔 摘要 2 0 0 4 - 2 0 0 5 年，研究了雪茄外包皮烟人工发酵过程中的中性香气成分的变化规律，同时 设置了不同的温湿度发酵模式，在恒温恒湿箱中进行人工发酵，对发酵后的样品进行分析， 测定发酵过程中烟叶的化学成分和物理特性变化规律，确定最佳人工发酵工艺，并对此发酵 条件下烟叶的表面微生物进行分离鉴定，结果如下： 1 以雪茄外包皮烟为材料，在温度4 9 c ，相对湿度6 0 条件下置于恒温恒湿箱中进行 人工发酵，发酵时间为4 0 d 。对发酵过程中烟叶香气物质进行测定，定性定量测出3 1 种香 气物质其中苯丙氨酸转化产物4 种，棕色化反应产物3 种，西柏烷类降解产物2 种，类胡 萝h 素降解产物1 1 种另外，其它类别的还有l o 种结果表明：发酵开始后，大部分香气 物质成分的含量上升，在发酵第1 5 - 2 5 d ，烟叶香气物质含量达到高峰，而后开始下降。其 中茄酮、苯乙醇、苯乙醛、大马酮、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯，6 一甲基一5 一庚烯一2 一酮含量在第1 5 d 达到最大值；而新植二烯、苯甲醇、5 一甲基一2 一糠醛、西柏三烯二醇、 金合欢基丙酮、吲哚、黑松酵和香气物质总含量则在2 5 d 达到峰值本试验条件下，烟叶发 酵1 5 - 2 5 d 香气物质含量最高 2 化学成分变化结果显示，经发酵后，总氮、烟碱、总糖、还原糖、淀粉、可溶性蛋白 质、游离氨基酸的含量均下降，但下降幅度大小不一总氮、总糖、还原糖、淀粉变化幅度 不大，处理间差异不明显；可溶性蛋白质烟碱，游离氨基酸变化幅度较大，其中，不论烟 碱还是游离氮基酸，都是t 5 的下降幅度最大并且，在低温条件下，发酵的前2 4 天，总氮 含量变化幅度不大，2 4 天以后下降幅度较大；在较高温度下，前3 0 天变化幅度较大，3 0 天后变化幅度不明显烟碱、总糖、还原糖在发酵的前2 4 天变化较大，2 4 天以后几乎没有 变化淀粉、游离氨基酸在发酵的前3 0 天变化明显。3 0 天以后变化很小可溶性蛋白质在 发酵过程中下降幅度一直比较大 3 经过人工发酵后的烟叶，叶绿素a 、叶绿素b 、类胡萝h 素的含量都持续下降，叶绿 素a 、叶绿素b 在发酵的前2 4 天变化幅度大，2 4 天以后几乎没有变化；发酵后烟叶颜色较 为均匀一致，叶片上的青斑明显减少或消失，外观光泽明显，叶片柔软，组织细腻；烟叶的 弹性也在2 4 天达到最大值但发酵温度过低对烟叶弹性的改善效果不理想，而过高的温湿 度组合同样也会因为烟叶的化学成分降解过多，过快而使烟叶变糟，弹性变差 基于雪茄外包皮烟的特殊用途，以t 5 即：温度4 0 c ，相对湿度7 0 的条件下，发酵2 4 - 3 0 天。烟叶综合质量较好，可用性也较高 4 在温度4 0 c ，相对湿度7 0 的条件下，分离鉴定人工发酵过程中雪茄外包皮烟叶的叶 面微生物。整个发酵过程中没有分离到放线菌和酵母菌，在发酵过程中，叶面细菌数占叶面 数生物总数的百分比在9 0 以上，并且所有的细菌为芽孢杆菌。而霉菌所占比例相当小，表 明人工发酵过程中雪茄外包皮烟叶面微生物中细菌占绝对优势随着发酵过程进行，微生物 的数量逐步减少，到发酵结束。微生物的数量下降了9 0 左右 根据革兰氏染色情况，芽孢观察以及生理生化实验，从雪茄外包皮烟叶人工发酵过程中 叶面分离到的8 株菌种为： l 、蜡状芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) ；2 、巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r f u m ) ；3 、枯草芽 孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ：4 、蕈状芽孢杆菌( b a c i l l u sm y c o i d e s ) ；5 、嗜热脂肪芽孢杆菌( b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) ：6 、环状芽孢杆菌( b a c i l l u sc i r c u l a n s ) ；7 、短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) ； 8 、凝结芽孢杆菌( b a c i l l u sc o a g u l a n s ) 其中，巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌又在所有芽孢杆菌中占优势巨大芽孢杆菌占所有 芽孢杆菌的5 0 以上，其次是枯草芽孢杆菌，占1 9 左右因此，如果在雪茄外包皮烟叶人工 发酵或自然醇化过程中添加优势微生物，可能会收到缩短发酵周期。提高烟叶品质的作用， 还有待进一步研究 关键词：雪茄外包皮烟人工发酵香气化学成分物理特性微生物 2 1 文献综述 1 1 选题依据 烟叶陈化发酵是卷烟工业的一种初加工方法。当年收获的新烟，其品质都存在不同程 度的缺陷，不宜直接用于卷烟生产，必须经过一定时间的陈化发酵处理烟叶陈化发酵的方 法可分为自然发酵法和人工发酵法f 1 1 原烟和新烟具有生青气，地方性杂气，刺激性较大，燃吸质量粗糙尤其是低次烟，还 有苦、辣、涩等缺点为了克服新烟和低档烟的不良品质因素，可以采用发酵使烟叶的青气 消除，刺激性减轻，低档烤烟的苦、辣、涩有所改善，从而改进烟制品的香气和吸味，以有 利于提高烟草制品质量在陈化发酵过程中，烟叶主要化学成分发生了变化，青杂气和刺激 性大大减轻，香气显露，吃味醇和，色泽均匀并加深f 2 j 因此，陈化发酵是卷烟工业提高烟 叶质量的一个重要环节，历来受到卷烟工业的重视 1 2 烟叶陈化发酵机理的研究 关于烟叶陈化发酵的机理，目前有3 种不同学说1 1 】：( 1 ) 纯化学变化；( 2 ) 微生物作用；( 3 ) 酶催化 1 8 6 7 年俄罗斯的涅斯列尔和什列晋格首先提出烟叶发酵原因假说，认为烟叶中所含的 无机催化剂( 铁、镁) 是促使烟叶发酵的主要原因这些元素与空气中的氧进行催化作用，发 生化学反应，烟叶调制后水分缺乏，颜色变黄，大部分细胞死亡，多数酶失去活性，残留酶 对陈化的作用不大另外，烟叶发酵时耗氧量与温度同步变化，即较高的温度在定量上导致 更多的化学变化，这不符合酶催化的特征；烟叶表面的微生物，往往对烟叶质量产生不良影 响，如霉变等。 1 9 世纪8 0 年代，小什列晋格提出种新假说【3 l 认为引起发酵的最初原因是微生物的 参与，发酵的后期过程在无机催化剂的作用下进行r e i d 等人在研究雪茄烟发酵过程中发 现，微生物活动比较活跃，并与发酵过程和发酵质量有一定关系f l 】 同时，列夫理论口l 认为是烟叶本身所含的氧化酶类引起发酵作用，并指出主要是氧化酶、 过氧化氢酶，过氧化物酶等作用所致。酶学研究表明，在于燥条件下，一些酶具有很强的耐 热性，即使温度帕j 1 0 0 c 仍能保持酶活性，只是催化作用暂时终止周冀衡、肖协忠等p 4 1 也认为，发酵是烟叶在其本身酶参与下的生化过程，影响烟叶发酵的内在因素是烟叶本身细 胞内所含有的酶，它是促进烟叶发酵的原动力，烟叶发酵是多种酶联合作用的结果在陈化 发酵过程中，由于酶的催化，烟叶内部各种化学成分发生剧烈变化；这些变化伴随着强烈的 氧化过程，具体表现为烟叶强烈地从空气中吸收氧气，发生回潮并放出热量。影响烟叶发酵 的最重要的外在因素是温、湿度，烟叶中酶的催化作用受限于周围空气的温、湿度变化 除此之外，还有其他的研究人员从不同的角度对烟叶陈化发酵机理进行了研究。1 8 5 8 年，k o l l e r 5 】最早对烟草的发酵机制进行了研究，指出在某些方面雪茄烟的发酵与乙醇发酵 相似f r a n k e n b u l y 6 1 于1 9 5 0 年在对前人的研究总结后，提出烟叶是在自身酶、微生物及自 3 然氧化诸条件下共同完成的想法。认为这3 种作用都可能存在，可同时促进总的化学反应， 但何种机制占主要作用，则取决于烟草类型、发酵前处理和发酵条件b o d n a r 和b a t t a 7 1 对 烤烟自然发酵的研究表明，发酵过程中，烟叶的过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、淀 粉酶明显下降，而肚酶是增加的，过氧化氢酶活性与尼古丁含量的降低呈高度相关性。而 d i x o n 等i s 的研究表明，烤烟陈化之后，微生物的数量有所减少。烤烟中酶的作用是极小的， 烤烟发酵在很大程度上是一个纯化学过程。青岛轻工业研究所等【9 1 曾用环氧乙烷来杀死烟叶 叶面微生物，发现发酵仍可以进行，认为可能是由于增加了氧化作用的结果刘伯衡f j w 和 余永茂1 慵臭氧和紫外线处理烟叶，也得出了同样的结论。a r e s 等的研究表明，烤烟中的 尼古丁含量与示氧值呈正相关但是，余永茂、陈福星【1 3 l 、谢和等1 1 4 1 则报道，在烤烟人 工发酵过程中，应用微生物酶或者直接接种烤烟表面优势微生物。可以加快发酵进程，明显 提高烟草品质 由此可见，关于烟叶发酵的机制一直有争议，到目前尚未有定论，不过有些问题是比较 肯定的发酵过程主要是氧化反应，主要特征是消耗氧气，放出c 0 2 和热量。在三种人工发 酵假说中，存在一定的联系与制约关系。即使是微生物起作用也要归于其酶和代谢产物的作 用，而且，无论微生物酶或烟叶酶作用均需要环境条件和底物参与，才能提高酶活性，这是 微生物作用与酶作用的共性方面，而氧化作用则与烟叶周围环境条件有关【l ”。 1 3 烟叶陈化发酵工艺 5 0 年代初我国烤烟供应紧张，从前苏联等国引进了人工发酵技术，直到8 0 年代还在全 国普遍采用f f j 所以对烟叶自然陈化研究相对薄弱人工发酵虽有不少优点，但对烟叶品质 改善的效果无法与自然陈化相提并论到了9 0 年代烟叶生产水平长足进步，烟叶供应比较 充足，各地卷烟厂先后摒弃人工发酵而相继采用自然陈化，对烟叶自然陈化技术的研究才真 正展开 目前大多采用的烟叶发酵工艺f 3 崤3 种：自然发酵；人工发酵；堆积发酵 1 3 1 自然发酵 自然发酵( 也称自然醇化或陈化) 是一种最温和的发酵方法。将复烤后的烟叶贮存在仓库 内，使之随着季节温湿度的变化而缓慢地进行陈化，一般需要1 8 3 0 个月【1 6 】才能达到陈化 的要求经过陈化后的烟叶颜色略深、均匀，多为橘黄色或橘红色，吸湿性下降，有浓郁的 嗅香，燃吸时香味优美浓郁，青杂气基本消失。刺激性减轻，燃烧性改善，品质得到明显提 高但这种发酵方法时间长、占用仓库面积大，在多雨季节烟叶容易霉变。 余校芳等“刀对烤烟k 3 2 6 及广西晒黄烟二级烟叶在密封仓库内进行3 3 0 个月的贮存陈化 试验，通过对烟叶养护、管理和外观质量、内在质量的评定及化学分析。确定不同等级烟叶 的最佳贮存期分别为：c 2 f 复烤烟1 3 2 0 个月，b 2 f 复烤烟1 5 2 3 个月，广西晒黄烟二级1 3 2 0 个月郭俊成等1 1 司进行了皖南烤烟陈化研究。结果表明，中三、中四烟叶陈化时间两年 为宜，上二烟叶需3 年时间品质才能达到要求，各等级烟叶陈化时间最长不宜超过3 年，否则 4 烟叶香气将逐渐减少；同时还发现，随着烟叶陈化时间的延长，其填充力有逐年增加的趋势， 且与总糖、总氮和烟碱呈极显著负相关据张广周i l q 报道，室温2 5 、相对湿度6 5 是白肋 烟最佳贮存条件国内一些卷烟厂还尝试利用“密闭降氧”技术进行烟叶储存，其主要作用 是减少储存过程中烟叶造碎和走油的损失，对陈化不一定有利作为当今科技界研究热点的 微生物发酵技术，是一项新兴的生物工程技术近年来在国内外的研究中取得了突破性的进 展，已先后在食品、医药、饮料、保健品等领域得到广泛应用口叩” 为缩短烟叶的发酵时间并提高其发酵质量，许多学者还进行了控制烟叶发酵的环境温湿 度等相关研究d a r k i s 等i 矧的实验表明，采用强化发酵方法，提高陈化烟叶的环境温湿度。 可把一般需要8 1 8 个月以上的陈化时间缩短为2 个月左右，并获得与陈化8 1 8 个月相类似 的效果。王应昌蚴研制出的烟叶醇化剂，可减少烟叶燃吸时的刺激性，提高香气质量，同 时能加速烟叶的陈化进程，使其陈化期缩短1 2 1 8 个月有关利用纸箱包装进行烟叶发酵试 验的报道伽，为打叶复烤后的烟叶陈化提供了一种新的方法 1 3 2 人工发酵 人工发酵是模拟自然发酵原理，将烟叶放在有温湿度控制的发酵室内。通过人为调节烟 叶发酵时的环境温湿度来加速烟叶发酵进程的方法，以便在较短时间内取得改善烟叶品质的 效果人工发酵法缩短了发酵时间，温湿度也易于控制，但是它有消耗能源比较多的特点 一般温度控制在4 5 6 0 c ，相对湿度5 5 6 5 ，发酵时间1 2 2 6d | l q 采用人工发酵的烟叶 在颜色、香味和刺激性等方面的改善程度逊于自然陈化烟叶，但较未发酵烟叶有较显著的改 善。 烟叶人工发酵一般分为三个阶段嘲，第一阶段是升温阶段，主要是提高包内烟叶的温 度逐渐达到发酵所需要的程度，同时排出包内烟叶过多的水分，使之符合发酵所需要的标准， 因而，在不影响质量的原则下，这段时间是可以缩短 第二阶段是发酵阶段，主要是维持烟叶的温度，调节室内的相对湿度，以排除烟叶在发 酵过程中所产生的水分，使烟叶能在适宜的环境里进行发酵。注意保持包内烟叶温度略高于 室温，有利于包内水分的排除 在这个阶段还应掌握烟叶发酵的程度，适时的降温，以免发酵过度 第三个阶段是降温阶段，烟包逐渐冷却后，烟叶的物理性状适合需要，既不致因水分损 失过多，烟叶过干增加损耗，又不致因水分过高不宣贮存可根据具体情况来缩短这一阶段 所需时间 烟叶人工发酵是烟叶在一定的温度、湿度条件下进行氧化分解过程，发酵质量的好坏与 烟叶耗氧的程度有羌可采用示氧方法，看其发酵后烟叶耗氧情况，是否在示氧标准范围内 也可根据烟质、烟叶的颜色和气味观察 朱大恒 2 6 1 等比较研究了烤烟自然陈化与人工发酵前后化学成分的变化，结果发现，烤 烟经自然陈化或人工发酵后，还原糖，总氮、烟碱、蛋白质、氨基酸和总脂质含量均下降， 5 其下降幅度以自然陈化烟叶较大；总有机酸、挥发性酸和粗糖苷含量均上升，也以自然陈化 烟叶的上升幅度较显著。由此可见，促进烟叶大分子化合物的降解和转化以及小分子香气物 质的合成和积累，是烟叶发酵的主要技术关键遵循这一原理通过改进发酵工艺条件，并 结合有效的生化调控措施，进一步提高烟叶发酵效果、缩短发酵周期的目标是可能实现的 t 3 3 雪茄烟发酵常用方法 雪茄烟的原料晒晾烟叶，在调制之后，尚不适用于工厂加工制造雪茄烟，还必须 经过一定时期的发酵、陈化，使其吸食品质和加工性能得到显著改善，符合工厂加工的要求 经过长期的实践，人f 不仅认识了陈化是晒晾烟叶调制后改善吸食品质和加工性能的一个不 可少的过程，而且还深深感到，雪茄烟叶的陈化过程进展缓慢，所需时问很长，很不适应生 产需要雪茄烟工作者和科学家们，经过多年的科学试验和生产实践，创造了烟叶加速陈化 即烟叶发酵的许多方法。 现在国内外采用的雪茄烟发酵方法主要有以下几种：堆积发酵法，装箱发酵法，糊米 发酵法，红米发酵法，醇味发酵法，加料人工发酵法等多种发酵方法，而雪茄外包皮烟适于 堆积发酵发堆积发酵法就是将烟叶在一定量的含水条件下，堆码成一定体积的烟堆，依赖 于烟叶自热作用所产生的热量。促进烟叶内的生物化学变化，改进烟叶品质和加工特性的一 种方法。雪茄烟堆积发酵中还常常加进一些加速发酵进程以及改进燃烧性和香、色、味质量 的添加剂。如加进0 - 5 i 的曲酒，不仅能明显改进烟叶的燃烧性，除去杂气，增进烟香， 还有促进发酵进程的作用又如用茶叶水代替白水加到烟叶上，既能改进烟叶色泽，又能改 善吃味此外工厂为缩短发酵周期，特别是在冬季，有时采用热风加潮的方法，提高开始堆 积时的叶温，使烟堆升温加快鲫 1 4 陈化发酵过程中烟叶的主要变化 一个成功的陈忧初步可以达到这样的结果i 捌：就是将那些在吸用时，由于分解或千馏 所产生的刺激及不愉快的物质消除 1 ，4 1 陈化过程中主要化学成分的变化 不同烟叶处理方法的强度和时间不同，烟叶内在化学成分变化的速度和程度也有差异， 但变化方向上具有不少相似性p 瑚列瑚3 0 , 1 8 瑚川 ( 1 ) 碳水化合物；烤烟陈化过程中，总塘一般呈下降趋势，但减少程度不大白肋烟 堆积发酵过程中，因条件比较激烈，可溶性碳水化合物基本消失烟叶陈化过程中。果胶部 分分解，含量般降低，并释放出甲醇，可以降低烟气刺激性但果胶对烟叶吸湿性有所影 响，分解后会降低烟叶吸湿性 ( 2 ) 烟碱变化：烟碱在陈化结束时一般都有所减少我国烟草研究人员在研究烤烟的 人工发酵时还发现，发酵后烟碱和其它挥发碱都有所降低，但相比而言，其它挥发碱减少程 度更大，有人认为这可能与发酵烟叶的刺激性降低有很大关系，因为除烟碱外的其它挥发碱 对烟气的刺激性作用较大 6 ( 3 ) 氨基酸的变化：在烤烟的陈化过程中，氨基酸可以发生多种化学变化，例如氧化 脱氨，生成少一个碳原子的酵或酸；脱羧反应生成胺；与还原糖之间发生非酶棕色化反应， 生成类黑精和多种具有薰煮和烤香味的化合物，对形成优美的烟草和烟气香吃味有重要影 响。烟草中的氨基酸在燃烧裂解过程中一般形成具有刺激性的含氮化合物，对烟气香吃味产 生不良影响，经过陈化处理，氨基酸含量下降，并能转化成一系列对香吃味有优良作用的香 味化合物。 ( 4 3 脂肪酸1 3 埘】和有机酸的变化：烟叶陈化后，脂肪酸和有机酸总量增加，烟叶酸性 增强，其中挥发酸的增加较为显著这对于提高烟叶的吸味品质是有利的 ( 5 ) 酚类物质变化：酚类物质对烟草的物理化学特性有很大影响。烤烟陈化过程中， 对甲基苯酚，2 一甲氧基一对乙烯基苯酚，对乙烯基苯酚等简单酚类成分的含量增加多酚类 可在多酚氧化酶和过氧化物酶催化下氧化成醌，后者与氨基酸、蛋白质等成分形成分子量较 大的棕褐色色素，这种反应又称为酶催化的棕色化反应 ( 6 3 干物质损耗是烟叶陈化过程中的另一个重要现象。烟叶消耗氧气、部分蛋白质和 氨基酸脱氨放出氨气，果胶质分解放出甲醇，某些有机酸被氧化放出e 等反应过程，都是 促使干物质消耗的因素。发酵条件越剧烈，时间越长，放出气体越多，干物质损耗越多在 自然陈化过程中，烤烟干重损失约1 2 ，晾烟约3 4 人工发酵过程中烟叶干重损失 与自然陈化相差不明显，原因可能是，人工发酵虽条件较剧烈但时间较短，自然醇化虽条件 温和，但时间很长 1 4 2 陈化过程中内在外观特征的变化 烟叶经过适当的陈化可大大改誊烟质，这与叶组织中各种化学变化有密切关系随着 陈化进行，烟叶表现出各种明显的征象，它们的气味颜色及组织有特殊的改变 ( 1 ) 香气p l j 4 捌：烤烟烟叶的气味从“青叶”气味，经过似苦薄荷的、甚至有臭气的 转变为充分醇化的烟叶具有水果、芬芳及香醇的香气；雪茄烟开始有辛辣及“生”味，以后 逐渐消失，随烟叶醇化的进展达到芳香，部分有类似氨的气味 ( 2 ) 颜色：达到适当的醇化后，烟叶颜色发生变化，一般是颜色变为均匀，暗而深， 烤烟由一种鲜黄色转变为桔黄色再变为红黄色，雪茄芯烟逐渐变为深棕色，比发酵前的烟叶 缺少光泽。和气味的变化一样，这种变化也是明显的 ( 3 ) 随发酵进展，烟叶组织也起变化。良好发酵的特征，就是一种粘腻感觉的减少及 。蜡”的消失，这种胶质去除后，就使叶面有一种“柔软”的感觉 1 5 烟叶中的酶及其在烟叶陈化发酵中的作用 1 5 1 烟叶中的酶 烟叶中的酶主要为水解酶和氧化还原酶两大类【l q 水解酶包括糖苷酶、蛋白酶、肽酶、 酯酶、叶缘素酶和碳水化合物分解酶( 淀粉酶、麦芽糖酶、转化酶) 糖苷酶能将糖苷类化 台物中的糖基水解，如芸香苷在烟叶调制时经糖苷酶的作用而脱去糖基：蛋白酶和肽酶在烟 叶调制过程中可将蛋白质逐步分解为分子量低的肽和氨基酸：酯酶中的果胶酶能分解果胶脂 链的甲氧基而释放出甲醇，酯酶还能永解三酰基甘油成简单的脂肪酸，产生一酰基和二酰基 甘油和游离脂肪酸，改变烟叶中的脂溶性化合物：叶绿素酶能分解叶绿素；碳水化合物分解 酶包括淀粉酶、麦芽糖酶和转化酶等：淀粉酶有促进淀粉水解的能力，在烟叶调制过程中可 将淀粉水解为糖类；麦芽塘酶可将淀粉分解产生的麦芽糖进一步水解为葡萄糖，转化酶则将 蔗糖转化为葡萄糖和果糖。氧化还原酶包括曲酶、脱氢酶、氧化酶和过氧化酶等曲酶可将 烟叶中的淀粉分解为三碳糖，脱氢酶、氧化酶和过氧化酶可使烟株在呼吸作用下吸取氧而放 出二氧化碳 韩锦峰等p 6 j 研究发现，随着陈化过程的进行，烤烟烟叶中的a 一淀粉酶，蛋白酶活性逐 渐增大，到1 2 个月时达到最大值，之后逐渐降低；脂氧合酶活性在6 个月时达到最大，之后 降低；多酚氧化酶、琥珀酸脱氢酶活性随着陈化时间的进行，在前1 2 个月下降明显，之后其 变化逐渐趋于稳定。h a v i r p q 发现了烟叶中存在氧化羟基乙酸酯和乙醛酸酯的多种酶证据 1 5 2 酶在烟叶陈化发酵中的作用 对于烟叶中的酶在发酵过程中的作用，目前已有大量的研究报道如李祥麟等邮1 研究 用淀粉酶和过氧化氢酶的混合溶液喷洒烟叶表面来促进其发酵；有研究发现，在发酵过程中， 烤烟烟叶中的多酚氧化酶具有定活性，在发酵的第4 d ，多酚氧化酶活性达到最大值，说明 发酵可以提高多酚氧化酶的活性，加速烤烟烟叶内氯原酸和芸香苷的降解。余永茂等i l 埘指 出，应用酶发酵低次烟叶有利于提高发酵质量，可使8 0 以上的烟叶总禧含量提高6 1 0 ， 6 0 的烟叶蛋白质含量降低1 6 2 9 ，8 3 的烟叶糖氮比值提高，烟碱平均值升高l5 2 6 ，并可缩短发酵时间，使烟叶的青杂气消除，苦辣涩味消除或减轻，但颜色变化轻微f - r a n k e n b u r y 等口9 删研究指出，在发酵处理的各阶段，烟叶中的蛋白质约有一半被烟叶中的 酶水解t 并产生相当数量的氨基酸，这些氨基酸大部分经氧化脱氨形成氨，当氨在烟叶中达 到最大浓度时，会在发酵过程中逐渐挥发，其余的氨基酸与烟叶中的其它成分发生作用( 可 能是多酚类物质) 而产生大分子量水溶性低的缩合产物。b o c e v s k e 4 1 实验结果表明，经酶法 发酵后的烟叶弹性较好o e h e i j 等j 4 ”认为，在发酵过程中，烟叶糖分的降低是由于楮苷酶 将糖分解转化为许多重要的香味物质刘石等1 4 3 】的试验证明，铜离子可以激活多酚氧化酶， 从而缩短烟叶的发酵时间 近两年，我国在积佣酶制剂改善烟叶品质方面也进行了一些探索性的研究。如张立昌m l 报道了用从酵母菌b 1 3 分离醇化的酶制剂( 主要含有中性蛋白酶、糖化酶、果胶酶和纤维素酶) 处理打叶复烤后的陕西b 2 l 烟叶烟丝，l o o g 烟丝加酶量为0 5 9 ，于3 0 下作用2 4 h 评吸结果 显示，酶制剂处理烟丝可明显改善卷烟香气，减轻青杂气和刺激性，使低等级的烟叶提升1 2 个等级李晓等h 5 l 的研究也证实，在一定条件下向烟叶中施加一定量的a 一淀粉酶和糖化 酶，可使烟叶中的淀粉降解为水溶性糖实验得出酶作用的最佳条件为：a 一淀粉酶糖化酶 的最佳用量比为8 ( u g ) 8 0 “g ) ；烟叶水分含量为2 5 ，酶的作用时间为6 h 反应温度为3 0 8 烟叶中的淀粉8 嘴被降解，水溶性糖增加2 l4 左右评吸结果表明，经过酶处理后的烟 叶香气质变好，杂气和刺激性减轻，烟气甜度增大，余味变好，劲头有所降低，烟叶总体质 量得到提高李晓等j 4 6 谜一步对不同种类的酶处理烤烟和白肋烟烟叶进行了研究，结果表 明：烤烟烟叶用蛋白酶、淀粉酶和糖化酶混合处理的效果与各种酶在最佳条件下单独处理的 效果比较一致；酶解后烟叶蛋白质含量均有不同程度的降低，水溶性糖含量有所提高白肋 烟先用蛋白酶处理，再进行加料和烘焙处理，与未经酶处理的白肋烟相比，蟹自酶处理的自 肋烟吸味品质明显改善马林m 报道了将酶解和微生物发酵综合用于改变低次烤烟化学组 分，有效地降低了对吸食品质和安全性不利的蛋白质成分及小分子含氮化合物的研究结果。 该实验结果显示，用酶和微生物处理可降解烟叶中4 1 3 4 的蛋白质；烟气中有害气体：h c n 、 n o 、c o 分别减小了7 6 1 9 、7 1 4 3 5 、4 2 3 3 5 ，焦油生产量减少2 6 0 1 5 评吸结果表明，处 理后的烟叶香气增加，刺激性显著降低，余味干净，杂气轻微该处理方法为设计低焦油卷 烟提供了一种独特豹配方原料 在国外，在烟草发酵或加工过程中，利用酶制剂控制烟叶的内在化学成分，使其向着人 们所期望的方向转化，以弥补烟叶由于生长或调制不当造成的不足，达到改善烟叶吸味品质 目的的研究目前正在开展早在1 0 6 5 年，美国菲利浦莫里斯公司的b 1 ls p a n n 等忡j 就 对烟草薄片的酶处理进行过研究他们将烟梗含量约5 0 的烟末制成固形物含量为1 2 1 8 9 6 的稠浆。加入0 0 7 5 5 0 7 5 5 ( 按干烟末重量计) 的纤维素酶3 5 ，用乙酸或柠檬酸调节p h 值到 4 5 ( 在p 啊5 下此酶的活性最高) ，于室温下放置过夜发酵，然后按稠浆法制成烟草薄片 化学分析表明，此种薄片的水溶性物质、总还原性物质和还原糖的含量均高于原来的烟草原 料，草酸铵可溶物、氯化钠和纤维素的量均较低，总灰分、苯乙醇可溶物和半纤维素的量不 变评吸结果表明，用低量酶、甘油和乙酸处理的烟草薄片，刺激性较小，甜味较重，但缺 乏“万宝路”卷烟中的生物碱劲头c f b a i l e y 和九p e t r 9 】对硝酸盐还原酶和蔗 糖转化酶处理的烟叶进行了详细的研究，发现在温度为一9 3 9 和相对湿度为8 0 9 6 l o o 范 围内，用硝酸盐还原酶和蔗糖转化酶处理烟叶，l o d 后，对于开始就发酵的烟叶已具有调制 千草样的甜香，1 2 d 后甜香更浓，并带有香豆素的气息此时停止发酵，将烟叶置于1 8 2 5 的室温下，3 d 后香气不变燃吸时烟气柔和、干味极轻，且涩味亦很小又经过数天，除 上述香气外，烟气还具有淡淡的清香。将这种处理后的样品取- d , 部分，除去0 5 5 的水，并 于一g 下放置1 4 h ，结果除质量改善外，香气稍有提高。然而这种开始就发酵的烟叶，是此 试验阶段得到的最佳样品。开始就冷藏的烟叶样品产生甜香的速度较为缓慢。1 0 d 后烟气才 甜香、柔和，并具有轻微的刺激性将这种烟叶取一部分于1 8 2 5 温度下放置6 d ，甜香消 失，烟味变浓另一部分子2 1 1 2 下放置7 d ，甜香未变，但产生一种淡淡的丁酸气香。s i l b e r m a n 1 1 c 嗍发明了一种改善烟梗品质的方法，即在压梗前，先将烟梗浸入含一定量多糖水解 酶的水溶液中，用乙酸调节p h 值至3 5 6 0 的最佳范围内，浸入时间为5 3 0 m i n ，然后排出 剩余的溶液烟梗于2 0 8 0 温度下陈化1 5 m i n 至2 4 h ，温度越高，陈化时间越短再按常规 9 方法压切烟梗处理液中可加入有助于烟梗软化的甘油、丙二醇或三甘醇，还可以加入增香 剂、烟草提取物或其它料剂。该发明所用的多糖水解酶为果胶酶、半纤维酶和纤维素酶这 些酶是在a s p e r g i l l u sa i g e r 9 茈a s p e r g i u ao z y z a e ( 稻曲霉) 培养物中发现的试验结果表 明，酶处理的烟梗柔软，易于压扁、切丝，且其梗丝的填充力和挥发物的量显著增大，总粒 相物大幅度降低，并且掺兑此梗丝的卷烟受到评吸专家们的喜爱 1 6 烟叶中的微生物及其在烟叶陈化发酵中的作用 1 6 1 烟叶中的微生物 烟叶中的微生物种类繁多，新收获的烟叶中即带有大量的微生物最早研究p l 】发现， 雪茄烟烟叶表面存在着大量的细菌和霉菌，烘烤后烟叶中分离出的细菌主要是巨大芽孢菌 群，霉菌主要是青霉和曲霉t a m a y o 等j 5 2 j 从西班牙烟叶中分离出的微生物主要是芽孢秆菌 和球菌。韩锦峰等【5 3 j 指出，烟叶中的微生物种群主要包括细菌、放线菌和霉菌3 大类，每克 烟叶中的微生物总量一般为5 0 0 0 0 8 0 0 0 0 个在发酵过程中烟叶中的微生物数量随发酵过程 有一定减少，但放线菌的数量在烟叶陈化3 0 个月时有一定增加谢和等唧l 报道，烤烟n c 8 2 中的主要微生物种群是细菌，另外还有放线菌和霉菌陈福星等【1 q 发现，在烤烟人工发酵 的中期和发酵完成时，烟叶中均存在一定数量的微生物，其中以细菌为主，另外还有少量的 放线菌和霉菌烟叶表面的微生物数量和种类与发酵条件有密切关系e n g l i s h 等p 习的研究 表明，在潮湿、高温或无氧等不适条件下进行发酵，烟叶中的微生物主要是霉菌和厌氧芽孢 梭菌，易造成烟叶腐烂和香气损失；烟叶中的芽孢杆菌、嗜热细菌和小球菌对烟叶的香气和 品质则是有益的g a r n e r “ 在对白肋烟中分离出的细菌和酵母茵进行计数和鉴定时发现， 从自肋烟中分离出的杆菌型细菌主要是枯草芽孢杆菌，而酵母菌比细菌少对于深色明火烤 烟，在发酵初期时烟叶中的细菌密度呈增加趋势，随后逐渐降低l ”g i y a k e 等1 5 q 发现，发 酵过程中烟梗中的徽生物有一定的变化g e i s sv l p 9 l 认为，存在两个微生物课题：如何 对侵入的微生物进行控制；如何选择微生物的特殊功能并加以利用 1 6 2 微生物在烟叶陈化发酵过程中的作用 k o j j s j 先进行了向烟叶中接种微生物以增加香气和改善吸味的尝试在雪茄烟中接 种酵母菌，可大大加快发酵进程，使发酵更为彻底，但同时也会促进细菌和霉菌的生长。 t a m a y o 等i 辅报道，在烟叶中接种一种小球菌，可改善烟叶的香气。e n # i s h 等吲的研究认为， 在烟叶中分别或混合接种枯草芽孢杆菌和环状芽孢杆菌，能迅速产生一种愉快的香气。进一 步的研究表明，随着微生物的生长，烟叶中的总糖和还原糖降低，p h 值提高，烟碱和总氮发 生变化所以，烟叶表面的微生物在烟叶发酵过程中起着重要的作用，从而影响烟叶的香气 和品质 i z q u i e r d ot a m a y o 九等人删发现，用微生物接种的烟叶，香气和性状均得到改善，尤 其是当采用微球菌届( 鲋删c c 淞) 或杆菌属( b a c i l l u s ) 或两者的混合物接种烟叶时， 烟叶蛋白质含量降低，可溶性氮尤其是氨态氮和酰胺氮含量增加发酵期间生物碱( 主要是 i o 烟碱) 禽量降低，发酵后p h 值大幅度增加g i o v a n n o z z is e r m a n n ig 1 6 1 1 在实验室内采用微 生物d e b a 2 y o m y c o s1 1 1 o o t i a n a e 、肼c t o c o c c u s n i c o t i a n a e 、i l n i c o t i a n a ef a r i q u e f a c i e n s , b a c i l l u ss p 和a r t l w o b a c t e r n i c o t i a n a e 对雪茄烟用的肯塔基烟叶进行发 酵处理，结果由于柠檬酸、苹果酸、马来酸和琥珀酸的分解，导致烟叶变为碱性。其中可使 烟叶中游离氨基酸的含量增加，而彪j c t o c o c c u sm c o t j a n a e 可利用这些氮基酸进行代谢， 产生c 如、氨，丙烷和丙烯g i o v a n n o z z is e r m a n n ig 1 6 2 】的后续研究进一步表明，用上 述微生物制剂处理白9 烟叶总氮、可溶性氮和烟碱含量均大幅度降低，分别由3 5 7 4 ，6 9 缁 和3 3 6 降至9 8 7 、2 9 1 和8 9 9 6 ，而蛋白质氮含量在所有情况下均增大。r a y f d a w s o n i 叫 的研究表明，嗜热性放线菌属f t h e ，麓o p h j l j c 钟f 妇艘膨船) 在湿度非常低的醇化烟中生长 缓慢，并可使醇化烟叶产生一种令人喜欢的香气，尤其是水果香气和壤香等 微生物技术运用于烟草发酵的研究在国外开展较早，在国内仅仅是开始研究，大面积的 推广应用还未见报道。邱立友，赵铭钦等咿1 分析了红大、n c 8 9 、k 3 2 63 个烤烟品种不同陈 化时间的1 0 个烟样叶面微生物的数量、种类结果表明，在自然发酵烤烟叶面微生物中， 细菌占绝对优势，放线菌和霉菌尤其是放线菌数量较少细菌中芽孢杆菌属为优势菌群，霉 菌中曲霉为优势菌群不同品种的烤烟中，优良品种烤烟叶面微生物的数量较大，种类较多 自然发酵烤烟叶面的微生物可能是推动烟叶自然发酵过程中物质转化和品质改良的生物催 化剂之一微生物及酶原先应用于人工发酵低次烟叶 h i ，目前国内研究者正在试验这一技 术在烟叶自然陈化上的应用，韩锦峰【5 3 】、罗家基1 6 5 在这一课题上进行了成功尝试其方法 是筛选分离烟叶表面的优势菌种，通过人工培养快速增殖，然后按一定比例配制成微生物及 酶制剂喷施于烟叶表面，这样能显著提高陈化质量，改善烟叶香吃味，技术难点是菌种的稳 定性问题。但也有人发现，仅有微生物难以提高陈化质量，必须加其它料液才能显著改善香 吃味赵铭钦等口。脚| 在对烤烟叶面微生物区系和优势增香菌种分离鉴定和研究的基础上，曾 利用优势增香菌种和多种微生物混合研制而成的烟草微生物发酵增质剂，对烤烟人工发酵和 自然陈化过程中烟叶发酵质量的影响进行了研究，取得了满意的结果谢和等1 1 4 的研究表 明，将烤烟经辐照灭菌后，接入从烟叶中分离到的优势芽孢杆菌，可明显提高烟叶的香气和 品质 1 7 烟叶陈化发酵的问题与展望 烟叶自然陈化是环境温湿度和烟叶本身所含的酶、叶面微生物等共同作用的结果。所 以，从理论上讲开展烟叶陈化技术研究要从两方面入手：首先是环境因素，包括温度、湿度 和时间三要素以及烟叶含水率对陈化的影响；其次是生物因素，主要研究叶面微生物和烟叶 本身所含的酶等生物活性物质对烟叶陈化的影响 烟叶陈化质量的跟踪测试包括感官评吸、外观质量评定、理化成分分析、生物活性物 质检测等感官评吸按单料烟评吸方法进行，对每一项指标打分，并对烟叶质量特征进行文 字描述，香气、杂气和刺激性的评定是感官评吸的重点内容；外观质量评定以肉眼判定为主， 同时尝试计算机视觉判定的可能性，判定的主要内容是烟叶颜色、油分变化情况；物理指标 主要是烟丝的填充力，在化学成分测试中不能仅停留在糖、氮、烟碱等常规化学成分上，应 拓展检测范围，重点放在香气物质和刺激性物质的检测上；生物活性物质检测，主要对象是 烟叶本身所含的氧化酶种类、活性检测( 如过氧化氢酶、细胞色素氧化酶p m 等) ，烟叶表面 微生物优势菌种的分离鉴定，包括细菌，放线菌，霉菌、酵母菌，随着陈化时间的推移，烟 叶表面微生物优势菌种和烟叶本身所含氧化酶的种类和活性都可能发生变化。同时，还可以 检测淀粉酶，蛋白酶等酶的种类和活性l o ” 根据感官评吸和外观质量判定结果，确立不同地区、不同着生部位、不同等级片烟自然 陈化的最佳储存期；通过理化成分分析和生物活性物质检测，初步掌握自然陈化过程中烟叶 的物理，化学、生物指标的变化规律。对照感官评吸和外观质量评定结果，运用统计学方法， 探讨经验判断与烟叶理化、生物指标变化之间的相关性，寻求烟叶自然陈化的质量评价标准 还可以进行仓储温湿度人工调控试验，确立不同地区、不同部位，不同等级烟叶自然陈 化的最佳温湿度条件此外，应积极探索利用生物技术缩短储存周期提高烟叶陈化质量，目 前对于生物技术在烟叶储存养护上的应用，国内外尚未取得统一认识，这是当前烟叶陈化技 术研究的一个“热点。具体来说，我们可以从以下几个方面进行改进： ( 一) 通过改变烟叶自然醇化库的条件，适时适当增加仓库湿度、温度，便自然醇化仓 库的温湿度在春秋两季时基本能达到夏季的温湿度条件，使微生物的活动性和酶的活性得到 增加，从而使自然醇化的速度得到加快，缩短自然醇化的时间； ( 二) 改进人工发酵的温度、湿度、时间等工艺条件，采用较低温如3 5 - 4 5 、适当延 长发酵时问如5 0 天到两个月，使发酵缓和一些，使微生物和酶的作用时间加长，与自然酵 化靠近，从而使烟叶的化学成分向有利的方向转化得更充分； ( 三) 深入对微生物的种类和酶的类型对烟叶化学成分氧化降解作用的研究，采取有效 的生化调控措施，如使烟包内增加某种适宜的微生物、施加催化性强大的某种酶等，促进烟 叶大分子化合物的降解和转化以及小分子香气物质的合成和积累，缩短烟叶自然酵化时问， 进一步提高烟叶人工发酵的效果。 1 2 2 引言 雪茄烟的原料烟叶是晒晾烟，其化学组分和物理特性异于烤烟，其发酵方法与发酵工艺 也与烤烟相差很大，同时各地气候条件不同、晒晾烟的品质特征不同、烟叶在工业上的用途 不周( 例如：外包皮叶、内包皮叶和芯叶) ，发酵的具体技术也有很大的差别鲫 雪茄外包皮烟n i 更是烟叶制品中最为名贵的一类，其用途十分特殊，仅用于卷制雪茄烟 的外包皮，是烟支品质和档次的象征，因此世界上高档雪茄对所使用的外包皮烟叶都十分讲 究。雪茄外包皮烟在使用前必须经过2 3 次的发酵过程，来改善烟叶的颜色、色泽、弹性、 香吃昧和配伍性等，以期满足工业的要求但包皮烟的发酵设备、发酵工艺和发酵环境条件 等技术参数，各个厂家一般作为核心技术秘而不宣。目前，国内外有关这方面的研究报道十 分少见 6 s , 8 7 0 1 为了保证雪茄烟质量，并提高雪茄烟的档次，本试验以雪茄外包皮烟为原料，在恒温恒 湿箱中进行人工发酵，设置不同的温湿度发酵模式，以期探索出最佳的雪茄外包皮烟发酵模 式。在此基础上对雪茄外包皮烟叶表面的微生物进行分离、纯化、鉴定。探索出人工发酵过 程中雪茄外包皮烟叶表面的优势微生物，为高档雪茄烟的生产提供理论指导，从而提高企业 的经济效益 3 材料与方法 3 1 原料与仪器 2 0 0 4 年“海南建恒哈瓦那雪茄有限公司”基地生产的雪茄外包皮烟烟叶( 叶长2 5 c m 左右，叶色浅褐色) ；l r t - 1 5 0 - s 型恒温恒湿箱； i w s 一1 6 0 智能型恒温恒湿箱 3 2 试验设计及取样方法 3 2 12 0 0 4 年试验 取完整的雪茄外包皮烟烟叶，置于l r h 1 5 0 一s 型恒温恒湿箱中，在温度4 9 ( 2 和相对湿度 6 0 下发酵4 0 d 。发酵期间，于发酵0 、1 5 、2 5 、3 5 和4 0 d 取样，每次取样7 0 9 - 8 0 9 。4 5 c 烘干 2 4 h ，粉碎，过6 0 目筛，用于香气成分测定 3 2 22 0 0 5 年试验 本实验设七个处理： 采用模拟堆积发酵法，放入恒温恒湿箱中发酵，发酵4 2 天 t 1 一t 2 ：保温时期温度为3 0 c 、相对湿度分别为7 0 9 6 、8 0 5 ： t 3 一t 4 ：保温时期温度为3 5 、相对湿度分别为7 0 5 、8 0 5 ： t 5 一t 6 ：保温时期温度为4 0 c 、相对湿度分别为7 0 5 、8 0 ； t 7 ：保温时期温度为4 5 c 、相对湿度为8 0 5 。 为研究烟叶在发酵过程中的主要化学成分的动态变化规律，取样8 次，在发酵0 d 、6 d 、1 2 d 、 1 8 d 、2 4 d 、3 0 d 、3 6 d 、4 2 d 时取样，每次取样7 0 9 - 8 0 9 ，保证取样的代表性和均匀性，烘干，粉 碎，过6 0 目筛 3 2 3 微生物分离实验 在试验2 的基础上选择最佳发酵条件，并对此条件下发酵过程中烟叶表面微生物进行分离鉴 定 3 3 测定项目和方法 3