（植物营养学专业论文）利用低值鱼制备鱼蛋白液肥及其生物学效应的研究.pdf

中文摘要 食用价值比较低的鱼类和水产品加工下脚料统称为低值鱼。鱼蛋白液肥是低值鱼 经过酶降解，降解液中添加某些微量元素和活性物质所配制成的有机液体肥料。它除 了保留鱼体中丰富的蛋白质、矿质元素等，还含有许多生物活性物质，其促进作物生 长、提高作物产量和改善作物果实品质及增强作物抗性等方面的作用，已引起国内外 的普遍关注。但目前国内外对低值鱼的降解、鱼蛋白液肥的研制和应用上缺乏比较系 统的研究，以至影响了鱼蛋白液肥的推广应用。为此，本试验首先通过对低值鱼酶降 解工艺的研究，研制成鱼蛋白液肥i 号和2 号，并且通过盆栽和田问试验对鱼蛋白液 肥的生物学效应和应用机理做了较系统的研究，获得了如下主要结果： 1 试验得出：在固定反应温度条件下，底物浓度、加酶量和作用时间对低值鱼 的降解有很大影响；通过对降解充分性、降解液中游离态氨基酸总量和各单项氨基酸 量的研究，确定最佳工艺为：t = - 5 0 。c ，固液比1 ：7 ，酶添加量为鱼体蛋白含量的8 ， 作用时间为4 h 。此条件下低值鱼的降解率达到9 2 5 3 。 2 研究表明：利用试验所得的鱼蛋白降解液，添加适量微量元素肥料和海藻液 肥及竹酢液制成的鱼蛋白液肥，符合g b t 1 7 4 1 9 1 9 9 8 国家标准，为低值鱼高值化利 用开辟了新途径。 3 试验获知：鱼蛋白液肥1 号和2 号均能促进白菜幼苗的地上部分生长和根系 发育。茶树萌发前喷施鱼蛋白液肥能促进茶叶萌发，提高总萌芽数，并提早3 5 天采 茶。在大白菜和辣椒等多种作物上喷施鱼蛋白液肥，不仅增产显著，而且能提高农产 品的质量和耐贮性。在试验条件下，白菜增产达1 4 2 8 8 。 4 试验证明：两种鱼蛋白液肥不仅能促进作物对氮、磷、钾大量元素的吸收， 而且也提高作物对钙、镁、铁、锌等中微量营养元素的吸收积累。在叶面喷施辣椒、 番茄试验中均取得一致的结果。 5 试验发现：施用鱼蛋白液肥能提高作物的抗逆性，增强作物对干旱胁迫的抗 性。在不同的施肥方式条件下，施用鱼蛋白液肥均能降低作物体内膜脂过氧化产物 m d a 的积累和降低作物组织间脂膜的渗透率，减少干旱等不良条件对作物的破坏作 用。鱼蛋白液肥的两种施用方式对作物生长土壤的p h 和e c 值有一定的提高作用， 但未达到显著效果，即在丰富土壤养分的同时不会引起作物吸收水分的困难。 关键词：低值鱼降解； 鱼蛋白液肥研制；液肥的生物学效应 1 低值鱼的资源状况 第一部分文献综述 我国水产养殖和水产品的加工有几千年的历史。从1 9 8 9 年至今，我国水产品总 产量已连续1 6 年保持世界首位。2 0 0 3 年我国水产品总产量达到4 7 0 6 1 1 万吨，占世 界总产量( 1 3 2 亿吨) 的3 5 7 ，是位于第二位秘鲁的5 倍多。并且水产品人均占有 量也超过世界平均水平。2 0 世纪8 0 年代以前，海洋捕捞以带鱼、大黄鱼、小黄鱼和 乌贼等优质品种为主，目前除带鱼和小黄鱼仍维持一定的渔获量外，其他种类产量大 幅度下降，牙鲆、鳓鱼、对虾和梭子蟹等的渔获量只有1 0 年前的2 9 。而低值品种 则上升到总渔获量的6 0 7 0 。主要经济物种资源的衰退，使渔获物营养水平下降， 低龄化、小型化和低值化现象日益加剧。历史上曾经辉煌过的东海区带鱼冬汛、小黄 鱼春汛、马面鲍冬汛与春汛现己不复存在，南海区著名的八大渔汛也已有十多年未见 出现。同时，据f a o 的统计，2 0 0 2 年，不含中国的世界水产品产量的7 0 是加工后 销售的，而我国目前的加工比例仅占产量的8 左右。其中最需要得到加工业支持的 淡水水产品的加工率更是占不到5 ，与我国水产品总产量很不相称。而且由于我国 目前除少部分大型企业外，大部分中小企业加工设备简单、老化，技术落后，加工仍 然以冷冻初级加工为主，深加工、精加工能力十分薄弱，加工品附加值不高。2 0 0 3 年我国水产品加工总量为9 1 2 万吨，其中冷冻品达到5 4 3 万吨，占到了加工总产量的 5 9 5 ，而冷冻加工品量为1 5 7 万吨，也就是说加工量只有1 7 ，对另外的8 3 日i 1 3 8 6 万吨没有进行深加工。并且鱼类加工会产生大量的鱼加工下脚料，包括鱼头、鱼 骨、鱼鳞和内脏等，约占原料鱼的4 0 5 5 。 低值鱼除了含有大量的蛋白质，还含有多种生物活性物质。据报道：青鳞鱼下 脚料粗蛋白可达5 8 7 ，是鱼肉粗蛋白的7 6 ，烤鳗下脚料粗蛋白含量为2 2 6 ； 鱼头含有2 0 左右具有补脑功能的脑磷脂，鱼油中富含长链不饱和脂肪酸，尤其是被 誉为“脑黄金”的二十二碳六烯酸( d h a ) 和二十碳五烯酸( e p a ) 。黄金枪鱼鱼油 中d h a e p a 百分含量比为2 6 5 5 1 ，沙丁鱼为1 0 2 1 6 8 ：还有富含钙质的鱼骨( 人 体对淡水鱼中钙吸收率高达6 5 以上) ；富含胶质、蛋白质、多种矿物质、钙、磷的 鱼鳞等等。 向海洋索取食物、功能蛋白和特殊活性物质，已成为世界各沿海国家海洋开发 的一项重要内容。对低值鱼及水产品加工下脚料进行开发利用，也已在世界各国展开。 2 l 世纪将是人类研究、开发、利用海洋生物资源的黄金时代。 2 低值鱼主要成分 低值鱼除含有含有大量蛋白质、氨基酸和鱼油等物质外，还含有许多微量元素和 维生素等等。 2 1 蛋白质和氨基酸类 目前，蛋白质缺乏仍是全人类共同面临的严峻的问题，鱼类资源由于量大质优， 被誉为是战胜这一难题的强有力的武器。并且由于海洋存在许多极端环境，如高压( 深 海) 、低温( 极地、深海) 、高温( 海底火山口) 和高盐等，为了适应这些极端的海洋 生境，海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大 的不同。据报道青鳞鱼下脚料粗蛋白含量可达5 8 7 ( 干基) ，烤鳗下脚料粗蛋白的 含量为2 2 6 ，鳗鱼头中粗蛋白含量高达1 3 5 ( 湿基) ，鳙鱼下脚料中蛋白质含量 为1 3 5 2 ，可见鱼类加工下脚料仍是很好的蛋白源。国际上现在已在海洋生物中发 现2 0 0 0 多种生化活性物质，其中包括众多的特殊氨基酸、多肽及其衍生物。例如从 海人草中提取a 一红藻氨酸( k a i n i ea c i d ) ，用它作为广谱驱虫药物，对肠道内的蛲虫、 蛔虫等寄生虫驱除效果显著；美国从海洋生物中筛选强效抗炎剂和心血管药物，如n 一甲基组氨酸类，正在进行的i i 期临床实验的d i d e mi n b 是从海鞘( t r i d i d e m ni ns o l i d u m ) 中分离提取的一种环肽类化合物，组分中有较多罕见的氨基酸，d i d e mi nb 可能成为一种有效的抗癌药物等等。再者，海洋生物蛋白资源不论在种类还是在数量 上都远远大于陆地蛋白资源，并未得到很好的开发。由于鱼肉的化学组成与人体肌肉 的化学组成十分接近，所以蛋白质中氨基酸组成也和人体很相似，能供给人体必需的 氨基酸。 鱼皮在鱼体中约占5 ，鱼鳞约占2 5 4 。鱼鳞在构造上近似于陆产动物的骨骼， 其化学成分和骨相似，其中有机物占4 1 5 5 ，磷酸钙3 8 4 6 ，还含有少量碳酸钙、 磷酸镁、磷酸钠等无机盐。但鱼鳞中的无机盐含量较动物骨骼的含量少得多。除此之 外，鱼鳞中还含有其特有的成分：粘液质、色素、硬蛋白( i c h e t h y l e p i d i n ) ，鱼鳞中 胶原和陆产动物的胶原相比，由于鱼鳞的组织比较疏松，所以，其中所含的胶原也较 易被水解成明胶。利用鱼品加工过程中废弃的皮、鳞等提取动物胶，以代替猪皮、牛 皮、骡皮及龟、鳖甲制胶。实践证明，用鱼皮和鱼鳞制胶是动物中最好的原料之一。 鱼鳞、鱼皮胶可起到龟板胶、阿胶等同样滋阴止血的功效，且在润肺、补肺等方面具 有独特功效。 2 2 脂肪酸类 鱼油是以脂肪形式存在于鱼肉中或以分散油形式存在于鱼体内的油脂，此外还 含有少量类脂、磷甘油醚、脂溶性维生素以及蛋白质降解物等，其中磷脂主要由磷脂 酰胆碱和磷脂酰乙醇胺组成。与一般动植物油脂相比，鱼油中大部分脂肪具有较长的 碳链和多元不饱和度，长链脂肪酸通常占总脂肪量的1 4 一l 3 ，有时高达1 2 ，其中 5 6 个双键的脂肪酸通常占鱼油的1 5 3 0 ，尤其以n 3 系列的高度不饱和脂肪酸 ( h u f a ) ，如二十碳五烯酸( e p a ) 和二十二碳六烯酸( d h a ) 的含量比较高，例如大 眼金枪鱼e p a 、d h a 的含量分别为7 8 、3 0 6 ，远东拟沙丁鱼含量分别为2 2 5 、 1 2 1 等。e p a 、d h a 具有防治心血管疾病、抗炎、抗癌、增强免疫功能及促进幼 畜生长发育等功效。可见，鱼油具有一些其他脂类不可比拟的优点，被广泛用于保健 品、药物和优质饲料的开发生产。 2 4 维生素类 在上世纪早期，鱼类中曾以鳕鱼肝脏中维生素a 的含量较高而知名；鱼肉能提 供其他肉类少有的维生素。鱼肉中含有多种维生素b ，鱼油中含有脂溶性维生素a 和d ，是其他肉类所不及的。鱼眼球中含有丰富的维生索b l 、维生素a 和维生素b 2 ， 营养元素之丰富不次于鱼类。鱼肝富含维生素b 1 2 ，维生素b 1 2 是治疗恶性贫血症的 特效药，对营养性和其他巨型红细胞贫血症都有很好疗效；大黄鱼鱼肝油中含维生素 a 相当高，每1 9 中可达5 2 0 万国际单位。维生素a 对上皮细胞组织及身体的正常 活动有重要作用。此外，鱼鳞、鱼子、鱼鳔中均含有多种维生素。 2 5 矿物质类 鱼肉中含有相当多的矿物质与人体必需的微量元素。鱼肉和鱼骨里含有丰富的 磷、钙等矿物质，海水鱼还含有碘、钴和氟等人体必需的微量元素，铁和锌元素含量 也较多。如吃酥鱼，骨和刺都可以吃，能获得更多钙质。鱼肉中的钙含量，大多数高 于畜产动物肉，如远东拟沙丁鱼、鲐鱼、大头鳕、鳗鲡、牡蛎可食部分中的含钙量分 别为每l o o g 含7 0 m g 、2 2 m g 、4 2 r a g 、9 5 m g 、5 5 m g ，而猪、牛肉仅为每l o o g 肌肉含 5 m g 和3 m g 。此外，锰、镁、锌、铜等在营养上必须的微量成分在鱼贝肉的含量都高 于畜产动物肉中含量。 2 5 其他活性成分 卵磷脂：鱼鳞和鱼籽中均含有较多的卵磷脂，在一定程度上可增加记忆力，并可 控制脑细胞退化，具有健美抗衰老功效：也是一种良好的表面活性剂。 牛磺酸：利用鱼头、骨制得的鱼骨糊中牛磺酸高达o 3 2 7 。牛磺酸不仅对食品 呈味有影响，而且对人体健脑、降血压等诸多方面有着极为重要的作用。 硫酸软骨素：每千克鱼头可提取3 克软骨素。硫酸软骨素可治疗关节炎、腰痛， 抑制肠道对葡萄糖吸收，抑制肥胖、抗癌细胞增殖及治疗牛皮癣、肠炎、青光眼、糖 尿病引起的视网膜变等。 甲壳素：甲壳素存在蟹、虾等甲壳类中，科学界将其誉为继糖、蛋白质、脂肪、 矿物质之后人体必需的第六生命要素，其主要功能有：抑制肿瘤、强化肝脏机能、几 丁聚糖的降血压作用和治疗烧伤、烫伤、外伤、加速伤口愈合。甲壳素用于肥料方面， 有调节作物生长和防病抗病的功效。 3 低值鱼的利用现状 3 1 鱼油的利用 上个世纪5 0 年代初，利用鱼的甘油，特别是鲨鱼甘油中含有丰富的维生素 a 和d ，制成了鱼肝油制品，投放市场后很受欢迎，后来鲨鱼资源下降，鱼肝油产品 的生产逐渐由合成维生素a 和d 及植物油代替。随着鱼粉工业的兴起，鱼油产量不断 d h a 和e p a 的温度较低，一般高于2 0 c 其生长速度就会下降，而藻类具有较宽的生长 适应范围，具有更大的生产利用价值。 3 2 蛋白源的利用 3 2 1 食用鱼蛋白 鱼粉生产一直是开发利用低值鱼蛋白的主要手段，鱼粉的工业化生产可以追溯到 上个世纪初。最初，人们将不能食用的水产品及其下脚料制成饲料鱼粉，后来又将其 制成脱脂食用鱼粉，在鱼粉的基础上先后试制并投产的有工业蛋白胨、试剂蛋白胨和 水解注射液等产品；有的人员还从鱼精中成功提取鱼精蛋白、精氨酸和脱氧核糖核酸； 到了上世纪7 0 年代末8 0 年代初，又试制成功了浓缩鱼蛋白( f i s hp r o t e i n c o n c e n t r a t e ，f p c ) 。浓缩鱼蛋白的优点不仅能防止鱼变质，还能将不受人们欢迎 的未利用和利用率低的鱼类为人类所食用，是一种完全没有鱼臭、鱼腥昧的白色粉 末，营养价值很高。鱼蛋白粉作为高蛋白的营养强化剂目前主要应用于以下领域： 方便面中的应用。可作为方便面汤料的基料，深受消费者青睐。复合调味品中的应 用。日本在此方面开发和研究较多，烧津水产化学公司以水产提取物为中心，生产各 种调料，我国在此方面研究还比较滞后。膨化食品中的应用。水产动物蛋白制品在 膨化食品中应用较多。作为氨基酸强化剂添加到其它食品中。例如贝因美鱼肉高蛋 白营养米粉。蛋白质经纯化后适当加入一些添加剂，可作为保健食品出现在市场上。 由于鱼类蛋白质品位高，所含氨基酸比例与人体肌肉成分极为接近，吸收利用率 高，因而开发鱼蛋白水解物引起了人们的广泛兴趣。鱼蛋白经酶作用降解通常被分为 两大类：完全水解和部分水解，水解程度不同在最后的产品中影响它应用的性质就不 同。完全水解的水解产物主要有游离态氨基酸组成，将利用率低的鱼水解制备成混 合氨基酸，营养丰富，生物效价高，无腥味；也可通过加酶水解，保湿发酵生产特殊 高档氨基酸调味品一鱼露( f i s hs a h c e ) ，含有人体所必需的各种氨基酸，特别是含 有丰富的赖氨酸和谷氨酸，赖氨酸占其氨基酸总量的1 3 1 9 ，谷氨酸占1 5 2 0 ， 因此鱼露特别鲜美。此外，鱼露中还含有人体所必需的无机盐，如钙、镁、铁和磷等。 部分水解得到的产物是大量的肽类和少量的氨基酸。现代营养学研究表明：在蛋 白质消化期间，以肽类形式存在的氨基酸浓度比游离氨基酸的浓度大，而且小肽的吸 收速度也比等量游离氨基酸快，数量也更多。这揭示了小分子肽比等量的游离氨基酸 具有更高的生物效价和营养价值。肽是蛋白质和氨基酸的中间物。肽除具有易消化、 易吸收营养功能外，还具有抗应激、降血压、抗胆围醇、增强免疫等许多生理功能。 裘迪红等( 2 0 0 0 ) 对鲐鱼蛋白进行水解制备浓肽口服液或者运动员饮料，营养丰富， 具有一定的保健功能。目前，各国对肽制品开发应用日趋活跃，并不断深化研究利用。 此外，利用小杂鱼和低值鱼生产鱼糜产品的工作也取得很大进展。国外，如美国、 日本等国，鱼糜制品发展较快，尤其是日本，鱼糜制品已是大众化的水产加工品，每 年有2 5 0 3 0 0 万t 鱼类用于加工鱼糜制品，其产量占各种加工品的首位，其研制投产 的蟹腿虾肉等模拟食品达到以假乱真的程度。目前，我国也有一些企业生产鱼香肠、 鱼丸、冷冻鱼糜、鱼排等产品。 3 2 2 饲用鱼蛋白 鱼蛋白源作为饲料，最初是在产鱼地区，利用一些食用价值不大、鲜度差的低劣 鱼类及鱼头、内脏等废弃物，土法加工成的的鱼粉。方法是：将原料洗净沥干水分， 放入锅内煮沸，趁势捞起放入压榨机加压，剩下的鱼渣，晒干或烘干，使含水量降到 1 0 左右，粉碎得饲料鱼粉。随着加工业的发展，世界上鱼粉的生产普遍采用湿法压 榨。将原料蒸煮后，经压榨分离出大部分油脂和水分，再进行干燥，这样避免了油脂 氧化，鱼粉和鱼油的质量都好。近几年的液体鱼蛋白饲料是利用低值鱼，经绞碎后加 入一定量的酸或微生物发酵后，使其液化的浆状制品。上世纪7 0 年代在联合国的倡 导下，英国、澳大利亚、斯里兰卡、马来西亚等国相继试验或生产液体蛋白饲料。由 于液体蛋白饲料生产中的消化过程通常都是在酸性环境中进行，所以，此种饲料特称 为酸贮( a c i ds i l a g e ) 饲料。该饲料制取方法有糖蜜发酵法( 利用甘蔗制糖的下脚 料) 、酸化法、碱化法等。液体鱼蛋白饲料营养丰富，可与鱼粉媲美。而且它的蛋白 质多以氨基酸和多肽的形式存在，更有利于动物消化吸收，加之赖氨酸、蛋氨酸的含 量高于鱼粉，因此比鱼粉饲喂效果更好。根据试验，该饲料用于肉鸡，与鱼粉相比， 增重提高7 ，饲料消耗降低1 6 ；用于蛋鸡产蛋增加1 7 6 ，饲料消耗降低1 4 3 ， 用于养鱼、养虾也可取得很好效果。 3 2 3 农用鱼蛋白 低值鱼类用于农业方面，也是经历了一个有原始操作到产业化的过程。最初， 把变质的和食用价值小的鱼类堆置发酵或者沤制成浆液，直接施与农作物。虽然操 作简单，但利用率低和易引起作物病害等。液体鱼蛋白主要成分是多肽和氨基酸， 所以以此为主要原料制成肥料，也很容易被作物吸收利用。这种肥料含有利于植物 生长发育的1 7 种氨基酸和多种微量元素，是高科技生物工程的产物。使用这种肥料， 在不增大对作物投入的基础上，能使作物增产，可使经济效益、生态效益和社会效 益达到完美统一。 4 鱼蛋白液肥的研究动态 上世纪初，b r o w n ( 1 9 0 6 ) 、a r t a r r i ( 1 9 4 6 ) 、g h o s h b p ( 1 9 5 0 ) 先后研究了三叶 草、番茄对几种氨基酸的吸收，说明植物能够吸收氨基酸。由于人工合成氨基酸比较 困难，如果不解决来源问题，即使氨基酸肥效很好，将氨基酸作为农用肥料，也只能 是可望不可及的科学幻想。 近几年，以毛发为原料，以提取胱氨酸为目的的毛发水解行业，由于原料来源广、 成本低和技术简单，在各地兴起。但是各地对提取胱氨酸后的大量母液仍无妥善的处 理方法。据测试母液中含1 0 几种游离氨基酸和氯化铵，化学耗氧量和生物耗氧量均 大大超过排放标准，如排出厂外，不仅浪费了有用资源，还将造成环境污染。因此以 毛发为原料生产氨基酸肥料并不如人意。 海洋的环境特殊，蕴藏着无穷无尽的生物类群，它是人类赖以生存和持续发展的 宝库，例如：每年全球海洋浮游生物的产量约5 0 0 0 亿吨，人类从中进获取约0 8 亿 吨海洋水产品，还不到五千分之一，尽管如此少，但仍占人类现在使用蛋白质的五分 之一。近年来，由于捕捞业和水产加工业的发展，产生大量低值鱼类，低值鱼类有很 高的蛋白质含量，若将其用来生产氨基酸，不仅能解决蛋白质来源问题，也可以缓解 环境压力。 目前应用的鱼蛋白液肥主要有来自美国的邦龙鱼蛋白有机肥和青岛海华科技开发 有限公司生产的海华鱼蛋白有机肥，生产工艺均是以深海鱼类提取的鱼蛋白为主要原 料，配以深海植物提取的有效中微量元素、植物生长因子、酶等生物催化剂，生产的 纯天然液体有机肥。并且都有良好的施用效果：活化土壤、促进土壤微生物的繁殖、 促进植物吸收养分、调节土壤酸碱度等有独特效果。使用对象广泛，尤其对瓜果蔬菜 效果明显：可促进根系发达、茎秆粗壮和增强抗病性。使用方式有浸种催芽、基施、 灌根和叶面喷施。但是低值鱼类中除了蛋白源外，还含有大量矿物质元素如磷、钙等， 如何充分利用低值鱼类，使低值鱼最大限度的发挥对农作物的营养作用，值得进一步 研究。 4 1 鱼蛋白液肥的生产工艺与技术 4 1 1 酸降解法 酸水解的特点是水解迅速且比较彻底，几乎能使蛋白质全部水解成氨基酸，避免 消旋作用。所使用的盐酸也可以蒸发除去，如果用硫酸，这可以通过形成硫酸钙沉淀 除去。不足处是色氨酸被破坏，并与糖在酸中生成的醛类作用生成腐黑质，使水解液 成黑色，并造成过滤困难。 蛋白质的酸水解，通常用6 - 8 m o l l 盐酸或8 m l o l 硫酸，水解的程度一般受酸浓 度、水解温度和水解时间等因素的影响，反应条件根据产品的要求控制在1 1 0 1 2 0 。c ， 水解1 2 2 4 h 。酸浓度越大，水解温度越高，水解速度也越快，水解时间也就越短， 但必须注意，在这种条件下水解，氨基酸遭破坏的程度也越大，所以为了得到最佳水 解效果，必须作蛋白质水解曲线。 4 1 2 碱降解法 碱水解的速度较酸水解慢，一般用稀氢氧化钠，特点是可以避免色氨酸的破坏， 也无腐黑质的产生，但缺点是氨基酸会产生消旋作用。此外，精氨酸、胱氨酸全部遭 破坏，氨基酸的得率很低，所以该法生产效益不高，但由于技术简单在不少企业中仍 被广泛使用。 4 1 3 酶降解法 酶是生物体中具有催化功能的蛋白质，它的特点是具有高度的专一性，即蛋白酶 专一水解蛋白质，淀粉酶只能水解淀粉，且催化效率极高，是一般催化剂的1 0 6 一l o 倍。由于酶是一种蛋白质，因此对温度、p h 值和导致蛋白质变性的酸碱等因素非常 敏感，一般酶反应都是在比较温和的条件下进行的。 一般根据产品的需求而选用不同的酶制剂，通常采用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、 和木瓜蛋白酶等，也可利用鱼内脏的蛋白酶进行水解。酶水解的反应速度受酶的浓度 和活性、底物浓度、p h 值和温度等因素的影响。目前主要的酶降解工艺有： 4 3 1 利用鱼内脏来降解鱼蛋白 在对鲭鱼鱼头及尾等下脚料降解时，取一定比例的鲭鱼内脏作酶剂原料，具体条 件：内脏加入量为1 5 - 2 5 ，p h 8 5 9 0 ，t 为4 8 5 0 c ，反应时间为3 0 m i n 最后产品蛋 白质含量为3 0 2 ( 张健雄1 9 9 1 ) 。 4 3 2 单酶水解鱼蛋白 根据木瓜蛋白酶降解鱼蛋白的研究( 周涛1 9 9 8 ) 。用木瓜蛋白酶( 活力4 5 万单 位克) 水解鲐鱼废弃物制取鱼蛋白，通过正交试验的最佳条件：p h = 6 5 仁- 6 0 。c 酶 用量1 | 2 5 ( 占鱼糜中蛋白质含量) 反应时间6 小时。氮利用率7 1 ，蛋白质水解物 中粗蛋白含量8 2 4 8 ，必需氨基酸，氨基酸总量= 3 9 8 。复合生物蛋白酶降解( 毋瑾 超2 0 0 1 ) 。用复合生物蛋白酶f 1 0 2 ( 国家海洋局第二海洋研究所自行研制) 降解小 杂鱼( 鳗鱼7 0 下杂鱼虾3 0 ) ，最佳条件是：酶量底物为1 5 ：1 0 0 0 ，t = 5 0 ，反 应时间4 小时。降解液氨基酸含量7 3 ，分子量组成范围在7 4 0 0 以下，其中3 0 0 0 以 下占9 0 以上，1 0 0 0 以下占5 4 。 4 3 3 双酶水解鱼蛋白 在海鳗鱼头浓缩水解液中的制各中，曾少葵、张超桦采用双酶( 活力单位分别是 l x l 0 5 单位克和6 x 1 0 5 单位克) 水解技术。具体反应条件：将原料鱼磨碎后，加入2 o ( 占原料鱼百分数) 的枯草杆菌和木瓜蛋白酶，比例1 ：l ，p h = 7 0 t = 4 5 。c 反应 时间2 小时蛋白质回收率达7 3 4 。 4 2 鱼蛋白液肥的使用现状 4 2 1 使用方法 鱼蛋白液肥的使用方法主要有：叶面喷施、土壤施用、种子浸泡。液肥含有大量 游离氨基酸，在土壤中通过正常的生物活性缓慢地释放出来，满足植物的需要。可以 使土壤微生物加倍繁殖，提高活性，对活化土壤、促进作物吸收养分、调节土壤酸碱 度等有独特效果。鱼蛋白液肥它可以累积土壤的腐殖质从而提高土壤的质量，通过 疏松粘土，可以使植物根部舒展，改善水分和养分的输送，使植物获得充足营养。 鱼蛋白液肥浸泡种子也具有良好的效果，如糯玉米经氨基酸液肥浸种1 2 h 后，可 以促进糯玉米苗期的生长发育，具有早生、快发和壮苗的作用，并且对根系活力和叶 绿素含量均产生明显效果( 路明2 0 0 4 ) 。叶面喷施是一种最方便最有效的方法，能快 速补充植物对营养成分的边缘缺乏，刺激根茎的发育和对营养成分的吸收。鱼蛋白液 肥中含有大量的游离氨基酸，可被植物直接吸收利用。叶面喷施还具有吸收速度快、 利用率高、用量省等优点，还可节省费用，同时叶面施肥可以在作物的不同生长阶段、 不同种植密度、高度下进行，有利于集约农业的大规模机械化操作( 庄舜尧1 9 9 8 ) 。 叶子直接吸收和利用有效养分，参与作物的新陈代谢和有机物合成过程，增强体内酶 的活性，提高光合作用强度。对养分的利用率高、效果好，并可防止或避免由于土壤 对养分的固定而降低其有效性。土壤施肥，由于挥发、流失、土壤固定、田间杂草利 用等因素真正被植物吸收的一般只有3 0 4 0 ，因此，植物也不喷施肥料，特别是对 某些容易被土壤固定的元素如磷、铜、锰、铁、锌等，具有营养效果好的特点。对大 多数生长在山坡的茶树等不利于地面施肥的作物而言，叶面喷施尤为适合。在施肥期 还可按作物各生育期以及苗情和土壤的供肥实际状况进行分期喷洒和补救，以协调作 物对各种营养元素的需要和土壤供肥之间的矛盾，促进作物营养均衡、充足、并按一 定比例吸收，充分发挥叶面肥反应迅速的特点，以保证作物在适宜的肥水条件下进行 正常生长发育，达到高产优产的目的。 4 2 2 使用效果 鱼蛋白液肥适用于各种作物，尤其对栽培的瓜果，蔬菜效果更明显、主要表现在： 作物根系发达、茎杆粗壮、抗病力增加( 尤其对土传染病害如枯萎病、黄萎病、根结 线虫病及霜霉病、白粉病、银叶病等病害效果明显) ，使产量大幅度提高，品质 显著改善。具体表现在： 1 促进作物苗期生长。经氨基酸液肥浸种的糯玉米，在苗期其株高、叶面积和 根系的生长，均好于对照( 路明2 0 0 4 ) 。并且用氨基酸液体肥拌种也对玉米苗期生长 有一定促进作用。拌种处理后，玉米的主根系明显增长，根系干物重增加，单株根系 活力加强，从而促进了幼苗的营养吸收，地上部分发育好，干物重增加，也面积增大， 叶绿素含量提高( 李潮海1 9 9 6 ) 。 2 增加产量，提高品质。鱼蛋白液肥对白菜、茶树、水稻等的施肥试验，都增 加了产量( 李浩，2 0 0 1 ；叶榕，1 9 9 8 ；陆若辉，2 0 0 5 ) 。谭济才等人( 2 0 0 2 ) 在对茶 树的实验中，发现氨基酸肥不仅能使茶树提早萌发5 6 d ，芽头密度增加1 8 6 2 ，百 芽重增加6 5 1 5 5 ，尤其是春茶前喷施可显著提高名优茶的产量和质量。 3 增强作物抵抗不良环境的能力。鱼蛋白液肥本身含有大量不饱和脂肪酸，这 些不饱和脂肪酸可以大大降低植物细胞的冰点，使植物更耐低温，可减轻或防止低温 对作物造成的危害。同时，该肥料中脯氨酸含量高达2 左右，可以较好的保护植物 细胞膜的完整性，是细胞膜在逆境下免遭伤害，因此大大提高了作物对极端温度的适 应能力，增强了作物的抗寒性，使作物更耐低温。喷施鱼蛋白液肥对苹果、葡萄冻前 预防和冻后恢复均有良好效果( 于忠范，2 0 0 4 ) 。 4 改善果实的品质。叶面喷施鱼蛋白液肥对增加苹果果实中固形物有一定效果， 并且对苹果的着色有促进作用( 彭永波，2 0 0 4 ) ：鱼蛋白液肥对葡萄产量和含糖量亦 有明显效果( 王盛，2 0 0 4 ) 。 4 3 鱼蛋白液肥的发展前景 长期不合理的使用化肥，常导致土壤酸化、板结、肥力下降、污染加剧。随着 我国农村经济的发展及对绿色环境的重视，开发利用新型高效肥料已势在必行。鱼蛋 白液肥属天然产物，对人畜无毒无害，对环境无污染，运输方便，施用简单。有效成 分能被作物充分吸收利用，无残留，对作物土壤无任何危害，对植物生长起着显著的 调节和促进作用，是绿色食品的首选肥料。尤其无公害产品生产的发展，更需要从生 物资源生产无害化肥料。同时，随着我国水产养殖和水产加工业的发展，产生大量低 值鱼类，从中提取鱼蛋白生产有机肥，变废为宝，可以达到资源的高效利用。 鱼蛋白液肥含有利于植物生长发育的1 7 种氨基酸和多种微量元素。可以根据各 种作物的营养特性、吸收规律，以鱼蛋白液肥为基础，添加其他营养成分，配 制成一系列适合各种作物生长发育的专用肥，并可以根据不同区域土壤供肥能力不同 而调整肥料配方。 1 立体依据 第二部分绪论 1 1 低值鱼的资源及存在环境问题 我国水产品产量从1 9 9 0 年起，到2 0 0 4 年连续1 4 年位居世界首位。2 0 0 5 年上半 年全国水产品产量达到2 0 2 9 万吨。比去年同期增长5 5 ，预计2 0 0 5 年达到5 1 0 0 万 吨( 2 0 0 6 ，陈蓝荪) 。我国水产养殖业虽然取得了一些成就，但水产品加工业的发展 却不能与之适应。我国水产；b 口q - 品仅占水产品总量的3 0 7 ，远远落后于发达国家 7 0 的水平。水产品中初级产品多，深加工、精加工产品少。近几年来，我国海洋 中上层鱼类和低值鱼以及淡水鱼类的产量呈上升趋势，而我国对这些大宗、低值水产 品的加工利用仍是薄弱环节。以淡水鱼为例，1 9 9 3 年淡水鱼量7 5 0 万吨，占鱼类总 产量的4 1 ，可是淡水鱼加工品仅为8 5 万吨，只占总量的2 ，腐烂变质的鱼占1 0 以上，这样更会产生二次污染，给环境造成很大压力。在海洋捕捞中，低值小杂鱼占 5 7 5 9 ，用于食品加工的仅为3 0 。像沙丁鱼之类多脂低价红身鱼，由于本身特种 鱼腥、鱼体小、鱼骨细而常被人忽视，大部分作为饲料，更有直接抛弃。对这部分低 值鱼如果不进行有效处理，不仅会污染环境，而且会浪费大量的资源。例如，鱿鱼内 脏含有2 0 3 0 的粗脂肪，对其脂肪酸组成的气相色谱分析结果表明：不饱和脂肪酸 的含量为8 6 ，。系列脂肪酸的含量达1 4 ；鳗骨、鳗头等废弃物中含有丰富的蛋 白质、磷脂质、软骨素、维生素等。充分利用这些低值鱼资源，可提高鱼类加工的附 加值，获得良好的经济效益和社会效益。 1 2 有机液肥的需求 低值鱼的降解和资源化利用在保护环境为前提的今天，适应当夸农业发展的方 向，是可持续发展为前提的新型发展观的直接体现。降解液不仅具有绿色、环保的特 点而且生物相容性好，具有广泛的应用范围。其主要特征是生产得到的有机液肥富含 氨基酸、生物活性物质、以及营养全面的螯合态矿物质，适合现代生态农业和绿色农 产品生产要求。同时，在设施栽培和无土栽培日益发展的今天，液体肥料的冲施和滴 灌等特有的技术优势，更能满足现代农业发展的需要。鱼蛋白液肥在充分利用废弃资 源，减轻环境压力的同时，也开创了一种无废液排放，不污染环境的清洁生产工艺， 避免了对环境的二次污染，从而实现了生产工艺和农业工艺的环境友好。 2 研究内容 2 1 低值鱼的酶解技术研究 研究底物浓度( 固液比) 、加酶量、降解时间及添加剂等对低值鱼降解的影响效 果，通过分析降解液中氨基酸含量及降解充分程度，确定最佳反应条件。 2 2 鱼蛋白液肥的研制 分析降解液中氨基酸含量，根据国家有关标准和农业生产的需要，确定所用降 解液的氨基酸浓度、添加的各无机元素量和其他活性物质的量。 2 3 鱼蛋白液肥的生物学效应研究 主要研究鱼蛋白液肥对作物生长发育的影响及机理，并明确鱼蛋白液肥的施用 技术和作物增产优质的效果。 3 本试验拟解决的关键问题 3 1 确定适用于液肥生产的低值鱼酶降解的最佳工艺。 3 2 提出鱼蛋白液肥的最佳配方和复配技术。 3 3 提出鱼蛋白液肥的施用技术，并明确其生物学效应。 1 低值鱼的酶降解 第三部分材料与方法 实验材料 取自浙江省象山小带鱼、部分下脚料等杂鱼、蛋白酶( 活力单位3 0 0 0 0 u g ，浙江 省海宁金潮实业有限公司) 等。 实验设计 将小带鱼清洗干净打浆。选择适合生物酶发挥最佳作用的温度和p h ，作用时间 设定1 h 、2 h 、3 h 、4 h 、5 h 、6 h 六个水平，加酶量选择小带鱼蛋白质含量的5 、6 、 7 、8 、9 、1 0 、1 1 七个水平，固液比设定1 ：2 、1 ：3 、1 ：4 、l ：5 、l ：6 、 1 ：7 六个水平。 实验方法 以单因素试验方法分析各个因素对降解作用的影响作用，将每个处理的降解液离 心得到残渣，烘干后的残渣量作为评价降解充分性的指标，测定降解液中氨基酸总量。 选定降解比较充分的降解液进行氨基酸组分分析，确定最佳方案。 2 鱼蛋白液肥的研制 试验材料 试验所得降解液，购自市场的微肥硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰、硼酸， 海藻肥( 余姚赛德科技公司) ，青之源增效剂( 浙江省丽水中林高科有限公司) 3 鱼蛋白液肥的生物学效应 3 1 鱼蛋白液肥对作物生长发育的影响 3 1 1 白菜幼苗生长试验 材料：鱼蛋白液肥l 号、2 号，白菜种子( 早熟5 号) 。 实验设计：对照c k 清水，液肥1 号、2 号浸种浓度设1 0 0 倍、3 0 0 倍、5 0 0 倍4 个处理，重复3 次，随即区组排列。 实验方法：浸种8 个小时后，清水冲洗。播于基质盆中，生长过程中不旌任何肥 料，只是浇水，且各处理保持一致，生育期4 0 天。生育过程中测量株高、叶绿素， 收获后测量株高、根长、叶面积、鲜株重、鲜根重及烘干重，对根系扫描测定吸收面 积和根体积等。 3 1 2 茶树发芽试验 材料：杭州梅家坞茶树龙井4 3 号，鱼蛋白液肥1 号、2 号。 实验设计：液肥1 号、2 号各稀释5 0 0 倍，每个处理设置3 个重复，每个小区长 2 米，宽l 米，两端各有保护区。由于地处山坡，就每个处理分处上中下三块田里， 以消除地域差异。试验始于2 0 0 5 3 9 号，选取茶树萌发比较均匀的地段设置试验，每 周喷施一次肥料，茶树发芽后分3 次考种，用面积为2 5 e m * 2 5 c m 的框架作为考种面 积，记录总芽数、一叶一心和二叶一心芽的数量。 3 1 3 番茄营养生长试验 实验材料：鱼蛋白液肥l 号、2 号，番茄( 世纪浪人) 。 实验设计：本试验为基质盆栽试验，每盆称取等重量基质，设定液肥l 号、2 号 3 0 0 倍和5 0 0 倍两个处理，每个处理3 次重复，随即区组排列。 实验方法：试验开始于2 0 0 5 年6 月。首先在基质中育苗，等长至6 片真叶后选 择长势一致的苗，移栽到盆中，每盆1 株，培养1 5 天后开始喷施，分别于苗期、花 前期各喷施1 次，每次每个处理用量为3 0 0 m l 。开花期收获植株，分析植株体内养分 积累情况。 3 4 鱼蛋白液肥对蔬菜产量及品质影响 3 4 1 白菜试验( 叶喷) 试验材料：鱼蛋白液肥1 号、2 号，大白菜( 早熟5 号) 。 试验设计：液肥1 号、2 号稀释3 0 0 倍、5 0 0 倍，4 个处理，随机区组排列，试 验重复3 次，小区面积1 8 x 1 3 m 2 ，各小区边均有保护区。 实验方法：试验在富阳市栗园村进行，土壤为泥沙土，白菜在2 0 0 5 年6 月初播 种。实验开始于6 月2 7 号，在大棚内进行。每次间隔一周喷施两次，每次每个处理 用量为2 升。白菜于7 月1 4 号收获，测小区产量、白菜植株硝酸盐和v c 含量。 3 4 2 辣椒试验( 叶喷) 实验材料：鱼蛋白液肥i 号、2 号，辣椒( 江蔬) 。 试验设计：本试验为盆栽试验，土样为黄粉土，每盆称取3 k g 土，设定液肥l 号、2 号3 0 0 倍和5 0 0 倍两个处理，对照喷施清水，每个处理3 次重复。随即区组排 列。 实验方法：试验开始于2 0 0 5 年6 月。首先在基质中育苗，等长至6 片真叶后选 择长势一致的苗，移栽到盆中，每盆1 株，培养1 5 天后开始喷施，分别于苗期、花 前期和坐果期喷施3 次，每次每个处理用量为3 0 0 m l 。试验结束于9 月7 号，收获后 称量每个处理产量和辣椒品质分析：硝酸盐含量、v c 及植株中养分积累情况。 3 5 鱼蛋白液肥对白菜抗胁迫能力的影响及叶面喷施与地面施用问差别 试验 实验材料：白菜( 早熟5 号) ，鱼蛋白液肥1 号、2 号。 实验设计：本试验为盆栽试验，土样为青紫泥。每盐称取等量土样，设定液肥1 号、2 号3 0 0 倍和5 0 0 倍两个处理，每个处理3 次重复，随即区组排列。整个试实验 分为叶面喷施和土施两种处理部分。 实验方法：试验始于2 0 0 5 年1 0 月8 号，在盆中播种，长至3 片真叶取长势一致 定苗，每盆4 株。1 0 月2 4 号开始施肥，每个处理每次施肥3 0 0 m l ( 每盆l o o m l ) ，叶 喷部分由于次性量比较大，分多次喷施，每次相隔周，试验1 1 月7 号结束。结 束后收获两种施肥方法下生长的白菜，测量其株高及体内养分积累情况。同步做抗性 试验，也在1 1 月7 号不再浇水施肥，观察其变化情况，2 周后，观察白菜在干旱胁 迫下的变化，并采摘白菜测定体内丙二醛含量和植物细胞差别透性的情况。 4 主要指标的测定方法 4 1 土壤理化性状的分析测定 p h 和e c ：1 ：5 土水比提取，用p h 计和d d s 1 1 a t 数字电导仪测定。速效氮、 磷、钾的测定分别采用碱解扩散法、钼锑抗比色法、速火焰光度计测定( 鲁如坤， 土壤农化分析，1 9 9 9 ) 。 4 2 植株营养元素的测定 植株大量元素及微量元素含量，用硝酸消化，氮、磷、钾分别用4 1 种方法测定 中微量元素用i c p 测定。 4 3 植株叶面积、根系表面积测定 植株叶面积测定用叶形纸称重法( 张宪政，1 9 9 2 ) ，试验结束后用清水小心冲洗干 净根系，用根系扫描仪s c a n n e r s t d l 6 0 0 + 测定性状。 4 4 植物组织中丙二醛( m d a ) 、植物细胞差别透性的测定 丙二醛的测定采用t b a 法( 张宪政，1 9 9 0 ) ，植物细胞差别透性的分析采用的方 法为电导率比值法( 植物生理学实验手册，1 9 8 5 ) 。 4 5 硝酸盐和v e 的测定 硝酸盐测定用紫外线分光光度法( 卢其明，1 9 9 7 ) ，v c 含量测定用2 、6 一二氯靛酚 滴定法( 土壤农化分析，1 9 9 9 ) 4 6 氨基酸的测定 氨基酸的测定采用茚三酮比色法( 食品分析，1 9 9 2 ) ，各单项的分析采用高效液 相色谱测定 1 低值鱼成分分析 第四部分结果与讨论 试验通过对小带鱼等杂鱼成份进行分析，发现低值小带鱼含有的粗蛋白和灰分分 别为6 2 6 7 和1 8 4 2 ( 干基) ，可见是一种可利用的丰富的蛋白源，并且含有较高 的矿质元素1 8 4 2 ( 如表1 ) 。但由于鱼种不同和水产品加工下脚料的具体鱼体部位 不同，低质鱼的成分也有很大差异。如表1 中，低值青鳞鱼的蛋白质含量为7 2 4 7 ， 灰分的含量为1 2 4 7 ；鳙鱼下脚料和鳕鱼碎肉的蛋白质含量分别是1 3 5 2 和1 8 2 ， 灰分含量为6 6 3 和2 6 1 。因此对低值鱼的降解应该因原料不同方法也不同，根据 所需降解液中氨基酸含量，合理搭配低值鱼类的比例，尽量做到每种低值鱼都得到合 理充分利用。 表1 几种低值鱼类成分分析( ) 2 影响低值鱼降解的主要因素 首先将小带鱼去除杂物洗净，匀浆。固定恒温水浴锅反应温度5 0 。c ，以降解液 中氨基酸产率( 降解得到氨基酸量降解鱼样量) 和降解充分性( 1 一最后渣滓降解鱼 样) 作为指标，分析和选择适当的酶添加量、酶解时间和底物浓度( 固液比) 。 2 1 酶添加量对降解的影响 在统一作用时间2 h 和固液比l ：2 的前提下，酶添加量按照鱼体中蛋白质含量的 百分数计算。本试验设定酶添加量为鱼体内蛋白含量的5 、6 、7 、8 、9 、1 0 、 1 1 七个水平，结果如图1 。 2 0 1 5 1 0 5 o 5678g1 0 1 1 酶添加量 图1 酶添加量对降解的影响 由图1 得出，随着酶添加量的提高，渣滓率逐渐降低，并在酶量1 0 以后又增大， 说明随着酶量的增加，降解越来越充分，鱼体的各种营养成分都转化为液态。酶量超 过1 0 后，渣滓增多，降解作用减弱。从氨基酸产率效果来看，在酶添加量1 8 范围内，随着酶量的增加产率也逐渐提高，在酶量为8 达到最大值8 6 6 7 ，而后降 低。虽然在酶量8 和1 0 条件下，渣滓率分别为1 1 6 5 和9 9 ，而氨基酸产率却 是8 7 和5 5 ，但是从生产目的考虑，酶量取鱼体蛋白含量的8 最佳。 2 2 固液比对降解的影响 在选定酶添加量为8 、温度不变情况下，设定固液比1 ：2 、1 ：3 、l ：4 、l ：5 、 1 ：6 、1 ：7 六个水平。( 反应所取浆液9 0 o o g ，l o i n 水量分别为o m l 、3 0 m l 、6 0 m l 、 9 0 r a l 、1 2 0 m l 、1 5 0 m 1 ) 结果如图2 ：由结果得出，随着加水量的增加( 固液比的减小) ， 降解液渣滓率逐渐降低，小于1 ：5 之后趋势变缓，而氨基酸产率逐渐升高，从生产 角度考虑，为方便操作，选定固液比1 ：7 。 1 1 1 0 9 8 7 6 图2 固液比对降解的影响 2 3 添加剂对降解的影响 由于大部分矿物质营养元素在p h 较大时会发生沉淀或化合变成不可利用状态， 为了充分利用低值鱼类的矿质元素，在降解过程中，加入某些螫合剂等，对降解液酸 碱度起缓冲作用。在降解前后，测定p h ，结果如图3 ：降解前基本上都保持在6 8 左 右，降解后，在6 3 6 4 之问，因为所用酶为中性酶，所以对酶的作用发挥影响不大， 且基本保持中性，利于低值鱼中矿物质元素的释放利用。 图3 反应前后降解液酸碱度的变化 2 4 作用时间对降解的影响 在温度、酶添加量为鱼体蛋白含量的8 和固液比为1 ：7 条件下，设定作用时间 1 h 、2 h 、3 h 、4 h 、5 h 、6 h 六个水平，分析降解时间对降解的影响，结果如图4 。 8 5 8 7 5 7 6 5 f i 孬虿 i 氨基酸辛率f l23456 作用时间h 图4 作用时间对鱼蛋白降解的影响 由图4 可看出，在1 4 h 范围内，随着作用时间的增长，氨基酸产率逐渐升高， 在超过4 个小时以后，就有减小的趋势，而渣滓率则是在1 4 h 逐渐降低，超过4 h 后， 有增大趋势，所以，选定最佳作用时间为4 h 。 将试验2 4 所得降解液，选取作用时间分别为2 h 、4 h 、6 h ，进行氨基酸样品分析， 定名为样品a 、b 、c ，分析降解液中氨基酸各组分，讨论降解时问对低值鱼降解液 中氨基酸各成分的影响。成份如表3 ：由结果看出，三种降解液中，氨基酸总量b 样 中最高，且其中吸收效果比较差的氨基酸( 脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸) 所 占百分数最低为2 5 5 ，起抑制作用的氨基酸仅占2 ，均优于样品a 、c 。所以，在 保证氨基酸产率比较高情况下，降解4 h 效果最好。 表3 降解液a 、b 、c 分析氨基酸各组分如下单位( r a g l ) 因此，确定最佳工艺为：t = 5 0 。c ，固液比1 ：7 ，酶添加量为鱼体蛋白的