（麻醉学专业论文）氯胺酮对大鼠慢性神经病理性痛的影响.pdf

目录 i|iill f l iillr f il l l l r l l f lfi i r i l l l y 19 0 1 , 6 i = = h 3 i ih i i 7 i i i i i 中文摘要l 英文摘要o ooooo 4 研究论文氯胺酮对大鼠慢性神经病理性痛的影响 前言- 一”一”6 日l j 舌“一”“一“一“”一”一”一”一”“一”一“”一”一”6 材料与方法o ooooo 6 结果o ooooo 一ooo ooooooooo 一一”一“一“”一”“1 4 附图d o oooooooooo 1 6 附表2 6 讨论o o ooio o ob oo0 2 8 结论o ooooo o00 3 2 参考文献3 2 综j 苤o o oooo ooooo oooo 3 6 致谢0 00 000 一o ooooo 一4 4 个人简历o oo ooo 0oo ooooooooooob o oo 4 5 中文摘要 氯胺酮对大鼠慢性神经病理性痛的影响 摘要 目的：神经病理性疼痛( n e u r o p a t h i cp a i n ) 是由神经系统的损伤或 功能紊乱引起的疼痛( 国际疼痛研究协会) ，临床上常呈慢性状态。慢性 神经病理性痛在临床上十分常见且严重影响着患者的生活质量，但由于其 发病机制非常复杂，所以对慢性神经病理性痛的发病机制与治疗方法的研 究一直是一个重要课题。 氯胺酮因其镇痛强、毒性低的特点被广泛应用于临床麻醉中。慢性神 经病理性痛的发病机制现有多种学说，其中被广泛认可的是中枢敏化机 制，而神经生长相关蛋白( g a p 一4 3 ) 与中枢敏化的形成和疼痛的发生发展 有着非常密切的关系。本实验模拟b e n n e t ta n dx i e 设计的坐骨神经慢性 压迫法( c c i 法) 制备大鼠神经病理性痛模型。通过观察假手术组( c 组) 、 神经病理性痛组( c c i 组) 以及模型制备成功后给予氯胺酮组( k 组) 三 组大鼠的机械缩足反应、神经传导速度、电镜下坐骨神经超微结构以及脊 髓背角g a p 叫3 等指标的的变化，探讨氯胺酮对大鼠神经病理性痛的影响 及其可能的作用机制，以期发现更具针对性的疼痛治疗靶点，为临床治疗 提供理论依据。 方法：雄性成年s d 大鼠7 5 只，体重2 0 0 2 0 9 ，由河北医科大学动 物实验中心提供，随机分为3 组，每组2 5 只：第一组假手术组( 正常对 照组c 组) 仅分离暴露坐骨神经但不结扎；第二组慢性神经病理性痛组 ( c c i 组) 采用c c i 法即坐骨神经结扎的方法制备大鼠的慢性神经病理性 痛模型；第三组氯胺酮组( k 组) 于c c i 模型制备成功后3 - 2 1 天腹腔注 射氯胺酮l o m g k g 。 大鼠神经病理性痛模型的制备腹腔注射1 0 水合氯醛3 0 0 m g k g 将 麻醉大鼠后，参照c c i 法，将大鼠左侧卧位固定于实验操作台上，股部去 毛，切开右下肢股骨中段皮肤，分离肌肉，暴露出右下肢坐骨神经。选择 坐骨神经分支前l c m 主干位置，以4 - 0 铬制羊肠线松扎4 道，间隔l m m ， 以神经外膜轻微受压但不阻断血管为度，打结时可见肢体微微抽动。造模 完成时对侧下肢注射庆大霉素2 万单位预防感染。 中文摘要 三组分别于术前( t 。) ，术后3 天( t 。) 、7 天( t ：) 、1 4 天( t 。) 、2 1 天( t 4 ) 五个时间点，每组随机抽出5 只大鼠，测量其机械缩足反射阈值 ( m e c h a n i c a lw i t h d r a w a lt h r e s h o l d ，m w t ) ；麻醉后暴露大鼠坐骨神经， 测量完神经传导速度( n c v ) 后处死大鼠迅速取材，取出的坐骨神经首先 进行肉眼观察，制成标本后电镜下观察坐骨神经的超微结构；取出的l 。咱 脊髓及背根神经节，利用r t - p c r 法检测g a p 一4 3 蛋白m r n a 的表达水平， 利用w e s t e r nb l o t 技术测定g a p 一4 3 蛋白的表达量。 采用s p s s l 7 0 统计学软件进行分析，计量资料均以均数标准差( x s ) 表示，组内及组间比较采用单因素方差分析，p o 0 5 表示差异具有 统计学意义。 结果： 1 机械缩足反应域值( m w t ) ：大鼠在坐骨神经结扎后均出现跛行、轻 度爪外翻以及舔舐等痛性行为学表现。相比于手术前，c c i 组和k 组于 手术后第3 天到2 1 天各个时间点m w t 均降低( p o 0 5 ) ；相比于c 组，c c i 组和k 组于术后第3 天到2 1 天m w t 均降低( p o 0 5 ) ；相比于c c i 组，k 组m w t 于术后第7 天开始升高( p o 0 5 ) ，直至实验结束。 2 神经传导速度( n c v ) ：相比于手术前，c c i 组和k 组于术后第7 天 到第2 1 天n c v 降低( p 0 0 5 ) ；相比于c 组，从第7 天开始c c i 组和k 组的n c v 降低( p o 0 5 ) ；相比于c c i 组，k 组从第7 天开始n c v 升高 ( p o 0 5 ) 。 3 电镜观察c 组神经结构完整，髓鞘板层规则；c c i 组在第7 天时 髓鞘变薄分层，髓索、微丝、微管变少，1 4 天时髓鞘明显变薄，髓索、 微丝、微管明显变少，甚至出现髓鞘脱落轴突断裂；k 组于1 4 天时情况 开始好转，髓鞘增厚，髓索微丝微管增加，2 1 天时情况明显好转，髓鞘 增厚、板层开始规则出现，髓索、微丝、微管明显增加。 4 大鼠脊髓背角g a p 一4 3 蛋白的表达：与正常对照c 组相比，术后第 3 天开始，c c i 、k 组的g a p 一4 3 蛋白的表达量均增加，且具有统计学意义 ( p o 0 5 ) ；与c c i 组相比，k 组g a p 一4 3 蛋白的表达从第7 天开始降低， 到术后的第1 4 天显著降低，至实验结束时基本恢复至正常水平( p o 0 5 ) ； 大鼠脊髓背角g a p 一4 3 蛋白的m r n a 的变化与g a p - 4 3 蛋白的变化基本一致， 与c 组对比，c c i 、k 组术后各时间点测得的g a p - 4 3 蛋白的m r n a 表达上 中文摘要 调( p o 0 5 ) ，与c c i 组比较，k 组注射氯胺酮后的于第3 、7 、1 4 、2 1 天 均表达下调( p o 0 5 ) 。 结论： 1腹腔注射氯胺酮可有效缓解大鼠的神经病理性痛 2氯胺酮缓解大鼠神经病理性痛的机制可能与其抑制脊髓背角神经 元g a p - 4 3 蛋白的表达上调有关。 关键词：氯胺酮；慢性神经病理性痛；脊髓背角；g a p 4 3 蛋白； r r - p c r ：w e s t e r nb l o t 英文摘要 e f f e c t s0 fi n t r a p e r i t o n e a lk e t a m i n e o nc h r o n i cn e u r o p a t h i c 1 3 a l nl nr a t s a b s t r a c t o b je c t i v e ：a c c o r d i n gt ot h et h ei n t e r n a t i o n a la s s o c i a t i o nf o rt h es t u d y o fp a i n ，i a s p , n e u r o p a t h i cp a i ni st h ep a i nc a u s e db yt h ei n j u r yo rd i s o r d e ro f t h en e r v es y s t e m n e u r o p a t h i cp a i ni sv e r yc o m m o na n dh a dad i r e c ti m p a c t o np a t i e n tq u a l i t yo fl i f e k a t e m i n ei sw i l d l yu s e di nc l i n i c a la n a t h s i a g a p - 4 3i sa s s o c i a t e dw i t h c e n t r a ls e n s i t i z a t i o n c e n t r a ls e n s i t i z a t i o ni sa ni m p o r t a n tf a c t o ro ft h ec h r o n i c n e u r o p a t h i cp a i n t h ep e r s e n ts t u d yc o p i n g t h eb e n n e t ta n dx i e sc c ir a t m o d e li st oe v a l u a t et h ee f f e c t sa n dt h em e c h a n i s mo f i n t r a p e r i t o n e a l k e t a m i n eo nc h r o n i cn e u r o p a t h i cp a i ni nr a t s a n dt h es t u d yc o u l dh e l pf i n d i n g o u tm o r es p e c i f i ct a r g e to ft r e a t m e n tf o rc h r o n i cn e u r o p a t h i cp a i n m e t h o d s ： s e v e n t y f i v e m a l es dr a t s w e i g h i n g2 0 0 - x 2 0 9w e r e r a n d o m l ya s s i g n e d t oo n eo ft h r e e g r o u p s ，t w e n t y - f i v e i ne a c h g r o u p ：g r o u pi ( c ) s h a mo p e r a t i o n ；g r o u pi i ( c c i ) c h r o n i cc o n s t r i c t i o n i n j u r y ；a n dg r o u pi l l ( k ) i n t r a p e r i t o n e a l k e t a m i n e t h ea n i m a l sw e r e a n e s t h e t i z e dw i t hi n t r a p e r i t o n e a l10 c h l o r a lh y d r a t e3 0 0 m g k g t h er i g h t s c i a t i cn e r v ew a se x p o s e da n df o u rl i g a t u r e sw e r ep l a c e di ng r o u pc c ia n dk k a t e m i n elo m g k gw a sg i v e ni n t r a p e r i t o n e a la t3 21 d a ya f t e rs u r g e r yi n g r o u pk 5 0 m e c h a n i c a l w i t h d r a w a lt h r e s h o l d ( m w r ) t ov o nf r e y f i l a m e n ts t i m u l a t i o n 、n e r v ec o n d u c t i o nv e l o c i t y ( n c v ) w e r em e a s u r e db e f o r e ( t 0 ) a n da t3 , 7 ，1 4a n d2 1d a y sa f t e rs u r g e r y ( t i t 4 ) t h ea n i m a l sw e r et h e n k i l l e d ，t h es c i a t i cn e r v ew a se x p o s e dt oo b s e r v et h en e u r oc h a n g e si ng e n e r a l a n da te l e c t r o nm i c r o s c o p yo ft h eu l t r a s t r u c t u r e t h el u m b a rs e g m e n to ft h e s p i n a lc o r dd o r s a lh o r nw a sr e m o v e df o rd e t e r m i n a t i o no ft h ee x p r e s s i o no f g a p - 4 3p r o t e i na n dg a p - 4 3 m r n a r e s u l t s ： 1m e c h a n i c a l w i t h d r a w a lt h r e s h o l d ( m w t ) c o m p a r e dw i t ht o ， 4 英文摘要 t h em w tw a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e da t3 - 21 d a ya f t e rs u r g e r y ( t l - t 4 ) ( p o 0 5 ) ；c o m p a r e dw i t hg r o u pc ，t h em w t w a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e d a t3 - 2 1d a ya f t e rs u r g e r y ( t 1 - t 4 ) ( p o 0 5 ) ；t h em w tw a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e ra tt 2 - t 4i ng r o u pk t h a ni ng r o u pc c i ( p o 0 5 ) 2n e r v ec o n d u c t i o nv e l o c i t y ( n c v ) c o m p a r e dw i t ht o ，t h en c v w a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e da t7 - 21 d a ya f t e rs u r g e r y ( t 2 - t 4 ) ( p 0 0 5 ) ； c o m p a r e dw i t hg r o u pc ，t h en c v w a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e da t7 21d a y a f t e rs u r g e r y ( t 2 一t 4 ) ( p o 0 5 ) ；t h en c vw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e ra tt 2 - t 4i n g r o u pk t h a ni ng r o u pc c i ( p o 0 5 ) 3e l e c t r o nm i c r o s c o p yo b s e r v a t i o nt h en e u r a ls t r u c t u r ew a sr u l e a n di n t e g r i t y ；i ng r o u pc ；i nt h eg r o u po fc c i ，n e u r a la x o n sw e r ef r a c t u r e d ， m y e l i nw a st h i n n i n g ，m i c r o f i l a m e n t sa n dm i c r o t u b u l e sw e r er e d u c e df r o m7t o 21d a y i nt h eg r o u po fk ，m y e l i nw a st h i c k e n i n ga n dl a m e l l a rc h a n g i n gr u l e f r o m1 4t o2 1d a y 4t h e e x p r e s s i o no fg a p - 4 3i ns p i n a lc o r dd o r s a lh o mc o m p a r e d w i t h g r o u pc ，t h ee x p r e s s i o no fg a p - 4 3p r o t e i nw a ss i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e da t3 21d a ya f t e rs u r g e r y ( t l t 4 ) ( p o 0 5 ) ；t h ee x p r e s s i o no f g a p 一4 3p r o t e i nw a sd e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l ya tt 1 一t 4i ng r o u pkt h a ni n g r o u pc c i ( p o 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no fg a p 4 3m r n a i ns p i n a lc o r dd o r s a l h o mw a st h es a m et ot h eg a p - 4 3 p r o t e i n c o n c l u s i o n ： 1 i n t r a p e r i t o n e a lk a t e m i n e h a da ne f f o r to nc h r o n i cn e u r o p a t h i cp a i n i nr a t s 2t h e p o s s i b l em e c h a n i s mo fi n t r a p e r i t o n e a lk a t e m i n ei n h i b i t i n g n e u r o p a t h i cp a i ni sr e d u c i n gt h ee x p r e s s i o no fg a p - 4 3i nt h es p i n a lc o r d d o r s a lh o m k e yw o r d s ：k e t a m i n e ；c h r o n i cn e u r o p a t h i cp a i n ；s p i n a lc o r dd o r s a l h o r n ；g a p - 4 3 ；r t - p c r ；w e s t e r nb l o t 5 研究论文 氯胺酮对大鼠。幔性神经病理性痛的影响 _ 上- j 一 刖吾 疼痛是一种由国际疼痛研究协会定义为与实际或潜在的组织损伤相 关，或以这种损伤形式描述的一种感观和情感的不愉快体验。其中，神经 病理性疼痛是由神经系统损害或功能障碍所导致的疼痛，严重影响患者的 生活质量。因其发病机制的复杂性且缺乏有效的临床治疗，现仍是临床研 究的热点。本实验通过制备慢性神经病理性痛的大鼠模型，观察临床常用 的麻醉性镇痛药物氯胺酮对慢性神经病理性痛的影响，为全面研究神经病 理性痛的发病机制及临床用药治疗提供理论依据。 氯胺酮因其镇痛效能强、毒性较小等特点被广泛应用于i 临床。以往研 究表明氯胺酮能非选择性的与n m d a 受体结合而达到镇痛作用。生长相关 蛋白( g r o w t ha s s o c i a t i o np r o t e i n4 3g a p 一4 3 ) 是一种胞膜磷酸蛋白， 它与神经的发育、轴突生长、突触重建等神经活动密切相关，且与中枢的 痛觉敏化有着非常密切的关系。 本实验采用c c i 模型来模拟大鼠神经病理性神经痛，通过观测痛阈， 神经传导速度及神经形态的变化来研究氯胺酮对大鼠神经病理性痛的影 响，进一步采用r t p c r 、w e s t e r nb l o t 技术，观察脊髓背角g a p - 4 3 蛋白 的表达变化以探讨氯胺酮在神经病理性痛中作用的可能机制。 材料与方法 1 实验动物 健康雄性s d 大鼠7 5 只，体重2 0 0 2 0 9 ，清洁级( 河北医科大学动 物实验中心提供) ，动物实验室室温2 0 - - - 2 5 ，照明周期1 2 2 4 h ，混合饲 料喂养，自由进食水，环境适应一周后开始实验。 2 主要试剂与仪器 2 1 主要试剂 氯胺酮 水合氯醛 江苏恒瑞医药股份有限公司 美国s i g m a 公司 研究论文 庆大霉素 一抗g a p - 4 3 ( w e s t e r nb l o t ) 二抗g a p - 4 3 ( w e s t e r nb l o t ) b a c t i n b c a 蛋白分析试剂盒 e c l 化学发光试剂盒 蛋白m a r k e r 2 2 主要仪器与设备 常规及显微外科手术器械 y o nf r e yh a i r s 动物疼痛行为容器 h 一7 5 0 0 透射电子显微镜 台式高速冷冻离心机 电泳仪 分光光度计 干燥箱 恒温水浴箱 - 8 0 低温冰箱 凝胶图像分析系统 3 实验分组 石家庄欧意药业有限公司 美国s a n t ac r u z 公司 美国s a n t ac r u z 公司 美国s a n t ac r u z 公司 美国p i e r c e 公司 p r o m e g a 公司 p r o m e g a 公司 省三院动物实验室提供 美国s t o e l i n g 公司 北京有机玻璃场 日本日立公司 德国e p p e n d o r f 公司 北京六一仪器厂 美国g e n e 公司 日本s a n y o 公司 江苏太仓医用仪器厂 日本s a n y 0 公司 美国u v p 公诉 健康雄性成年s d 大鼠7 5 只，体重2 0 0 _ 2 0 9 ，分笼饲养自由进食水。 适应性喂养后将大鼠随机分为3 组，每组2 5 只。 假手术组( c 组，n = 2 5 ) ：只分离暴露坐骨神经但不结扎，坐骨神经 结扎后3 2 1 天，每天腹腔注射同等体积生理盐水，做为实验的正常对照 组。 神经病理性痛组( c c i 组，n = 2 5 ) ：通过坐骨神经结扎的方法制备神 经病理性痛模型( c c i 法) ，造模后每天腹腔注射与氯胺酮同等体积的生 理盐水直至取材。 氯胺酮组大鼠( k 组，n = 2 5 ) ：同样通过c c i 法造模，坐骨神经结扎 后3 - 2 1 天，每天腹腔注射氯胺酮l o m g k g n 2 3 ，直至取材。 c 组、c c i 组、k 组大鼠在坐骨神经结扎后的3 天( t 。) 、7 天( t ：) 、 研究论文 1 4 天( t 。) 、2 1 ( t 。) 天五个时间点，每组随机抽取5 只大鼠，测量其m w t ； 麻醉后暴露坐骨神经测量其n c v ，处死后迅速取材，取出的坐骨神经首先 进行肉眼观察，制成标本后电镜下观察坐骨神经的超微结构；取出的l 。喝 脊髓利用r t - p c r 法检测6 a p - 4 3 蛋白m r n a 的表达水平，利用w e s t e r nb l o t 技术测定g a p 一4 3 蛋白的表达量。 4 模型制备 本实验采用的是由b e n n e t ta n dx i e 1 设计的经典坐骨神经慢性压迫 ( c c l ) 法，制备大鼠神经病理性痛模型。腹腔注射1 0 的水合氯醛 3 0 0 m g k g 将大鼠麻醉后，左侧卧位固定于动物操作台上，右侧股部去毛， 在无菌原则下切开右下肢股部皮肤皮下组织，钝性分离肌肉层，暴露右侧 坐骨神经，并轻柔的将其分离，在坐骨神经分支前的l c m 主干处用4 - 0 羊肠线松扎4 道，间隔l m m 左右，结扎线的松紧以保证坐骨神经一周均受 压但不影响血供为宜。结扎时可见右侧小腿肌肉轻度颤抖。生理盐水冲洗 伤口，逐层缝合，对侧下肢肌注庆大霉素2 万单位预防感染。 5 机械缩足反射阈值( m e c h a n i c a lw i t h d r a w a lt h r e s h o l d ，m w t ) 的测定 参照c h a p l a n 等h 1 报道的u pa n dd o w n 方法测定大鼠的m w t 。将大 鼠置于底部为i c m xi c m 金属网的透明有机玻璃箱中，待大鼠适应环境后， 用一系列标准的v o nf r e yh a i r s 刺激大鼠后肢的足底中部，缓慢用力， 若大鼠在受刺激时出现立即的缩足、抬腿、躲避、添爪反应则记为阳性； 若纤维丝弯曲9 0 。仍无反应则记为阴性反应。依据文献选择y o nf r e y h a i r s 的压力值为0 4 1 、o 5 2 、o 8 7 、1 1 6 、2 0 5 、3 6 1 、5 5 0 、8 2 8 、 l o 3 3 与1 6 7 3 9 两次的间隔不应小于3 0 s ，直至出现第一次阴阳性反应的 骑跨，再继续向下连侧4 次。根据d i x o n 晦1 的内推法计算出机械缩足阈值， 其计算公式为：m w t = 1 0 h m6 1 ，其中x f 为最后一次y o nf r e yh a i r s 力度的 l o g 值，6 为相邻y o nf r e yh a i r s 力度的l o g 值差值的平均值，k 为阴性 和阳性反应类型的查表值。 6 神经传导速度( n c v ) 的测定 大鼠麻醉后暴露坐骨神经，使用m e m - 3 1 2 0 型肌电图仪对n c v 进行测 量。两个刺激电级分别固定在神经受压处的两端，记录电极分别固定于腓 肠肌和跟腱处，测量两次诱发电位的时间t 1 与t 2 ，用游标卡尺测量出被 测神经两端的距离d ，根据公式：n c v = d ( t 1 - t 2 ) 计算n c v 。 3 ) r n h 沉淀：将上层水相用移液枪转移到无r n h 酶的离心管中，加 入等体积的异丙醇，混合均匀以沉淀其中的r n h ，混匀后放置- 2 0 c 的冰 箱中2 h ，4 c 下1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n 。r n h 沉淀在离心管的底部和侧壁上 形成胶状沉淀。 4 ) r n h 清洗：移去上清，每l m l t r i z o l 试剂裂解的样品中加入不少 于l m l 的7 5 乙醇以清洗r n h 的沉淀。混合均匀后，4 下1 2 0 0 0 r p m 离心 1 0 m i n 。 5 ) r n a 干燥：小心吸去乙醇溶液，将r n h 沉淀在室温中干燥5 一l o m i n 。 6 ) 溶解r n h 沉淀：加入无r n h 酶的蒸馏水1 0 u l ，用枪反复吹打几次， 使之完全溶解，溶解后的r n h 溶液备用。 研究论文 8 1 2 2r n a 质量检测 1 ) 紫外吸收法测定样品r n a 浓度及纯度：首先用蒸馏水对分光光度 计调零，后将r n a 溶于i o u l d e p c 水中，取其中2 u l 上样，点击软件显示 样品的浓度。r n a 溶液的a 2 6 0 a 2 8 0 比值即为样品r n a 的纯度。 2 ) 变性琼脂糖凝胶电泳的测定：用1 9 琼脂糖溶于i o o m l d e p c 水中配 置的i * t a e 溶液制胶；取l u l r n a 与l u l b u f f e r 缓冲液充分混合，上样前 凝胶须预先电泳5 m i n 。 8 1 2 3 合成样品c d n a 1 ) 反应体系 序号反应物剂量 1 r n a 模板1 - 5 u g 2 o l i g o ( d t )2 u g 3d n t p 2 u g 4n l d t tl u l 5r n a 酶抑制剂0 5 u l 6逆转录4ul 7 s c r i p tm - m l v l u l d e p c 水补足至总体积2 0 u l ，6 0 0 0 r p m 短暂离心。 2 ) 混合液在加入逆转录酶m - m l v 之前7 0 干浴5 m i n ，之后冰水浴至 管内外温度一致，最后加4 7 号反应物4 2 。c 水浴5 0 m i n 。取出后9 5 。c 干 浴3 m i n ，最终的逆转录溶液即为要得的c d n a 溶液，- 8 0 。c 保存。 8 1 2 4 样品的管家基因( g a d p h ) 的p c r 1 ) 反应体系 序号反应物剂量 1 2 * t a qm a s t e r m i x5 u l 2内参上游引物0 5 u l 3内参下游引物0 5 u l 4阳性模板d n al u l 5 d d h 2 03 u l 反应体系的总体积为l o u l ，6 0 0 0 r m p 短暂离心。r tp c r 仪上进行p c r 扩增反应。首先9 4 。c 预变性5 m i n ，之后依照9 4 。c 变性3 0 s 、5 9 。c 退火3 0 s 、 研究论文 7 2 延伸6 0 s 的反应顺序循环3 2 次。 2 ) 以l 琼脂糖凝胶电泳p c r 与d n al a d d e r ，溴乙锭染色，用于检测 p c r 产物是否为单一的特异性扩增条带。 8 1 2 5 样品g a p 一4 3 基因p c r 1 ) c d n a 样品均分别配置实时定量p c r 反应体系 序号反应物剂量 1 2 * t a qm a s t e r m i x 5 u l 2 阳性模板上游引物0 5 u l 3阳性模板下游引物0 5 u l 4 阳性模板d n a l u l 5d d h 2 03 u l 反应体系的总体积为l o u l ，6 0 0 0 r m p 短暂离心。将配置好的p c r 反应 溶液置于r t _ p c r 仪上进行p c r 扩增反应。首先9 4 。c 预变性5 m i n ，之后依 照9 4 变性3 0 s 、5 9 退火3 0 s 、7 2 延伸6 0 s 的反应顺序循环3 2 次。 2 ) 以1 琼脂糖凝胶电泳p c r 与d n al a d d e r ，溴乙锭染色，用于检测 p c r 产物是否为单一的特异性扩增条带。 8 1 2 6r t p c r 合成引物 实验中的目的基因g a p 一4 3 和作为内参的管家基因g a d p h 均由 p r e m i e r5 o 软件自行设计，遵循以下三个基本原则：引物与模板的序列 互补配对；引物与引物之间不形成二聚体或发夹结构；引物不在模板的非 目的位点引发错配。 g a d p h ：上游引物5 - a c c a c c a t g g a g a a g g c t g g 一3 下游引物5 一g g t t t c t t a c t c c t t g g a g g - 3 扩增长度为6 9 8 b p g a p - 4 3 ：上游引物5 一t g c c t g c t g c t g t c a c t g a 一3 下游引物5 一g g c a g g a g a g a c a g g g t t c a 一3 扩增长度为2 5 4 b p 8 1 2 7 电泳 所有样品的目的基因与管家基因均进行r t - p c r 反应。p c r 的产物与 d n al a d d e r 在1 琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，检测p c r 产物是否为 单一的特异性扩增条带。 研究论文 8 2w e s t e r nb l o t 实验 8 2 1 实验取材 三组大鼠分别于术前一天、术后3 天、7 天、1 4 天、2 l 天取材。大 鼠1 0 水合氯醛3 0 0 m g k g 麻醉满意后，将大鼠置于冰板上，依照无菌原 则进行操作。迅速取出l 。咱节段脊髓及背根神经节，置于液氮中， - 8 0 。 低温冰箱中保存。 8 2 2 实验步骤 8 2 2 1 提取总蛋白 1 ) 把保存于液氮中的脊髓和背根神经节标本快速取出，在研钵中研 碎，为防止蛋白 升温变性研磨同时应加入液氮。 2 ) 加入遇冷的r i p a 裂解液到匀浆器中行匀浆，之后加入蛋白酶抑制 剂p m s f ，然后放在冰上。 3 ) 数分钟后再次研磨，使标本组织尽可能碾碎。 4 ) 充分裂解30m i n 后将裂解液移至1 5 m l 离心管中，4 下 1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，离心后的上清液即为总蛋白溶解液，一8 0 。c 保存。 8 2 2 2b c a 法测定总蛋白浓度 1 ) 将蛋白分析液a 、b 按体积5 0 ：1 混合为c 液。 2 ) 用p b s 将试剂盒中浓度为2 m g m l 的标准浓度蛋白稀释为 0 2 5 u g m l 、1 2 5 u g m l 、5 0 0 u g m l 、 l m g m l 、2 m g m l 六种浓度备用。 3 ) 将己制备好的蛋白溶解液与p b s 按体积1 ：4 混合备用。 4 ) 在微孔板中依次加入p b s 、稀释后的标准浓度蛋白和蛋白分析液c 液。 5 ) 与酶标仪中的5 7 0 n m 比色，得出标准浓度蛋白和预测样本蛋白的 o d 值，绘制o d 值一蛋白浓度标准曲线，依据标准曲线由o d 值计算样本中 的总蛋白浓度。 8 2 2 3s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 ) 配置4 的积层胶和1 0 的分离胶。 2 ) 测完蛋白含量后，计算含3 0 u g 蛋白的溶液体积为上样量。 3 ) 用微量移液器吸取等量的己变性的待侧蛋白质样品，把样品缓慢注 研究论文 入样品孔中，将蓝色预染蛋白质m a r k e r 加入对照孔。 4 ) 先将电压设定5 0 v 进行电泳，当溴酚蓝到达积层胶和分离胶的交界 处时将电压改为l o o v 电泳，至溴酚蓝到达分离胶底部便可终止电泳，进 行下一步的转膜。 8 2 2 4 转膜 1 ) 剪好与凝胶块大小相同的滤纸和1 张p d v f 膜，用转移缓冲液自 下向上潮湿，置于水上浸2 小时。 2 ) 按阴极一滤纸一凝胶一p v d f 膜一滤纸一阳极的顺序叠放。 3 ) 将转膜槽放入冰盒内，电转移一般采用l o o v 稳压，大约3 h 可将 蛋白转移到p v d f 膜上。 4 ) 转膜完毕后取出p d v f 膜，然后在电泳缓冲液中漂洗可能粘附的 凝胶，晾干备用。 8 2 2 5g a p - 4 3 蛋白检测 1 ) 将p d v f 膜用t b s t 液冲洗三次，放于干净平皿中，加浸过p d v f 膜 的封闭液，室温下封闭1 小时。 2 ) 封闭结束后，加入兔抗g a p 一4 3 一抗，鼠抗b - a c t i n 一抗( 1 ：1 0 0 0 稀释) ，4 下过夜。 3 ) 次日，t b s t 液冲洗三次，将p d v f 膜转至另一平皿中，加入辣根过 氧化物酶标记的羊抗兔二抗( 1 ：4 0 0 0 0 稀释) 和鼠抗0 - a c t i n 二抗( 1 ： 5 0 0 0 稀释) ，室温孵育3 小时 4 ) 将e c l 化学发光试剂盒中的a 液与b 液等体积混合，放到p d v f 膜上，把膜蛋白面朝下与混合液充分接触l m i n 后，用滤纸使膜快速干燥， 在暗室中将膜置于x 线暗盒中，完成曝光。 9 图像采集与分析 r t - p c r 和w e s t e r nb l o t 的图像均采用u v p 凝胶成像系统进行采集， 使用q u a n t i t yo n e 4 6 软件进行图像的分析。g a p 一4 3m r n a 的表达量用目 的片段的光密度值( o d ) 与内参g a p d ho d 值的比值来表示。g a p 一4 3 蛋白 的表达量用目的片段的光密度值( 0 d ) 与内参b - a c t i no d 值的比值来 - - - 。o 表不。 1 0 统计学处理 采用s p s s l 7 0 统计学软件进行分析，计量资料均以均数标准差( x 研究论文 s ) 表示，组内及组间比较采用单因素方差分析，p o 0 5 表示差异具有 统计学意义。 结果 1 神经病理性痛大鼠的行为学变化 1 1 一般情况 c 组大鼠健康状况良好，无任何不良反应；c c i 组大鼠在坐骨神经结 扎后一般情况尚可，术后1 天出现跛行，结扎侧足趾卷曲、足外翻等疼痛 行为学表现。术后3 天情况更为明显。术后7 天出现明显的舔舐患侧肢体 及甩足显现，术后1 4 天可见肌肉萎缩；k 组在坐骨神经结扎后同样出现 跛行、足外翻、边缘着地、着地时间短，给药后，以上情况明显好转，术 后7 天没有出现明显的舔舐和甩足行为，肌肉萎缩不明显。 1 2 机械缩足反射阈值( m e c h a n i c a lw i t h d r a w a lt h r e s h o l d ，m w t ) 大鼠在坐骨神经结扎后均出现跛行、轻度爪外翻以及舔舐等痛行为学 表现。相比于手术前，c c i 组和k 组从手术后第3 天到2 1 天各个时间点 机械缩足反射阈值( m w t ) 均降低( p o 0 5 ) ；相比于c 组，c c i 组和k 组从 术后第3 天到2 1 天各时间点m w t 均降低( p o 0 5 ) ；相比于c c i 组，k 组 的机械痛域从术后第7 天开始升高( p o 0 5 ) 。 2 神经传导速度( n c v ) 相比于手术前，c c l 组和k 组于术后第7 天到第2 1 天各个时间点神 经传导速度( n c v ) 降低( p 0 0 5 ) ；相比于c 组，从第7 天开始c c i 组和 k 组的n c v 降低( p o 0 5 ) ；相比于c c i 组，k 组从第7 天开始n c v 升高 ( p o 0 5 ) 。 3 坐骨神经的形态学变化 3 1 肉眼观察 c 组神经表面光滑、无充血水肿、与周围组织无粘连；c c i 组术后3 天神经出现充血水肿，到术后1 4 时尤为明显，且与周围组织发生明显的 粘连；k 组给药后、术后第7 天神经充血水肿减轻，1 4 天时明显减轻。 3 2 电镜观察 c 组神经结构完整，髓鞘板层规则；c c i 组7 天时髓鞘变薄分层，髓 研究论文 索、微丝、微管变少，1 4 天时髓鞘明显变薄，髓索、微丝、微管明显变 少，甚至出现髓鞘脱落轴突断裂；k 组1 4 天时情况开始好转，髓鞘增厚， 髓索微丝微管增加，2 1 天时情况明显好转，髓鞘增厚、板层开始规则出 现，髓索、微丝、微管明显增加。 4 脊髓背角g a p - 4 3 蛋白的表达 4 1w e s t e r nb l o t 实验 与正常对照的c 组相比，术后第3 天开始，c c i 、k 组的g a p 一4 3 蛋白 的表达量均增加，且具有统计学意义( p o 0 5 ) ；与c c i 组相比，k 组g a p - 4 3 蛋白的表达从给药后第3 天开始降低，到术后的第7 天显著降低( p o 0 5 ) ， 至实验结束时已接近正常水平。 4 2r t p c r 实验 大鼠脊髓背角g a p 一4 3 蛋白的m r n a 的变化与g a p - 4 3 蛋白的变化基本 一致，与c 组对比，c c i 、k 组术后各时间点测得的g a p - 4 3 蛋白的m r n a 表达上调( p o 0 5 ) ，与c c i 组比较，k 组于注射氯胺酮后的第3 、7 、1 4 、 2 1 天均表达下调( p o 0 5 ) 。 研究论文 附图 f i g 1 t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yo fg r o u pc ( m a g n i f i c a t i o n 2 0 k ) f i g 2 t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yo f g r o u pc c i a t7d a y ( m a g n i f i c a t i o n 30 k ) 1 6 f i g 4 t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r