（特种经济动物饲养专业论文）茶树根际促生细菌的研究.pdf

摘要植物根际微生物是植物根际微环境中的重要生物类群，对植物生长发育具有明显的影响，本研究利用选择性培养基，对不同茶园根际微生物进行了分离，研究了茶树根际细菌、真菌、放线菌的数量变化：运用选择性培养基对根际固氮、解磷和解钾细菌进行了筛选，运用生物学方法对具产植物激索潜能的促生细菌和植物病原真菌拮抗细菌进行了筛选，对细菌分离物进行了鉴定；对一株植物病原真菌拮抗细菌的抗菌物质进行了分离、纯化并研究了其部分理化性质。主要结果如下。1 土壤肥沃的茶园根际细菌的数量最大，土壤贫瘠的茶园数量最小；相同土壤肥力的茶园，1 0 年生茶园根际细菌的数量最大，4 年生的次之，2 0 年生的最小；根际真菌的数量，土壤肥沃茶园的较小，中等和贫瘠茶园的较大。根际放线菌的数量，2 0 年生茶园的明显高于4 年和1 0 年生茶园的，而且，土壤贫瘠茶园的数量较大。相同肥力的土壤中，固氮菌的数量随茶龄的增加而减少，但减少的幅度以贫瘠土壤最大；解磷和解钾细菌也显示了随茶龄的增加数量减少的趋势，但肥沃土壤中，茶树达到1 0 年时减少的幅度不明显，2 0 年生茶树急剧减少；中等和贫瘠土壤中茶龄达到1 0 时便明显减少。相同茶龄的土壤中固氮菌的数量随土壤肥力的降低而减少；在4 年生茶园里，解磷和解钾细菌的数量与土壤肥力关系不大：在1 0 年生茶园里，随肥力的降低而减少；在2 0 年生茶园里，随土壤肥力降低而有所增加。2 从茶树根际中获得产植物激素纯化细菌分离物3 个，固氮细菌纯化分离物1 0 个，解磷细菌纯化分离物8 个，解钾细菌纯化分离物2 个，筛选获得对多种植物病原真菌具有较强拮抗作用的细菌1 株。3 对分离的茶树根际促生细菌经培养特征观察、生理生化指标测定，鉴定结果为编号n 4 2 、n 5 0 、n 8 0 、n 1 1 9 的分离物属于拜叶林克氏菌属i v( b e i j e r i n c k i a ) ，n 4 6 、n 4 9 的分离物属于氮单胞菌属( a z o m o n a s ) ，n 1 0 7 、n 1 5 2 的分离物属于黄色杆菌属( x a n t h o b a c t e r ) ，n 1 2 0 、n 1 1 5 的分离物属于固氮菌属( a z o t o b a c t e r ) ：p 5 4 、p 1 2 1 、p 1 2 6 、p 1 2 9 的分离物属于假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) ，p 3 8 、p 5 5 、p 1 2 4 、p 1 2 7 、k 4 4 、k 4 6 的分离物属于芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) ，p g 7 的分离物属于假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) ，p g 2 0 的分离物属于土壤杆菌( a g r o b a c t e r i u m ) ，编号p g 3 6 的分离物属于芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) ；a 9 5 的拮抗细菌经培养特征观察、生理生化指标测定、1 6 s r d n a 碱基序列测定和同源性分析，鉴定其为圆孢芽孢杆菌( b a c i l l u sg l o b i s p o r u s ) ，定名为b a c i l l u sg l o b i s p o r u sa 9 5 ，g e n eb a n k 注册号为a y 2 9 2 9 8 9 。4b a c i l l u sg t o b 卸o , - u sa 9 5 菌株发酵液经硫酸铵沉淀、s e p h a d e xg - 1 0 0柱层析、d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w 柱层析、s e p h a d e xg 一5 0 层析、真空冷冻干燥，获得纯化抗菌蛋白，经s d s p a g e 测定其分子量为4 0 7 k d ，经稳定性检测表明该蛋白在1 0 0 条件下煮沸5 5 r a i n 仍具有拮抗活性，对胰蛋白酶、蛋白酶k 不敏感，对氯仿较敏感，对于较大范围的p h 值变化不敏感。关键词：茶；根际微生物；根际促生细菌；抗菌蛋白；纯化vs t u d i e so hp l a n tg r o w t h - p r o m o t i n gr h i z o b a e t e r i ao ft e ar h i z o s p h e r es u n h a i x i n( f o r e s t r yc o l l e g e ，s h a n d o n ga g r i c u l t u r eu n i v e r s i t y )a b s t r a e tr h i z o s p h e r em i c r o b e si sa ni m p o r t a n tb i o l o g i c a lg r o u pi nr h i z o s p h e r em i c r o e c o l o g yw h i c hg r e a t l yi m p a c t e do np l a n tg r o w t h i nt h i ss t u d y ,r h i z o s p h e r em i c r o b e sw e r ei s o l a t e dt h r o u g hs e l e c t i v em e d i u r a ，q u a n t i t ya n a l y s i so fr h i z o s p h e r eb a c t e r i a , f u n g i ，a c t i n o m y e e si nd i f f e r e n tt e ap l a n t a t i o nw e r ec o n d u c t e d a z o t o b a c t e r , p h o s p h o b a c t e r i aa n db a c i l l u sm u c i l a g i n o s u sw e r es e l e c t e dt h r o u g hs e l e c t i v em e d i u m s o m ep l a n tg r o w t h p r o m o t i n gr h i z o b a c t e r i ao ft e ar h i z o s p h e r ew e r es e l e c t e db yb i o l o g i c a lm e t h o da n dw e r ei d e n t i f i e df u r t h e r , w h i c hw e r es u p p o s e dt ob ew i t ht h ep o t e n t i a lo fs e c r e t i n gp l a n th o r m o n eo rt ob ew i t hs i g n i f i c a n ta n t i b i o t i ca b i l i t ya g a i n s tp l a n tp a t h o g e n y o n es t r a i na n t i b i o t i cm a t e r i a lw a sp u r i f i e da n di t sp h y s i c o - - c h e m i c a lq u a l i t i e sw e r es t u d i e d t h er e s u h sa sf o l l o w i n g 1 ，r i c ht e ap l a n t a t i o ns o i l sh a dh i g h e rr l f i z o s p h e r em i c r o b ep o p u l a t i o nd e n s i t i e st h a np o o rt e ap l a n t a t i o ns o i l s i nt h et e ap l a n t a t i o n so fs i m i l a rf e r t i l i t y ,t h ep o p u l a t i o nd e n s i t yo fr h i z o s p h e r eb a c t e r i av a r i e dw i t hc u l t i v a t i o na g eo ft h ep l a n t a t i o n s ，f o l l o w i n gap a t t e r no f1 0y e a r 4y e a r 2 0y e a r t h ep o p u l a t i o nd e n s i t yo f r h i z o s p h e r ef u n g ii nr i c ht e ap l a n t a t i o n sw a sm o r et h a nt h a ti nn o r m a la n dp o o rt e ap l a n t a t i o n s t h ep o p u l a t i o nd e n s i t yo fa c t i n o m y c e si n2 0y e a r so l dt e ap l a n t a t i o n sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti n4o r1 0y e a ro l dt e ap l a n t a t i o n s ；a n dm o r e o v e gp o o rt e ap l a n t a t i o ns o i l sh a dt h eg r e a t e s tp o p u l a t i o nd e n s i t yo f a c t i n o m y c e s v ii nt h es a m ef e r t i l i t ys o i l ，t h ep o p u l a t i o no fa z o t o b a c t e rb e c a m es m a l l e rw i t ht h et e aa g ei n c r e a s e ，e s p e c i a l l yi np o o rs o i l p h o s p h o b a c t e r i aa n db a c i l l u sm u c i l a g i n o s u ss h o w e dt h es a m et r e n d a st os a m et e aa g e ，t h ep o p u l a t i o no fa z o t o b a c t e rb e c a m es m a l l e rw i t ht h es o i lf e r t i l i t yd e c r e a s e i n4y e a r s t e ap l a n t a t i o n ，t h ep o p u l a t i o no fp h o s p h o b a c t e r i aa n db a c i l l u sm u c i l a g i n o s u sh a dn oa p p a r e n t l yr e l a t i o n s h i pw i t hs o i lf e r t i l i t y ；i n1 0y e a r s t e ap l a n t a t i o n ，t h a to ft w ok i n d so fb a c t e r i ad e c r e a s e dw i t ht h es o i lf e r t i l i t yd e c r e a s e ；i n2 0y e a r s t e ap l a n t a t i o n ，h o w e v e r , t h a to ft w ok i n d so fb a c t e r i ai n c r e a s e dw i t ht h es o i lf e r t i l i t yd e c r e a s e 2 ，i nt h i se x p e r i m e n t ，3s t r a i n sw i t ht h ep o t e n t i a la b i l i t yo fs e c r e t i n gp l a n th o r m o n e ，1 0a z o t o b a c t e rs t r a i n s ，8p h o s p h o b a c t e r i as t r a i n s ，2b a c i l l u sm u c i l a g i n o s u ss t r a i n sa n d1a n t i b i o t i cs t r a i nw e r es e l e c t e d 3 ，b yc e l lf o r m ，c o l o n yo b s e r v a t i o na n dt h eb i o c h e m i c a la n a l y s i s ，n 4 2 ，n 5 0 ，n 8 0a n dn 1 1 9w e r ei d e n t i f i e da sb e i j e r i n c k i a ；n 4 6a n dn 4 9w e r ei d e n t i f i e da sa z o m o n a s ；n 1 0 7a n dn 1 5 2w e r ei d e n t i f i e da sx a n t h o b a c t e r ；n 1 2 0a n dn 1 1 5w e r ei d e n t i f i e da sa z o t o b a c t e r ；p 5 4 ，p 1 2 1 ，p 1 2 6 ，p 1 2 9a n dp g 7w e r ei d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a s ；p 3 8 ，p 5 5 ，p 1 2 4 ，p 1 2 7 ，k 4 4 ，k 4 6a n dp g 3 6w e r ei d e n t i f i e da sb a c i l l u s ，p g 2 0w e r ei d e n t i f i e da s a g r o b a c t e r i u m ；b yc e l lf o r ma n dc o l o n yo b s e r v a t i o n ，b i o c h e m i c a la n a l y s i sa n d1 6 s r d n ab l a s t , a 9 5w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u sg l o b i s p o r u s ，g e n eb a n ka c c e s s i o nn u m b e ri sa y 2 9 2 9 8 9 4 ，a 9 5c u l t u r ew a sc o n c e n t r a t e db ya m m o n i u ms u l p h a t e ，c o l u m nc h r o m a t o g r a p h yo ns e p h a d e xg 1 0 0 ，d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o wa n ds e p h a d e xg - 5 0 a n dw h a t sm o r e ，a n t i b i o t i cp r o t e i nw a sp u r i f i e da n dd e t e c t e dm o l e c u l a rw e i g h t sa s4 0 7 k db ys d s p a g e t h i sp u r i f i e dp r o t e i nv i ii si n s e n s i t i v et oh e a t ，r e s i s t a n tt ot r y p i n ，p r o t e i n a s ek ，h o w e v e r , i ti ss e n s i t i v ec h l o r o f o r m i t sp ha c t i v er a n g ew a sw i d ef r o m4 0t o1 1 0 k e yw o r d s ：t e a ，r h i z o s p h e r em i c r o b e s ，p g p r ，a n t i b i o t i cp r o t e i n ，p u r i f i c a t i o nv i i l关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密屠应遵守此规定。论文作者签名：蝴导雌名：雄7 形日期：英文缩略表缩写英文中文说明p g p rp l a n tg r o w t h - p r o m o t i n gr h i z o b a c t e r i a植物根际促生细菌i s rl bs d si n d u c e ds y s t e m a t i cr e s i s t a n c e诱导系统抗性l b 培养基s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠t e m e dt e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e四甲基乙二胺p b sp c ra pp h o s p h o r i ca c i db u f f e rs a l t磷酸缓冲液p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应a m m o n i u mp e r s u l f a t e。过硫酸铵p a g ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i sn c b in a t i o n a lc e m e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o ni x聚丙烯酰胺凝胶电泳美国国家生物技术信息中心山东农业大学硕士论文1 前言1 1 植物根际( r h i z o s p h e r e ) 和根际微生物植物根际( r h i z o s p h e r e ) 是指生物和物理特性受到植物根系影响的紧密环绕根的区域。这一概念首先于1 9 0 4 年由德国微生物学家l o r e n zh i l t n e r 采用，用以描述豆科植物根系与细菌的特殊关系，植物根际的微生物丰富而活跃，构成了根际特有的微生物区系1 根际微生物以细菌为主，根据根际细菌( r h i z o b a c t e r i a ) 对植物的作用可分为有益( 2 8 ) 、有害( 8 1 5 ) 和中性( 8 0 9 0 ) 三类( 陈晓斌等，2 0 0 0 ) 3 1 ；根际细菌中多为革兰氏阴性无芽孢杆菌，革兰氏阳性无芽孢杆菌和球菌、多形态杆菌、芽孢菌较少。根际细菌中存在着大量能运动的细菌、产色素的细菌以及分解淀粉和蛋白质、氮化、硝化、糖酵解、纤维素分解细菌，如假单胞杆菌属、黄杆菌属、产碱菌属和土壤杆菌属的一些种类( k a t z n e l s o nh ，1 9 6 5 ) 【9 0 】。1 2 植物根际促生细菌( p l a n tg r o w t h p r o m o t i n gr h i z o b a c t e r i ap g p r )1 9 7 8 年k l o e p p e r 和s c h r o t h 在马铃薯上首先提出了p g p r 的概念。现已报道的具有促生功能的菌属如土壤杆菌属( k e r r a ，1 9 7 2 ；m o o r el w ，1 9 7 9 ) 【9 7 】、产碱杆菌属( e l a dy ，1 9 8 7 ：y u e n g y ，1 9 8 6 ) 7 9 1 1 6 】、节杆菌属( k 1 0 c p p e rj w ，1 9 8 6 ) 9 3 、固氮杆菌属( m e s h r a ms v = ，1 9 9 2 ) 9 6 1 、芽孢杆菌属( b r o a db e n dm e ，1 9 7 7 ；f a u l l e ，1 9 7 9 ) 7 5 1 【80 1 、欧文氏菌属( s n e h b ，1 9 8 4 ) 1 0 7 1 、假单胞菌属( h o w e l lc r ，1 9 8 0 ：m a l i nh u l t b e r g ，1 9 9 8 1w e l l e rd m 等，1 9 8 6 ) 【8 5 】 9 5 】 u s l 、黄单胞菌属( c h e n w ，1 9 8 7 ) 【7 6 增。有研究证明p g p r 广泛存在于植物根系中，据不完孙海新：茶树根际促生细菌的研究全统计，包括假单胞杆菌属和芽孢杆菌属在内的2 0 多个菌属具有防病促生潜能( o s u l l i v a n d j 等，1 9 9 2 ) 1 0 l 】。1 3p g p r 的主要作用1 3 1 促进植物的种子萌发、营养生长、结实及提高作物产量七十年代初就有实验证明用p s e u d o m o n a ss p 处理劣质黄瓜种子可提高发芽率，一些菌株处理后的大豆和油菜种子，在寒冷的土壤条件下发芽率显著提高，促进豆类作物的早期营养生长( ajc a t t e l a n 等，1 9 9 9 ) 【6 9 】【1 1 叭。有报道表明促生细菌能够对许多农田植物产生促生作用，如促进小麦株高的伸长、地上部干重及总干重的增加( 王平等，1 9 9 9 ；j j g e r m i d a 等，1 9 9 6 ) c 4 7 8 8 】；增加烟草幼苗、幼苗叶鲜重、根重和烟叶中p 、k 的含量及其株高( 顾金刚等，2 0 0 2 ) 1 8 ；促进水稻的生长和发育，调控光合产物在源、库中的分配，促进水稻籽粒乳熟初期库的建成，从而有助于丰产丰收( 吕泽勋等，1 9 9 9 ；吕泽勋等，2 0 0 0 ；吕泽勋等，2 0 0 0 ；丘明祺等，2 0 0 2 ；沈德龙等，2 0 0 2 ；s a m i n am e h n a z 等，2 0 0 1 ) c 3 2 3 3 】【3 4 】 3 8 】【4 ”c t 0 4 ，而且，试验也表明p g p r 有利于经济型林木的育苗、生长，有助于提高林木的质量，通过丰富的代谢活动，增加土壤的肥沃程度，达到合理利用森林资源的目的( 胡炳福等，1 9 9 6 ：李永吉等，1 9 9 6 ；杨承栋，1 9 9 8 ) 2 1 1c 2 4 1 56 1 。1 3 2p g p r 的防病作用利用微生物的拮抗作用控制病害的方法避免了化学药物对人、畜的副作用，直接减少了环境污染，长久以来受到人们重视，研究表明根际细菌中存在对水稻、棉花以及观赏性植物的病原真菌具有显著拮抗作用的根际拮抗细菌( 陈双雅，2 0 0 3 ；丁之铨等，2 0 0 1 ；孙宵璐，1 9 9 9 ) c 2 1c 1 1 4 2 1 ，而且也有一些菌株对烟草病原线2山东农业大学硕士论文虫等具有较强抑制或拮抗作用甚至杀灭作用( 付艳平等，1 9 9 9 ：顾金刚等，2 0 0 1 ) 1 5 1 1 7 】。不同土壤类型中的不同植物具有相对稳定的根际微生物种群，植物、微生物、土壤三者之间具有相互的影响( m s h i s h i d o 等，1 9 9 8 ) 9 8 ，人们对病害的生物防治从单纯的依靠具有拮抗性的微生物抑制或消灭有害微生物发展到借助多种微生物或多种因素来拈抗多种病原微生物，或者创造一个有利于寄主生长和有益微生物的繁殖而不利于病原微生物繁殖和扩展的生态环境，从而实现控制病害发生与蔓延的目的( 蔡学清等，2 0 0 3 ；陈秀蓉等，2 0 0 2 ；何惠琴等，2 0 0 2 ：b h a v d i s h n j o h f i 等，2 0 0 3 ；i m r a n a s i d d i q u i 等，2 0 0 2 ：sr o s e 等，2 0 0 3 ) 【1 】【4 】【2 0 1 1 7 3 】1 8 6 1 0 8 。随着分子生物学理论和基因重组技术的不断发展，通过分子生物学手段改造从自然界筛选的野生型根际促生细菌，使有益菌株促进作物生长、生物固氮、降解污染物及防治病虫害的生物功能得到大幅度增强成为根际促生细菌新的研究热点，而且通过研究其根际定殖情况表明，多数根际细菌保留着野生型菌株所特有的强定殖力，生物学功能和遗传性稳定性( 王平等，1 9 9 8 ；胡小加等，1 9 9 9 ；龙伟文等，2 0 0 0 ；莫才清等，1 9 9 7 ；王平等，1 9 9 7 ；王平等，1 9 9 6 ；吕泽勋等，2 0 0 1 ：朱栋华等，2 0 0 3 ) 【2 2 】 2 9 f 3 l 】 3 6 1 1 4 8 】 4 9 】 5 0 】 6 2 】 5 8 】。1 4p g p r 的作用机制1 4 1p g p r 促进作用生长、增加产量首先，根际促生细菌通过分泌植物生长调节剂促进植物的生长，在假单胞菌、枯草杆菌等5 0 个种中发现有4 0 多个种产生植物生长激素，2 9 个种产生赤霉素，4 5 个种产生激动素。荧光假单孙海新：茶树根际促生细菌的研究胞杆菌产赤霉素、青霉素，部分产吲哚乙酸，维生素。恶臭假单胞菌分泌吲哚一3 一乙酸、吲哚一3 一乳酸、赤霉素等( 李明，2 0 0 1 ) 2 3 1 。大量的报道表明假单胞菌属是植物根际微环境中产植物生长调节剂的主要菌属( la s g h a r 等，1 9 9 6 ；h o n gx i ej j 等，1 9 9 6 ；i n e seg a r c i ad es a l a m o n e 等，2 0 0 1 ) 1 3 8 】1 8 4 】 8 7 ，一些编码生长激素的基因，如赤霉素及其前体物质的基因也已相继被克隆( c h u m x i aw a n g 等，2 0 0 0 ；p e t e rvm i n o r s k y ，2 0 0 4 ；s a l e h u z z a m a ns h a h ，1 9 9 8 ) 1 7 8 1 0 3 1 0 s 。其次，根际促生细菌有利于农田污染物的降解，研究表明，根际促生细菌对三氯乙烯、芳香族化合物及除草剂有降解作用，如谷胱甘肽转移酶在革兰氏阴性菌若干属中存在，尤其在肠杆菌科和假单胞菌属中的一些种，通过谷胱甘肽的结合作用除去除草剂中的氯，除此之外有利于土壤中难溶性物质的分解，一些细菌的固氮作用表明p g p r 可增加植物的生物固氮量，提高植物蛋白质含量和植物产量( h b e r t r a n d 等，2 0 0 1 ；rd et r o t h 等，1 9 9 6 ；v l a d i m i rk c h e b o t a r 等，2 0 0 1 ) 【8 3 】 1 0 2 】【l l3 1 。一些根际芽孢杆菌、黄单胞杆菌、假单胞菌等由于具有溶解土壤中的难溶性磷的作用从而利于植物吸收、增加植物养分的能力( a v i v a s ，2 0 0 3 ；j r d ef r e i t a s 等，1 9 9 7 ) 【7 2 】 8 9 1 。1 4 2p g p r 的抗病机制1 4 2 1 竞争和定殖优势微生物之间的竞争作用包括两个方面，即营养竞争和位点竞争，在作物根系表面存在一些部位，根及种子的分泌物较多，水分湿度大，适合细菌生长和繁殖的有利位点，p g p r 可以抢先占领这些位点，有效地利用根围营养和分泌物，减少了病原菌所必4山东农业大学硕士论文需的营养物质；或者占据生态位点阻止和降低了有害菌在这些位点地建立。荧光假单胞杆菌作为种群最大，最具有应用前景的p g p r 菌属，由于具有生长快、侵入性定殖的特点，这些菌株非常适合与土壤接种，在根围能迅速繁殖，通过竞争发挥生防作用，单就这一特征，已被认为是其防病机制之一，通过比较对小麦全蚀病具有拮抗作用的荧光假单胞杆菌及其抗生素缺失突变体对小麦全蚀病的抑制作用，表明单纯抗生素起的作用很小，营养和位点竞争才是发挥生防作用的关键( 陈晓斌等，2 0 0 0 ) 3 1 。1 4 2 2 铁载体( s i d e r o p h o r e s ) 的作用铁载体是微生物产生的一种对f e 3 + 具有超强络合力的低分子量有机化合物，多为八面体构型。其生物合成受外界f e 3 + 的含量的影响，可在细胞内精细的调节。其功能是向微生物提供铁素养分。不同的微生物产生的铁载体主要基团相同，均为异羟酸或邻苯二酸的衍生物。铁载体产量丰富的根际细菌在与不能产生铁载体或者产生较少的有害微生物竞争铁元素养分时占有优势，进而抑制有害微生物在根际的生长和繁殖并表现出生防作用( 王平等，1 9 9 4 ；丁延芹等，2 0 0 1 ) 4 6 】【1 0 】。1 4 2 3 抗生作用从自然界中筛选具有抗生作用的菌株一直都是生物防治的重点内容，目前报道的拮抗菌株主要集中在芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌等属中( 崔林等，2 0 0 3 ；范青等，2 0 0 1 ：郭坚华等，2 0 0 1马平等，1 9 9 8 ；邱清华等，2 0 0 2 ；王占武等，1 9 9 9 ：辛玉成等，1 9 9 9 ；赵新华等，2 0 0 1 ；郑爱萍等，2 0 0 3 ) 6 1 3 1 1 9 】 3 5 1 3 9 1 5 1 【5 5 】【6 3 】惭】，这些菌属的钿菌能够分泌蛋白类抗菌物质或者非蛋白类抗菌孙海新：茶树根际促生细菌的研究物质如吩嗪、2 ，4 - 二乙酰腾黄酚、硝吡咯菌素等，而且生长迅速，适应性强，能够利用自然界中广泛存在的各种有机物，具有广阔的应用前景( 戴晓燕等，1 9 9 9 ：范青等，2 0 0 1 ；潭周进等，2 0 0 3 ；郑爱萍等，2 0 0 2 ) 1 4 】【4 3 】【6 6 1 。1 4 2 4 诱导系统抗性( i n d u c e ds y s t e m a t i cr e s i s t a n c e 简称i s r )近年来，对于p g p k 的作用机理的深入研究逐渐表明，除了竞争作用和拮抗作用以外，p g p r 诱导产生的系统抗性是又一重要方面。i s r 就是利用生物或者非生物因子处理植物，使之形成的物理的或者化学的防御障碍，从而产生的抗性。例如，一些芽孢杆菌可以分泌低分子量的丁二醇类物质从而诱导植物高表达量产生茉莉酸及水杨酸类物质，从而有效降低由欧文氏菌引起的软腐病( c h o o n g m i nr y u ，2 0 0 4 ) 7 7 l ，t a n u j as i n g h 等利用荧光假单胞菌诱导c h i c k d e a 对c h a r c o a lr o t 的抗性进行生物防治( t a n u j as i n g h ，tkj a n a ，d i l l pk a r o r a ，2 0 0 0 ) i 0 9 ：vks h a r m a 和jn o w a k 等利用荧光假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p )p s j n 处理番茄种子诱导对立枯病害害的诱导系统抗性( vks h a r m a ，jn o w a k ，1 9 9 8 ) 】；也有人研究发现在土壤中加入荧光假单胞菌p s f l u o r e s c e n sc h a o 可以产生h c n 从而使烟草产生对烟草坏死病毒的诱导系统抗性，在拟南芥中该菌株同样可以诱导植株产生对p e r o n o s p o r ap a r a s i d c a 的系统抗性。杨海莲等将阴沟肠杆菌( e n w r o b a c 把rc l o a c a 曲和争论产碱菌似l c a l i g e n e sp a r a d o x u s ) 作为诱导子处理孕穗期的水稻叶片来诱导水稻对自叶枯病抗性并且认为它们对水稻白叶枯病的诱导能力与脂氧合酶( l o x ) 、过氧化物酶口o d ) 和苯丙氨酸酶( p a l ) 的活性有关( 秦国政，+ 2 0 0 3 ；杨海莲等，1 9 9 9 ；a n n a l i s ai a v i c o l i ，山东农业大学硕士论文2 0 0 3 ) 3 7 1 1 5 7 【7 ”，高效液相色谱( h p l c ) 检测结果显示，经荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌诱导后，植株体内酚类物质如丹宁、苯乙烯酸等物质含量成倍上升，对于病害的抗性也显著增强( o n g e n am 等，2 0 0 2 ；u rs a r m a 等，2 0 0 2 ；u d a irs i n g h 等，2 0 0 3 ；u es i n g h 等，2 0 0 2 ：z e h n d e rg w , 等，2 0 0 1 ) 1 0 0 1 0 6 t l o 叫 1 1 7 。1 5 本研究的目的和意义茶叶是一种天然保健饮料，被誉为2 l 世纪的健康饮料，由于茶叶以嫩梢为主要收获物，过量的使用化学肥料和传统的化学农药防治病虫害的方法带来的农残超量、生态污染等问题日益严重，随着现代绿色消费和重返自然观念的兴起，绿色食品茶、有机茶成为无公害食品生产的一个热点，寻找环境友好型的新型替代药物和肥料已成为茶叶可持续发展的迫切需要。近年来，越来越多的研究表明植物根系和根际微生物的生理活动对土壤性状、植物养分吸收、植物生长发育都具有明显的影响( 刘建军等，1 9 9 8 ：张淑香等，2 0 0 0 ；张淑香等，2 0 0 0 ) 2 7 1 6 1 】 6 2 。，根际微生物种群与植株的健康状况也有关系( 徐长伦等，1 9 9 7 ) 5 3 】，通过改善根际微生态环境来促进植物的生长以及从根际微环境中筛选具有良好促生和抗菌作用的有益菌群，日益受到人们的重视( 林敏等，1 9 9 2 ；徐风花等，1 9 9 8 ) 2 6 1 5 4 1 。国内对于根际促生细菌的研究多集中在粮食作物和蔬菜上，关于茶树根际促生细菌的研究报道目前尚少，本课题对茶树根际微生物进行了分离，研究了不同肥力、不同茶龄的茶树根际细菌、真菌和放线菌的数量变化，对茶树根际促生细菌进行了筛选和鉴定，对一株拮抗效果较好的植物病原真菌拮抗菌的抗菌物质进行7孙海新：茶树根际促生细菌的研究了分离、纯化，旨在为进一步研究茶树根际微生物的种群变化规律、充分利用茶树根际细菌这一资源库，为茶叶的无公害化生产提供有益参考。2 材料与方法2 1 材料2 1 1 茶树类型山东省日照市4 年生、1 0 年生、2 0 年生茶树的根际土壤，茶树品种均为黄山群体种，土壤肥沃程度按照有效成分含量分为肥沃、中等、贫瘠茶园三种类型。土壤主要有效成分速效氮、速效磷、速效钾和有机质的含量测定，分别用碱解法、钼蓝比色法、火焰光度法和重铬酸钾容量法- 夕 加热法。土壤主要有效成分如表2 - 1 。表2 - i 供试土壤主要有效成分t a b l e 2 一ip h y s i c o - c h e m i c a lp m p e m e so fs e l e c t e ds o i l2 1 2 微生物分离培养基细菌分离采用改良p d a 培养基：土豆2 0 0 9 、牛肉膏5 9 、葡萄糖2 0 9 、( n h 4 ) z s 0 4i g 、m g s 0 4l g 、k h 2 p 0 40 6 9 、c a c 0 33 9 、山东农业大学硕士论文h 2 01 0 0 0 m l 、琼脂1 5 9 。放线菌分离采用高氏一号培养基：可溶性淀粉2 0 9 、k n 0 3l g 、k 2 h p 0 4o 5 9 、m g s 0 4o 5 9 、n a c l0 5 9 、f es 0 4o 0 1g 、h 2 01 0 0 0 m l 、琼脂1 5 9 。真菌分离采用马丁氏培养基：葡萄糖1 0 9 、蛋白胨5 9 、k h 2 p 0 4l g 、m g s 0 4o 5 9 、1 1 0 0 孟加拉红3 m l 、h 2 01 0 0 0 m l 、琼脂1 5 9 。固氮菌分离采用a s h b y 无氮培养基：甘露醇1 0 9 、k h 2 p 0 40 2 9 、m g s 0 4o 2 9 、n a c l0 2 9 、k 2 s 0 40 3 9 、c a c 0 35 9 、h 2 01 0 0 0 m l 、琼脂1 5 9 。解磷细菌分离采用以下培养：葡萄糖1 0 9 、( n h 4 ) 2 s 0 4o 5 9 、n a c l0 3 9 、k c io 3 9 、m g s 0 4o 3 9 、f e s 0 40 0 3 9 、m n s 0 4l g 、c a 3 ( p 0 4 ) 25 9 、h 2 01 0 0 0 m l 、琼脂1 5 9 。解钾细菌采用以下培养基：蔗糖5 9 、n a 2 h p o n2 9 、m g s 0 40 5 9 、f e c l 3o 0 0 5 9 、c a c 0 3o 1 9 、钾铝硅酸盐l g 、h 2 01 0 0 0 m l 、琼脂1 5 9 。2 1 3 主要药品试剂丙烯酰胺上海伯奥生物科技公司甲叉双丙烯酰胺s i g m a 分装四甲基乙二胺上海润捷化学试剂有限公司十二烷基硫酸钠s i g m a 分装溴酚蓝上海化学试剂厂考马斯亮蓝r 2 5 0北京经科b 巯基乙醇m e r c k 分装过硫酸铵华美生物公司9孙海新：茶树根际促生细菌的研究s e p h a d e x 10 0s e p h a d e xg 一5 0m e d i u md e a e s e p h a r o s e低分子量标准蛋白胰蛋白酶蛋白酶k2 1 4 主要仪器生化培养箱高速冷冻离心机核酸蛋白质检测仪酸度计恒温振荡培养箱电泳仪2 1 5 指示菌p h a r m a c i a 分装p h a r m a c i a 分装f a s tf l o wp h a r m a c i a 分装上海升正生物科技有限公司s i g m a 分装p r o m e g a 原装光学显微镜真空冷冻干燥机自动部分收集器记录仪恒温水浴锅b i o - r a dm i l l i - p r o t e i ni ie l e c t r o p h r e s i sc e l l茶树病原菌指示菌：茶云纹叶枯病菌( c o l l e t o t r i c h u mc a m e l l i a e ) 、茶轮斑病菌( p h y l l o s t i c t at h e s e f o l i a ) 。其他病原菌：棉花立枯病( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 、黄瓜枯萎病菌、( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 、绿色木霉( t r i c h o d e r m av f r i d e ) 、玉米圆斑病菌( h e l m i n t h o s p o s p o r i u mc a r b o n u m ) 、棉花枯萎病菌( f u s a r i u mo x y s p o r i u mf s p v a s i n f e c t u m ) 、苹果轮纹病菌( b o t r y o s p h a e r i ab e r e n g e r i a n af s p p i r i c o l a ) 、玉蜀黍赤霉病菌( g i b b e r e l l a z e a e ) 、苹果炭疽病菌( g l o m e r l l ac i n g u l a ) 、烟草炭疽病菌( c o l l e c t o t r i c h u mn i c o t i a n a e ) 、葡萄炭疽病菌( g l o e s p o r u mf r u c t i g e n u m ) 。2 2 方法2 2 1 微生物的分离山东农业大学硕士论文2 2 1 1 样品采集选取不同类型茶园，不同茶园按照五点采样法采样，将茶树根系及黏附其上的根际土壤一同装入无菌袋中，并在袋上注明采集地点、1 3 期、土样号，取回( 周德庆，1 9 9 6 ) 6 7 1 。2 2 1 2 分离样品稀释液的制各方法为：无菌环境下抖落附在根上的松散土块，取1 0 克根际土溶于9 0 m l 无菌水中，2 8 。c 恒温振荡3 0 m i n 使微生物细胞充分分散，静置2 - 3 m i n ，即得1 0 。1 稀释液，取l m l l o o稀释液与9 m l 无菌水混匀，即得1 0 。2 稀释液，再取l m l l o 。2 稀释液与9 m l 无菌水混匀，即得1 0 。3 稀释液，依次类推，制备1 0 。4 、1 0 、l o 、l o 、1 0 一、1 0 一、l o 邶等一系列稀释液供涂布平板用( 周德庆，1 9 9 6 ) 6 7 1 。2 2 1 3 培养与记数采用平板涂抹法：用移液器吸取l o o m l 的土壤稀释液于平板中央，然后用涂布器将稀释液在平板上涂匀。分离细菌选用稀释度为1 0 一、1 0 一、l o 。o ，于3 7 。c 恒温培养l d - 3 d ，记数并挑取单菌落成纯培养：分离真菌选用稀释度为1 0 。、1 0 、l ，于2 5 c 恒温培养7 d ，记数并挑取单菌落成纯培养：分离放线菌稀释度为l o 一、1 0 4 、0 ，于2 8 。c 恒温培养4 d ，记数并挑取单菌落成纯培养( 周德庆，1 9 9 6 ) 1 6 7 1 。2 2 2 固氮菌、解磷细菌、解钾细菌的筛选采用平板涂抹法：用移液器吸取l o