（生态学专业论文）以海洋线虫chromadorina+sp为模型动物的环境激素活体筛选的初步研究.pdf

娃海洋线出c h r o m a d o r i n as p 为模型动物豹坯境澈豢滔秘：筛选妁勰步硝究 以海洋线虫c h r o m a d o r i n as p 为模型动物的环境激素活体筛 选的初步研究 摘要 蘧着鼗学耪矮黪澍是持久控毒识污染兹丈量接敖副繇境孛，这垫诧学物蔟怼 生物乃至生态系统的内分泌扰乱作用，越来越受到生态毒理学家的关注。目前， 各戮学者正袄较开鼹_ 环境激素兹生貔筛途方法骚究，褥生镑簿选方法建立静蘩穑 是模型动物的选择。本文以玉米琼脂培养基为载体，在实验童成功地分离并单种 传代培养了自由生潘海洋线虫c h r o m a d o r i n as p ，以c h r o m a d o r i n as p 为模黧动 物，选择急性致死零、胚胎发育和繁殖为指振，并辅以对消化管、性腺、肌肉和 体爨超微结构的观察，研究了久效磷对海洋线虫c h r o m a d o r i n as p 的毒性和环境 激素效应。 作为模趔动物的c h r o m a d o r i n as p ，是从青岛栈桥附近潮问带分选出的，经 实黢室内人工培养，c h r o m a d o r i n as p ，酶瑟靛、瑟嚣发弯褥 燕帮釜戆行为熬形态 学、生态学研究结果表明，在2 3 土0 50 c ，赫度为2 6 7 条件下，c h r o m a d o r i n as p 的胚胎发育时间为4 9 6 9 a ：2 。9 0h r ，最短世彳弋时闯为1 4d ，圈次蜕皮依次发生在第 三天、第五天、第七天和第九天，并在第十四天开始产卵。刚孵化的幼虫长约 1 6 5r t m ，通体透明，开始掇食后，可以区分透明的咽和不透明的消化管。l l 、 l 2 、b 、k 幼虫平均体长分别为2 2 7 | m 、3 3 5 岬、4 3 7p m 秘5 2 8p m 。第四次蜕 皮聪，出现性别分化，性成熟后，体长为6 3 8 9 土6 4 8i x m ，雌雄个体开始交配、 产露。耱饕靛性毙为l ：l ，露薅牲繁壤，痰襄壤长率为o ，0 7 6 d 。出于c h r o m a d o r i n a s p 世代周期短、发育特征明显、雌雄异体、繁殖快等特点，是研究化学污染物 繁臻毒往斡理想模爱动物。 将上述分选出的c h r o m a d o r i n as p 经过数月传代培养后，暴露在含有久效磷 的玉米琼脂平板上。结果表明，久效磷对c h r o m a d o r i n as p 2 4 ，4 8 ，9 6h r - l c s o 分别为6 6 + 4 2 、3 6 9 4 、1 6 。0 3 弘m ；在o 1 一l o 0 州范围内的久效磷使c h r o m a d o r i n a s p 胚胎发育延迟，t 0u m 的久效磷影响卵的孵化，l 斗m 久效磷使线虫子一代的 数鬃减少，锭是对照组熬5 2 9 。久效磷撺到了c h r o m a d o r i n as p 。的繁殖，对海 洋线虫c h r o m a d o r i 日s p 具有较高毒性和生髓扰乱作用。 以海洋线虫c h r o m a d o r i n as p 为模型动物的环境激豢活体筛选的初步研究 o 1b t m 久效磷暴露对c h r o m a d o r i n as p 子一代成虫的消化管、性腺、肌肉和 体壁的破坏作用表现为：消化管微绒毛出现轻微破损，线粒体基质电子密度不匀； 雄性性腺中脂肪颗粒明显增加：肌原纤维轻微萎缩，间隔增大，肌浆网轻微水肿； 体壁轻微水肿，内部结构部分塌陷，溶解。1 0r t m 久效磷对c h r o m a d o r i n as p 威 虫的消化管、性腺、肌肉和体壁的破坏作用加剧，表现为使消化管微绒毛出现破 损部分空缺，内质网囊泡化，线粒体内嵴膨胀部分溶解；使精巢内精细胞膜溶解， 细胞间电子密度不匀；卵巢内线粒体大量增生，基质电子密度不匀，脂肪颗粒的 电子密度增大；肌原纤维严重萎缩，间隔增大，肌浆网水肿、溶解；体壁严重水 肿、囊泡化，内部结构塌陷，溶解。 另外，还利用上述建立的模型动物实验系统，测试了重金属镉和双酚a 对 c h r o m a d o r i n as p 的急性毒性，镉和双酚a 的2 4 、4 8 、9 6h r - l c s o 分别为4 5 2 9 、 2 7 8 9 、1 7 8 3 ：1 5 5 7 、7 5 5 、3 8 41 t i g l 。综上实验结果表明采用自由生活海洋线 虫c h r o m a d o r i n as p 作为环境激素活体筛选的模型动物具有方便、快速、有效的 特点。 关键词：自由生活海洋线虫；c h r o m a d o r i n as p ；生活史；久效磷；毒性效应 以海洋线虫c h r o m a d o j 1 1 7 0s p 为模型动物的环境激岽活作筛选的胡步研究 s c r e e no u te n v i r o n m e n t a lh o r m o n ei nv i v iu s i n gm a r i n e n e m a t o d ec h r o m a d o r i n as p a sam o d e lo r g a n i s m a b s t r a c t a sl a r g en u m b e ro fc h e m i c a l s ，e s p e c i a l l yp e r m a n e n to r g a n i cp o l l u t i o na r e r e l e a s e di n t ot h ee n v i r o n m e n t ，a n dm a n yo ft h e s ec h e m i c a l sa r es u s p e c t e dt oh a v e e n d o c r i n e d i s r u p t i n ga c t i v i t ya n dt h e r e b ya f f e c to r g a n i s m si nm a n ye c o s y s t e m s a t p r e s e n t ，m a n yr e s e a r c h e r sf r o md i f f e r e n tc o u n t r ya r ee n d e a v o r i n g t od e v e l o pa s s a yf o r e n v i r o n m e n t a lh o r m o n e a n dt h eb a s et oc o n s t r u c tt h ea s s a yi st oc h o o s ea l 】m o d e l o r g a n i s m i nt h i sp a p e r , t h el o c a lm a r i n en e m a t o d ec h r o m a d o r i n as p w e r ec o l l e c t e d a n dc u l t i v a t e do nc o r n m e a la g a rp l a t e ，a n dt h et o x i c i t ya n de n v i r o n m e n t h o r m o n a l a c t i v i t yo fm o n o c r o t o p h o sa r es t u d i e du s i n gc h r o m a d o r i n as p a sam o d e lo r g a n i s m ， a n dc h o o s i n gm o r t a l i t y ，e m b y o n i cd e v e l o p m e n ta n dr e p r o d u c t i v ea sm a i ne n d p i o n t s ， t h ec h a n g e so fi n t e s t i n e ，g l a n o d ，b o d ym u s c l ea n db o d y w a l la sa s s i s t a n ti n d i c a t e r s t h em o d e lo r g a n i s mm a r i n en e m a t o d ec h r o m a d o r i n as p a r ec o l l e c t e df r o m i n t e r t i d en e a r b yq i n g d a op i e r , a n dc u l t i v a t e di nl a r g en u m b e r si nl a b w ed e s c r i b et h e m o r p h o l o g y a n de c o l o g yo fc h r o m a d o r i n a s p se m b r y o n i c ，p o s t e m b r y o n i c d e v e l o p m e n ta n dr e p r o d u c t i o nb yt h em e a n so fm e a s u r i n ga n dr e c o r d i n gu n d e ra m i c r o s c o p e w ef i n dt h a te m b r y o n i cd e v e l o p m e n to fc h r o m a d o r i n as p t m d e r g o e s 4 9 6 9 土2 9 0h o u r sa t2 3 士0 5 。c ，2 6 7 s ，a n dt h em i n i m u mg e n e r a t i o nt i m ei s1 4d a y s t h ef o u rm o l tt i m ei sd e t e r m i n e db yd r a w i n gt h ep o s t e m b r y o n i cg r o w t hc h i v e ，a r e f o u n dt oo c c u ra tt h et h i r d ，f o u r t h ，s e v e n t ha n dn i n t hd a ya f t e rh a t c h i n g c h r o m a d o r i n as p 1 a ye g g sa tt h ef o u r t e e n t hd a y t h eh a t c h e dl a r v a ei se x c e e d i n g t r a n s l u c e n t ，a f t e rt a k i n gf o o dt h ei n t e s t i n eb e c o m eo p a q u ea n dt h eb o d yl e n g t hi s16 5 g m t h eb o d yl e n g t ho fl i ，l 2 ，l 3 ，l 4l a r v a ea r e2 2 7 肛m ，3 3 5 9 m ，4 3 7 9 ma n d5 2 8 9 m a f t e rt h ef o u r t hm o l t i n g ，t h ec h r o m a d o r i n as p b e g i nt os e x u a ld i f f e r e n t i a t i o n t h e b o d yl e n g t ho fa d u l ti s6 3 8 9 士6 4 8 p r n m a l ea n df e m a l ea d u l t sb e g i nt oc o p u l a t ea n d l a ye g g s a sc h r o m a d o r i n as p h a v i n g s h o r tl i f e c y c l e ，o b v i o u s d e v e l o p m e n t a l c h a r a c t e r s ，d i o e c i s m ，f a s tr e p r o d u c t i o n ，h a sb e e ns h o w n t ob es u i t a b l et e s to r g a n i s m f o ra s s e s s i n gt h er e p r o d u c t i v et o x i c i t yo fc h e m i c a l s a f t e rc u l t i v a t e df o rs e v e r a lm o n t h s ，t h em a r i n en e m a t o d ec h r o m a d o r i n as p a r e e x p o s u r e d t o m o n o c r o t o p h o s t h e2 4 ，4 8 ，9 6 h r - l c s 0 o fm o n o c r o t o p h o st o 1 1 i 坠塑堂垡皇! ! 竺竺! 生! ! 竺! ! ：垄堡型垫望堕! 塑塑蘑番墅型! 塑生竺塑 c h r o m a d o r i n as p a r er e s p e c t i v e l y6 6 4 2 ，3 6 9 4 ，16 0 3g m a to r 4 0 0g m ，t h e e m b y r o n i cd e v e l o p m e n to fc h r o m a d o r i n as p i sd e l a y e db ym o n o c r o t o p h o s t h ee g g s d on o th a t c ha t10 a m a t1g mm o n o c r o t o p h o s ，t h en u m b e ro ff i r s to f f s p r i n gi s s i g n i f i c a n td i f f e r e tf r o mc o n t r o l ，a n dw a sa b u t5 2 9 o fc o n t r 0 1 t h er e p r o d u c t i o no f c h r o m a d o r i n as p i ss i g n i f i c a n t l yr e s t r a i n e db ym o n o c r o t o p h o s m o n o c r o t o p h o sh a s h i g ht o x i c i t ya n dd i s r u p er e p r o d u c t i o no nc h r o m a d o r i n as p t h ed a m a g e so fo 1 p mm o n o c r o t o p h o so nu l t r a s t r u c t u r eo fi n t e s t i n e ，g o n a d ， b o d ym u s c l ea n db o d y w a l lo fc h r o m a d o r i n as p a r et h a ti tc a u s em i c r o v i l l u sa r e s l i g h t l yb r o k e n o r l o s t ，t h e e l e c t r o n i c d e n s i t y o fm i t o c h o n d r i a lm a t r i x i s u n h o m o g e n o u si ni n t e s t i n e t h en u m b e ro fl i p i dd r o p l e t si n t e s t e si f f e r e a s e t h e d i s t a n c eb e t w e e nm u s c l ef i b r i li n c r e a s es a r e o p l a s m i cs w e l l e du p ，d i l a t e da n di t s m e m b r a n ei sb r o k e n b o d y w a l li ss l i g h t l ys w e l l e du pa n dv e s c i l a t e d 1 1 1 ；i n t e s t i n e g o n a d ，b o d ym u s c l ea n db o d y w a l lo f c h r o m a d o r i n as p a r ed a m a g e db a d l yb y1 0r t m m o n o c r o t o p h o s a r et h a ti tc a u s em i c r o v i l l u sa r eb r o k e no rl o s t ，t h ee n d o p l a s m i ca r e v e s c i l a t e d ，t h em i t o c h o n d r i a lc r i s t a ei s s w o l l e nu pa n dd i s i n t e g r a t e d p a r t i a l l y i n i n t e s t i n e t h em e m b r a n eo fs p e r mi sd i s s o l v e da n dt h ee l e c t r o n i cd e n s i t yb e t w e e nt h e s p e r mi su n h o m o g e n o u s t h en u m b e ro fm i t o c h o n d r i ai no v a r yi n c r e a s e ，t h e e l e c t r o n i cd e n s i t yo fm i t o c h o n d r i a lm a t r i xi su n h o m o g e n o u s ，t h ee l e c t r o n i cd e n s i t yo f l i p i dd r o p l e t si n c r e a s e t h e d i s t a n c eb e t w e e nm u s c l ef i b r i li n c r e a s e s a r c o p l a s m i c s w e l l e du p ，d i l a t e da n di t sm e m b r a n ei s b r o k e n b o d y w a l li ss w e l l e du pa n d v e s c i l a t e d t h e2 4 ，4 8 ，9 6 h r - l c s 0v a l u eo fah e a v ym e t a l ( c d ) a n daw a t e r - f a s tc h e m i c a l ( b i s a ) o nc h r o m a d o r i n as p a r eo b t a i n e do nt h i st e s ts y s t e m ，r e s p e c t i v e l y4 5 2 9 ，2 7 8 9 ， 1 7 8 3a n d1 5 5 7 ，7 5 5 ，3 8 4m g l w ef i n dt h a tc h r o m a d o r i n as p i sas u i t a b l em o d e l o r g a n i s mf o rs c r e e n i n go u te n v i r o n m e n t a lh o r m o n ei nv i v i k e y w o r d s ：f r e e - l i v i n gm a r i n en e m a t o d e ：c h r o m a d o r i n as p ；l i f eh i s t o r y m o n o c r o t o p h o s ；t o x i c i t y 以海洋线虫c h r o m a d o r i n as p 为碳坐功物的环蝇撒囊活体筛选的初步i _ j 宄 0 前言 线虫州e m a t o d e ) 通常不分节，无附肢，有假体腔，是具完全消化道、神经系 统、排泄系统的蠕虫状无脊椎动物。在动物界中，线虫动物门( n e m a t o d e ) 是一个 极其庞大的生物类群，种类丰富。自由生活海洋线虫( f r e e l i v i n g m a r i n en e m a t o d e s ， 以下简称海洋线虫) 是线虫动物1 1 的一个重要组成部分。海洋线虫分布广泛，从 滨海带的高潮线直到深海大洋的最深海沟，从寒冷的两极直到深海脊上的高温热 泉生物群落都有它们的分却。海洋线虫是底栖生态系统的重要组成部分，在大多 数底栖生境中，海洋线虫是数量上最丰富的后生动物，占后生动物数量的9 0 以上。 鉴于线虫在科学研究中的重要地位，海洋线虫是底栖生物中最为优势的群 体，具有稳定的生命周期、较短的生活刷期和高的繁殖力，与其他小型底栖动物 相比，有较广的盐度和温度的耐受力、较低的自然死亡率和较低的呼吸损失率 2 1 ：以及海洋线虫的种群分布与底栖环境之间的密切关系 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 1 0 , 1 1 】。国际小 型底栖动物会议暨海洋线虫国际学术研讨会每三年举行次，且每次会议对以上 不同专题都有所侧重地进行讨沦。 目前，对海洋线虫的研究己经发展到了许多的领域，主要集中在以下八个方 面：r 1 ) 海洋线虫的系统分类学；( 2 ) 海洋线虫的密度，生物量及其时、空分布； ( 3 ) 海洋线虫的实验室培养、生活史及生产量的测定：( 4 ) 海洋线虫的竞争、捕食 与共生( 包括与其他生物的) ；( 5 ) 海洋线虫的群落结构和多样性；( 6 ) 深海线虫( 极 端条件下如热泉生物群落的线虫) 的种类组成，生理、生化方面的研究；( 7 ) 污染 生态学；( 8 ) 生物化学及分子生物学。以上各个研究领域更多是交叉的，较少进 行独立的研究。 相比寄生线虫和土壤生活线虫的培养，对水生环境线虫培养的研究开展的比 较晚，最早可追述到1 9 3 8 年c h i t w o o d 的报道1 2 】；对海洋线虫的培养研究，则起 始于- 1 世纪六十年代，目前，己经取得了较大的研究进展。j e n s e ne ，l o p e z ； 等在实验室条件下，对部分海洋线虫的食性、食物代谢进行了研究叭1 4 1 ：h o p p e r b e 等在报道了温度对红树林沉积环境中六种海洋线虫生括史的影响1 1 5 1 ；t o m 以海洋线虫c h r o m a d o r i n as d 为模型动物的环境激桑活体筛选的初步研究 m o e n s 等在不同温度、盐度以及食物丰度条件下，研究了两种食细菌性的海洋线 虫p e l l i o d i t i sm a r i n a ( 以下简称户m a r i n a ) 和d i p l o a i m e l l o i d e sm e y l i ( 以下简称d m e y l i ) 的生活史、摄食行为和代谢速率的变化1 , 1 6 1 。由于对海洋线虫的营养需求 缺乏了解，对海洋线虫的培养难度要明显大于土壤生活和寄生线虫的培养。但因 海洋线虫的种类丰富，分布广泛，获取容易，对其培养有着广阔的前景1 1 7 】。 国内对海洋线虫的研究主要内容集中在新种的描述，对种群分布和种群的生 物多样性调查。调查的范围主要在渤、黄海沿岸和海底、厦门沿岸、台湾海峡海 底以及大亚湾等。关于海洋线虫的培养，王诗红等( 1 9 9 4 ) 首次在在实验室内成功 培养了海洋线虫d 功o l a i m e l l as p ，并在实验室条件下，对其生活史进行了研究 【1 8 l 。 海洋线虫在整个底栖生态系统能量流动中的重要作用 1 6 , 1 7 , 1 9 , 2 0 , 2 ”，使海洋线 虫成为一种较好的实验材料，亦可作为环境监测的指示生物2 2 0 3 1 ，如通过监测海 洋线虫群落结构的变化，可指示水域或底栖环境的重金属污染和富集情况【2 4 1 ， 在高污染区海洋线虫的群落结构具有明显的变化特征口”。目前为止，国内尚未 有以海洋线虫为模型动物进行生态毒理学研究的报道。海洋线虫作为生态毒理学 研究的模型动物具有诸多优点：( 1 ) 种类丰富，分布广泛，容易获得和培养；( 2 ) 线虫的生活周期比鱼类短，例如一种虾池海洋线虫d i p l o l a i m e l l as p ，一个世代 只有1 6 d ，因而在短时间内观察毒物对线虫多世代的影响，大大缩短实验周期， 提高效率；( 3 ) 生殖器官细胞和生殖细胞有区别，生殖细胞因个体和营养状态的 不同而又有区别，和人的性机制非常相似。所以利用线虫研究的结果更有利于外 推到人。 本文从青岛栈桥附近分选出了海洋线虫c h r o m a d o r i n as p ，通过实验室长期 的单种传代培养；以c h r o m a d o r i n as p 为模型动物，研究久效磷及其他环境污染 物对其急性毒性作用，以及对其发育和繁殖的影响；并辅以体壁、肌肉、消化管 和性腺等超微结构的变化，建立一种快速、简便、有效的化学污染物的实验室筛 选系统和指标体系。 以海洋线斑c l u o m a d o r i n as p ，为接型动物巧境激臻滔搏摇逛0 0 韧步埘究 1 线虫在环境激素研究中的应用与研究进展 1 1 环境雌激素生物筛选方法 环境雌激素( e n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s ) 是一类人工合成或自然存在的化合物， 它们缆够干筑久窝动物体内激素翡合裁、释赦、运输、饩滚，激素与受体夔绣合、 功能的表达和排出铎一系列生物过程，并可损害人和幼物的内分泌系统和生殖系 统，甚至也肖损伤蕊代生臻功能的灞在麓力。1 9 9 6 年以来，环境雅激素造成的 动物生殖异常、生殖畸变以及人精予数减少等现象，日l 起了世界各国的广泛艇视 f 2 矾，各国政府纷纷把环境雌激素的筛选技术列为本国环境科学研究的重点，业 已建立了多耪繇境雌激素的生物筛选技术2 7 , 2 8 1 ，环境雌激素的生物筛选方法包括 各种离体( i nv i t r o ) 筛选和活体沏v f v o ) 筛选方法拉9 , 3 0 j 。 1 1 1 环境激素离体筛选方法 离体筛选技术藏有敏感、简便、经济的特点，可潋开展大量样品的裣溅，主 要豹筛选体系有哺乳动物细胞系( 如m c f 7 ) 、鱼类原代肝细胞、转导酵母细胞 系等并取得了较好的筛选效巢。但离体筛选技术在准确性和荧敏度等方面存在诸 多缺点1 3 1 i ：番秘微生物或缨慰的壤葵都是在离钵条传下，赡以糖确地模拟戏反 映有毒化合物在生物体内的累积、转运和转化过程，也无法得到毒效学和毒物动 力攀豹资释。 1 1 ，2 嚣境激素嚣体拣选方法 虽然璃体筛选方法具有敏感、简便、经济的特点，但是在筛选的准确度等方 面存在很多缺点，而且不能反映环境激素对生物体尤其是人体的影嗡情况，阂此 摄豁薅选方法越来越受到重援。美瓣国家环像局蹇1 9 9 9 年起推荐以鱼类等侈为 模型动物筛选化学物质的环境雌激素活性【2 ”。联合国经济合作与发展缀织 f o e e 秘也这甥要求建立环辘雄激素豹活诲箨选技零e 枣鼠予塞上皮增殖实浚是 最经典的活体筛选方法，目前常用以鱼类为模型动物进行环境激素的活体筛选。 以海洋线虫c h r o m a d o l i n as p 为模型动物的环境激桑活体筛选的初步研究 1 1 3 模型动物选择 模型动物的选择是环境激素活体筛选方法建立的基础，另外，毒理学研究终 点( e n dp o i n t s ) ，选择的模型动物也不同。一种理想的模型动物应具备以下几点： ( 1 ) 具备敏感的筛选指标：( 2 ) 实验动物易于获得和室内培养；( 3 ) 生活周期短，繁 殖快，生长迅速；( 4 ) 已具备比较深入的生理研究基础并获得较充分的基础研究 数据。在目前，国外环境激素活体筛选技术所选择的模型动物有鱼类、两栖类、 爬行类、鸟类、啮齿类和灵长类。在环境雌激素的筛选中，啮齿类主要是以小鼠 作为模型动物，以鱼类作为模型动物的斑马鱼( b r a c h y d a n i or e r i o ) 、日本青鲻 f j a p a n e s em e d a k a ) 、美国红鱼( s c i a e n o p so c e l l a t u s ) 等。 1 1 4 指标的选择 作为环境雌激素筛选的模型动物，必须具备非常敏感可靠的筛选指标。有研 究表明，卵生动物的卵黄原蛋白可以作为有效筛选人工合成化学物质是否具有环 境雌激素活性的敏感指标。卵黄原蛋白是雌性卵生动物的特异性蛋白。在雌激素 或具有雌激素活性物质的刺激下，雄性卵生动物也能合成卵黄原蛋白。因此检测 化学污染物暴露后，雄性卵生动物体内卵黄原蛋白是否被诱导产生已成为环境雌 激素筛选的一个有效的指标，目前的研究揭示，多种具有环境雌激素活性的化学 物质，如有机氯杀虫剂的d d t 、多氯联苯、烷基酚、二恶英( d o x i n ) 、乙烯雌酚 等都能诱导雄性卵生动物产生卵黄原蛋白 此外，还有其他指标卵膜蛋白、y 一谷氨酰转移酶、细胞色素p 4 5 0 多功能氧化 酶系统、类固醇浓度、生殖腺指数和肝脏指数、外部第二性征的改变、配子活力 等。 1 2 线虫在环境激素研究中的应用 1 2 1 自由生活线虫作为模型动物的毒理学研究 自由生活线虫是线虫动物门重要的组成部分，种类丰富，分布广泛，是淡水 和海洋环境、底栖和土壤生态系统中的重要类群。c e l e g a n s 具有众所周知的优 点：易于培养、生活史短、基因组测序已经完成等，因而被广泛地应用于神经学、 娃海洋线虫c h r o m a d o r i n as p 为接型动物妁趟：境激豢活体筛选的树步研究 发育生物学和分子生物学等慕础生物学研究t j 3 2 , 3 3 1 。w i l l i a m 等1 9 8 8 年首次提 出将c e l e g a n s 用作水生环境海性测试的模型渤物 3 4 , 3 5 l 。s t e v e n 报道了在不同培 养条 孛下( 盐魔、食物的有无) ，采用不同发育时期的线虫作为水生毒性测试的实 验材料，选择不同的指标，对测试毒物的敏感性不同p “。w i l l i a m 等将c e l e g a n s 瘸终承生巧麓毒蛀爨渡鲍实黢生甥，选择了慧蛙致死为指标，发现该指撂对毒物 不敏感【3 5 】。因此，一魑学者以c e l e g a n s 作为慢性毒性的实验材料。s h i n y a 等以 c e l e g a n s 静强吸、摄食行为体为捂菰，捡灞裂乙醇对c e l e g a n s 熬浮墩挣割，并 发现双酚a 对c e l e g a n s 的摄食具有抑制作用 3 7 , 3 8 。j o n e s 等则以转基因型 c e l e g a n s 为实验材料，应用于生物簸测和毒理学研究，这萃孛转基因c e l e g a n s ， 在外源毒物嬲作用下，导致嘲部肌肉的应激反应，产生芦一半乳糖苷酶1 39 1 ，使培 养基变色，从而指示污染物的毒性作用。 1 2 2 线虫作为环境激素筛选的指标濑撵 n o b u a k i 等i 4 0 , 4 1 4 秘剜彀c e l e g a n s 静玺薅力、繁疆率蔻最终撂蠡，谔绩了类 固醇激素、酚类化合物、有机锡类化合物和高氟有机物的生殖干扰作用。c u s t o d i a ( 2 0 0 1 ) ，a p o l o n i a ( 2 0 0 5 ) 等研究发现，c e l e g a n s 辩黄潦蛋白的合成与罐激素( 孕 酮、雌二醇、n n i n ) z n n n , 显的n n 效应关系1 4 3 州，d n a 微矩阵技术的分析 结果显示，至少有两个c e l e g a n s 的卵黄原蛋白基因( v i t 2 和v i t 一6 ) 表达，受到雌 激素憋正调掩，这与脊雄动物棼鬻槌 娃；目对发现重金熙锈，在低浓度下( 1 1 0f u n ) 可以诱导卵黄原蛋白的产生，而较高浓度( 1 0 0p m ) 却抑制卵黄原蛋白的合成。因 _ f 逝，在瑷线象为环凌耀激素嚣锌薅逡麓模型动铹，可以疆究繇凌蛙激素豹生臻技 乱作用。 1 3 环境雌激素筛选模型动物海洋线虫的培养、生活史及相关研 究 虽然海洋线虫在底栖生态系统中具有非常重要的作用弹5 。6 能犏，键是尚来有 对海洋线虫毒理学磷究豹报道，仅蠢少量文献研究污染物对线虫影响叫。海洋 线虫具有较短的生活周期、商的种群密度，分布于不同的营养级，某魑种具裔耐 受离污染繇壤缝力。瓣我，选择海洋线虫嚣戈矮境蛙激素薅选敬摸型勰骢具蠢重 以海洋线虫c h r o m a d o r i n as p 为模型动物的环境激素活体筛选的初步研究 要的意义。 1 3 1 海洋线虫的培养 对寄生线虫和土壤生活线虫培养的研究开展的较早，而对水生环境线虫培养 的研究，则要追述到1 9 3 8 年c h i t w o o d 。w i e s e r 和k a n w i s h e r ( 1 9 6 0 ) 年测定了 e n o p l u sc o m m u n i s 的增长率和呼吸同化率1 50 l ；w i e s e r ( 1 9 5 3 ，1 9 5 9 ) 研究了自由生活 海洋线虫的培养条件和食物选择口i 】；这些早期学者的研究，如t i e j e n 、l e e 、m e y e r s 和h o p p e r 等【5 2 , 5 3 , 5 4 , 5 5 ，为海洋线虫的培养，提宝贵供必不可少的原始资料。 v r a n k e n 等早在1 9 8 4 年，提出将海洋线虫m o n h y s t e r ad i s j u n c t a ( 以下简称m d i s j u n c t a ) 和m o n h y s t e r am i c r o p h t h a l m a ( 以q z 简称mm i c r o p h t h a l m a ) 作为生态毒理 学研究的实验材料，并就md i s j u n c t a 和mm i c r o p h t h a l m a 的培养条件、生活史 和实验条件的标准化作了初步的探讨【5 “。 1 3 2 海洋线虫的结构特征和功能 由于海洋线虫生活环境的复杂性，在显微镜下海洋线虫的形态也多种多样， 缺少能够代表线虫动物门形态结构特征的模式种。尽管海洋线虫形态多样，但是， 海洋线虫还是具有许多共同的特征。如：有一些附着生长的种类体长可以达到几 毫米，但大多数海洋线线虫的成体是长圆筒状蠕虫，线虫个体较小，体长一般在 1 21 1 1 1 1 1 ，且绝大多数海洋线虫是透明的，可以在显微镜下方便地观察其内部结 构，这使得线虫有大量的结构特征可用于种类的鉴定。 线虫整体结构呈管套管状，外面的管是由外部的表皮层和内部的纵肌层组 成。线虫没有环纹肌，所以身体不能伸缩。运动是通过伸缩背腹部的肌肉块调整 体内压来完成。由于，背腹面具有挠曲性，固定后的线虫在显微镜下，一般是侧 面朝上，因此，大部分的图版描述多是侧面观。 内部的管是消化道从头部顶端到接近末端，所以，线虫有尾。消化道分为口 腔，肌肉发达的食管( 或称之为咽) ，消化管和短的直肠。在消化道和体壁之间体 液腔称之为假体腔，体腔内有性腺。 1 3 2 1 消化管 线虫的消化管是由一层细胞围成的管状结构，前端与咽相连，末端连接直肠， 消化管细胞的上表皮有一层微绒毛，消化管细胞分泌消化酶对食物进行消化和营 6 戥海洋线虫c h r o m a d o # 恤s p 为模型动物的环境激豢活体筛选的韧步研究 养的吸收；此外还可以贮存营养物质，合成卵黄原蚤白5 7 , 5 8 1 。 1 3 2 2 生殖系统 雌性线擞可能有一个或两个卯艇( 单子寓双子宫) ，卵巢可能折射或不折射。 卵巢的数量和结构怒分类的个重要的特征。双子寓线虫的生殖孔通常位予体中 部，丽单子窟线虫的生殖孔靠近肛门。雄性线虫一般有两个精巢( 双鼯) ，有可能 反向排列或一前一厝排列，但一些大的类群只有一个精巢。海洋线呶具有明照的 接别特薤和性毙。 i 3 3 生态学 由于海洋线虫具有广泛的适应性，存在于所有的沿海和海底生境中。它们是 一麴滨海环境最丰富的后生动物，在河日和盐沼底泥中数登最多( 簿平方米约 2 0 0 0 万个) ，两在裸嚣的砂旗海滩和深海海底数量最少( 每平方米l o 万个) 。海洋 线虫具有高的同化率和种群密度，与大型底栖动物相比，线斑和小黧底栖动物的 生物量一般簧低，缎是生产量可能鞠等或越过大型动物豹总和。 海洋线虫种群最显著的特征是：在任何个生境中种类繁多，通常一个较大 基懿静类数譬嵩予线宝溢外粒 壬俺主要类群l 娟1 。耱鹣丰富瞧謦爨多榉桎睫善囊境 的不同而改变，在沙质海滩最高的关键种超过1 0 0 种，在泥膜和藻焱生境中，关 键静的数量在3 0 7 0 羊申。通过群落分丰斤表明，在不同的生辘中优势痰不同。邋零 在海草和低盐的泥质生境中只有一个或几个优势种；而沙滩和高盐泥质生境肖很 多的优势种，但任何一个种酃不是绝对的优势群体。一些小型底栖动物学者，提 出萼孽线虫秘橇是类熟比率用作环境簸溅的搀标p 9 , 6 0 , 引1 。 l 。3 4 摄食 海洋线嫩的食物包括有机碎屑、腐烂的生物、细菌、硅藻和其他活的生物。 生活在同一生境酶线虫可能竞争这憋资源，健小豁食物收集器官只麓摄食小的食 物颗粒，因此u 1 腔的结构类型反映特定的食物选择性，根据口腔类型，海洋线虫 的食性类型分为：选择沉积食性、无选择沉积食性、铡食者和捕食者蹭种类黧f 6 霉 论楚疆静摄食类型，海洋线虫鲍摄食圣亍力，郯是通过口吞食，再经过姻的泵吸进 入消化管【1 4 1 ，线虫能够吞咽任何小于口腔的物质颗粒，伴随着个体发育，摄食 量逶步增麓。k 襄秽葳熬兹c h r o m a d o r i t at e n t t i s 每天熬摄食：鏊是律鬟豹嚣绥，劳 以海洋线虫c h r o m a d o r i n as p 为模型动物的环境激豢活体筛选的初步研究 在个体发育过程中，食物类型的变化会影响性腺的发育程度【6 3 1 。因此，研究外 源化合物的毒性时，可以通过海洋线虫摄食进行污染物的暴露实验。 1 3 5 繁殖和生活史 大部分海洋线虫是雌雄异体( 两性繁殖) ，交配受精后卵在海底经四个幼虫期 发育成成虫一为卵生。只有机少数种是胎生的一卵在子宫里孵化。线虫发育最显 著的特征是经历四次蜕皮，每次蜕皮后体长会显著增加，c e l e g a n s ( b y e r l ye ta 1 ， 1 9 7 6 ) t 删在每个幼虫期蜕皮后体长比原来增加1 3 ，因此，不同的幼虫期可以体长 区分开【6 5 1 。只有成虫的性腺和交接刺是完全成熟的。海洋线虫的繁殖力不是很 高，幼虫的数量一般比成虫少，大多数种类成虫个体非常小，生活周期要比季节 周期短，通常是2 0 3 0 d ，而且繁殖是连续的。一些大的海洋线虫可能有年周期， 然而世代时间和生殖力极易受温度的影响。实验中，温度升高5 ，产卵量提高 了6 倍【6 0 , 6 6 。 1 4 研究展望 以鱼类为模型动物筛选环境雌激素，常用淡水和海水鱼类，其中海水鱼类的 获得和实验室培养的耗费较高，培养条件难以控制，存活率不高。而海洋线虫具 有易于培养、生活史短、行两性繁殖等优点。并有研究表明，雌激素与土壤线虫 c e l e g a n s 体内卵黄原蛋白的表达之间，有显著的剂量一效应关系h j 。因此，以海 洋线虫为实验材料，用雌激素或污染物暴露l 2 一l 3 期幼虫或雄性成虫，提取暴露 后的线虫总r n a ，通过r t - p c r 监测卵黄原蛋白m r n a 的有无，在此基础上， 利用酶链免疫吸附法定量卵黄原蛋白的表达量，从而建立以海洋线虫为模型动物 的环境雌激素活体筛选技术。 本文中，我们分选出自由生活海洋线虫的本地种c h r o m a d o r i n as p ，已经在 实验室传代培养一年左右，并以c h r o m a d o r i n as p 为模型动物，研究久效磷、重 金属和双酚a 的急性致死作用：选择胚胎发育和繁殖为指标，并辅以对消化管、 性腺、肌肉和体壁超微结构的观察，初步研究了久效磷对海洋线虫c h r o m a d o r i n a s d 的环境激素效应。为后续工作提供一些基础的数据。 坚海洋线虫c h r o m a d o r m as p 为模型动物的环境微索活体嫡屯曲初步驯宄 2 海洋线虫c h r o m a d o r i n as p 的实验室培养及生活史研究 对自由海洋线虫培养的研究，始于二十世纪六十年代。目前已取得较大的进 展。根据报道，温度、盐度、p h 值、食物类型和丰度等，是影响海洋线虫的实 验室培养及其生活史的主要因素”，”，”2 15 ”