临床科研设计和方法.ppt

临床科研设计和方法,从一篇SCI文章中透视其科研设计,熊清芳,立题,题目：简明、具体、新颖、醒目、能高度概括整个研究内容。题目的内容反映出研究因素、研究对象及试验效应这三个主要环节及它们之间的联系。RoleoftheCoinhibitoryReceptorCytotoxicTLymphocyteAntigen-4onApoptosis-ProneCD8TCellsinPersistentHepatitisBVirusInfection,医学科研的程序,基本步骤有5个阶段1.科研选题2.科研设计3.实施方法4.统计分析5.总结归纳,1.科研选题,选题是确定所要探索的题目，是科研的起点，也是关系到科研成败和成果大小的关键性问题.基本程序,提出问题,文献评估,假设形成,立项,选题,题意来自：（1）直觉引起的预想“一闪念”（2）既往的实际经验（3）从书籍、文献或别人的经验中获得启示,胰岛素的发现,班廷是加拿大的一位外科医生。童年时他的一位朋友因患糖尿病而死去，使他对糖尿病有很深的感受，以后一直试图找到医治糖尿病的方法。年，他偶然在一本外科杂志上看到一篇文章，报导结扎胰导管可以使分泌胰酶的细胞萎缩，而胰岛细胞却不受影响。这篇文章给了班廷很大启发，他在笔记本上写道：“结扎狗的胰导管。等候到个星期使胰腺萎缩。然后切下胰腺进行抽提。”，大胆尝试后。年，胰岛素在临床上应用。班廷由于这一贡献获得了诺贝尔奖金。,选题,1、选题要小，开掘要深；不要题目很大，内容却很单薄。2、“选题新、方法新、资料新”3、“新题新做”和“小题大做”,1、创新性原则2、科学性原则3、可行性原则4、效益性原则5、需要性原则,选题应遵循的原则,文献检索,围绕以下5个问题：（1）有助于认识本课题意义的文献（2）有关本课题的既往研究工作（3）本课题研究的现状（4）可供借鉴的方法（5）关于本课题的不同见解与争论，特别是与自己假设相反的见解及工作。,CTLA一4作用模式图,CTLA一4在非T淋巴细胞如NK细胞、巨噬细胞、肝细胞及脑细胞上几乎不表达,CTLA一4作用模式图,CD28与B7分子结合，可以使IL-2mRNA增加，促进T细胞活化和增殖，上调免疫反应。CTLA-4与B7结合后抑制T细胞的增殖与活化，使细胞周期停滞在G0G1期，不向S期发展。CTLA-4还可促进T细胞分泌TGF-，下调T细胞的反应性和细胞因子的分泌，抑制IL-2R基因表达，减少细胞分泌IL-2，介导不依赖Fas途径的T细胞凋亡，从而在T细胞应答过程中起负性调节作用。,CD8T与CHB关系,CD8Tcells有清除HBV的作用；在CHB患者中显著下降。（背景）CHB治疗以抑制病毒为主，并有费用高、耐药、毒性等缺点。因此以减少T耐受，从而达到持久的抗病毒的免疫治疗是非常重要的。（背景）,Bim研究基础和CHB关系,WehaveidentifiedBimmediatedapoptosisasakeymechanismresultinginthedepletionofHBV-specificCD8TcellresponsesinCHB.InterruptionofthispathwayreconstitutedmultispecificCD8T-cellresponsesagainstHBV,confirmingitsfunctionalrelevance.（前期工作）Virus-specificCD8TcellshavealsobeenshowntobehighlypronetoapoptosisinpatientswithHCVinfection.（相关研究）,肝脏T细胞凋亡与Bim关系,Wehypothesizethattheproapoptoticdefectsinthesehepatotropicviralinfectionsareimposedbythetolerogenicliverenvironmenttheytarget.ThisislinewithrecentdatashowingthattheprematuredeathofTcellsprimedintheliverisBim-dependent.,HBV特异性T细胞与协同抑制信号关系,Wepostulatethatinthissetting,virus-specificTcellsaredriventowardsapoptosisbypersistenthigh-doseantigenwithinsufficientcostimulatorysignals,outweighedbyanexcessofcoinhibitorysignals.,HBV特异性T细胞与PD-1关系,OnesuchcoinhibitorysignalismediatedthroughthePD-1pathway,whichhasbeenshowntobecriticalforengenderingintrahepatictoleranceandtocontributetothefailureoftheT-cellresponseinCHB.BlockadeofthePD-1pathwayonlyresultsinapartialrecoveryofsomeHBVCD8specificitiesinaproportionofpatientswithCHB,implicatingaroleforadditionalmediators.,CTLA-4、PD-1与T细胞的关系,TolerogenicantigenpresentationcanbemediatedthroughthecombinationofbothPD-1andcytotoxicTlymphocyteantigen-4(CTLA-4);thelattercoinhibitoryreceptorhasrecentlybeenshowntoactsynergistically（协同）withPD-1topromoteT-cellexhaustioninHCVinfection.,CTLA-4与免疫缺陷的关系,ThecrucialroleofCTLA-4inperipheraltolerancehasbeendemonstratedinCTLA-4knockoutmicethatdevelopalethallymphoproliferativedisorder.Conversely,CTLA-4expressioninhibitsclearanceofanumberofpathogensandinparticularcorrelateswithreversibleimmunedysfunctionanddiseaseprogressioninhumanimmunodeficiencyvirus(HIV)infection.,CTLA-4多态性与HBV关系,AroleforCTLA-4inthepathogenesisofHBVdiseasehasbeensuggestedbyastudylinkingsinglenucleotidepolymorphismsofCTLA-4totheoutcomeofHBVinfection.,文献检索,围绕以下5个问题：（1）有助于认识本课题意义的文献（2）有关本课题的既往研究工作（3）本课题研究的现状（4）可供借鉴的方法（5）关于本课题的不同见解与争论，特别是与自己假设相反的见解及工作。,医学科研假设,假设的特征1、科学性以一定的科学理论为依据，绝不是随意的幻想和毫无根据的猜测。也就是假设要有两个条件；事实、科学理论。2、假定性它是在观察和实验材料不足的情况下，凭思维活动做出的，尚有待于实践的检验。,研究假说,1、InthisstudyweexaminedthepropensityofCD8TcellsfrompatientswithCHBtoup-regulateCTLA-4.2、WefoundalinkbetweentheexpressionofCTLA-4andtheproapoptoticmediatorBiminHBV-specificCD8.3、LongitudinalstudyofacohortofCHBpatientscommencingantiviraltherapyshowedthatviralloadreductiondidnotreduceCTLA-4orBimlevelsinantiviralTcells.4、WethereforeexploredthepotentialtomanipulatethiscoinhibitorypathwayinvitrotorestoreexpansionofHBV-specificCD8Tcells.,2、科研设计,基本要素：被试因素、受试对象、实验效应如何正确选择三个要素，是科研设计的关键问题,被试因素（处理因素）,1、概念研究者根据研究目的欲施加的能作用于受试对象并引起直接或间接效应的因素，称为处理因素。2、注意点-（1）确定试验中的重要因素。（2）确定被试因素与非被试因素。（3）被试因素必须标准化。,受试对象,1、正常人的选择。所谓“正常人”是指排除了影响所研究指标的疾病和有关因素的同质人群。2、病例选择。基本要求是正确诊断、正确分期和病情的正确判断。应制定统一的诊断标准。,试验效应,1、尽可能选择敏感度高、客观性强、特异度高的指标。2、注意观察处理与效应之间的时序关系。3、多选硬指标，少用软指标。,实验设计的基本原则,一、对照原则二、随机原则三、重复原则,实验设计的基本原则,一.对照原则：常用的有以下几种1.空白对照2.安慰剂对照3.实验对照：对照组不施加处理因素,但施加某种与处理因素有关的实验因素.4.标准对照；5.历史对照6.自身对照7.相互对照,二、随机原则,1、意义；贯彻随机化原则是提高组间均衡性的一个重要手段,也是资料统计分析时,进行统计推断的前提.2、随机化方法.（1）随机抽样:单纯随机抽样,系统抽样,整群抽样,分层抽样.（2）随机化分配.可采用随机数字表和随机排列表来进行.还可以用抽签的方法,如预先规定奇数到实验组,偶数到对照组.随机化分配虽然能提高比较组间的均衡性,但不能保证比较组间具有可比性,三、重复原则,重复-指各处理组及对照组的例数(或实验次数)要有一定的数量.如果例数太少,有可能把个别情况误认为普遍情况.如果例数太多造成不必要的浪费.主要涉及下列几个方面：诊断标准、纳入标准和排除标准。,研究指标,研究对象:CHB患者（PBMC、肝组织）研究指标：HBVDNA、ALT、HbsAg、CD8T细胞、CD4T细胞、r-IFN、CTLA-4、Bim、PD-1(关联性、客观性、灵敏性、特异性、精确性、观察性),AllparticipantswereHCVandHIVseronegativeandcytomegalovirus(CMV)seropositive.PatientswithCHBwerestratifiedbyHBVDNAlevelsaboveorbelow2,000IU/mL(determinedbyreal-timepolymerasechainreactionPCR),accordingtoEuropeanAssociationfortheStudyoftheLiver(EASL)guidelines.,AllCHBpatientsweretreatment-naiveatrecruitment;asubgroupofsevenpatientswasfollowedlongitudinallyaftercommencinglamivudineandadefovir(Table2).HepatitisBs-antigen(HBsAg)wasquantitatedwiththeArchitectassay.Pairedperipheralbloodandliverbiopsyspecimens(surplustodiagnosticrequirements)wereobtainedfromeightpatientswithCHB(Table1).,临床试验的伦理学问题,知情同意权和伦理学：ThestudywasapprovedbythelocalEthicalCommitteesandwritteninformedconsentwasobtainedfromallpatients.,病例特征,研究内容,CHB患者CD8T细胞中CTLA-4增加CTLA-4增高的HBV特异性CD8T细胞中Bim水平上升抗病毒治疗不能降低HBV特异性CD8T细胞CTLA-4和Bim的高表达阻断CTLA-4能减少HBV特异性CD8T细胞耗竭在乙肝病毒持续感染中CTLA-4对CD8T细胞的作用,CHB患者CD8T细胞中CTLA-4增加,1、健康人与CHB患者（空白对照），CD8T细胞数量、CTLA-4水平、以及CTLA-4分别与HBVDNA和r-IFN的关系。2、CHB患者和感染CMV和EBV患者（标准对照），外周PBC在体外刺激后，CD8T细胞数量、CTLA-4水平、以及CTLA-4分别与HBVDNA和r-IFN的关系。,CTLA-4增高的HBV特异性CD8T细胞中Bim水平上升,1、CTLA-4阳性的HBV特异性CD8T细胞与CTLA-4阴性细胞相比Bim水平差异。2、阻断CTLA-4后Bim的改变。证实CTLA-4通过Bim对HBV特异性CD8T细胞起作用。,抗病毒治疗不能使HBV特异性CD8T细胞中高表达的CTLA-4和Bim下降,7例未抗病毒治疗CHB患者用阿德福韦酯和拉米夫定抗病毒，观察病毒载量、HbsAg、HBV特异性CD8T细胞、以及HBV特异性CD8T细胞中CTLA-4、Bim的水平。（自身对照）,阻断CTLA-4能恢复HBV特异性CD8T细胞,1、分离CHB患者血中的HBV特异性CD8T细胞，用CTLA-4阻断剂或者IgG抗体培养，IFN-r的变化。2、加入阻断剂后，CHB患者与CMV、EBV感染者相比，HBV特异性CD8T细胞的反应性改变。,阻断CTLA-4能恢复HBV特异性CD8T细胞,3、肝脏淋巴细胞分离培养，用CTLA-4阻断剂，部分不能阻断。4、有报道，PD-1参与T细胞耐受，加入PD-1阻断剂，能部分阻断，同时加入CTLA-4、PD-1阻断剂能完全恢复HBV特异性CD8T细胞的功能。,研究内容,CHB患者CD8T细胞中CTLA-4增加CTLA-4增高的HBV特异性CD8T细胞中Bim水平上升抗病毒治疗不能降低高表达CTLA-4和Bim的HBV特异性CD8T细胞阻断CTLA-4能恢复HBV特异性CD8T细胞在乙肝病毒持续感染中CTLA-4对CD8T细胞的作用,实验方法,PeripheralBloodMononuclearCells(PBMCs)Isolation,Culture,andAnalysisofVirus-SpecificCD8TCells.IntrahepaticLymphocyteIsolation,Culture,andFunctionalAssay.Flow-CytometricAnalysisofTotalandVirus-SpecificCD8TCells.,实验方法,FordetectionofintracellularCTLA-4onvirus-specificCD8Tcellsexvivo,cellswerestainedwithhumanleukocyteantigenA2(HLA-A2)/c18-27,HLA-A2/e183-191,HLA-A2/e335-343,andHLA-A2/e348-357HBVdextrame