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一个调控拟南芥盐干旱胁迫响应的基因功能研究 摘要 借助已有的基因表达谱分析，发现拟南芥中一个功能未知的基因d r s l 被盐 和干旱诱导表达。然而，d s r l 基因是否在盐和干旱胁迫响应中起重要的作用 尚不清楚。 为阐明d s r l 基因在耐盐和抗旱中作用，获得了两个t o d n a 插入d s r i 基 因的功能缺失型等位系d s r l j 和d s r l 一2 ，本文研究了拟南芥野生型w t 和突变 体出，j 、出，一2 对盐和干旱胁迫响应的特征。研究结果如下： 1 在不同浓度的n a c l 胁迫条件下，d s r l j 突变体的存活率都明显高于野 生型：在1 7 5 m mn a c i 条件下，d s r l j 的存活率比野生型高出4 0 ：在1 2 5 m m 的n a c l 条件下，突变体d s r l j 、d s r l 2 比野生型w t 的发芽率分别高出2 1 6 2 和2 7 0 3 ；竖培实验中在10 0 m m 的n a c i 条件下，突变体d s r l j 、d s r l 一2 比野生型w t 的根长长1 5 c m ，突变体鲜重比野生型高4 5 m g 5 株。表明突变 体凼r j j 、出，j 一2 的耐盐能力显著高于野生型。 2 盐胁迫相关基因表达的q r t - p c r 分析结果也表明，这种耐受性的提高 可能与在盐胁迫下突变体d s r l j 、d s r l 2 中m y b 2 m y c 2 及其下游靶基因的表 达水平提高有关，表明d s r l 基因可能通过调控m y b 2 m y c 2 介导的信号转导 途径来调节盐胁迫响应。 3 在干旱胁迫条件下，突变体d s r l 、d s r l 2 的存活率显著高于野生型； 突变体d s r l j 、d s r l 2 对渗透胁迫的耐受性比野生型更强，且突变体体内可溶 性总糖和脯氨酸的积累均比野生型高，这表明突变体d s r l 、d s r l 一2 比野生型 更加耐受干旱胁迫。 4 干旱胁迫相关基因表达的q r t - p c r 分析结果表明，突变体d s r l j 、 d s r l 2 对干旱胁迫的耐受性可能与在干旱胁迫下突变体中脯氨酸合成基因 p 5 c s 及一些下游胁迫相关基因的表达水平升高有关。 5 a b a 发芽率实验中，在5 m m 的a b a 条件下，突变体d s r l j 、出厂_ 7 2 比 野生型发芽率分别高出2 9 7 3 和3 2 4 3 ，差异显著；而在a b a 竖培实验中 根长鲜重表型没有差异，相关胁迫基因的表达也几乎没有差异，说明突变体 出厂，j ，凼，j 一2 的耐盐抗旱性可能与a b a 依赖途径有关。 6 在k c l 、l i c l 胁迫实验中进一步证实了突变体d s r l j 、d s r i 2 耐盐性可 能与离子平衡机制相关，h 2 0 2 耐受又说明d s r l 基因也参与了活性氧清除机制 的调节，而甘露醇胁迫下的相关基因表达则说明了突变体d s r l 一，d s r l 2 高盐 及干旱胁迫的主要调节方式是通过渗透调节。 总之，所有这些结果表明，d s r l 基因在调控盐和干旱胁迫响应过程中起 着重要的作用。 关键词：拟南芥盐胁迫干旱胁迫d s r l 基因信号转导途径基因表达 a b a 依赖途径 i i f u n c t i o n a la n a l y s i so f t h eg e n ei n v o l v e di nt h e r e g u l a t i o no fs a l t d r o u g h ts t r e s sr e s p o n s e si n a r a b i d o p s i s a bs t r a c t e x p r e s s i o no ft h ed s r ig e n ee n c o d i n gau n k o w np r o t e i nw a sf o u n dt o b e i n d u c e db ys a l ta n dd r o u g h ts t r e s s e sb yu s i n gg e n ee x p r e s s i o nm i c r o a r r a ya n a l y s i s d a t a h o w e v e r ，i ti su n c l e a rw h e t h e rt h ed s r lg e n ep l a y si m p o r t a n tr o l e si nt h e r e g u l a t i o no ft h er e s p o n s e so fa r a b i d o p s i sp l a n t st os a l ta n dd r o u g h ts t r e s s e s t oe l a r i f yt h er o l eo ft h ed s r lg e n ei ns a l t d r o u g h t s t r e s sr e s p o n s e s ，w e s t u d i e dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fr e s p o n s e so fw i l d - t y p ea r a b i d o p s i sa n dm u t a n t s d s r i j ，d s r l 一2t os a l ta n dd r o u g h ts t r e s s e s t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 u n d e rd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fn a c ls t r e s sc o n d i t i o n s ，t h es u r v i v a lr a t e o fd s r l jm u t a n ti ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fw i l dt y p e i n17 5 m mn a c i c o n d i t i o n s ，s u r v i v a lr a t eo ft h em u t a n td s r l jw a s4 0 h i g h e rt h a nt h a to ft h ew i l d t y p e ；i ng e r m i n a t i o nr a t ee x p e r i m e n t ，i n12 5 m mn a c lc o n d i t i o n s ，t h eg e r m i n a t i o n r a t e so fm u t a n t sd s r l - 1 ，d s r l 一2w e r eh i g h e rt h a nt h ew i l dt y p e2 1 6 2 a n d2 7 0 3 ， r e s p e c t i v e l y ；u n d e rv e r t i c a lc u l t u r ee x p e r i m e n tc o n d i t i o n so f1o o m mo fn a c i ，t h e r o o tl e n g t ho fm u t a n td s r l - 1 ，d s r l 一2w a sa b o u t1 5c ml o n g e rt h a nt h a to ft h ew i l d t y p e ，f r e s hw e i g h to fm u t a n tw a sa p p r o x i m a t e l y4 5 m g 5 p l a n t sh i g h e rt h a nt h a to f t h ew i l dt y p e s u g g e s t i n gt h a tt h em u t a n t sd s r l l 。d s r l 一2a r em o r er e s i s t a n tt os a l t s t r e s st h a nt h ew i l dt y p e 2 q r t - p c ra n a l y s i so fs a l ts t r e s s - r e l a t e dg e n ee x p r e s s i o na l s os h o w e dt h a t e n h a n c e dr e s i s i t a n c eo fm u t a n t sd s r l 一1 ，d s r l 一2t os a l ts t r e s sm a yb er e l a t e dt ot h e i n c r e a s e si n e x p r e s s i o nl e v e l s o fm y b 2 m y c 2a n dt h e i rd o w n s t r e a mt a r g e t i n g g e n e s ，i n d i c a t i n gt h a td s r lg e n ec o u l dr e g u l a t em y b 2 m y c 2 一m e d i a t e ds i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a yt or e g u l a t es a l ts t r e s sr e s p o n s e s 3 u n d e rd r o u g h ts t r e s s ，t h es u r v i v a lr a t eo fm u t a n t sd s r l j ，d s r l 一2w e r e a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fw i l dt y p e ；a n dt h et o l e r a n c eo fm u t a n t sd s r l 1 d s r l - 2t oo s m o t i cs t r e s sw a sm o r er e s i s t a n tt oo s m o t i cs t r e s st h a nt h ew i l dt y p e ， a n d i n u n d e rd r o u g h ts t r e s sc o n d i t i o n s ，t h el e v e l so fm u t a n t ss o l u b l es u g a ra n d p r o l i n ea c c u m u l a t i o ni nm u t a n t sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s eo f t h ew i l d t y p e ，i n d i c a t i n gt h a t e n h a n c e dr e s i s t a n c eo fm u t a n t sd s r l 一1a n dd s r l 一2i s i i i a s s i a c t e dw i t hi n c r e a s e s i nt h e l e v e l so fs o l u b l e s u g a r a n d p r o l i n e a c c u m u l a t i o n m o r et o l e r a n tt h a nw i l d t y p et od r o u g h ts t r e s s 4 q r t - p c ra n a l y s i so fd r o u g h ts t r e s s r e l a t e dg e n ee x p r e s s i o ns h o w e dt h a t e n h a n c e dt o l e r a n c eo fm u t a n t sd s r l 一_ a n dd s r l 一2t od r o u g h ts t r e s sm a yb er e l a t e d t oi n c r e a s e si nt h ee x p r e s s i o nl e v e l so ft h ep r o l i n es y n t h e s i sg e n ep 5 c s a n ds o m e s t r e s sd o w n s t r e a mg e n e su n d e rd r o u g h ts t r e s s 5 i nt h ea b ag e r m i n a t i o ne x p e r i m e n t s ，i n 5 m ma b ac o n d i t i o n ，t h e 2 e r m i n a t i o nr a t e so fm u t a n t sd s r l ja n dd s r l 2w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h e w i l d t y p e 2 9 7 3 a n d3 2 4 3 ，r e s p e c t i v e l y ，i n d i c a t i n gr e s p o n s e s o fm u t a n t s d s r1 ia n dd s r l 2t os a l ta n dd r o u g h ts t r e s s e sm a yb ea b ad e p e n d e n t 6 i nk c l a n dl i e ls t r e s se x p e r i m e n t sf u r t h e rc o n f i r m e d e n h a n c e ds a l t t o l e r a n c eo fm u t a n t sd s r l j ，a n dd s r l 2a r ew a sa s s o c i a t e dw i t ht h em e c h a n i s mo f i o nb a l a n c et os a l tt o l e r a n c e i na d d i t i o n ，m u t a n t sa l s os h o w e d ，t h e r el s a n o t h e l e x p l a n a t i o no fe n h a n c e dh 2 0 2r e s i s i t a n c ec o m p a r e dw i t ht h ew i l dt y p e ，m u t a n t s s u g g e s t i n gt h a te n h a n c e ds a l t d r o u g h tr e s i s t a n c eo fm u t a n t si s a l s oa s s i c a t e dw l t n o x y g e ns c a v e n g i n gm e c h a n i s m i ns u m ，a 1 1t h e s er e s u l t ss h o wt h a td s r lg e n ei nt h er e g u l a t i o no fs a l t a n d d r o u g h ts t r e s sp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h er e g u l a t i o no fs a l ta n dd r o u g h t s t r e s s r e s p o n s e s k e y w o r d s ：a r a b i d o p s i s ；s a l t s t r e s s ；d r o u g h ts t r e s s ；d s r lg e n e ；s i g n a l i n g t r a n s d u c t i o np a t h w a y ；a b ad e p e n d e n tp a t h w a y i v 插图清单 图1 1 高等植物体内活性氧组分清除体系7 图1 2 干旱胁迫诱导基因在胁迫耐受中的作用及响应1 l 图1 3 拟南芥植株形态图1 1 图2 1 实验技术路线图2 6 图3 1 野生型w t 和d s r l j 、蕊，j 2 突变体的d s r l 基因转录水平分析2 7 图3 2d s r 基因的组织特异性表达2 8 图3 3d s r l 基因随时间在野生型中表达量的变化2 8 图3 4d s r l j 、d s r l 2 两个突变体的t o d n a 插入位点2 8 图3 5d s r l 编码蛋白同源进化树2 9 图3 - 6d s r l 同源氨基酸序列比对3 0 图3 7 土培野生型w t 和西r j j 、d s r l 一2 两个突变体的生长表型3 1 图3 8m s 培养野生型w t 和d s r l j 、d s r l 2 两个突变体的生长和发育3 2 图3 1 0n a c l 胁迫下野生型w t 与d s r l j 突变体移栽后的表型比较3 3 图3 1 1n a c l 胁迫下野生型w t 与d s r l j 突变体移栽后的存活率比较3 3 图3 1 2n a c l 胁迫下野生型w t 与突变体出，j 、d s r l 一2 的发芽率3 4 图3 。1 3n a c l 胁迫下野生型w t 与突变体d s r l i 幽，j 一2 的发芽率比较3 4 图3 1 4n a c l 胁迫下野生型w t 与突变体西，j j 、d s r l 一2 的竖培表型3 5 图3 15n a c l 胁迫下野生型w t 与突变体d s r l | 、凼，j 2 的根长和鲜重对比3 6 图3 1 6n a c l 胁迫下野生型w t 与突变体d s r l j ，d s r l 一2 相关基因的表达3 7 图3 1 7k c l 、l i c l 胁迫下野生型与突变体d s r l ，、西，j 一2 的竖培表型3 8 图3 1 8k c l 、l i c l 胁迫下野生型与突变体d s r l j 、d s r l 2 的根长和鲜重对比3 9 图3 1 9m a n 胁迫下野生型w t 与突变体d s r l j 、d s r l 一2 的发芽率4 0 图3 2 0m a n 胁迫下野生型w t 与突变体d s r l j 、d s r l 2 的发芽率比较4 0 图3 。2 1m a n 胁迫下野生型w t 与突变体出，j j ，幽，- j 2 的竖培表型4 1 图3 2 2m a n 胁迫下野生型w t 与突变体d s r l j 、d s r l 2 的根长和鲜重对比4 1 图3 2 3m a n 胁迫下野生型w t 与突变体d s r l j 、d s r l 2 相关基因的表达4 3 图3 2 4 野生型与突变体出厂j j 在土壤干旱处理后的表型4 4 图3 2 5 野生型与突变体凼，、幽，2 同时在土壤干旱处理后的表型4 4 图3 2 6 野生型与突变体d s r l j 、d s r l 2 单独在土壤干旱同步处理后的表型4 4 图3 2 7 野生型与突变体d s r l j 、d s r l 2 离体叶片失水表型及失水率对比4 6 图3 2 8 野生型与突变体出厂j j 、d s r l 2 叶片含水量对比4 6 图3 2 9 干旱处理后的可溶性总糖与脯氨酸含量的变化4 7 图3 3 0 干旱胁迫下野生型与突变体d s r l 7 ，d s r l 2 中d r e b 2 a 基因的表达4 8 i x 图3 3 l 干旱胁迫下野生型w t 与突变体d s r l j 、丞，j 一2 中相关基因的表达4 9 图3 3 2 干旱胁迫下野生型与突变体d s r l j 、d s r l 2 中脯氨酸相关基因的表达5 0 图3 3 3a b a 胁迫下野生型w t 与突变体凼，7 j 、d s r l 2 的发芽率5 1 图3 3 4a b a 胁迫下野生型w t 与突变体d s r l 、d s r l 2 的发芽率比较5 2 图3 3 5a b a 胁迫下野生型w t 与突变体d s r l j 、d s r l 2 的竖培表型5 3 图3 3 5a b a 胁迫下野生型w t 与突变体出，j j 、d s r l 2 的根长和鲜重对比5 3 图3 3 7a b a 胁迫下野生型w t 与突变体凼，i j j 、凼，j 2 相关基因的表达5 4 图3 3 8h 2 0 2 胁迫下野生型w t 与突变体凼，j 、豳，2 的发芽率5 5 图3 3 9h 2 0 2 胁迫下野生型w t 与突变体凼，、西，- j 7 2 的发芽率比较5 5 图3 4 0h 2 0 2 胁迫下野生型w t 与突变体出，j j 、出，j 2 的竖培表型5 5 图3 4 1h 2 0 2 胁迫下野生型、胛与突变体d s r l j ，出，j 。2 的根长和鲜重对比5 6 图4 1 干旱及盐胁迫下植物信号转导途径及基因表达调控网络一5 8 图4 2 干旱及盐胁迫下植物信号交叉转导调控网络5 9 插表清单 表2 一l 大量元素1 5 表2 2 微量元素15 表2 3m s 培养基配方15 表2 - 4 土培营养液配方1 6 x 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得金胆工些太堂 或其他教育机构的学位或证t s 而使川过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签字： 签字日期：沙t o 年厂月f - 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金目曼工些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权盒 旦曼王些盘堂可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名：多多群 导师签名： 签字日期：7 o l 矿年哪日 学位论文作者毕业后去向： 作单位： 通讯地址： 签字日期：彦一年f 月谚e t 2 电话： 邮编： 致谢 首先非常感谢我的导师曹树青教授! 本论文的研究工作是在曹树青教授的 精心指导和悉心关怀下完成的，论文从选题设计到写作审定无不凝聚着导师的 智慧与心血。导师严谨的治学态度、渊博的知识、敏锐的专业思维、无私奉献 的科研精神使我深受启迪。两年半来，导师在学业方面给予我悉心全面的指导， 在生活上对我们也是关怀备至，并在授业解惑的同时教授我为人之道，其言传 身教将使我终身受益。在论文反复推敲修改的这段日子里，导师严谨认真、一 丝不苟、求实创新的科学精神再一次深深地感动着我，影响着我。值此论文完 成之际，谨向曹老师表示我最诚挚的谢意和深深的祝福! 本论文的顺利完成，离不开各位老师和朋友的关心和帮助。 在两年半的学习期间，曾得同到实验室任永兵，宗凯，孙佳佳，吕申超， 王敏的关心和帮助以及师姐边小会的大力支持，感谢刘锐锋，于淼，蒋磊在完 成本实验时对我的帮助，感谢江力老师、孔维文老师对我实验论文提出的宝贵 建议和指正。实验室全体成员都为实验的开展营造了良好的环境，没有他们的 帮助和支持是没有办法完成我的硕士学位论文的，同窗之间的友谊永远长存。 非常感激我的父母长期以来对我的支持和鼓励，让我可以有勇气面对所有 的困难和挫折，在此谢谢你们! 感谢所有曾经为我提供过帮助的师长，同学，朋友。不仅在科研的道路上， 更在人生的道路上，因为有你们而变得更加精彩! 最后，谨向所有指导、帮助、关心和支持过我的各位老师、同学和朋友一 并致以衷心的感谢! v 汪洋 二零一零年四月于合肥 1 1 植物耐盐机制研究进展 第一章绪论 随着全球水资源短缺以及土壤沙化、盐化问题越来越严重，盐胁迫已经成 为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要限制因素【lj 。土壤盐渍化问 题是长期困扰世界农业生产的一大难题。世界上大约有3 3 3 亿h m 2 土地具有 不同程度的盐渍化，占陆地面积的7 。我国有着占全国可耕地面积的四分之 一的盐渍化土地，大约20 0 0 万h m 2 。目前世界人口的基数过大及许多国家城 市化加剧，可耕地面积急剧下降，以及不适当的农业措施都会造成了大量良田 次生盐渍化【2 】，再加上全球的粮食危机，世界农业正面临着极大的挑战。因此， 如何有效地开发和利用盐渍化土地，提高农作物尤其是高产农作物的耐盐性进 而提高产量是目前我国乃至世界农业生产中十分热门的研究课题p j 。 近年来国家对盐碱地的开发和利用十分重视，使得对盐生植物的研究成为 一门热门话题。常规的改善灌溉、物理洗盐和化学法等治理土壤盐碱化措施存 在增加成本及治标不治本等缺点，因此克隆耐盐碱基因，进而培育转耐盐碱基 因植物足解决土壤盐渍化的重要途径。目前，许多甜土模式植物经盐胁迫后耐 盐基因克隆的研究已经取得很大的进展【4 j ，并且进行了转基因研究。随着现代 分子生物学技术的飞速发展，克隆、鉴定目的基因，将目的基因转化到目标植 物中并获得转基因工程植株，使植物育种取得了突破性进展p j 。 目前，国内外学者针对盐胁迫对植物的伤害以及植物对盐渍环境的适应机 理，在整体水平、器官水平、细胞水平、分子水平等不同层次上进行了深入地 研究，已经克隆出了一些盐耐受的基因，并通过耐受基因的转化，进而获得了 一些对盐耐受增强的转基因植物，展示了美好的发展远景。 l 1 1 1 盐胁迫对植物的影响 盐胁迫会影响植物几乎所有重要的生命过程，如生长发育、光合作用、蛋 白合成、脂类和能量代谢等。虽然盐胁迫下所有植物的生长都会受到抑制，但 是不同植物对于致死盐浓度的耐受水平和生长抑制率是不同的。通常土壤含盐 量一旦达到0 2 0 5 就不利于植物的生长，而盐碱土的含量却高达0 6 1 0 0 ，因此会对植物造成严重伤害【6 】。盐胁迫不仅对非盐生植物而且对盐生植 物都会产生伤害作用。盐胁迫对植物的伤害主要包括两个方面：( 1 ) 高盐土壤中 的各种离子( 女f f n a + 、m 9 2 + 、c u 2 + 、z n 2 + 等) 进入根细胞，达到毒害水平后破坏胞 内离子平衡，从而产生离子毒害效应；( 2 ) 土壤中的高盐降低土壤渗透势，使根 细胞吸水困难，对植物细胞产生渗透胁迫效应。离子毒害与渗透胁迫是初级胁 迫，作用于植物时可引起氧化胁迫等一系列次级胁迫fj 。 1 1 1 1 盐胁迫对植物形态生长发育的影响 盐胁迫对植物生长发育有着多方面的影响，包括损伤膜系统的完整性、抑 制酶的活性，增加养分需求，破坏叶绿体的功能，引起新陈代谢功能紊乱等哺】。 盐胁迫对个体生长上有着显著的影响，在整体上表现为盐胁迫抑制植物组织和 器官的生长，使得发育过程加速，营养生长期和开花期会缩短，以及会减少禾 本科植物的分粟数和籽粒数等。植物在高盐胁迫几分钟后，生长速率就会下降， 且下降程度与根部渗透压呈正比。研究表明，高盐胁迫短时间内老叶上会出现 不同程度损伤，几周内就会导致老叶死亡，时间更长时，嫩叶死亡乃至整个植 株的死亡。长时间处于高盐条件下，植物叶片的面积会缩小【9 j ，这可能是盐分 影响了细胞的分裂以及细胞延伸速率或是减少了细胞的延伸时间，这可能是盐 诱导的c a 2 + 缺乏造成，补充c a 2 + 后此种伤害会减轻。n a c l 胁迫下外加一定浓度 的c a c l 2 可以缓解盐胁迫对生长的抑制，说明这种抑制作用既有渗透效应也有离 子效应。盐主要是使得植物光合面积的减小进而造成植物碳同化量的减少。这 是因为n a c i 显著抑制由葡萄糖合成壁多糖的过程，增强壁多聚体氧化交联的潜 势，从而抑制细胞生长【l o 】。 1 1 1 2 盐胁迫对植物生理代谢过程的影响 在高盐逆境条件下，植物形态会发生一系列变化，这些都是与植物内部的 生理代谢过程密不可分的。 1 1 1 2 1 盐胁迫对植物光合作用的影响 很多报道已经证明盐胁迫条件下会影响植物光合作用，也有研究证明，低 盐刺激有时会对光合作用起到促进作用】。一般情况下，盐胁迫对非盐生植物 的光合作用具有抑制作用，而且随外界盐浓度的提高，被抑制的程度会随着增 大【1 2 】。盐胁迫降低植物光合作用，在较长期盐胁迫下，叶肉导度和光合面积下 降，7 这是植物生长受抑制的主要原因【1 3 】。光合作用下降一般可能是由以下几个 方面造成的：( 1 ) 盐胁迫会使得叶绿体中的类囊体膜成分以及超微结构发生改 变；( 2 ) 盐胁迫条件下会影响植物体内叶绿素含量以及光能的吸收和转换；( 3 ) 盐胁迫对光合酶以及与光合作用相关的酶都会产生影响。( 4 ) 盐胁迫会诱导脱 落酸在植物体内的合成，进而促进叶片气孔的关闭，使c 0 2 的吸收受阻，导致 植物产生生理干旱。( 5 ) 盐胁迫引起衰老叶片增多等等。除此之外，盐胁迫还 会对光合电子的传递产生不利的影响。以上这五个方面都构成了盐胁迫对植物 光合作用的破坏和干扰。 1 1 1 2 2 盐胁迫对植物体内化学物质的影响 一般盐胁迫逆境条件下，植物体内大部分化学物质都会受到影响。比如植 物体内的渗透调节物质、激素、养分矿物质、细胞内保护酶等都会受到不同程 2 度的影响。 植物体内的主要渗透调节物质是脯氨酸( p r o l i n e ) 禾1 溶性糖。盐胁迫下植物 细胞可通过调节细胞内游离脯氨酸的含量以及可溶性糖的含量来平衡自身细胞 渗透势。有些报道表明无花果扦插苗经2 5 0m mn a c l 处理时，叶片中游离脯氨 酸的含量会明显增加，而且游离脯氨酸质量摩尔浓度随着n a c l 浓度的增加呈“s ” 型变化，当n a c l 浓度为2 0 0 3 0 0m m 时，游离脯氨酸的增加量达到峰值i l4 。惠 红霞等【1 5 】报道，盐胁迫下枸杞叶片中的可溶性糖含量与对照相比总的趋势是呈 增加的。可溶性糖含量随盐浓度的增加呈现出先上升后下降的趋势，当n a c i 的 量小于0 5 时，可溶性糖含量随盐浓度增加而上升；含n a c i 的量为o 5 时，可 溶性糖的含量达到最大值后，随着含n a c i 量的增加开始呈现缓慢下降的趋势。 除脯氨酸和可溶性糖以外，甜菜碱和可溶性蛋白都是植物体内的渗透调节剂， 在盐胁迫逆境条件下，植物细胞调节这些渗透调节物质来平衡自身的渗透压和 维持胞内各种营养元素，来抵抗或者避免盐胁迫的危害。 植物激素对植物盐耐受性有着重大的影响，有些激素可提高植物对盐的耐 受性，它可以抵消盐胁迫以及促进植物生长。脱落酸( a b s c i s i c a c i d ，a b a ) ，是一 种逆境激素，它几乎存在于所有的高等植物中，在植物种子发育以及植物对逆 境条件的适应过程中都起着至关重要的调控作用【l6 1 。a b a 是在众多植物激素 中，受环境条件影响最大的一种【1 7 】。研究表明，多种逆境胁迫条件下，很多植 物中的a b a 水平会有明显的上升 】s 】，且外源a b a 处理后使得植物所呈现出的形 态和生理上的反应都类似很多逆境条件的刺激。 植物在矿物质元素的吸收过程中，如果出现盐胁迫时，盐离子会与各种营 养物质元素相互竞争，进而造成矿物质营养胁迫，这样就打破了植物体内的离 子平衡，从而影响了植物的正常生长发育。高浓度n a + 会严重阻碍植物对k + 的吸 收和运输，从而导致k + 缺失，很多植物中，n a + 和c l 的含量是随n a c l 处理浓度 的升高而增加，然c a 2 + , k + 和m 9 2 + 的含量会明显降低【l 。 超氧化物歧化酶( s o d ) 是生物体中比较重要的保护酶类之一。s o d 能够有效 清除生物体内的氧自由基，它的活性会随着n a c i 胁迫程度的增加而逐渐降低。 过氧化物酶( p o d ) 以及超氧化物歧化酶( s o d ) 在生物体内的主要功能是消除盐 胁迫时所诱导产生的胞内活性氧，抑制膜内不饱和脂肪酸的过氧化作用，进而 维持细胞质膜的稳定性和完整性，以提高植物对盐胁迫的适应性。研究表明， 在盐胁迫下，经外源谷胱甘肽( g s h ) 处理后，大麦中的p o d 、s o d 、过氧化氢酶 ( c a t ) 谷胱甘肽还原酶( g r ) 的活性被明显的提高，能延缓盐胁迫对生物膜的损伤 l l 引，从而消除或者避免伤害。 1 1 1 2 3 盐胁迫对植物其他生理代谢的影响 在盐胁迫条件下，除了会影响到植物的光合作用、碳代谢以及植物激素的 含量等生理代谢之外，盐胁迫还会影响植物呼吸作用、氮素和蛋白质代谢、硫 代谢、脂代谢以及生物固氮活动的一系列生理代谢过程的改变。再低盐条件下， 植物的呼吸作用增强，促进了蛋白质的合成，进而使得植物的生理活动会朝着 有利于其适应盐胁迫的方向发展，所以经过一段时间的低盐环境适应后，一些 植物可以对高盐胁迫产生耐受。高盐浓度下，植物的呼吸作用受到阻碍，蛋白 质合成被抑制，光合作用也被抑制，这样就会使植物的生长发育受到严重的阻 碍。脂类对很多生理胁迫的耐受都起着很重要的作用。不饱和脂肪酸可以消除 水分胁迫和盐胁迫的危害。研究表明，在n a c l 浓度小于4 5 m m 的低浓度条件下 时，花生中脂类含量会增加，而在高盐下会降低【2 0 1 。 1 1 1 3 盐胁迫对植物细胞超微结构的影响 盐胁迫在很大程度上是通过破坏植物生物膜的生理功能，从而引起对植物 的伤害作用，植物的生物膜系统是盐胁迫伤害的原初部位和主要部位。盐胁迫 条件下，植物细胞内n a + 会短时间内大量积累，导致活性氧产生和清除之间的动 态平衡失衡，这样能够启动膜脂过氧化和膜脂脱脂作用，造成膜蛋白遭到破坏， 从而损伤膜结构。据报道，盐胁迫条件下，超氧化物歧化酶s o d 活性会降低， 从而使得植物自身清除氧自由基的能力降低，促进了自由基引发的膜脂过氧化 的加剧，植株体内丙二醛( m d a ) 增多，从而产生盐害。 盐胁迫直接影响细胞的膜脂和膜蛋白，使质膜透性增大和膜脂过氧化，从 而影响膜的正常生理功能。然而，对植物生物膜系统的破坏会影响到植物细胞 内各个由膜系统分化出来的细胞器以及细胞器里的各种超微结构。在盐胁迫条 件下，不同的胁迫浓度、不同的胁迫时间对细胞器产生不同的影响和伤害，植 物细胞内各种细胞器的超微结构会发生不同的变化，甚至同一细胞内的不同细 胞器对盐的耐受性也会有差异，受盐胁迫的破坏程度差别很大。 叶绿体一直是研究结构与功能相关性的理想材料之一，叶绿体结构的形成 与作物产量主要受光合作用支配，而光能的吸收、电子的传递、还原能力的形 成和初级光合产物的形成都有关。盐胁迫使叶绿体中类囊体膜成分与超微结构 发生改变。盐胁迫下，甘薯叶肉细胞中叶绿体的类囊体膜膨胀，大部分破碎【2 u ； 马铃薯叶绿体基粒垛叠的数目和高度降低，类囊体膨胀，淀粉粒变大 2 引。 盐胁迫下，线粒体结构被破坏后，会使呼吸作用的组织性被打乱，从而造 成能量的浪费。有研究发现，水分胁迫会使玉米幼苗根尖细胞线粒体数目增多， 这可以为植物逆浓度梯度拒盐、逆浓度吸收矿物质元素、盐分区域化、合成有 机渗透调节物质以及盐诱导的变化调节提供更多的能量【2 3 1 。 液泡是植物成熟细胞最大的细胞器，在细胞化学能利用、信号传导、膨压 调节中起重要作用。盐胁迫下液泡的增多和增大显然与其抗盐性能有关【24 1 ，液 泡的增多和增大一是有利于收集一些破坏了的膜系统片段。二是有利于收集一 部分n a + 、c 1 ，使盐分区域化。植物细胞所吸收的n a + 、c 1 。主要分布于液泡中作 为渗压剂【2 5 1 。 4 1 1 2 植物耐盐的机理 植物耐盐机制的研究涉及多个方面，是个相当复杂的问题，很多机制目前 尚不十分清楚，有些机制虽然己研究得相当深入，但还不能揭示植物抗盐性的 实质。一般来讲，植物的抗盐性与盐分的吸收、运输、排泄、分配、生物膜功 能、离子区域化作用以及抗盐物质的合成和积累等密切相关。我们在这里把植 物耐盐机制归纳为三个方面：渗透调节、离子调节、活性氧清除机制。 1 1 2 1 渗透调节 当植物受到盐胁迫时，外界渗透势比细胞内的渗透势低，从而出现水分胁 迫( w a t e rs t r e s s ) ，会引起植物生理干旱，只有当细胞内渗透势低于外界时，才能 够吸收水分【2 6 1 。在盐胁迫下，植物通过从外界选择性吸收和积累大量的无机盐 离子来降低水势，同时合成和积累一定浓度的有机溶质作为渗透调节剂共同进 行渗透调节，从而维持植物体内存在一定的水分来调节细胞内外渗透压的平衡。 这些渗透调节物质油糖类( 蔗糖和果糖) ，多元醇( 甘油、甘露醇、山梨醇、海藻 糖、果聚糖等) ，含硫化合物( 硫酸胆碱、2 甲基硫代异丙醇) ，季胺盐，以及氨 基酸及其衍生物( 脯氨酸、甘氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱) 等【2 。 在细胞质中累积的渗透调节物质主要是一些对酶的正常功能没有影响的有 机化合物，且数量有限，最常见的是脯氨酸【2 8 1 。盐胁迫条件下，脯氨酸含量的 变化是由于其合成过程增强而氧化速率下降所造成的。脯氨酸的作用一般被认 为是用来平衡液泡中的高浓度盐分，避免细胞质脱水，但是关于脯氨酸与盐胁 迫之间的关系到目前还没有定论。有研究表明，脯氨酸积累与耐盐程度呈负相 关【2 9 , 3 0 1 ，因此认为脯氨酸得累积可能是植物受到盐害的结果【3 1 1 。然而，更多的 研究者认为，脯氨酸累积是植物为了对抗盐胁迫采取的一种自身保护性措施 3 2 , 3 3 】。此外，脯氨酸还具有其他的保护性作用，如防止一些酶类变性：作为碳、 氮的能量储备及自由基清除剂；调节细胞质传递p h 值，防止细胞质酸化等。 可溶性糖也是一种比较重要的渗透调节物质，在盐胁迫早期，植物中可溶 性糖的含量增加，但是到了盐胁后期它的含量却又降低，这可能是呼吸作用的 增强和光合作用的降低的交互作用所致。 甜菜碱( g i y c i n e b e t a n i n e ) 的累积有利于增强植物对盐的耐受性，它具有维持 细胞内与外环境渗透势平衡的稳定复合蛋白四级结构。它是位于细胞质中的一 种无毒渗透保护剂，它的累积不会影响许多代谢中重要酶类的活性，并能接触 盐胁迫对许多酶类的伤害或者保护酶类的活性【3 4 。 1 1 2 2 离子调节 盐胁迫下，植物细胞失水，引起渗透胁迫，为了保持细胞内渗透势平衡与 水分平衡，植物细胞可以通过有选择性地对无机离子和小分子有机代谢产物的 积累、转运和区域化等机制缓解渗透胁迫，保持细胞水平衡。盐分胁迫下，大 5 多数作物中都存在着离子区域化现象。离子区域化功能在盐生植物和非盐生植 物是不同的，盐生植物一般会将吸收的盐离子通过跨膜运输累积到液泡，与细 胞质分隔开来，使得细胞的渗透势降低从而吸收外界水分，使细胞质免受于盐 离子对生理代谢的伤害：而非盐生植物则是会尽量减少对有害盐离子的吸收， 同时将吸收的有害盐离子输送到衰老的组织中储存，这样就牺牲衰老的组织来 保护幼嫩组织【35 1 ，或者它会在细胞质中合成有机小分子物质来平衡细胞内外渗 透势。离子区域化依赖于离子的跨膜运输【3 6 】，有以下三种方式：质子泵、离子通 道和离子载体以及n a + h + 逆向运输载体。盐胁迫下，主要是n a + 会破坏植物体内 的离子平衡，因此，植物一般都通过对离子的选择性吸收或则离子区域化来降 低n a + 毒害或则将过多的n a + 排出植物体内。 1 1 - 2 - 3 活性氧清除机制 正常生理条件下，植物细胞中会产生活性氧组分( r o s ) ，正常条件下不会对 植物产生很大的伤害，但是盐胁迫条件下，植物细胞结构中会产生大量的r o s ， 会造成叶绿体、质膜、蛋白质、核酸等的氧化伤害，从而影响到植物的正常生 理代谢【3 。7 1 。为了保护细胞免受过量r o s 的伤害，植物体发展了一套完整防御系 统，即活性氧清除系统，包括酶系统和非酶系统。如图1 1 【38 1 ，它们协同作用， 共同发挥作用来抵御盐胁迫诱导的氧化伤害，酶系统主要包括：超氧化物歧化 酶、过氧化物酶、过氧化氢酶( c a t ) 、抗坏血酸过氧化物酶(