（植物病理学专业论文）葛集壶菌的主要生物学特性及其rDNA的ITS分析.pdf

西南大学硕士学位论文摘要 葛集壶菌的主要生物学特性 及其r d n a 的i t s 分析 植物病理专业硕士研究生：吉同宾 指导教师：谭万忠教授吴云研究员 摘要 葛集壶菌( s y n c m t r 妇p u e r a r a em i y ，异名：小集壶菌$ m 向，鼬辨删衄蛔l ( r a t ) g a u m ) 又称为葛拟锈病菌，是野葛上的一种专性内寄生菌，侵染野葛形成不规则瘤状形膨大，引致 “葛拟锈病”，瘤状体内着生许多病原菌的营养体，阻碍导管中水分和无机营养物质的运输， 最终导致野葛的枯死。本研究主要探讨该病菌的发生动态、生物学特性、接种条件，在此基 础上探索病菌核酸的获取方法，并分析核糖体d n a ( r d n a ) 的序列，为葛集壶菌在野葛生物控 制中的应用和建立该菌的分子快速检测技术奠定基础。研究所获得的主要结果如下； 1 、从2 0 0 6 年3 月到1 2 月对广州市葛拟锈病的发生动态进行调查调查结果表明：该病 每年4 1 2 月在野葛上均有发生，在梅雨季节，病害迅速发生并蔓延，9 ，1 0 月台风较多，雨 水充足，发病重，至1 2 月份，病害的发生仍比较严重，但叶片上病斑的大小基本上已无变化， 且随着叶片的枯黄凋落，病情指数呈下降趋势 2 ，测定葛集壶菌的主要生物学特性，以确定游动孢子囊萌发释放游动孢子的适宜温湿度 等条件结果表明：集壶菌的孢子囊在1 0 3 5 c 之间均可以萌发而萌发的最适温度为1 5 2 0 ，平均萌发率可达到4 4 9 3 1 但随着温度的升高或降低，萌发率逐渐下降：当温度为3 5 时，萌发率仅为2 4 i 孢子囊的致死温度约为4 6 c ；孢子囊在i 为3 1 l 的无菌水中均可 以萌发，在p h6 8 时，孢子囊的平均萌发率可达到4 3 2 ，而偏碱和偏酸对孢子囊的萌发均 有不同程度的影响；不同的营养条件对孢子囊的萌发影响较小，不管是在没有营养的无菌水 中还是在营养丰富的葡萄糖、蔗糖等溶液中，都可以萌发；孢子囊的萌发不受光照条件的 影响，在2 4 h 连续光照、2 4 h 连续黑暗和1 2 h 光照1 2 h 黑暗交替3 个处理下的孢子囊萌发宰 西南大学硕士学位论文摘要 分别为4 3 2 、4 1 - 5 和4 2 6 7 3 ，采集成熟的葛集壶菌接种野葛，分别选用不同的方法和条件，以测定接种温度和湿度 对葛集壶菌侵染野葛的影响实验结果表明：在1 8 c 和时。接种发病率最高，达8 3 7 ： 保湿培养时间为6h 时可以接种成功，但接种发病率只有1 1 1 ，随着保湿时间的延长，发病 率逐渐增大，当接种保湿4 8h 时，发病率可以达到8 3 7 4 、分别从发病野葛、粉葛但t h o m s o 脯& n n l ) 和山葛僻m o n t a n am c r o 上获得病原物集壶 菌固w 缈椭mp u * r a r a ) 的孢子囊堆，用其作材料进行了不同d n a 提取方法的效果比较，同 时对来自以上3 种不同植物菌株的r d n a i t s 进行了克隆和序列分析结果表明：改良的氯化 苄法获取基因组d n a 的效率最高，单孢子囊破碎法释放出的d n a 作为模板，然后进行p c r 扩增也可以满足i t s 的克隆和分析；来源于野葛和粉葛菌株的i t s l - 5 8 s r r s 2 分别为8 5 6b p 和9 0 7b p ，同源性为9 2 ；而山葛菌株的i t s l - 5 8 s o f t s 2 为1 1 4 8b p ，与野葛和粉葛菌株的同 源性分别为5 4 和5 5 由此推断，粉葛与野葛上的菌株可能为同种下不同变种，而山葛上 的菌株为另一个种：或者3 种植物上的菌株分别为3 个不同的集壶菌种 关键词：葛集壶菌野葛生物学特性接种条件r d n a 序列分析 n 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t a n a l y s e so fb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n di t si n r i b o s o m a ld n ao fs y n c h y t r i u mp u e r a r i a e c a n d i d a t c ：t o n g - b i nn 1 s u p e r v i s o r s ：w a n - z h o n g t a n la n d y u n w f f 2 1 s c h o o l o f p l a n t p r o t e c t i o n , u n i v e r s i t y o f s o u t h w e 观c b o n g q i 鸩, 加0 7 1 6 , c h i n 2 u s d a f o r e s t s e r v i c e - f o r e s t h c a l t h t e c l m o l o g y e a t e q m r i s e t e m n , m o r g n t o w n , w v 2 6 5 晒。u s a a b s t r a c t a saa o x i m ma n dc i a 】m g i n gw e e d , i m d z u 艄s e r i o t mh a r mt o o l o g y , 抛删嘛a n d i n d u s t r yi nu s a t h e r ea m a n yb i o c o n t r o lf a c t o r si nc h i n aw h c i tk u d z uo r i g i n a t e d 劬l c 向墙锄 p u e r a r i ai sap a r a s i t i cf u n g u so l lk u d z ua n di t 翻nb r i n gf g r i o u sl e a f 掣ms y m p t o m so nl e a v e so f k u d z u i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s , d e v c l o p n 坼n t s , i n o c u l a t i o nc o n d i f i o 雎w e r e i n v e s t i g a t e d ，t h et e c h n i q u e sf o re x t r a c t i n gr i b o m a ld n a ( r d n a ) w m 伽弘i i e d ，a n dt h er d n a s e q u e n c ew a sa n a l y z e d 1 t h e p s e u d o - r u s t d i s e a s e 删b y & p u e r a r a e o i lp u o a o b a t ap 1 m t si ng u a n g d o n g p r o v i n c ew a ss t o r e y e di nm a r c ht od e c e m b e r , 2 0 0 6 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed i s e a s ew a sp r e s e n t f r o ma p r i lt od e c e m b e r , a n di td e v e l o p e dq m c h y d u r i n gt h er a i n y 秘锄锄，t h e ni tb e c a m e 鹳怵i n s e p t e m b e ra n d0 d o b 日b e c a u s eo fa b u n d a n tr a i na n ds t r o n gt y p h o o n , f i n a l l yi ti r c m i l m c ds e r i o u si n d e c e m b e r , t h o u g hs p o th a da t i t t l ec h a n g ea n dt h ed i s e a s ei n d e xh a v ed e c r e a s e dw i t ht h ef a l l i n go f l e a v e s 2 b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fs p u e r a r i a ew c r l gs t u d i e dt of i n do u tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n so f s p o n m g i u mg e w n l n a t i o n t h er e s u l ts h o w c dt h a ts p o m s i u mc o u l dg e r m i n a t ea t1 0 - 3 5 ( 2 ；t h e o p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s1 5 加w i t ht h eg e r m i n a t i o nr a t eo f4 4 9 3 ：t h e 叩o m g i mg c r m m a f i o n r a t ew a sr e d u c e da tt e m p e r a t u r e sl o w e rt h a n1 5 c a n dh i g h e rt h a n2 0 c ；t h eg c r m i n a t i o nr a t ew i l l s o n l y2 4 砒3 5 c ；t h el e t h a lt e m p e r a t u r eo ft h es p o n m g i u mw a s4 6 t h eo p t t m lp hw 柚6 - 8 w i t hg e r m i n a t i o nr a t eo f4 3 2 t h en u t r i t i o nh a r d l ya f f e c t e dm g i u m g e n n i n f i o na n dt h e m 西南大学硕士学位论文a b s t r a c t s p o r a n g i t t mg e r m i n a t e de v c l l l i ns 址矗l ew a t e r t h e l i g h th a dl i t t l ei n t l u e n e e s p o r a n g i u m g e r m i n a t i o na n ds p o r a o g i ag e n n i n a t e a tu n d e rb o t l al i g h t a n dd a r k n e s s ；i m d a ri m l i l u l l o l l u l l i 班t , c o n t i n u o u sd a r ka n da l t e r n a t i o no fl i g h ta n dd a r l m e s s , t h es p o r a n g i u m 群删曲嘀t i o 皿r a l t c $ w e 他4 3 2 ， 4 1 5 ，4 2 6 7 e o r r e s l d o n d e n t l y 3 d i f ：f c r e r tm e t l l o d so fi n o e u l a t i o a aw e l t ts t u d i e d i b er e s u l ts l a o w e dt h a tt h et e m l r a t u r c b e t w e e n1 8 - 2 0 0 蛐t l a co p t i m u mf o ri n o c u l a t i o no t 五p u e r a r a e ：k r a r a o b a t aa n dt h e i n f e c t i o nr a t ew a sa b o u t8 4 w i t h i nt h e 把m 拼m 山m r e l a t i v e l yl o n g e rd u r a t i o no fw e t n e s s ( 4 8 h o u r s ) a f t e ri n o c u l a t i o nw a sf a v o r a b l et of l u n g a li n f e c t i o na n dd i s e a s ed e v e l o l m a e n t 4 f i v ec l i f f e l g , n ! d i 、i ae x t r a c t i o nm e t h o d sw c l r ct e s t e df o r 掣m 哪j ci ) n ae x t r a c t i o nf i o mt h e s o f to fp u e r a t a o b a t a ，p t h o m s o n ia n dp m o n t a n a i l l cm o d i f i e dt e c h n i q u eo fb e m y lc h l o r i d e w a ss h o w et h em 0 6 te i f i e i e n t0 1 1 ct oe x 咖c t 萨- n o m i ed i n i a r l d i n i a - i t sw c r ea m p l i f i e ds u e e e s s t u l l y a n d d i r e c t l y f r o mas i n g ks p o r a n g i u m b y p c r t h e i t ss e q u e n c e s o f t h e i s o l a t e s f i - o m p 1 0 b a t aa n d p t h o m s o n i i 啪8 5 6b l , a n d9 0 7i n , r e s p e e t i v e l ya n dw i t h9 2 o fs e c l t k n c cs i m i l a r i t y ；t h ei t s s e a t m n c e so ft w oi s o l a t e s ( s i m - 1a n ds p r , l - 2 ) f r o m 只站i o 蚪缸啊4w g l r c1 1 4 8 b pa n d1 1 4 7i , p w i t h 5 4 a n d5 5 s e q u e n c es m a i l a r i t y , r e s p e c t i v e l y , t ot h ei s o l a t e sf r o mp o b a t aa n d 只曲堪鼠w c p r o l , o 硎t h a tt h ei s o l a t e sf z o mp o b a t aa n dp t h o m s o n i 懈d i f f e r e n tv n r i e 雠, , o ft h e 髓瞄 叩妇a n dt h ei s o l a t e sf r o mp m o n t t a n aw c ad i f f e r e n ts p 妇o f 蜀y n c h y t r m ；l h ci s o l a t e sf i - o m 尸 o b a t aa n d 只t h o m s o n w mt w oc l o s e l yr c l a t e x l 叩e c i 船a n dt h ei s o l a t e sf r o mp m o n t a n aw a sa m o l t cd i s t a n t l yi t t l a t e d 叩疯 k e yw o r d s ：s y n c h y t r i u mp u e r a r i a e ； i n o c u l a t i o nc o n d i t i o n s ；r d n a s e q t t e n e ew t l y s i s 西南大学硕士学位论文缩写词和英汉对照表 缩写词和英汉对照表 a b b r e v a t i o n so ft e c h n i c a lw o r d so rp h r a s e s 英文全称e n g l i s hm e a m p i c i l l i n b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l b a s e p m r d o u b l ed i s t i m dw a t e r d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y n 曲o n u c l e o s i d et r i p p h o s p h a e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a c e t i ca c i d l u r i ab r o t hm e d i u m m o l a r m o l a r i t y l i t e r o p e c a td e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c 虹o n r i b o s o m a ld n a r i b o n u c l e i ca c i da l 刁m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 8 0 d i u md o d e c y ls u l f a t e t h e r m a la q u a t i c sd n a p o l y m m - a s e t r i sb o r a t c e d t a b u f f e r 乃蕾o q 力z 4 u n i t 砌i v i t yo fe n z y m e v 中文名称c h i n e s ee t f l m e 氨苄青霉素 同源性对比工具 碱基对 双蒸水 脱氧核糖核酸 脱氧核苷三磷酸 乙酰四乙酸 u i 培养蒸 摩尔 摩尔浓度( 体积) 光密度 聚合酶链式反应 核糖体m _ a 核糖核酸酶 每分钟转速 十二烷基硫酸钠 嗜热水生菌d n a 聚合酶 硼酸电泳缓冲液 t e 缓冲液 酶活单位一娜即一一一m州一腿一呻誊|暮|记u 独创性声明 学位论文题目：蔓篡壶爸鲍圭要生翅堂挂焦盈甚出的诞盆扭 本入提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：吉同宾签字日期：2 0 0 7 年5 月2 4 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。允许论文被查阅和借阅。 本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 学位论文作者签名：孝闰彦 导师签名：孛譬芬易 l ， 签字日期：函一万岁月；日 签字日期： 护7 年6 月 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 邮编： 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 恶性杂草野葛及其研究概况 1 1 1 野葛及其危害 野葛( e m 砌l o b a t a ( 晰u d ) o h w i ) 是一种多年生落叶草本植物叶系由三片5 m 长、 有浅裂的叶子组成( m i t i c h e t a l 。2 0 0 0 ；r a d f o r d e t a l ，1 9 6 8 ) t 茎缠绕，直径可达1 0 1 1 8 c m 在美国南部甚至可以达到2 5 3 0c m ( r a d e r 矗a l ，2 0 ；t s u g a w a ，1 9 9 2 ) ：叶片通过光合作 用合成的塘分以淀粉的形式存储在膨大的根系，根系发达，可达3 6m 深；花期在每年7 月下 旬到9 月初，花粉红色，圆锥花序：果实为荚果。含3 1 0 粒肾型种子( t e r r i n e t a l 2 0 0 3 ) 。 野葛属于豆科蝶形花亚科葛属，共有1 7 个种( m a e s e ne ta l ，1 9 8 5 ) 最常见且分布最广泛 的是野葛、粉葛僻t h o m s o n i ib e n t h ) 和山葛僻m o n t a n am 哪) 通常情况下它们交替重叠存在 在形态学上难以区分( w u e t a l 。1 9 9 4 ) ，至今在分类学上仍存在很大分歧t 恤e s e ne t a l 1 9 8 5 l 陈忠毅，1 9 9 4 t 曾明，2 0 0 3 ) 野葛可以对林业造成很大的危害。野葛叶片可随太阳的方向而变化，可以最大程度的利 用太阳光进行光合作用( f o r s e t h e t a l ，1 9 8 7 ) ：野葛根系发达，并储存有大量的营养物质。生长 能力强，向各个地方蔓延，蚕食了其他的许多自然植被，并能够缠绕许多高大乔木( 附图1 ) 由于它的覆盖作用，阻止许多植物的光合作用，使得这些树木不能够健康生长，因此每年需 要花费巨额资金来控制这些野葛( s a n e t a l ，2 0 0 5 ) 野葛还侵占农田，损害经济作物。不仅影响农业生产同时也对工业造成破坏生长在 火车轨道旁边的野葛，爬满了整个轨道，因此，铁路部门每年要花费大量的钱财来清除这些 野葛电业方面同样如此，野葛沿着线杆、电线蔓延，很容易压断电线。并造成重大事故 据报道，美国南部的电业公司每年要为此花费1 , 5 0 0 7 y 美元( w h s l e r e t 以1 9 r 7 7 ) 1 1 2 扩散分布 野葛原产于中国、韩国、日本等一些亚洲国家，现已经广泛分布于世界各地在美国 野葛于1 8 7 6 年首先出现是在宾夕法尼亚州费城的百年纪念展览会上日本政府展出的野葛因 叶子奇特且花朵芳香浓郁而吸引了众多植物爱好者，野葛首次引入美国是作为观赏植物引入 的。1 9 0 7 年，佛罗里达州的m r cep l e a s 认为野葛是一种很好的牲畜饲料t 由此，野葛在美 l 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 国开始蔓延( s h u r t l e f f me t 以，1 9 8 5 ) 到了2 0 世纪3 0 年代，野葛作为水土保持植物受到政府 的重视，人们在政府韵号召鼓励下( 每种植1 英亩可获锝8 美元) 大面积种植，种植面积超过了 4 8 6 万公顷，繁殖秧苗达7 , 3 0 0 万株( r a b ，1 9 4 2 ) ，从而使野葛在美国得到迅猛扩张由于野 葛生长迅速，缺少天敌，又没有有效的控制方法，野葛的扩张蔓延对生态、农业、工业等都 造成了严重的影响。1 9 5 0 s ，野葛在恻m r a lc o n s e r v a t i o np r o s x a m 中被除名，并被确认为 有害杂草。1 9 9 8 年，野葛又被u s c o n g t e , , 路和e p p o 列为危险性有害杂草( k e r r y e t a ，2 0 0 5 s a n n a n d a l e 1 9 9 9 ) 。 野葛在每m ? 土壤表面可产生1 , 8 0 0 粒种子。这些种子可以通过入和其袍哺乳动物或鸟进 行远距离传播，但种子的发育能力低，所以跨地区的传播多是人为引进栽培所造成的 ( d a b a d g h a o ，1 9 4 9 ) 。植株生长在滋生地蔓延，野葛可在茎与土壤接触处形成不定根，成为一 新的植株这是野葛的主要繁殖蔓延方式野葛生长非常迅速可达2 5 3 0c m d ( m i t i c h e t 吐 2 0 0 0 ：r a d f o r de ta l ，1 9 6 s ) 野葛目前在世界上的分布是：非洲：塞拉利昂等；噩洲：中国，印尼。日本，韩国，朝 鲜。马来西亚，巴基斯坦，菲律宾。越南，泰国等；北美洲：百幕大群岛，美国，巴拉圭， 巴拿马，多米尼加。巴西等；大洋州：澳大利亚，斐济，新西兰，几内亚等 在美国，野葛在南至佛罗里达州，西到俄克拉菏马州j e 抵德克萨斯州均有分布，受害 最严重的是密西西比河、阿拉巴马州、乔治亚洲的山麓地带( k 毫f t ye ta l t2 0 0 5 ) 到2 0 0 5 年3 月1 日止，美国印地安那州就有7 0 + 地方都有了野葛的分布( k e n n e t he t a l ，2 0 0 5 ) ，野葛也已经 从原来的二百万英亩发展到了七百万英亩( 1 ( , e r r y e t a l 。2 0 0 5 ；s a s e k e f a l ，1 9 9 0 ) 1 1 3 生物学特性与控制 野葛的抗逆性强，在森林的边际，道路的两旁，水沟旁边等地均可生长，特别适宜在开 阔苴肥沃的土地上生长侧【a 鲫e t a l ，1 9 8 5m u n g e r e t a ，2 0 0 2 ) 野葛是短日照植物，充足 的阳光有利于其生长。在亚热带雨林生长良好( z h a 略e t a t ，1 9 9 9 ) 但过高的温度不宜生长， 在3 0 3 5 时，光合作用基本上停止( w e c h s k f a a l ，1 9 7 7 ) 据报道，野葛在年降水量为9 7 2 1 4 c m 年平均温度在1 2 2 2 6 7 ，p h5 肛7 7 1 时适宜生长( a n n a n d a k ，1 9 9 9 ) 。 化学防治具有效果快、使用方便、易于大面积推广应用等特点但在防除时，化学农药 往往也杀灭了许多种其他生物：通常情况下化学防除费用较高；在大面积山林及一些自身经 济价值相对较低的生态环境如草原使用往往不经济、不现实；对一些特殊环境如水库、潮泊 2 西南大学硕七学位论文第一章文献综述 化学农药是限制使用的( s c h r o e d e r ，1 9 9 2 ) ；对于许多种恶性杂草，大多数除草剂通常只能杀灭 地上部分，难以清除地下部分，所以需连续藏用，防治效果难以持久( 江荣昌等，1 9 8 9 ) 。目前 生产上用于防治野葛的除草剂主要有( k e n n e t h 甜以。2 0 0 5 ) ：百草敌或麦草畏( b a n v e l d i c a m b a ) 、 绿草定o r i c l o p y r ) 、甲黄隆( e s c o r t - m e t s u l f u r o nm e t h y l ) 、森草净( o u s t - s u l f o m e t u r o nm e t h y l ) 、特 丁塞隆( s p i t e8 0d f - t b e u t h i u r o n ) 、毒莠定和2 ，4 d ( t o r d o n - p i c l o r a ma n d2 4 d ) 等 其它防治方法如机械防治、农业防治等均能对野葛起到一定的控制作用，但最终不能完 全消除或把野葛控制在经济危害水平以下 1 2 微生物除草的研究进展 1 2 1 病原微生物在生物防治中的应用 微生物防治杂草分为传统微生物防治和应用微生物除草剂防治两种传统的生物防治方 法，是从杂草原产地引入寄生性和传播能力较强的病原菌在田间接种引起目标杂草病害流行， 从而把杂草数量降到某一临界点以下，建立一种持久的动态平衡( 马娟等。2 0 0 6 向梅梅等， 2 0 0 5 ：刘焕禄等，2 0 0 0 ；余柳青等，2 0 0 0 ) ，这主要是针对引入区缺乏自然天敌控制而成为有 害杂草的植物，病原微生物的搜寻就要在杂草起源地进行( 张希福等，1 9 9 7 ) 在农业生态系统 中。引入病原微生物，使之建立种群并能长期流行，成为杂草种群的长期控制因素，是微生 物防治的重要目标利用植物病原微生物防除杂草是杂草生物防治的一个重要组成部分。而 大批量的接种体淹没式地应用于环境则需要它们具有寄主专一性，且必须具备强致病力以起 到防除效果近年来利用活体微生物，主要是植物病原微生物，最常见的是植物病原真菌， 它可以直接穿透寄主表皮，进入寄主组织，达到防除杂草的目的。例如国内早就推广应用于 控制菟丝子的“鲁宝一号，( 林冠伦，1 鲫1 ) 和美国已登记注册并应用于控制果园藤蔓杂草的 c o l l e g o ( c h a m d a t t a n d i n o o r ，2 0 0 0 ) ，都是由刺盘孢( c 锄协d 耐c j l m l 聊) 属真菌研制成的生 物除草剂 真菌发展成为杂草生防菌所需经过的步骤有：1 ) 广泛地调查某一靶标杂草自然群落的致 病菌；2 ) 研究所筛选致病菌的生物学特性，该致病菌须具备强致病力。在杂草严重发生期能 够侵染靶标杂草，并在自然种群中传播，从而达到有效防除靶标杂革：3 ) 鉴定该致病菌的分 类学地位，确定其安全性，进行寄主范围的测定，而在测定一种候选生防菌的寄主范围时， 往往先选择一些可能会被该生物体侵染的植物种进行，这包括与目标杂草同属及同科的其他 属的代表种、近缘科的代表种、主要经济作物及观赏植物、与目标杂草在物候上尤其是形态 3 西南大学硕士学位论文第一章文献综述 上很相似的植物和在当地具有生态意义的植物种类( g u p t a ，2 0 0 0 ；赵玉宏等，2 0 0 3 ) 1 2 2 生防的历史成就及现状 澳大利亚利用锈菌0 妇c j i 毋豇矗h 4 ) 防治麦田杂草灯芯草粉苞苣( c 蛔础讹自岫n c e ) 是国际上首例利用引进病原微生物开展杂草生防的成功例证( 万方浩等，1 9 9 1 ) 该杂草属多年 生菊科草本植物，靠种子和根部再生繁殖，是澳大利亚东南部麦田中的主要杂草印7 睥 代初期在伊朗，土耳其、希腊、南斯拉夫、法国和葡萄牙发现有极强侵染力7 0 年代初期， 澳大利亚从杂草起源地地中海引进只c j i 出姚坼的一个1 t - 3 6 菌株，是普通窄叶型灯芯草粉苞 苣的专性病原物该株系在田间释放后。能使幼苗和老植株死亡，并很快达到种群流行，其 死亡率可达5 0 7 0 ，在试验区可达如1 ( c u l ，1 9 7 8 ) d e l f o s s ( 1 9 8 5 ) 等评述灯心草粉 苞苣的生物防治是利用引进病原菌防治外来杂草的最好的例证。是澳大利亚杂草生防史上的 一个新的里程碑。该杂草的每年舫治费用节省2 5 9 6 百万美元。智利于7 哞代通过引进多孢锈 菌( p h r a g m i d i u mv i o l a c e u m ) 用于防治黑莓获得成功( o e h r e n s ，1 9 7 7 ) 年代初，美国杂草 ( a g e r a t i a 砌4 砌) 由于从该杂革起源地加勒比海地区引进一种小尾孢苗( c e r c o s p o r e l l aa g e r a t i a ) 使得该杂草在美国的夏威夷获得了成功防治( c h a m d a u a ae ta l ，1 9 8 2 ) 谭万忠( 1 9 9 3 ) 等在空心 莲子草上发现了一种炭疽病菌。经初步鉴定病原为盘长孢刺盘孢( c 础呦州幽珊 g l o e o p h o r o s p o r a ) ，并经实验证明对空心莲子草哇加胁彻船m 脚妇群m 淤时有很强的抑制作用 ( 谭万忠，1 9 9 4 a ；谭万忠，1 9 9 4 b ) 近年来在空心莲子草上又发现一种镰刀菌，其在自然田问 可以引起杂草的枯黄萎症状，并且在室内和室外接种条件下。均可引起很严重的植株黄化和 死亡m ne t a l ，2 0 0 2 ；周冠军，2 乃 目前有关引进病原微生物防除恶性杂草的研究还处于开发阶段，由于引进病原的风险性 及植物检疫方面的需要，各国对于这一资源的开发应用都采取谨慎态度美国，加拿大、澳 大利亚还成立了专门机构，加强这一领域的指导和管理美国农业部下设的杂草生物防治工 作组o v g b c w ) - 专f l 负责杂革生舫资源的引进和开发工作，并在海外建立生防工作站。开展这 一方面的研究取得了一定的进展随着生防菌的大量研究与开发，美国、加拿大、澳大利亚 等国家对环境安全性的评价日益重视并制定了相应的管理法规( 曾士迈等，1 9 8 6 ) 。但由于杂 草生物防治前期投资较大，在某种程度上限制了在发展中国家和不发达国家的研究和进展 1 3 微生物控制野葛的研究进展 4 西南大学硕士学位论文第一章文献综述 应用病原微生物控制野葛需要首先从植物病原微生物中筛选野葛的生防菌( p e m b c r t o n 。 1 9 8 8 ) 。迄今已经在野葛上发现的病原茁有：链格孢( a l t e r n a r i a 黟) ，座囊葡萄座腔菌 ( b o t r y o 啊h a e r i ad o t h i d e a ，1 5 o b t u s a ，且r i b 神，小核伏革菌( c o r t i c f u mm 蛔o s c l e r o t i u m ) ，野葛色二 孢( d 妒h 妇胛，i ) 胶孢壳( i 夸耐ks c o p a r a ) ，茭白小光壳( l e p t o s p h a e r u l i n a a r g e n l i n e n s i s ) ， 小盾壳( m i c r o t a y r l u m 黟) ，野葛球腔菌( m y c o s p h a e r e l l a p u e r a r i c o l a = c e r c o s p o r a p u e r a r i c o l a ) 。拟 茎点霉( p h o m o p s i a 黟) ，葛斑点细菌菜豆变种( p h y t o m o n a sm e d i c a g i n h 删：脚如a k ) 野葛 假尾孢菌( p s e u d o c e r c o s p o r ap u e r a r i i c o l a ) ，丁香假单孢杆菌菜豆致病型僻螂硪w w 剐 i n g a e p u p h a s e o l i c o l a ) ，放射点盘萄( s t 洲sm 凼口国小核立桔丝核菌( 旯娩w i 缸m c r o s c e r o 豳) ( b a i n e t a ，1 9 4 7 ；f a r r i s e t a l ，1 9 8 9 ) 其中丁香假单孢杆菌菜豆致病型僻s y r i n g a e p v p h a s e o l i c o l a ) 能在野葛叶片上产生轮纹状的坏死斑，z i d a k ( 1 9 9 6 ) 在1 9 9 6 年报道其能有效防治生长期为8 到1 0 周的野葛幼苗。但其寄主范围广泛，有可能使某些有益的植物发病。疣孢漆斑菌( m y r o t h e c i m n * ，砌1 能在分生孢子座上产生大量的分生孢子，主要通过雨水传播，作用于野葛的茎杆和 叶片上接种时，表面活性剂能够增强对野葛的侵染( b o y e t t e 甜以，2 0 0 0 ) 田闯实验表明在 野葛上接种1 4 天后能够获得9 5 左右的防效。但这种真菌的寄主范围广泛，对多种作物均有致 病性。胶孢炭疽菌( c o i t i o n c h u mg o e o s p o r o d e s ) 是f a n i s ( 2 0 0 0 ) 从美国休斯顿的野葛上分离的。 侵染野葛的茎杆和叶片，形成病斑若长期在查彼培养基上培养，还能够增强侵染力葛集 壶菌国，呐舸如 m r 缸c ) 在野葛的茎、叶柄、花和叶片上均可造成病斑。其形状用肉眼看上 去与锈病菌的孢子囊相仿，所以被称为葛拟锈病，也被称为“葛赤涉病n i i k j o ，1 9 8 2 ) 冯岩( 1 9 9 9 ) 等在粉葛上分离到一种集壶菌并对其进行了生物学特性方面的研究我们在广 州市龙洞凤凰山调查到野葛同样被一种集壶菌寄生，且致病力强，它可以在野葛的茎、花、 叶柄和叶片上造成拟锈斑点( 附图2 ) 根据高又曼( 1 9 7 9 ) 对集壶菌种的分类依据，即根据各集壶菌发育史不同以及孢子囊萌发类 型可以分为7 种，而寄生于野葛上的是葛集壶菌( $ ，m 砂触p u e r a r i a em i y - 豸y n c h y t r u m m 缸w a u m o a u m x 戴芳澜。1 9 7 9 ) 。葛集壶菌没有休眠孢子，不同于同属的其它真菌( j o h n e t a l 1 9 5 5 ) 游动孢子囊近圆形( 附图3 ) ，橙黄色，菌体内有一油球，孢子囊成熟时。放入水中孢 子囊吸水膨胀，产生一个很强的内压，使得孢子囊壁在薄弱的地方破裂，游动孢子便从孢囊 壁裂口处逸出，释放出具单根尾鞭毛的游动孢子( z u s a n o e t a l ，1 9 0 7 ) 。繁殖方式为整体产果t 原生质体形成同一外膜的孢子囊堆( 姚一建等。2 0 0 2 ) 。游动孢子具有强烈的趋氧性，趋温性和 趋化性，但没有趋触性和趋光性( j o y c ed 以，1 9 9 6 ；j o h n 甜a l ，1 9 5 4 ) k e s a n o ，1 9 0 9 ) 西南大学硕十学位论文 第= 章引 言 第二章引言 野葛属于豆科蝶形花亚科葛属，1 8 7 6 年从日本传入美国，由于缺少天敌且抗逆性强，对 美国的工业，农业和生态都造成了很严重的危害，已经被列为一种恶性杂草目前防治野葛 的方法主要有化学防治、农业防治和生物防治化学防治在山林及一些自身经济价值相对较 低的生态环境如草原使用往往不经济，不现实。且对一些特殊环境如水库、湖泊。化学农药 是限制使用的机械防除有害杂草对环境安全，短时问内也可迅速杀灭一定范围内的有害生 物。但在机械防除后，如不妥善处理有害杂草残株这些残株依靠无性繁殖可能成为新的传 播源农业防治有助于对野葛蔓延的控制，但费时费力，效率低从植物病原微生物中筛选 野葛生防菌是很好的防治途径，置s y r n g a e 、肛v e r r u c a r a ，c 鲋吗即瞳磁等对野葛均有一 定的控制效果，但由于寄主范围广泛，侵染其他经济作物，不适合作为野葛的生防菌。因此。 迫切需要找到一种对野葛具有强致病力且寄主范围较窄的微生物来作为野葛的生防菌。 葛集壶菌是野葛上的专性内寄生莹。侵染野葛一方面可导致野葛茎、叶呈菌瘿状肿大， 受窖部位因生长发育不均匀而呈畸形，最后变黄，萎蔫桔死l 另一方面可影响水分和营养的 运输，从而影响到野葛的正常生长和发育，对野葛的扩散蔓延有较大的生防应用前景利用 生物因子控制恶性杂草对环境的污染是为将杂草控制在经济及生态危害水平之下，而逐步达 到可持续控制仍需要做很多的工作本研究拟从葛集壶菌的生物学特性，接种、核糖体序列 几个方面展开对其作为野葛生防菌的可行性进行探讨 6 西南大学硕士学位论文 第三章材料与方法 第三章材料与方法 3 1 实验材料 3 1 1 供试植株与菌株 实验所需野葛采自广州市天河区龙跟洞，粉葛采自广州市白云区人和镇。 葛集壶菌株s p l - 1 、s p l - 2 分别采自广州市凤凰山和火炉山的野葛，菌株s p t - 1 和s p t - 2 均 采自广州市人和镇的粉葛，菌株s p m - 1 、s p m 2 分别采自广州市凤凰山和火炉山的山葛。 3 1 2 主要试剂 h o q 凝胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司；i c r 克隆载体p t a 2 v e c t o r 及t a r g e t c i o n e t m - p l u s 一试剂盒( 用作连接克隆反应) 购白东洋纺c 上海) 生物科技有限公司；r n a 酶、t a q 酶、d n a m a r k e r d l 2 0 0 0 购白t a k a r a 生物工程有限公司琼脂糖。胰蛋白胨，酵母 提取物，t r i s 以及其余试剂均为分析纯或化学纯通用引物由赛百盛生物工程有限公司合成； 测序分别由深圳检疫检验局、上海英俊生物技术有限公司和北京华大基因生物有限公司完成。 3 1 3 主要仪器设备 w f j 7 2 0 0 型可见分光光度计( 上海尼龙柯仪器有限公司) ；h h - 2 数显恒温水浴锅( 金坛富华 仪器有限公司) m j - 2 5 0 1 霉菌培养箱上海一恒科学仪器有限公司) 超净工作台( s w c c , o o ， 苏州净化) ；t h z - 8 2 z 型气浴恒温振荡器( 江苏金坛市医疗仪器厂) ；全自动高压灭菌锅 ( h v e = 5 0 ，日本) ；- 8 0 c 超低温冰箱( u l t l 3 8 6 - 3 - v 3 7 ，美国) ；台式高