（动物学专业论文）中华蜜蜂apidaecin基因在乳酸乳球菌中的融合表达.pdf

中山大学硕士学位论文 中华蜜蜂a p i d a e c i n 基因在乳酸乳球菌中的融合表达 专业：动物学 硕士生：黄玉明 指导老师：张文庆教授 摘要 a p i d a e c i n 是一种从蜜蜂的淋巴液中分离到的多肽抗生素。主要对革兰阴氏性 菌，尤其是人类肠杆菌科致病菌，具有很强的杀伤力，而对真核细胞没有毒性作 用。因此，a p i d a e e i n 在医药和食品工业中有着广阔的应用前景。泛素可以以分子 内伴侣形式起到促进翻译和增加产物稳定性的作用，而且表达的融合蛋白在离体 或体内条件下，经泛素特异性蛋白酶在泛素分子c 一末端切割后，可以释放出完 整而有活性的外源蛋白。这项被称为泛素融合的技术( u b i q u “m ，f i l s i o n t e c h n o l o g y ) 已开始应用于多种外源基因的表达及转基因植物研究领域。 本研究设计一对简并引物，从中华蜜蜂( a p i sc e r a n ac e r a n a ) 中克隆了泛素 基因的编码区。序列分析表明，该编码区的长度为2 2 8b p ，编码的多肽由7 6 个 氨基酸残基组成，相对分子质量为8 5 7k d a ，其等电点为6 7 9 ，同源性比较发现， 中华蜜蜂泛素基因与其他真核生物泛素基因在氨基酸水平上具有9 6 以上的相 似性。根据乳酸乳球菌的密码子偏嗜性，对原来的a p i d a e c i n 基因进行了改造， 以泛素( u b i q u i t i n ) 融合蛋白的形式在乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) m g l 3 6 3 中表达了a p i d a e e i n 。利用s d s p a g e 在重组后的宿主苗中检测到特异蛋白带。 u b i q u i t i n - a p i d a e c i n 融合蛋白不具备活性，为了能够去除泛素，得到有活性的 a p i d a e c i n ，从酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 中克隆一种泛素特异性蛋白 酶y u h l ，序列分析表明与g e n b a n k 中泛素特异性蛋白酶( y u i - 1 1 ) 基因的序列 黄玉明 中华蜜蜂a p i d a e c i n 基因在乳酸乳球菌中的融台表达 完全一致。克隆到的泛素特异性蛋白酶y u h l 与乳酸乳球菌表达载体p m g 3 6 e 连接构建表达载体，计划在乳酸乳球菌( ll a c t i s ) m g l 3 6 3 中表达，为获得有活 性的a p i d a e c i n ，进行了初步的探索。 关键词：抗菌肽，a p i d a e c i n ，泛素，乳酸乳球菌，融合表达，泛素特异性蛋白酶 ! 当查兰堡主兰堡丝茎 f u s i o ne x p r e s s i o no f a p i sc e r a n ac e r a n aa p i d a e c i n g e n ei nl a c t o c o c c u sl a c t s m a j o r ：z o o l o g y n a m e ：h u a n gy u m i n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz h a n gw e n - q i n g a b s t r a c t a p i d a e c i n ，ap e p t i d ea n t i b i o t i cw h i c hi si s o l a t e df r o ml y m p hf l u i do ft h e h o n e y b e e ，h a ss t r o n ga n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e sa g a i n s tg r a mn e g a t i v eb a c t e r i ab u th a sn o t o x i c i t yo ne u k a r y o t i cc e l l s s ot h ep e p t i d eh a sp r o m i s i n gp o s s i b l ea p p l i c a t i o n si n m e d i c i n ea n df o o di n d u s t r y t y o i q u i t i na p p e a r st or e d u c e v a r i a b i l i t yi ne x p r e s s i o n y i e l d sa n de n h a n c es o l u b i l i t y , p r o b a b l yb e c a u s et h e ya c ta s c o v a l e n t l yl i n k e d c h a p e r o n e sa n de n h a n c et h ef o l d i n go ft h ef u s e dp r o t e i n t h eb i o a c t i v ee x t r i n s i c p r o t e i nc a nb er e l e a s e db yu b i q u i t i n - s p e c i f i cp r o t e a s e st h a ts p e c i f i c a l l yc l e a v et h e i s o p e p t i d eb o n da tt h ec - t e r m i n u so f n h i q u i t i n ，i nv i t r oo rv i v o t h i su b i q u i t i n 一血s i o n t e c h n o l o g yh a sb e e nd e v e l o p e df o rt h ee x p r e s s i o no fh e t e r o l o g o u sg e n e sa n dt h e r e s e a r c ho nt r a n s g e n ep l a n t i nt h i sr e s e a r c i l t h ec o d i n gs e q u e n c eo f 却缸c e r a n ac e r a n au b i q u i t i ng e n ew a s i s o l a t e d t h el e n g t ho fh i so r fi s2 2 8b p ，e n c o d i n ga p r o t e i nw i t hm ro f8 5 7k d a a n di s o e l e c t r i cp o i n to f6 ，7 9 ，m u l t i p l es e q u e n c ea l i g n m e n ti n d i c a t e dt h a ta c e r a n a c e r a n au b i q u i t i ni s v e r ys i m i l a rt ot h eh o m o l o g o u sp r o t e i n so fo t h e re u k a r y o t i c s p e c i e sa n di th a sm o r et h a n9 6 i d e n t i t yw i t ho t h e re u k a r y o t i eu b i q u i t i n s a l lk n o w n k e y - f u n c t i o n a ls i t e sa r es t i l le x i s t e di na c e r a n ac e r a n an h i q u i t i n i no r d e rt oi n c t e a s e t h ef u s i o ne x p r e s s i o nt om e e tt h en e e d so fi n d u s t r i a la p p l i c a t i o n , t h ea p i d a e c i ng e n e 1 1 i 黄玉明 中华蜜蜂目p i d a e c i n 基因在乳酸乳球茼中的融合表达 w a sm o d i f i e da c c o r d i n gt ot h ec o d o nb i a so fl a c t o c o c c u sl a c t i s ，a n dt h e nt h e u b i q u i t i nf u s i o no fa p i d a e c i nw a se x p r e s s e di n l a c t sm g l 3 6 3 as p e c i f i cb a n d c o u l db ed e t e c t e di nt h ee x t r a c t so ft h eh o s ts t r a i nb ys d s p a g e s i n c et h ef u s i o n p r o t e i no fu b i q u i t i n a p i d a e c i nh a sn oa n t i b a c t e r i a la c t i v i t y , y u h lg e n e ，ak i n do f u b i q u i t i n s p e c i f i ch y d r o l a s ed e r i v e df r o ms a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，w a sc l o n e df r o m t h eg e n o m eo fs c e r e v i s i a et oh y d r o l y s et h eu b i q u i t i n d n aa l i g n m e n ts h o w e dt h a t t h ef r a g m e nh a dt h es a m es e q u e n c ea st h ey u h lg e n ei ng e n b a n k i no r d e rt og e t a p i d a e c i nw i t ha n t i b a c t e r i a la c t i v i t y , a ne x p r e s s i o nv e c t o rw a so b t a i n e db yl k k 啦 y u h la n dt h ev e c t o rp m g 3 6 e w ew i l lt r yt oe x p r e s sy u h li n l 1 a c t i sm g l 3 6 3a n d u s et h ey u h lt og e ta p i d a e c i nf o ra n t i b a c t e r i a la s s a y k e y w o r d s ：a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ，a p i d a e c i n ，u b i q u i t i n ，l a c t o c o c c u sl a c t i s ，f u s i o n e x p r e s s i o n , u b i q u i t i n - s p e c i f i cp r o t e a s e s i v 中山大学硕士学位论文 前言 2 0 世纪5 0 年代，抗生素作为抗菌剂添加到食品和饲料中开始使用，伴随着 抗生素的广泛使用，药物残留和耐药性问题越来越受到人们的关注。最近，欧盟 决定将在2 0 0 6 年后全部禁止使用传统抗生素( 邓君明和张曦，2 0 0 3 ) 。目前，我 国也在逐步限制和减少抗生素的使用种类。面临传统抗生素淘汰的局面，应用生 物技术研究与开发无公害的新型抗菌剂代替抗生素作为食品和饲料添加剂势在 必行。 昆虫抗菌肽是近几年开发的一类新型食品和饲料添加剂，具有代替传统抗生 素的潜力( 刘毅等，1 9 9 9 ；邱芳萍等，2 0 0 2 ：温刘发和何建国，2 0 0 3 ) ，其优点 在于：种类多，可选择范围广，抗菌活性高，抗菌谱广，不易产生抗性突变，无 免疫原性，溶解性和热稳定性及对较高的离子强度或较大的p h 变化具有较好的 耐受性，甚至有抵抗消化道多肽酶水解的能力。因此，抗菌肽受到越来越多研究 人员的关注，成为开发新型抗生素的目标之。迄今为止，在昆虫中发现的抗菌 肽已达1 7 0 多种( b o m a n 2 0 0 3 ) ，其中，a p i d a e e i n 是一类来源于膜翅目昆虫的 富脯氨酸的多肽抗生素，最早从蜜蜂的淋巴液中分离得到，一般含有1 6 一1 8 个氨 基酸残基，在低p h 值q h = 2 o ) 和高温( 1 0 0 。c ) 的条件下都很稳定；目前已从7 种膜翅目昆虫中分离出1 3 个同种型a p i d a e c i n ，尚未从膜翅目以外的昆虫体内分 离到这类抗菌肽( c a s t e e l se ta 1 ，1 9 9 4 ) 。该类抗菌肽对多种革兰氏阴性菌，特别 是肠杆菌科，具有很强的杀伤作用，而通常对包括乳酸乳球菌在内的革兰氏阳性 菌不起作用，对真核细胞也没有毒性作用；因此，在食品和饲料添加剂，医药工 业和植物抗细菌病基因工程上有着广阔的应用前景。 天然抗菌肽作为食品和饲料添加剂具有众多传统抗生素所没有的优点，但天 然抗菌肽在昆虫中的含量很少，直接从昆虫血淋巴中纯化蛋白成本较高，不利于 工业化生产，而合成成本过于昂贵也一直是制约其研究和工业化生产的瓶颈。随 着基因工程技术的发展，人们尝试在不同的表达系统，特别是大肠杆菌表达系统 中融合表达( 邱定红等，2 0 0 2 ；朱嘉明等，2 0 0 2 ；周霞等2 0 0 3 ；陈海旭等，2 0 0 1 ) ； 或在酵母表达系统和昆虫细胞一杆状病毒表达系统中直接表达抗菌肽基因( 叶玉 坤等，1 9 9 4 ；韩万江等，1 9 9 8 ；陈海旭等，2 0 0 2 ；黄亚东等，2 0 0 3 a ，b ) 。但融 黄玉明 中华蜜蜂a p i d a e c i n 基因在乳酸乳球菌中的融合表达 合表达产物难以分离、表达量少或抗菌活性较低，如何提高食品和饲用抗菌肽类 的产量、降低成本，是广泛应用这些天然抗菌剂必须解决的问题之一。泛素 ( u b i q u i t i n ) 由7 6 个氨基酸组成，分子量约为8 6k d a ，是真核生物内高度保守 的一种多肽。目前所知，泛素主要通过a t p 依赖的泛素一蛋白酶体通路 ( u b i q u i t i n - p r o t e a s o m e p a t h w a y , u p p ) 高效并高度选择性地对胞质和胞核内蛋白 进行降解( g l i c k m a na n dc i e c h a n o v e r ，2 0 0 2 ) ，作为分子伴侣参与核糖体的生物 发生、细胞内吞等多种生理功f i ( v a r s h a v a s k y , 1 9 9 7 ) 。近年研究发现，将短肽或 小分子蛋白与泛素融合后，能极大地提高目的蛋白在原核细胞中的表达量，并且 由于泛素分子发挥其可能的分子伴侣作用，可以避免小分子蛋白在宿主菌中被降 解( b a k e re ta 1 ，1 9 9 4 ；h o n d r e de ta 1 ，1 9 9 9 ) 。这项被称为泛素融合的技术 ( u b i q u i t i n - f u s i o nt e c h n o l o g y ) 己开始应用于多种外源基因的表达及转基因植物 研究领域( h o n d r e de ta 1 ，1 9 9 9 ) 。此外，由于能将泛素与融合蛋白完全切割分离 的去泛素化酶( d e u b i q u i t i n a t i n ge n z y m e s ，d u b s ) 广泛存在于真核生物细胞内 ( c h u n g a n d b a e k ，1 9 9 9 ) ，因此利用该泛素融合技术表达的多肽或蛋白，不需要 进行融合蛋白分离处理，这在一定程度上简化了表达产物的后处理工艺。 本研究通过设计一对简并引物，从中华蜜蜂中克隆了泛素基因。而后，将本 实验室克隆到的中华蜜蜂a p i d a e c i n 与泛素基因融合后，在乳酸乳球菌中进行表 达。s d s 电泳分析表明，得到特异性目的蛋白条带。a p i d a e c i n 与泛素的融合蛋 白不具备抗菌活性。为了进一步纯化表达产物，得到有活性的a p i d a e c i n ，必须去 掉融合蛋白中的泛素。m i l l e r 等( 1 9 8 9 ) 从酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的基因组文库中筛选出一种泛素特异性蛋白酶y u h l 。这种泛素特异性蛋白酶只 有2 6 k d 大小，实际上是酵母中的一种酶复合体中的一个组成部分，而且编码 y u h1 的基因中不含有内含子。无论是纯化后的y u h1 ，还是表达该酶的大肠 杆菌裂解液，均具有水解泛素的活性( m i l l e re ta 1 ，1 9 8 9 ) ，并且，该酶的活性高， 特异性强。因此，在泛素融合表达产物的酶解中，受到人们的青睐。通过特异性 引物从酿酒酵母中克隆到泛素特异性蛋白酶y u h l 基因并在乳酸乳球菌中中进 行表达。这为进一步水解泛素一a p i d a e c i n 融合蛋白，得到有活性的a p i d a e c i n 创造 条件。同时，也将有利于其他以泛素融合蛋白形式构建的表达体系中目的蛋白的 纯化。 中山大学硕士学位论文 第1 章富脯氨酸昆虫抗菌肽的研究与应用 昆虫受感染或外源物质进入血淋巴都会激发其细胞和体液的免疫应答，以消 灭入侵的病原菌。作为体液防御的一部分，通常会产生一系列不同的多肽类物质， 共同构成一个广谱抗菌体系，在许多方面都可与脊椎动物免疫防御系统相媲美。 富脯氨酸抗菌肽是一类线性的，富含脯氨酸( 脯氨酸含量可达到5 0 ) 的抗菌肽。 它最早是从蜜蜂( c a s t e e l se t a l ，1 9 8 9 ) 和牛( g e n n a r oe t a l ，1 9 8 9 ) 中分离出来的，后陆 续在其他的昆虫和哺乳动物( b u l e te ta 1 ，1 9 9 9 ；g e n n a r oe ta 1 ，2 0 0 0 ) ，还有甲壳类 ( s c h n a p pe ta 1 ，1 9 9 6 ；d e s t o u m i e u xe ta 1 ，1 9 9 7 ) 和蚯蚓( c h oe ta ，1 9 9 8 ) 中分离到不 同的富脯氨酸抗菌肽。高含量的精氨酸或亮氨酸使其带有正电荷，这一类抗菌肽 主要对革兰氏阴性菌起作用。 1 1 富脯氨酸昆虫抗菌肽的分类 现己从膜翅目，鳞翅目，半翅目，双翅目昆虫中分离出富脯氨酸抗菌肽，并 可将其分成两类，短链的和长链的富脯氨酸抗菌肽( b u l e te ta l ，1 9 9 9 ) 。 1 1 1 短链的富脯氨酸抗菌肽 短链的富脯氨酸抗菌肽由1 5 ( m e t a l n i k o w i n i ) 到2 0 ( 如p y r r h o c o r i c i n ) 个氨 基酸组成，包括了a p i d a e c i n ( 从膜翅目昆虫中分离出来) ( c a s t e e l se la 1 ，1 9 8 9 ； c a s t e e l se ta 1 1 9 9 4 ) ，d r o s o c i n ( 从d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 中分离) ( b u l e te t a 1 ，1 9 9 3 ) ，p y r r h o c o r i c i n ( 从p y r r h o c o r i sa p t e r u s 中分离) ( c o c i a n c i c he t a l ，1 9 9 4 ) ， f o r m a e c i n s1a n d2 ( 从m y r m e c i ag u l o s a 中分离) ( m a c k i n t o s he ta 1 ，1 9 9 8 ) 和 m e t a l n i k o w i n s ( 从p a l o m e n a p r a s i n a 中分离) ( c h e m y s c he ta 1 ，1 9 9 6 ) 。序列分析 发现，短链的富脯氨酸抗菌肽c 末端的8 个氨基酸 ( p r o - a r g p r o - p r o h i s p r o - a r g l e u i i e ) 是进化保守的，在a p i d a e c i n s 中最为明显， 随着亲缘关系有所变化，与之亲缘关系较远的m e t a l n i k o w i n s 则变化较大 ( l e v a s h i n ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 黄玉明 中华蜜蜂a p i d a e e i n 基因在乳酸乳球菌中的融合表达 1 l 2 长链的富脯氨酸抗菌肽 长链的富脯氨酸抗菌肽由2 6 ( m e t c h n i k o w i n s ) 到3 9 个( a b a e c i n 丘o m b p a s c u o r u m ) 氨基酸组成，包括a b a e c i n s ( 从却括m e l l i f e m 和b o m b u s p a s c u o r u m 中分离) ( c a s t e e l se t a ，1 9 9 0 ；r e e se t a l ，1 9 9 7 ) ，i c b o c i n 的四个同种型( 从b o m b y x m o r i 中分离) ( h a r aa n d y a m a k a w a ，1 9 9 5 ；c h o w d h u r y e t a l ，1 9 9 5 ；f u r u k a w ae t a l ， 1 9 9 7 ) ，另一同种型来源于t r i c h o p l u s i an i ( l i ue ta 1 ，1 9 9 5 ) ，m e t c h n i k o w i n 的两 个同种型( 从d m e l a n o g a s t e r 中分离) ( l e v a s h i n ae t a l ，1 9 9 5 ) 。长链的富脯氨酸 抗菌肽在c 末端部分有一共同序列p r o p h e a s h - p r o l y s a s n ，而且m e t c h n i k o w i n s 还含有短链的抗菌肽的保守序列p r o a r g p r o ( l e v a s h i n ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 1 2 富脯氨酸昆虫抗茵肽的结构特征 a p i d a e c i n s 是目前研究较多的富脯氨酸抗菌肽，已从7 种昆虫体内分离到 a p i d a e c i n 型抗菌肽共1 3 个同种型，并且尚未从膜翅目以外的昆虫中发现 a p i d a e c i n 型抗菌肽：同时发现任何一种a p i d a e c i n 型抗菌肽确实都不存在翻译后 修饰( c a s t e e l se ta 1 ，1 9 9 4 ) 。a p i d a e c i n 为小分子非螺旋短肽，由1 8 个氨基酸组成， 包括3 个精氨酸和6 个脯氨酸残基，基本结构为：g n n r p ( v i ) y i p q p r p p h p r ( z 0 ( c a s t e e l s e ta 1 1 9 8 9 ) 。c d n a 克隆分析发现一个前体蛋白可加工产生多达 1 2 个短肽( 2 k u ) ，形成多个同种型。这些同种型通常是由多基因家族或不同的等 位基因产生的。t a g u c h i 等( 1 9 9 6 ) 人从蜜蜂淋巴中分离到无活性的a p i d a e c i n 前体， 其n 末端附有氨基酸，提出a p i d a e c i n 前体象c e c r o p i n 、s a r c o t o x i n i i 和m c l i t t i n 前体一样，其成熟过程必需一种氨肽酶( a m i n o p e p t i d a s e ) 。a p i d a e c i n 前体的结构 很独特，即有重复单元( r e p e t i t i v eu n n s ) 出现，可以迅速增强免疫应答，产生真正 超量的抗菌肽。通过这种机制来增强“免疫”应答效率，在昆虫中还是独一无二 的( c a s t e e l se ta 1 ，1 9 8 9 ) 。序列对比发现，a p i d a e c i n 型抗菌肽的某些部分是进化保 守的，最明显的是位于c 末端的8 个氨基酸的一段序列( p r p p h p r l ) ，还有一个 p k - p 二肽( 在抗菌肽h bib 序列中是第4 5 残基) ，以及在第9 位点的脯氨酸 f 抗菌肽h b h i 除外1 ，共同构成了保守“核心”区域。在这些保守部分之间的区 域和n 末端区域是变化的，称为“可变”区，而且发现亲缘关系近的昆虫( 如 4 中山大学硕士学位论文 蜜蜂熊蜂；w a s p s h o r n e t s y e l l o w j a c k e t s ) 之间这种变化很小( 仅1 个或2 个氨基 酸差异) ；若亲缘关系较远如蜜蜂和姬蜂总科的p a r a s i t i cw a s p s 之间的变化就很明 显了( i c a s t e e l se t 口，1 9 9 4 ) 。 另外一些富脯氨酸抗菌肽的苏氨酸残基存在o 一糖基化。这种翻译后修饰最 早是在d r o s o c i n 中发现的( b u l e te ta l , ，1 9 9 3 ) ，d r o s o c i n 由1 9 个氨基酸组成，第11 的苏氨酸保守并被。一二糖基化，包括n 乙酰半乳糖胺和半乳糖。随后人们发现 在p y r r h o c o r i c i n ( c o c i a n c i c he t a l ，1 9 9 4 ) ，l e b o c i n s ( h a ma n d y a n m k a w a ，, 1 9 9 5 ) 和 f o r m a e c i n s ( m a c k i n t o s h e t 口，1 9 9 8 ) 中也有氨基酸残基的0 一糖基化。p y r r h o c o r i c i n 由2 0 个氨基酸组成，与d r o s o c i n 相同，其苏氨酸被二糖基化；两种f o r m a e c i n s 都是由1 6 个氨基酸组成，与d r o s o c i n 有5 0 的序列同源，在保守的苏氨酸上被 n 乙酰半乳糖胺糖基化。l e b o c i n l 和2 由相同的3 2 个氨基酸组成，不同的只是 其糖基部分，分别为二糖和单糖。糖苷结构的不同可能是糖链延伸或降解的不同 阶段。d r o s o c i n 和p y r r h o c o r i c i n 也存在这种相似的糖基异构。l e b o c i n 3 与l e b o c i n 2 几乎完全一样，除了亮氨酸被脯氨酸代替( a a r aa n dy a m a k a w a ，1 9 9 5 ) 。尽管来源 于彳p 妇m e l l i f e r a 的a b a e c i n s 和m e t c h n i k o w i n s 也存在保守的苏氨酸，但并没有 o 一糖基化，可能是因为此苏氨酸残基周围的序列不具有被糖基化的序列特征： p r o - t h r - x a a x a a - p r o ( g e n n a r oe ta 1 ，, 2 0 0 2 ) 。 富脯氨酸抗菌肽的某些部分的序列是相似的，推测这一家族可能由p r o t o - a b a e c i n 进化而来( l e v a s h i n ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 。去除p r o t o a b a e c i n 的n 末端区可得到 m e t c h n i k o w i n s ，而a p i d a e c i n s ，d r o s o c i n s ，p y r r h o c o r i c i n s 和m e t a l n i k o w i n s 则可由 其减去c 末端区衍生得到( g e r m a r oe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 1 3 富脯氨酸昆虫抗菌肽结构与功能的关系 对比a p i d a e c i n s 各同种型的抑菌测试结果，发现各同种型的抗菌谱差异显著， 蜜蜂的a p i d a e c i n 对y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a 有很强的抑菌作用，但对c a m p y l o b a c t e r j e j u n i 没有活性，而黄蜂中分离的a p i d a e c i n 作用却完全相反( t a g u c h ie ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 “可变”区发生微小的变化会使抗菌谱发生巨大的变化。如用赖氨酸( 同种型 c d 3 一) 取代同种型c d l 一中的一个精氨酸和一个谷氨酸，就会使其完全失去对小 肠结肠炎耶尔森氏菌的原有活性但新肽对空肠弯曲杆菌空肠亚种有致死活性，而 黄玉明中华蜜蜂a p i d a e c i n 基因在乳酸乳球菌中的融合表达 原来的c d l 是没有这种活性的( c a s t e e l se ta 1 ，1 9 8 9 ) 。说明“变化”的序列短片段 之中存在着特异性的结构元件基础，即“可变”区决定抗菌谱的特异性。在研究 中，c a s t e e l s 等( 1 9 9 4 ) 还从对a p i d a e c i n 敏感的e s c h e r i c h i ac o l ia t c c l l 7 7 5 分离 出一突变株，此突变株对5 0 0 倍高浓度的蜜蜂，熊蜂和蝉泥蜂的a p i d a e c i n 不敏 感。而其他的同型，如黄蜂的a p i d a e c i n ，或具成孔活性的多肽( c e c r o p i np 1 和 m a g a i n i n ) 则对此突变株和其亲本同样具有抑菌活性。 c a s t e e l s 等( 1 9 9 4 ) 用丝氨酸置换保守“核心”区第9 位点的脯氨酸而合成 的一种人工肽h b l i i ，几乎对所有测试菌株都没有抑菌活性。因此推测这些“核 心”序列是a p i d a e c i n 型抗菌肽产生基本抗菌能力所必不可少的，即任何改变都 能预计对其功能有所削弱甚至完全丧失。t a g u c h i 等( 1 9 9 4 ) 建立一种活体系统 检测h bib 基因经随机突变处理后的产物的抗菌活性，以分析a p i d a e c i n 结构和 功能的关系，结果也证实c 末端区域在a p i d a e c i n 的抗菌活性上起着非常重要的 作用。随后又通过体内和体外试验的功能图谱分析得知，在a p i d a e c i n 中出现频 率高的脯氨酸残基、第1 2 位点的精氨酸和c 末端的亮氨酸残基对其抗菌活性也 有重要作用，并且发现a p i a e c i n 活性变化程度和被替换的氨基酸数量有密切关系 ( t a g u c h ie ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 天然的d r o s o c i n ，p y r r h o c o r i c i n 和f o r m a e c i n 肽链中部的苏氨酸都被糖基化。 d r o s o c i n 的o 一糖基化苏氨酸对其抗菌活性有重要作用，g a l - g a l n a c 二醣的加入 能增加d r o s o c i n 的抗菌活性，其抗菌谱与糖基类型( g a lv sg a l n a c ) 和糖苷键的类 型( 一o 一，口一o 一，或伍一c 一) 有关( g o b b o e ta l ，2 0 0 2 ) 。研究还发现o 一糖基的 p y r r h o c o r i e i n 比没有o 一糖基的p y r r h o c o r i c i n 抗菌活性要低( h o f f m a n ne ta 1 ，1 9 9 9 ) ， 而且只有不带和带有两个糖的p y r r h o c o r i c i n 在体外表现出抗菌活性，而带单糖的 却没有活性( h a r aa n d y a m a k a w a ，1 9 9 5 ) 。t h r l l 上被o 一糖基的比没有o 糖基的 f o r m a e c i n 抗菌活性要高( m a c k i n t o s he ta t ，1 9 9 8 ) 。m c m a n u s 等( 1 9 9 9 ) 对d r o s o c i n 的天然二糖结构的研究发现，糖基化和非糖基化的结构存在微妙的差异，提出一 个模型，认为d r o s o c i n 的第4 7 位和第1 7 一1 9 位氨基酸残基与目标蛋白质的相互 作用，而糖基化则是标示出这些正确的结合位点。苏氨酸的糖基化可能是参与了 抗菌肽与目标蛋白的结合过程，和帮助多肽与细胞表面相互作用或进入细胞中 ( k r a g o le la l ，2 0 0 2 ) 。无糖基化的l e b o c i n s 比天然的l e b o c i n s 活性低，说明o 一糖 6 中山大学硕士学位论文 基对l e b o c i n s 抗菌活性是必需的，但加入单个糖能增加其抗菌能力，而第二个糖 的加入( 形成像p y r r h o c o r i c i n 那样的g a l - g a l n a c 结构) 却减低其活性。 k r a g o l 等( 2 0 0 2 ) 用丙氨酸( a l a 扫描1 对p y r r h o c o r i c i n 的每个氨基酸残基进行 替换，研究其抗菌活性发现，a s p 2 p r o l 0 这一区域对抗菌活性起最决定性作用。 a r 9 1 9 对抗菌活性也有重要作用( h o f f m a a n n e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。c 末端的两个精氨基酸有 利于p y r r h o c o r i c i n 与带负电荷的细菌的表面进行相互作用，使抗菌肽进入细菌细 胞中。 与a p i d a e c i n 相似，被切去n 一或c 末端的d r o s o c i n 和p y r r h o c o r i c i n 的衍生物 没有活性，而且所有d 一异构体都无活性( c a s t e e l sa n dt e m p s t ，1 9 9 4 ；b u l e te t a 1 ，1 9 9 6 ；h o f f m a n ne ta 1 ，1 9 9 9 ；o t v o $ e ta 1 ，2 0 0 0 a ) 。 1 4 富脯氨酸昆虫抗菌肽的抗菌活性及作用机制 1 4 1 富脯氨酸昆虫抗茵肽的抗菌谱 c a s t e e l s 等( 1 9 8 9 ) 发现从蜜蜂体分离的的a p i d a e c i n 三个同种型对 e n t e r o b a c t e r i a c e a e 有很强的抑菌作用，包括人类致病菌如s a l m o n e l l as e r o v a r s ， s h i g h e l l ad y s e n t e r i a e 和y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a ，其m i c 值达到0 0 5 0 5 毫克，毫升； 对植物相关的细菌僻h i z o b i u 和a g r o b a c t e r i u ms p e c i e s ) 和植物病原菌 ( p s e u c o m o n a s s y r i n g a e 和e r w i n i a s a l i c i s ) 同样具有强的抑菌活性，而对昆虫病原 菌如b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s , s e r r a t i am a r c e s c e n s ，和蜜蜂病原菌b a c i l l u sa l v e i ，则 不敏感( m i c 2 0 0 毫克，毫升) 。说明a p i d a e c i n 的抗菌谱是明确指向蜜蜂常遇到的 微生物，如植物相关的细菌。但仅在成蜂血淋巴中的a p i d a e c i n 才有抗菌活性， 蜜蜂幼虫体内只有相当数量的无活性前提分子。 d r o s o c i n ，p y r r h o c o r i c i n ，f o r m a e c i n s 和m e t a l n i k o w i n s 对革兰氏阴性菌有很 高的抗菌活性。f o r m a e c i n s 在低微摩尔浓度时只对ec o l i 有抑菌作用( m a c k i n t o s h e t a l ，1 9 9 8 ) 。天然的p y r r h o c o r i c i n 和d r o s o c i n 对革兰氏阴性菌如e c o l i ，s a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m ，k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 和a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s 都有抑菌作用 ( h o f f m a n ne ta 1 1 9 9 9 ；o t v o se ta 1 2 0 0 0 a ) 。e n t e r o b a c t e rc l o a c a e 和e r w i n i a c a r o t o v o r ac a r o t o v o r a 对d r o s o c i n 也很敏感。两者对革兰氏阳性菌m i c r o c o c c u s 黄玉明中华蜜蜂a p i d a e c i n 基因在乳酸乳球菌中的融合表达 肠f p m 都有抑菌作用，而且p y r r h o c o r i c i n 对b a c i l l u sm e g a t e r i u m 也有弱的抑菌作 用。但天然的短链富脯氨酸抗菌肽对主要的革兰氏阳性人类致病菌，如 s t a p h y l o c o c c u sa l g y e l l s ，s t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a ，s t r e p t o c o c c u s p y o g e u e s 或真菌都 无抑菌活性。然而，新的研究发现，被寄生虫感染的果蝇也能表达d r o s o c i n ( b o u l m g e re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 d r o s o c i n ，p y r r h o c o r i c i n 及其的活性类似物，即使在高浓度下，对哺乳动物 的红色细胞也不具溶血作用。不同来源的所有的富脯氨酸多肽都具这一特征，对 培养的哺乳动物细胞无毒性作用( s k e r l a v a je ta l + ，1 9 9 0 ；o t v o s e t a 1 ，2 0 0 0 a ； o t v o s ，2 0 0 2 ) 。h o f f m a n n 等发现( 1 9 9 9 ) 至少在实验条件下，d r o s o c i n 在动物血液 中不稳定，但在昆虫血淋巴中更为稳定。然而在人和小鼠血液中，p y r r h o c o r i c i n 的稳定性高于d r o s o c i n ，但是其降解速度还是很快，而且这类抗菌肽有一个特点， 就是在晟初的几个小时内不作用，杀菌过程需要一段时间( c u d i ce ta 1 ，1 9 9 9 ； o t v o se ta l ，2 0 0 0 a ) 。 来自昆虫的长链富含脯氨酸多肽比短链具有更广的抗菌谱，但其特异活性在 大部份的情形下比较低。a b a e c i n 的体外的活性比a p i d a e c i n 弱，而且抗菌活性受 介质影响明显。在低离子强度的介质中，对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的作用是 相等的。但在相同条件下，x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s 对a b a e c i n s 最为敏感却对 a p i d a e c i n s 不敏感( c a s t e e l se ta 1 ，1 9 9 0 ) 。m e t c h n i k o w i n s 的抗菌活性只在少数菌种 中测试过，需进一步研究。然而，m e t c h n i k o w i n s 对革兰氏阳性细菌( m i c r o c o c e u s m t e u s ) 和细丝状的真菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 有抑菌作用( 抑菌浓度为0 5 1 0u m ) ，但对革兰氏阴性细菌( e c o l i ) 无作用( l e v a s h i n ae la 1 ，1 9 9 5 ) 。与a b a e c i n s 相 似，l e