（动物营养与饲料科学专业论文）氧化应激对仔猪肝细胞中AMPK活性的影响.pdf

摘要 为了初步探索氧化应激对a m p k 活性的影响，本实验通过体外细胞培养技术建 立仔猪氧化应激模型，研究了不同氧化剂引起氧化应激、以及v c 抑制氧化应激后 a m p k 活性的变化情况。 实验共分为6 个处理：处理一，对照组，采用低糖型的d m e m 为基础培养液分 离培养仔猪肝细胞；处理二，在处理一培养液中加入o 6 m m o l l 的h 2 0 2 ：处理三， 在处理一培养液中加入l m m o l l 的百草枯( p q ) ；处理四，0 2 m m o l l 的v c 预处理 3 0 m i n 后再加入0 6 m m o l l 的h 2 0 2 ：处理五，o 2 m m o f l 的v c 预处理3 0 m i n 后再加 入l m m o l l 的百草枯；处理六，只加入o 2 m m o l l 的v c 。以原代分离培养的仔猪肝 细胞为材料，测定了细胞中a m p k 活性，细胞培养液中总甘油三酯( t g ) 、总胆固 醇( t c ) 浓度，并通过对培养液中谷丙转氨酶( a l t ) 、乳酸脱氢酶( l d h ) ，以及 细胞中超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽还原酶( g s h p x ) 、一氧化氮( n o ) 、丙 二醛( m d a ) 浓度的测定来反映细胞氧化应激情况。结果表明： 加入h 2 0 2 后，a l t 浓度比对照组提高3 0 2 ( p 0 叭) ；l d h 浓度比对照组提 高2 8 6 4 ( p o 0 1 ) 。加入p q 后肝细胞培养液中a l t 浓度、l d h 浓度分别比对照 组提高2 4 0 3 ( p o 0 5 ) 和2 4 0 3 ( p o 0 1 ) ，h 2 0 2 和p q 处理之间两种抗氧化酶 活性差异不显著。 加入h 2 0 2 和p q 后细胞内g s h p x 活性分别比对照组下降5 8 6 和5 5 0 3 ( p o 叭) ，两个处理间差异不显著。s o d 活性在加入h 2 0 2 和p q 后分别比对照组下 降4 7 o l 和3 5 3 3 ( p 0 0 1 ) ，处理间差异不显著。 h 2 0 2 和p q 处理组细胞内n o 含量分别比对照组提高1 2 6 3 2 和2 5 2 8 7 ( p 0 0 1 ) ，p q 组的n o 含量高于h 2 0 2 组( p o 0 1 ) 。h 2 0 2 和p q 处理组m d a 的 含量分别高于对照组1 1 7 9 9 和1 1 9 2 2 ( p 0 0 5 ) ，与基础培养液对照组差异不显著；l d h 的浓度低于h 2 0 2 和p q 处理组( p o 0 1 ) 。v c 预处理后再加入p q 和单独加入v e 两个处理组细胞内g s h p x 活性高于h 2 0 2 和p q 组( p o 0 5 ) ， 低于基础培养液组( p 0 0 1 ) ；细胞内n o 和m d a 含量极显著低于h 2 0 2 和p q 处理 组( p 0 0 1 ) ，与基础培养液组差异不显著。 由此可知，在采用v c 预处理后，可以使细胞内a l l 和l d h 的外流保持不变或 减少，抗氧化酶活性的下降受到一定程度的抑制，n o 和m d a 产生处于正常水平。 说明v c 可以减轻由h 2 0 2 和p q 造成的氧化损伤。 各处理a m p k 活性的变化情况是h 2 0 2 和p q 处理组比对照组分别提高5 5 1 1 和 4 5 9 7 ( p o 0 5 ) 。v e 预处理后再加入h 2 0 2 比h x o z 组a m p k 活性降低2 1 9 4 ，v c 预处理后再加入p q 处理组比p q 组a m p k 活性降低2 7 2 1 。经相关性分析表明，a m p k 活性与g s h p x 和s o d 活性呈负相关，与n o 和m d a 浓度呈正相关。由此可以认 为氧化应激可以激活a m p k 。 经检测细胞培养液中t c 的含量各处理间差异不显著。而t g 浓度则是对照组、 h 2 0 2 、p q 低于其余三个处理( p o 0 5 ) 。 综上所述，本实验通过h 2 0 2 和p q 建立起了仔猪肝细胞氧化应激模型，氧化应 激可以激活a m p k 。 关键词：氧化应激a m p k过氧化氡( h 2 0 2 )百草枯( p q ) 肝细胞 t h ee f f e c to fa m p a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s ea c t i v i t y i n d u c e db yo x i d a t i v es t r e s si ni s o l a t e dp i gh e p a t o c y t e s f a n n i n g ( a n i m a ln u t r i o na n df e e ds c i e n c e ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rc h e nd a iw 宅n t h ee x p e r i m e n tw a sc o n d u c t e dt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to ft h eo x i d a t i v es t r e s so nt h e a m p ka c t i v i t y o x i d a t i v es t r e s sw a sp r o d u c e db yh 2 0 2o rp a r a q u a t ( p q ) i ni s o l a t e d p e r f u s e dp i g l e th e p a t o c y t e si nv i t r o v cw a su s e dt op r o t e c tc e l l sf r o mo x i d a t i v es t r e s s t h ee x p e r i m e n td e s i g n e ds i xt r e a t m e n t s ：c o n t r o l ( b a s a lc u l t u r e ) ，h 2 0 2 ( o 6 m r n o l l ) ， p q ( 1 0 0 r e t o o l l ) ，h 2 0 2 ( o 6 m m o l l ) a n dv c ( o 2 r e t o o l l ) ，p q ( 1 0 0 r e t o o l l ) a n dv c ( o 2 m m o l l ) ，v e ( o 2 m m o l l ) t h el e v e lo f t c ( t o t a lc h o l e s t e r 0 1 ) ，t g ( t r i g l y c e r i d e s ) ，a l t ( a l a n i n ea m i n o t r a n s t e r a s e ) a n dl d h ( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ) i nc e l l s c u l t u r a ls u p e m a t a n t w e r em e a s u r e d t h ea c t i v i v yo fs o d ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) a n dg s h - p x ( g l u t a t h i o n p e r o x i d a s e ) ，t h ec o n t e n to fn o ( n i t r i co x i d e ) a n dm d a ( m a l o n d i a l d e h y d e ) i nc e l l sw e r e d e t e r m i n e d ，t h ea c t i v i t yo f a m p kw a sa l s os t u d i e di np i g l e th e p a t o c y t e s t h er e s u l t sw e r e a sf o l l o w s ： h 2 0 2c a ni n c r e a s et h ea c t i v i t yo fa l tb y3 0 2 ( p o 0 1 ) a n dl d hb y 2 2 8 6 ( p o ，0 1 ) a l t a n dl d ha c t i v i t i e sw e r ei n c r e a s e db y2 4 0 3 ( p 0 o s ) a n d 2 0 3 1 ( p 0 0 1 ) r e s p e c t i v e l yi nc e l l st r e a t e dw i t hp q t h ea c t i v i t yo f g s h p xi nc e l l sa f t e r t r e a t e dw i t hh 2 0 2o rp qw a sd e c r e a s e db y5 8 6 a n d5 5 0 3 f p ( 0 0 1 ) r e s p e c t i v e l y t h e s o da c t i v i t yw a sr e d u c e db y4 7 0 1 ( p o 0 1 ) i nh 2 0 2t r e a t m e n t ，a n dr e d u c e db y3 5 3 3 f p o 0 1 ) i np qt r e a t m e n t t h ec o n t e n t so f n 0a n dm d a w e r ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya f t e r t r e a tw i t hh 2 0 2o rp q n oc o n t e n ti np qt r e a t m e n tw a sh i g h e rt h a nt h a ti nh 2 0 2t r e a t m e n t t h er e s u l t so ft h e s ei n d e x e ss h o w e dt h a tt r e a t m e n t 诹也h 2 0 2o rp qw o u l dd i s r u p t s t r u c t u r eo fh e p a t o c y t em e m b r a n e h 2 0 2o rp qa l s or e d u c e dt h ea c t i v i t yo fa n t i o x i d a t i v e e n z y m e s ，a n dt h e s et w oo x i d a n t si n c r e a s e dt h ec o n t e n to fn 0 ，m d a f r o mt h e s ef a c t s ，i t w a sc o n c l u d e dt h a tt r e a t m e n tw i t hh 2 0 2o rp qr e s u l t e di no x i d a t i v es t r e s si np i g l e t h e p a t o c y t e s p r e t r e a t m e n tw i t hv cd e c r e a s e da l ta n dl d ha e t i v i t y , a n di n c r e a s e dt h ea c t i v i t yo f g s h - p xa n ds o dc o m p a r e dt ot r e a t m e n tw i t hh 2 0 2o rp q v ca d d e di n t oc e l lc u l t u r e s u p e m a t a n tr e d u c e dt h ec o n t e n to f n oa n dm d a i nh e p a t o c y t e s t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tv cw a sa ne f f i c i e n ta n f i o x i d a n t i tw a sa b l et op r e v e n tt h e d e c r e a s eo fo x i d a t i v ee n z y m e sa n dk e e pt h ec o n t e n to f n o ，m d aa tan o r m a ll e v e l i tw a s c o n c l u d e dt h a tv cc o u l dp r o t e c tt h ec e l l sf r o mo x i d a t i v es t r e s si n d u c e db yh 2 0 2a n dp q t h ea c t i v i t i e so fa m p ki ns i xg r o u p sw e r ed i f f e r e n t a f t e rt r e a t e dw i t hh 2 0 2o rp q t h ea c t i v i t yo fa m p kw a si n c r e a s e db y5 5 1 1 a n d4 5 9 7 r e s p e c t i v e l y c o m p a r e dt o h = 0 2t r e a t m e n t ，a m p ka c t i v i t yr e d u c e d2 1 4 9 i nc e l l sp r e t r e a t e dw i t hv c v ca l s o r e d u c e da m p ka c r i d t yb y2 7 2 1 c o m p a r e dt op qt r e a t m e n t t h e r ew a san e g a t i v e c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ea c t i v i t yo fa m p ka n dt h ea c t i v i t yo fg s h p x s o d a m p k a c t i v i t yh a dap o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t l lt h ec o n t e n t so f n o m d a t h e s er e s u l t ss u g g e s t e d t h a ta m p kw o u l db ea c t i v a t e db yo x i d a t i v es t r e s s t h ec o n t e n to ft ga n dt cw e r ee x a m i n e di nt h ec u l t u r a ls u p e m a t a n t t h er e s u l tw a s n o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n ta m o n gt r e a t m e n t s a d d i t i o no fv ci nh e p a t o c y t e sc o u l di n c r e a s e t h ec o n t e n to f t g t a k e nt o g e t h e r , o u rr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a th 2 0 2o rp qi n d u c e de f f i c i e n t l y o x i d a t i v es t r e s so f p i g l e th e p a t o c y t e s a n do x i d a t i v es t r e s sc o u l da c t i v a t ea m p ka c t i v i t y k e yw o r d s ：o x i d a t i v es t r e s s a m p - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) p a r a q u a t ( p q ) h e p a t o c y t e 论文独创性声明 本人郑重声明： 所星交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所 知。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位 或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 苏了 关于论文使用授权的声明 。l 蜘，年，月勤同 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允诌论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：。锄孥 导师签名：。千曙荻 i 呻s 年砖o r 舐广年月；嗣 1 刖置 目前养殖业发展迅速。生产集约化程度不断增加，在生产效率增长的同时也带 来越来越多的应激情况，氧化应激就是其中一种常见的应激情况。 引起氧化应激的原因较多，生产中的创伤、运输，空气污染物( 如n 0 2 、n o 等) ， 电离辐射，紫外线，某些化学毒物( 如除草剂百草枯、卤化烃类c c l 4 等) ，以及某些 药物( 例如抗癌药博莱霉素、阿道诺霉素等) 均会使动物处于氧化应激状态【l 】。氧化 应激将导致细胞膜完整性受损。多种酶活性改变，组织的功能无法正常实现，从而引 起畜禽采食置下降，生产性能降低，发生代谢性疾病，丽目前尚无直接有效的方法来 解决氧化应激带来的这一系列问题。 腺苷一磷酸( a m p ) 激活的蛋白激酶( a m p a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，缩写州p k ) 是一种对能量平衡改变非常敏感的酶类，对其近十多年来的研究发现，a m p k 在应 激动物的代谢中具有特殊的作用，它可以根据机体细胞的能荷状态调节细胞产能和耗 能代谢的方向1 2 1 。几乎所有的应激都可引起体内能量代谢的变化，从而激活a m p k ， 氧化应激也不例外。由于a m p k 在营养代谢调节中的这重要作用，近几年来有关 a m p k 的研究逐渐成为生物化学和生物医学的热点领域p l 。 目前有关a m p k 的研究结果表明在实验动物中a m p k 与应激代谢调节有关，这 一结果为利用a m p k 改善应激对生产动物的损伤提供了新的思路。进一步对该酶生 理功能进行深入研究和探索，并将其与生产动物的应激损伤联系，可能为深入了解应 激本质和寻求缓解应激的有效措施提供新的思路和方向。氧化应激做为一种常见的应 激状况，它与a m p k 之间关系的研究仅在实验动物上有少量报道。本实验主要利用 体外培养仔猪肝细胞研究了氧化应激条件下a m p k 活性变化情况，以及一系列相关 酶活性和氧化产物数量的变化，为进一步了解a m p k 在畜禽氧化应激状态下的代谢 情况，探索a m p k 是否介导氧化应激提供基础数据。 2 。文献综述 2 1 氧化应激的产生与危害 2 1 1 自由基的产生与清除 氧化应激( o x i d a t i v es t r e s s ) 是指一系列的细胞内或外状态，该状态下自由基 ( 如0 ：一、h ：o ：、o h ) 及相关物质大量产生【4 1 ，体内的清防御系统不能及时清除这些自 由基，导致氧化和抗氧化系统动态平衡失调，自由基累积，造成氧化损伤。 在生理情况下，生物体内正常的物质代谢过程中也会产生自由基，此时自由基是 机体正常代谢产物，具有杀死有害微生物，调节免疫力等独特的生理作用。生物体内 自由基主要由某些酶促反应和非酶促反应产生【5 l 。 酶促反应系统包括呼吸链氧化磷酸化及微粒体细胞色素p 。等，例如典型的次黄 嘌呤( 或黄嘌呤) 黄嘌呤氧化酶系统( x x o 系统) 。非酶促反应指氧与有机化合物 反应以及电离辐射引起的共价键化合物均裂等过程，这些过程同样也会产生大量自由 基，如水经辐射分解可产生超氧阴离子及h 。o ：。 机体对自由基损伤的防御主要可归纳为大分子的酶促自由基清除系统和小分子 的抗氧化剂两大类1 6 j ： 酶类：如超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) ，谷胱甘肽过氧化物酶 ( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，g s h - p x ) ，过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 等； 抗氧化剂：如维生素c ( 清除h ：o ：、r 、o h ) 、维生素e ( 清除r 0 0 ) ，含巯基化 合物( 如谷胱甘肽，半胱氨酸等，清除h 2 0 ：、r 、o h ) ，b 一胡萝h 素，尿酸及辅酶 q i o 等。 由于自由基性质活泼在很短时间内就可以与其它物质反应，而且往往以连锁反应的方式进 行，因此一旦机体内自由基的生成与清除的动态平衡被打破自由基会快速的增多累积，其造成 的损伤也逐步扩大。自由基的强氧化作用，可使其参与的反应直接或间接地对细胞及生物人分子 产生各种毒作用。导致机体暂时的或不可逆的损伤。 2 1 2 氧化应激的危害 氧化应激主要是由于自由基的大量堆积造成的一种机体的不良状态，因此氧化应 激对生物的损伤也就是自由基的损伤。一个特定的器官或系统对氧化应激的易感性， 取决于发挥氧化应激的因子( 自由基) 和其具有的抗氧化能力的因子之间的总平衡， 所以氧化损伤可以描述为抗氧化能力不足或氧化应激过度h l 。 自由基主要通过引发脂质过氧化、修饰蛋白质、引起分子交联等机制而造成如核 酸损伤、核苷酸类辅酶受到破坏、巯基酶活性改变，以及生物膜脂质过氧化等不良后 果。脂质过氧化是氧化应激引起的最常见的氧化损伤之一，即脂肪的多不饱和脂肪酸 侧链通过自由基链式反应而自动氧化。脂质过氧化链式反应会产生许多新的自由基， 而且该反应的终末产物还包括丙二醛( m d a ) 、乙烷、4 一羟烯烃等一些能与d n a 反 应而导致其突变，或与蛋白质反应引起其结构功能损伤的有毒物质。例如，m d a 可 以通过与蛋白质的游离氨基酸形成s c h i f f 碱，使蛋白质分子间发生交联，活性丧失”】。 除了引起脂类的过氧化外，自由基还直接作用于蛋白质，或通过脂类过氧化的产 物与蛋白质反应，引起蛋白质的损伤。1 9 8 4 年n a g y 等研究并证明了自由基对氨基酸 的作用口j 。d a v i e s 等( 1 9 8 7 ) 报告了牛血清白蛋白与o h 或o h + 0 2 一接触后，氨基 酸被破坏，并发现氨基酸的受损程度与自由基的浓度呈正相关【7 1 。b l u m 等观察到含 硒的g s h p x 与x x o 反应系统接触时活性丧失，s o d 能完全阻止失活反应，而c a t 则不能，提示0 2 。介导了g s h p x 的失活。其机制可能是通过攻击巯基，使g s h p x 由还原型转变为氧化型而失活【5 1 。归纳起来自由基对于蛋白质的作用方式主要有以下 三种【5 】：修饰氨基酸残基，引起蛋白质分子构象改变，肽链断裂，蛋白质分子发生 聚合或交联；增强蛋白质对水解酶的敏感性；使变性蛋白质发生集聚。 氧化应激对d n a 的氧化损伤在正常代谢情况下以很高的频率发生，据估计人体 内每个细胞的d n a 每天暴露于1 1 0 4 氧化冲击，导致2 0 多种不同的d n a 的氧化损 伤l 引。d n a 的外源性氧化损伤可以由电离辐射或光氧化、羟基过氧化物、氧自由基 及其它具有氧化性的因素所致【9 1 。大剂量的辐射可直接使d n a 断裂；较小的剂量的 辐射对d n a 的损害主要是d n a 的主链断裂，碱基降解和氢键破坏，氢键破坏可能 是主链断裂或碱基降解的结果所造成的次级反应【l l 。b r i c k e r s 等实验证明，抗癌药博 莱霉素( b l e o m y e i n ) 可引起犊牛胸腺d n a 及新生兔表皮d n a 的链断裂，其中超氧 阴离子参与了d n a 损伤，反应体系中若加入s o d 、e d t a 和细胞色素c ，d n a 链断 裂即被抑制【10 1 。l e s k o 等用分离的染色质和h 2 0 2 作用发现有d n a 与蛋白质联接物 ( d p c ) 产生，并认为这是由于- o h 引起d n a 自由基与蛋白质相互偶联的结果。d p c 难以修复，未修复的d p c 可能影响d n a 的正常复制与转录，最终导致细胞畸变和死 亡【i i i 。 2 2a m p k 对营养代谢的调节 2 2 1 脯p k 的研究历史 a m p k 目前已成为生物化学、生理学以及医学等领域的研究热点之一，追溯其研 究历史，可以发现a m p k 的研究最早始于二十世纪七十年代初期。b e g 等( 1 9 7 3 ) 报 道，在a t p 存在的同时大鼠肝细胞中的一种物质可使h m g r ( 羟甲基戊二酸单酰辅酶a 还原酶) 的活性受到抑制。同年c a r l s o n 和k i m 也报道，大鼠肝脏与a t p 同时培养时， a c c ( 乙酰辅酶a 羧化酶) 会被一种蛋白激酶磷酸化丽失活。此后，b e g 等( 1 9 7 8 ) ， k o t h 等( 1 9 7 9 ) 发现h m g r 的失活与其发生的磷酸化作用有关。y e h 等( 1 9 8 0 ) 发现 a c c 的磷酸化失活与5 ，_ a m p 有关。1 9 8 5 年f e r r e r 等进而发现a m p 也参与了h m g r 的 磷酸化失活作用。c a r l i n g 等( 1 9 8 7 ) 从大鼠肝脏部分纯化出一种蛋白激酶，能催化 a c c 和h m g r 发生磷酸化使其失活。此后的大量的研究最终证实引起a c c 和h m g r 失活 的激酶为同一种酶，被重新命名为a m p k ( c a r l i n ge ta l ，1 9 8 9 ) 【2 t 1 2 】。 2 2 2a m p k 的结构及分布特点 a m p k 分子是由a 、b 、y 三个亚基组成的三聚体，属于s e r i n e t h r e o n i n e 激 酶家庭的一员【1 3 j 。q 为催化亚基，b 、y 为调节亚基。a 亚基有一个n 端激酶催化区 和一个c 端调节区，b 亚基主要起支架作用。a 、y 亚基分别在b 亚基的k i s ( k i n a s e i n t e r a c t i o ns e q u e n c e ) 和a s c ( a s s o c i a t i o nw i g hs n f i ) 区被固定。y 亚基有四个 c b s ( c y s t o t h i o n i n ebs y n t h a s e ) 串联重复区，这些区可能参与了5 - a m p 在a m p k 激酶 的结合【1 4 1 。研究还发现这三种亚基又分别有自身的同工型，亚基有n1 和a2 两个 同工型，b 亚基也有两个同工型b1 和b2 ，y 亚基则有三个同工型y1 、y2 和y3 。 a m p k 在体内分布很广，心脏，肝脏，十二指肠，骨髂肌中均可检测到a m p k 。 d a v i e s 等( 1 9 8 9 ) 研究报道a m p k 分布于大鼠的各组织器官，在代谢愈高的组织如 肝脏，a m p k 活性越愈高，而在骨骼肌和脑中活性最低【1 5 】。余冰( 2 0 0 3 ) 研究报道， 在仔猪肝脏、骨骼肌、心脏和十二指肠中均有a m p k 分布，其中骨骼肌a m p k 基础 活性相对较高，肝脏a m p k 基础活性相对较低【2 1 。两者结果的差异可能是由于动物 种类不同导致其不同组织器官主要功能有区别，进而影响a m p k 的基础活性。 2 2 3a m p k 对营养代谢的调节 a i v 6 ，k 作为一种可调控能量代谢的蛋白激酶，它能被细胞内a m p a t p 比例增加 而激活。因此许多会降低细胞能量水平的代谢应激都能激活它，如热应激、缺血、缺 氧、氧化应激、代谢中毒等。a m p k 作为维持体内的能量平衡的关键物，被称为是 调控细胞能量的“燃料感受器”d 6 , ”1 ，它旦激活，最先的一系列的反应就是维持细 胞内的能量平衡【1 8 】。 a m p k 活化后，对能量的调控作用主要是通过迅速调节一系列作用底物的活性， 从而改变脂肪和碳水化合物代谢来实现的【。近几年的研究还发现，a j v l p k 可能参与 了基因表达的调节，进而适应性的调节细胞的合成和分解代谢方向。同时，a m p k 4 还可能参与激素信号传递调节等其他一些细胞活动，来影响体内能量代谢过程。 2 2 3 1a m p k 活化对脂肪代谢的调节 a m p k 对脂肪代谢的调节，主要通过直接磷酸化调节脂质代谢的酶类活性，甚至 通过调节这些酶的基因表达来调节酶活性，进而改变脂质的代谢方向1 2 1 。调节方式主 要有两方面，一是促进脂肪酸分解，二是抑制脂肪酸合成。 首先a m p k 对脂肪酸合成的抑制主要通过磷酸化固醇合成的关键酶h m g r ，抑 制固醇合成：或者是通过磷酸化脂肪酸合成的关键酶a c c a 及甘油三酯合成的限速 酶甘油磷酸酰基转移酶( g p a t ) 来实现脂肪酸合成的抑制。其次a m p k 还可以磷酸化 a c c - 1 3 、激素敏感脂酶( h s l ) 、丙二酸单酰辅酶a 脱羧酶( m c d ) 及细胞骨架成分促 进脂肪酸的氧化。 目前研究的相对较多的是a m p k 对a c c 和h m g r 两种酶的调节作用。d c a r l i n g 等( 1 9 8 9 ) 实验结果显示，a m p k 是肝中影响h m g r 活性的主要酶类【1 9 1 。d a r i e s 等 ( 1 9 9 0 ) 2 0 1 研究认为a c c 上有三个磷酸化位点可被a m p k 磷酸化，分别是s e r l 2 ”， s e r 7 9 和s e r l 2 0 0 。而引起a c c 酶活改变的主要是s e t 7 9 的磷酸化，其余两个位点的磷酸 化对酶活没有影响。h e n i n 等( 1 9 9 5 ) 1 2 1 研究发现，悬浮培养的大鼠肝细胞中添加 a i c a r 培养5 分钟后，h m g r 活性便被抑制8 5 ，一直到培养3 0 分钟结束后h m g r 活性都没有出现上升趋势；同时胆固醇含量极显著下降，到3 0 分钟后，胆固醇合成 量较对照组减少约9 4 。c o t t o n 等( 1 9 9 5 ) 发现，在悬浮培养的大鼠肝细胞中添加 0 5 m m o l l 的a i c a r 后，h m g r 的活性在2 0 分钟达到最低，并且直到6 0 分钟后 h m g r 活性也没有升高的迹象，此时胆固醇合成量较对照组减少约8 0 1 2 2 1 。j a s o nr b d y c k 等( 1 9 9 9 ) 【2 习研究发现a m p k 可以磷酸化大鼠心肌细胞中a c c 的两种亚型， a c c 2 6 5 和a c c 2 柏，使其活性几乎完全丧失。而且该研究还发现，a m p k 2 亚基是 主要的调节a c c 活性的催化亚基。c h e n 等( 2 0 0 0 ) 观察到大鼠骨骼肌在剧烈运动 3 0 秒后，a m p k a1 和2 亚基活性显著高于未运动时，a c c 磷酸化也比未运动时增 加了约3 8 倍【2 4 1 。余冰( 2 0 0 3 ) 报道在仔猪肝细胞上使用a i c a r 激活a m p k 以后， a c c 活性下降，而使用抑制剂8 b r - a m p 抑制a m p k 活性以后，a c c 活性上升【2 】。 2 2 3 2 m p i ( 活化对碳水化合物代谢的调节 a m p k 活化除了通过对脂类代谢调节，增加对细胞的供能以外，同时还对碳水 化合物代谢有影响。a m p k 活化可以促进葡萄糖的吸收。抑制糖异生。调节糖原合 成与糖酵解，使机体能量代谢朝着产能的方向进行。 现在许多的研究都检测到在分离的骨骼肌，脂肪细胞，心脏或肝脏中，a m p k 的活化会影响到葡萄糖的转运口5 - 2 8 1 。在分离的大鼠心室肌肉或再灌注的心脏中， a m p k 活性增加则葡萄糖吸收增加，经检测葡萄糖吸收增加是由于g l u t 一4 从细胞 内贮存池到质膜的转移增多而引起的【2 引。在其他一些组织中，多种应激例如缺氧，高 血清渗透压和运动都能活化a m p k 的1 ，a2 亚基，同时葡萄糖的吸收成倍增加 2 7 , 2 9 , 3 0 。a m p k 活化对糖酵解的促进作用可能是通过增加已糖激酶和磷酸果糖激酶活性 来实现的，a m p k 还会刺激糖原异生途径的关键酶来抑制糖的异生作用【l ”。 i s a b e l l el e c l e r c 等实验认为a m p k 可能会在转录水平上调节特异性的葡萄糖应 答基因。w w w i n d e r 等【3 2 1 实验结果表明，加入a i c a r 2 m m 后大鼠肌肉中a m p k 活 性和葡萄糖吸收量极显著增加。w a f aa b b u d 等口3 】实验结果表明，在3 t 3 l 1 前脂肪细 胞和c 2 c 1 2 成肌细胞中加入a i c a r 后激活a m p k ，g l u t 1 介导的葡萄糖的转运率 提高了4 6 倍。 2 3 氧化应激对a m p k 活性的影响 2 3 1 氧化应激对体内能量水平的改变 氧化应激会造成机体一系列的损伤，并引起能量代谢的改变。首先氧化应激所导 致的脂质过氧化使脂类在体内的代谢过程受到影响，脂类正常氧化供能减少。其次脂 质过氧化还会造成生物膜的脂质过氧化，使膜的脂质与蛋白质比例失常，液态性与流 动性发生改变，膜受体与离子通道的脂质微环境遭到破坏。破坏的结果之一就是c a 2 + 内流增多使细胞内钙超载，钙超载可以抑制呼吸链上的电子传递【3 “。此外这种破坏还 可促使黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转化，加速自由基的产生，形成恶性循环【5 】。 氧化应激生成的自由基还会严重的损伤线粒体。线粒体在生物体的能量代谢过程 中具有重要作用，这是因为线粒体内外膜间的是三羧酸循环的所在地，内膜上还包含 有催化氧化磷酸化的5 种蛋白质复合体【3 5 】。并且转运a t p 的载体位于线粒体膜上， 线粒体内生成的a t p 需经过线粒体膜才能转运到线料体外【3 6 】。线粒体膜受损还会引 起a t p 酶活性下降，导致a t p 代谢过程受到阻碍。因此一旦线粒体受损，a t p 产生 和转运就受到抑制。 自由基对线粒体的损伤首先是使线粒体膜发生脂质过氧化，影响a t p 的生成与转 运。除此之外，氧化应激还会对线粒体d n a 造成损害。线粒体d n a 呈双链环状， 独立存在于细胞核外，与核d n a 相比它缺乏保护性组蛋白，损伤的修复能力受到限 6 制1 35 1 ，因此线粒体的d n a 较核d n a 更易受自由基攻击。同时由于线粒体d n a 编码 的多肽都是氧化磷酸化系统的组成部分，所以自由基可以通过损伤线粒体d n a 来攻 击氧化磷酸化系统。氧化磷酸化系统受损后a t p 生成减少，自由基生成增多，又进 一步引起该系统的损伤，形成一种氧化损伤和氧化磷酸化之间的循环损伤机制。因此 线粒体受到氧化损伤时，体内的能量代谢就会被抑制，a t p 生成减少。 此外，氧化应激会促进细胞内n o 生成增多【3 ”，而n o 与体内能量代谢过程密 切相关。首先，n o 与线粒体呼吸功能有关，其分子机制为：n o 可以抑制线粒体电 子传递链中的复合物1 ( n a d h 辅酶q 还原酶) 和复合物2 ( 琥珀酰一辅酶q 还原 酶) 的活性1 4 2 1 。其次，有实验发现，心肌微血管释放的n o 抑制了线粒体的呼吸链， 进一步的研究则提出n o 不但抑制这两种酶的活性，还通过与线粒体电子传递链末端 的细胞色素氧化酶的氧结合位点竞争性结合，而调节线粒体的呼吸和组织氧耗量【4 3 1 。 第三，n o 还可以抑制三羧酸循环的关键酶顺乌头酸酶，从而抑制肝脏a t p 合成【4 “。 第四，n o 可激活多聚a d p 一核糖聚合酶( 队d p ) ，使n a d 一大量消耗，导致糖酵解 速度的降低和呼吸链的电子传递减缓【4 5 1 。n o 还使3 一磷酸甘油醛脱氢酶( g a s p h ) 亚硝基化，从而抑制糖酵解，阻断细胞能量的生成m 】。因此当氧化应激促使n o 过量 的生成时，细胞内a t p 的产生减少。 2 3 2 能量水平与a m p k 的活化 a m p k 的活化在体内主要受机体能量水平的调节，当体内a t p 水平下降，a m p 水平 升高时，a m p k 就被激活。a m p 是a m p k 的特异性激活剂之一，但其作用机制比较复杂。 当a m p k 被a m p 活化时，首先是a m p 结合到a m p k 上，从而引起它的变构效应，即a m p k a 亚基构形改变后与y 皿基结合，并暴露出一个磷酸化位点，使a m p k 更易磷酸化。 a m p 结合到a m p k 上还使它成为上游a m p k 激酶( a m p k k ) 更好的底物，以及成为p p 2 c ( p r o t e i np h o s p h a t a s e 2 c ，蛋白磷酸酶2 c ) 更差的底物( p p 2 c 可使已磷酸化的a m p k 去磷酸化而失去酶活) 口，矧。近来的研究已经确定了a m p k 的上游激酶就是肿瘤抑 制因子之一l k b i b 6 4 7 1 。 a m p k 的磷酸化主要是其催化亚基n 第1 7 2 位的t h r 被上游激酶磷酸化 2 , 1 3 , 1 6 , 1 8 】， 但也有报道认为除了t h r l 7 2 以外，o 亚基至少还有两个其他残基可被a m p k k ( a m p k 激酶) 磷酸化，它们是t h r 2 诣和s e r 4 8 5 ( n n n2 亚基中的s e ? 9 1 ) 。而b 亚基也在多个 位点上发生了磷酸化，但磷酸化这些残基的蛋白酶，以及这些位点磷酸化对a m p k 活 性的影响都还是未知的1 4 s 】。 使a m p k 活化的还不仅仅是a m p 本身，研究发现a m p 对a m p k 活性的促进 作用受到高浓度的a t p 抑制，a m p 与a m p k 的亲和力也会因a t p 浓度的升高而下 降。原因在于a t p 能与a m p 竞争结合a i v l p k 上的变构位点，从而抑制a m p 对a m p k 的活化作用。因此调控a m p k 的信号确切的讲应该是a m p a t p 比值【3 】。 除了a m p a t p 比例以外，近几年研究发现，a m p k 的活化也可以通过一些不依 赖于改变a m p a t p 比率的途径来现实的。如5 氨基4 咪唑羧基酰胺核苷( 5 a m i n o 4 i m i d a z a l e c a r b o x a m i df i b o s i d e ，缩写为a i c a r ) 作为一种a m p k 特异性活化 剂，是通过其单核苷酸衍生物z m p 来激活a m p k 的 2 j 2 。还有一些物质如m e t f o r m i n ( 盐酸二甲双胍) ，l e p t i n ( 瘦素) ，a d i p o n e c t i o n ( 胖激素) 等也能激活a m p k ，但 对其激活a m p k 的途径了解很有限，极有可能是通过与a m p a t p 比率的变化无关的方 式来活化a m p k 的【4 9 l 。就目前研究结果而言，a m p a t p 比率仍然是a m p k 活化的最 主要诱因。 2 3 3 氧化应激对a m p k 活性的影响 当动物机体处于氧化应激状态时，体内的能量代谢平衡被打破，a t p 的消耗增多 而生成减少，造成a m p a t p 比率升高，这就可能激活a m p k 。a m p k 活化后立即开始抑 制a t p 消耗，促进a t p 的生成，减轻氧化应激带来的损害。目前这方面的内容研究较 少，主要集中在实验动物上，生产动物上有关两者关系的研究还未见报道。 s a n g - l i mc h o i 等( 2 0 0 1 ) 3 】研究发现，n i h 3 t 3 细胞培养时引入h 2 0 2 ，结果 a m p k 被激活了。q u a n r if i n 等( 2 0 0 4 ) 对大鼠活体注射奈醌，a m p k 活性在老年和 青年大鼠均升高，而且由于老年大鼠的抗氧化机能要弱于青年大鼠，a m p k 活性