（果树学专业论文）平邑甜茶根系质膜ATPases活性的调控及其与根系营养吸收的关系研究.pdf

v 工9 0 3 7 9 3 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科 学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和 做出重要贡献韵个人或集体，均在文中明确说明。本声明的 法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的 规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论 文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东 农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 弓方钞 砌乞 h 哪岛。0 。占 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 本试验以具有无融合生殖能力的平邑甜茶( 9 3 1 u s d u p e d e n m d s f 助j r e h d ) 当年实生苗或2 3 年生幼树为试材，在水培、砂培和盆栽条件下， 研究了四种营养物质、四种植物生长物质、根系修剪和秋施基肥对根系质 膜a t p a s e s 、蛋白激酶活性和根系营养吸收速率的调节，并结合抑制剂试 验和回归分析探讨了a t p a s e s 活性与根系营养吸收速率问的关系，结果如 下： 1 n a h t p o 一、k c l 、c a ( n o , ) 。和m g c l 。均可显著激活根系质膜h * - a t p a s e 和c a ”一a t p a s e 的活性；n a h 2 p o t 、k c l 、c a ( n o 。) 。可提高质膜h + - a t p a s e 的 p n p p 水解活性，降低h l a t p a s e 和p n p p 间的k m 值。 2 n a h 。p o , 、k c l 和m g c l t 可提高质膜蛋白总激酶的活性，且激酶活 性与质膜a t p a s e s 酶活的变化间有显著的相关性。 3 n a h 。p o 。处理下根系吸收f e ，c a ，m n ，z n ，c u 的速率变化和质膜 a t p a s e s 活性呈显著相关，与同样处理下质膜总蛋白激酶活性的变化趋势 相似但无相关性。 4 白色根和褐色根质膜a t p a s e s 活性对生长物质反应不同，吲哚乙 酸( i a a ，1 0 8 0 g g ) 和萘乙酸( n a a ，1 0 - 4 0 g g ) 对白色根质膜h l a t p a s e 和c a 2 。a t p a s e 的激活程度均强于褐色木质根，而高浓度的i a a ( 1 0 0 u g g ) 、n a a ( 5 0 p g g ) 对褐根质膜a t p a s e s 活性的抑制程度高于白色根。 低浓度的茉莉酸甲酯( 5 肛m o l l ，m e j a ) 和壳羧孢菌素( 2 5 斗g g ，f c ) 可 显著激活质膜a t p a s e s 的活性。i a a 可提高白色根和褐色根质膜h + - a t p a s e p n p p 的水解活性，降低h + - a t p a s e 和p n p p 间的l ( 1 n 值；而m e j a 和f c 对质 膜 i + 一a r p a s e 的p n p p 水解活性无影响。 5 i a a ，m e a 和f c 能够激活质膜蛋白总激酶的活性，且与a t p a s e s 活性变化间有显著的相关性。 平邑甜茶根系质膜a t p “s e s 活性的调控及其与根系营养吸收的关系研究 6 白色根和褐色根质膜a t p a s e s 活性对根系修剪和秋施基肥的反应 不同，根系修剪降低了白色根质膜a t p a s e s 的活性，提高了褐色根质膜 a t p a s e s 的活性；秋施基肥提高了白色根质膜a t p a s e s 的活性，而降低了 褐色根质膜a t p a s e s 的活性，且对c a ”- a t p a s e 的影响更为明显。两种措 施配合使用后的质膜a t p a s e s 活性介于单独使用之间。同样处理下，白色 根和褐色根质膜蛋白总激酶活性表现出一致的变化趋势。 关键词：平邑甜茶；根系；质膜；a t p a s e s ；蛋白激酶：营养吸收 山东农业大学硕士学位论文 s t u d i e so np l a s m am e m b r a n ea t p a s e s r e g u l a t i o ni nm a l u s h u p e h e n s i s ( p a m p ) r e h d r o o t s a n dt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e n a t p a s e sa n dr o o tn u t r i t i o nu p t a k e s a b s t r a c t t h ec h a n g e so fp l a s m am e m b r a n eh + - a t p a s ea n dc 一+ a t p a s ea c t i v i t i e s p r o t e i no v e r a l lk i n a s e sa c t i v i t i e sa n dr o o tn u t r i t i o nu p t a k e sw e r es t u d i e du n d e r t r e a t m e n t so f 4k i n k so fn u t r i t i o ne l e m e n t s ，4k i n d so fp l a n tg r o w t hm g u l a t o r s a n dr o o tp r u n i n ga sw e l la sb a s ef e r t i l i z e r , u s i n ga n n u a ls e e d l i n g sa n d2 - 3 y e a r so l dt r e e so f m a l u sh u p e h e n s 括( p a m p ) r e h d a sm a t e r i a l s ，i nh o a g l a n d n u t r i e n ts o l u t i o n ，s a n da n dn u r s e r yb a s i n m o r e o v e r , v i ai n h i b i t o r se x p e r i m e n t s a n dr e g r e s s i o na n a l y s i s ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np ma t p a s e sa n dr o o t n u t r i t i o nu p t a k e sw a sa l s or e s e a r c h e d r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 n a l - i z p 0 4 、k c l 、c a ( n 0 3 ) 2a n dm g c l 2c o u l ds i g n i f i c a n t l ya c t i v a t ep m i f - a t p a s ea n dc a z + - a t p a s e n a h 2 p 0 4 、k c l 、c a ( n 0 3 ) 2c o u l da l s oe n h a n e e t h ep n p ph y d r o l y s i sa c t i v i t yo fp m 一a t p a s ea n dr e d u c et h ek mv a l u e b e t w e e nh + a t p a s ea n dp n p p 2 n a h 2 p 0 4 、k c la n dm g c hc o u l di n c r e a s et h ea c t i v i t i e so fp mp r o t e i n o v e r a l ll d n a s e s ，w h i c hh a de v i d e n tr e l a t i o n s h i pw i t ha t p a s e sa c t i v i t i e s 3 u n d e rt r e a t m e n to f n a h 2 p 0 4 t h er o o tu p t a k er a t e so f f e ，c a ，m n ，z n ， c uw e r er e m a r k a b l yc o r r e l a t i v ew i t hp ma t p a s e sa c t i v i t i e s ；t h ec h a n g e so f r o o tu p t a k er a t e sw e r es i m i l a rw i t ht h et r e n do fp r o t e i no v e r a l lk i n a s e s a c t i v i t i e s ，b u tt h e r ew a sn or e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e m 4 w h i t er o o t s r e a c t i o n st op l a n tg r o w t hr e g u l a t o r sw e r ed i f f e r e mw i 也t h a t o fb r o w nr o o t sa n dt h ef o r m e rw a sm o r es e n s i t i v e 1 n d o l e a c e t i ca c i d ( i a a ， 1 0 - 8 0r j j g g ) a n dq n a p h t h y la c e t i ca c i d ( n a a ，1 0 一4 0l - t g g ) c o u l da c t i v a t ep m h + a t p a s ea n dc 一+ a t p a s eo fw h i t ea n db r o w nr o o t si n2 3y e a r so l dt r e e s a n dt h e i n d u c i n g e f f e c tw a sm o r ee v i d e n ti nt h ef o r m e r ；w h i l eh i g h c o n c e n t r m i o no f l a a ( 1 0 0 i - t g g ) a n dn a a ( 5 0 肛g ) i n h i b i t e db r o w nr o o t s 平邑甜茶根系质膜a t p a s e s 活性的调控及其与根系营养吸收的关系研究 p ma r p a s e sa c t i v i t i e sm o r es e r i o u s l yt h a nw h i t er o o t s l o wc o n c e n t r s t i o no f m e j aa n df cc o u l ds i g n i f i c a n t l yp r o m o t et h ea c t i v i t i e so fp ma t p a s e s m o r e o v e r , i a ae o u l de n h a n c et h ep n p p1 1 y d r o l y s i sa c t i v i t yo fp mh + - a t p a s e a n dr e d u c et h ek mv a l u a b l eb e t w e e nh + 一a r p a s ea n dp n p p lw h i l em e j aa n d f ch a dn os u c he f f e c t 5 i 从，m e j aa n df cc o u l dr a i s et h ep mp r o t e i no v e r a l lk i n a s e sa c t i v i t i e s ， w h i c hh a dv i d e n tr e l a t i o n s h i pw i t l la r p a s e sa c t i v i t i e s 6 w h i t er o o t s r e a c t i o nt or o o tp r u n i n ga n db a s ef e r t i l i z e rw a sd i f i e r e n tw i t h t h a to fb r o w nr o o r s r o o tp r u n i n gr e d u c e dt h ep ma = 曙a s e sa c t i v i t i e so fw h i t e r o o t sa n dm e a n w h i l ee n h a n c e dp ma t p a s e sa c t i v i t i e so fb r o w nr o o t s ；w h i l e b a s e = r e r t i l i z e re n h a n c e dt h ep ma t p a s e sa c t i v i t i e so fw h i t er o o r s r e d u c e dp m a t p a s e sa c t i v i t i e so fb r o w nr o o t sa n dh a dm o r es i g n i f i c a n te f f e c to n c a ”a t p a s e u n d e rt h esa ：i d _ et r e a t m e n t s p mp r o t e i no v e r a l lk i n a s e sa c t i e i f i e s s h o w e ds i m i l a rc h a n g i n gt r e n d k e y w o r d s ：m a l u sh u p e h e n s i s ( p a m p ) r e h d ；r o o t s ；p l a s m am e m b r a n e ； a t p a s e s ；p r o t e i nk i n a s e s ；n u t r i t i o nu p t a k e s 4 山东农业大学硕士学位论文 英文缩写 b s a c 。a m c a 2 + _ a t p a s e d t t e g l a e r f c f i t c t f a t p a s e 龇 a l i f m e j a n a a p m p m s f p n p p p v p q u e s d s s e r s o v o r v a n s r t c a t h r t r i s t 盯 英文缩略表 英文名称 b o v i n es e r u l r la l b u m e n c a l m o d u l i n c a 2 + a t p a s e d i t h i o t h r e i t o l e t h y l e n e g l y g l y c o l - b i s - n ，n - t e t r a , a c e t i ca c i d e n d o p l a s n i l er e t i c u l u m f u s i e o e ci n f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e h + a t p a s e i n d o l e a c e t i ca c i d i n d o l e b u t y r i ca c i d l a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e j a s m o n i ca c i dm e t h y le s t e r 1 1 - n a p h t h y la c e t i ca c i d p l a s m am e m b r a n e p h e n y l m e t h y s u l f o n y lf l u r i d e p - n i t r o p h e n y lp h o s p h a t e p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e q u e r e e t i n s o d i u ml a u r y ls u l f a t e s e r i n e s o d i u mo r t h o v a n d a t e s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u m t r i c h l o r o a c e t i ca c i d m o n i n e t r i h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e t y r o s i n e 中文名称 牛血清蛋白 钙调素 c a 泵 二硫赤藓糖醇 乙二醇双乙胺固连_ n n 乙酸 内质网 壳梭孢素 异硫氰酸盐 h 泵 吲哚乙酸 吲哚丁酸 激光诱导荧光 茉莉酸甲酯 萘乙酸 质膜 苯甲基磺酰氟 对硝基苯磷酸 聚乙烯吡咯烷酮 3 ，3 ，4 ，5 ，7 - 五羟黄酮 十二烷基磺酸钠 丝氨酸 钒酸钠 肌质网 三氯乙酸 苏氨酸 三羟甲基氨基甲烷 酪氨酸 平邑甜茶根系质膜a t p a s e s 活性的调控及其与根系营养吸收的关系研究 1 引言 1 1 植物 r - a t p a s e 1 1 1 植物h + _ a t p a s e 的分类 高等植物体内h + 一a t p a s e 分为3 类：第一种是有植物主宰酶之称的质 膜h + - a t p a s e ，由它建立的跨膜质子推动力可用于a t p 的形成，驱动次级离 子或溶质的跨膜运输等( m i c h e l e tb ，1 9 9 5 ) ，对有生命的细胞维持内外环 境的平衡具有极其重要的作用，同时可以帮助植物的细胞和器官控制多种 重要生理功能包括细胞分裂和伸长，在植物盐害、冻害等逆境生理的研究 中倍受重视，并涉及植物细胞的渗透调节和离子区域化等多项抗逆性生 理，该酶活性在不同水平上受到多种因素包括植物激素的调节，有关其调 节机制的研究开展十分活跃，尤其是其翻译后共价修饰调节方式受到极大 关注；第二种是有自然界微型发动机之称的f a t p a s e ( 也即a t p a s e 合酶) ， 广泛存在于线粒体、叶绿体、原核藻、异养菌和光合细菌中，是生物体能 量代谢的关键酶。该酶分别位于类囊体膜、质膜或线粒体内膜上，参与氧 化磷酸化与光合磷酸化反应，在跨膜质子动力势的推动下催化合成生物体 的能量“通货”a t p ( m i t c h e l lr1 9 6 6 ) ；第三种是于上世纪8 0 年代初所 发现的广泛存在于所有已知真核生物中的v a t p a s e ( f o r g a cm ，1 9 8 9 ) ， 是空泡膜系统中最重要的致电性质子泵，对细胞的内吞、外泌、膜流及物 质转运等生理生化过程提供必需条件( s c h u l d i n e rs ，1 9 7 8 m e l l m a n i ，1 9 8 6 ) ，是h l a t p a s e 家族中一个异常活跃的研究分支。 1 1 2 质膜w - a t p a s e 结构与特性 质膜 r a t p a s e ( p mh + - a t p a s e ) 属于p 型a t p a s e 家族，在催化的过 程中有磷酸化中间产物的存在。由多基因编码，分子量大约1 0 0 k d ，利用 由a t p 水解产生的能量，把细胞质中的h “泵”到膜外去，增加跨膜h + 梯度及膜电位，产生跨膜的离子自由能差( 质子动力uh + ) ，驱动次级 离子或溶质的传递并控制某些与生长发育有关的过程( m i c h e l e tb ， 1 9 9 5 ) 。在结构上，是一个跨膜l o 次的单链多肽( n a v a r r ec ，1 9 9 4 ) 。n 端及 c 端都位于胞质一侧，n 端的氨基酸链卷曲成a 一螺旋，由9 个跨膜区域通 过外表面非极性氨基酸残基插埋于磷脂膜中：c 末端的6 个n 一螺旋构成 环状质子通道，n 末端在膜内侧构成h + 入口( p a l m g r e nm g ，1 9 9 0 ，1 9 9 1 ) 。 山东农业大学硕士学位论文 质膜w - a t p a s e 的氨基酸序列有较高的同源性，从烟草、拟南芥、燕麦、 番茄、水稻等材料中获得质膜h * - a t p a s e 的c d n a 证实了这一点。 1 - 1 3 质膜口一a t p a s e 功能与作用机理 质膜h + _ a t p a s e 可以控制细胞内环境的p h ，产生跨膜质子电化学势 ( s z ea n dc h u r c h i l l1 9 8 1 ；b e n n e t ta n d8 p a n s w i c k1 9 8 3 ；8 z e1 9 8 4 ) ， 控制细胞伸长生长( h a g e r2 0 0 3 ) ，控制种子萌芽( y o s h i d aa n dk a g i m o t o 1 9 7 7 ) ，参与植物极性生长过程，并在植物气孔开闭，渗透调节以及对逆 境胁迫的适应( l y n c ha n ds t e p o n k u s ，1 9 8 7 ：n a k a m u r a ，1 9 9 2 ：k a s a m o 1 9 8 8 ) 中发挥作用。可通过多种调节系统调控自身活性和基因表达，适应 植物所处环境的变化。 目前质膜h - a t p a s e 的工作原理还未得到全面深入及准确的诠释，尤 其是a t p 水解与h + 传递耦合的机制还不甚清楚。假设一：h * - a t p a s e 上有 蛋白激酶和磷酸酶的活性部位，蛋白激酶与阴离子结合后被激活，与该酶 暴露在质膜内侧细胞质中的部分暂时结合( 形成磷酸中间物) 而获得能量， a r p a s e 形成高能状态期间其构象改变，与质子结合，构成质子跨膜通道。 质子经通道运送到膜外侧，随即磷酸酶被活化，与a t p a s e 结合的磷酸被 水解，然后a t p a s e 恢复到原来的低能状态。根据以上理论，s e r r a n o ( 1 9 8 9 ) 提出该酶有两种构象：e 。和e z ，它的大部分亲水区域在膜的原生质- n ，n 端构成h + 入口的门，暴露在膜外侧的c 端构成离子通道的出口。在a t p 被 水解的过程中，先以酰基磷酸键与w - a t p a s e 上的门冬酰残基结合，而后 形成磷酸化的中间产物。b r i s k i n ( 1 9 9 0 ) 提出假设二：蛋白激酶结合阳离 子( 如m g ”) 被激活后，构象e 。消耗a t p ，形成e l p h 。0 + 复合物，然后构象e 转变为构象岛；后磷酸酶活化，构象e 2 的酶失活，释放h + ，水解去掉磷酸 基团，| i 即被运向胞外。 1 2 植物c a 2 + - a t p a s e 1 2 1 分类 c a 2 + - a t p a s e 属于典型的p 型a t p 家族( d a v i de e v a n s ，1 9 9 8 ) ，能够利 用水解a t p 获得能量或质子电化学势能，催化阳离子逆浓度梯度转运，同时 生成磷酸化中间产物( h e v e l ls z c ，2 0 0 0 ) ；在此过程中，a t p a s e 完成e 。e ：构 象间转变，故也被称作e ，e ：型转运a t p a s e 。根据生化特征方面的差异，植物 平邑甜茶根系质膜a t p a s e s 活性的调控爱其与根系营养吸收的关系研究 细胞c a 2 + _ a t p a s e 可以分为两大类：一类对底物a t p 没有专一性，除a t p 外，还 能以g t p 、i t p 等为水解底物，受c a m 激活，不被c p a 专性抑制，称为p m ( 质膜 型) c a ”一a t p a s e ；另一类对底物a t p 有专一性，不受c a m 激活，但被c p a 专性抑 制，称为e r ( 内质网) 型c a “一a t p a s e ( a x e l s e n ，1 9 9 8 ) 。根据其蛋白序列同 源性，植物细胞c a - a t p a s e 可分属于】i a 型和1 i b 型两种不同基因家族蛋白 质，其中i i a 型包括e r ( 内质网) 型c r l a t p a s e 同系物，b 型包括p m ( 质膜) 型c a 2 + _ a t p a s e 同系物。它们的主要区别在于氨基酸序列上的不同，前者与 动物细胞上的s e r ( 肌质网) 型c a 2 * - a t p a s e 的氨基酸序列有较高的致性， 不含有c a m 结台区域，后者与动物细胞p m ( 质膜) 型c a l a t p a s e 同源性较高， 在氨基酸序列末装含有c a l 4 结合区域( 林建军，2 0 0 1 ) 。另外，位于质膜上 的p m 型c 矿一a t p a s e ，比位于内膜的c a ”一a t p a s e 对荧光素衍生物的敏感性 高，分子量大，以及对c a m 亲和力高等( b o n z a ，1 9 9 8 ) 。高等植物体内的所 有膜系统上都有c a ”一a t p a s e 的分布，。相比来说p m 型c a ”- a t p a s e 要l l e r 型 c a 2 l a t p a s e 的分布更为广泛，在质膜( b r i s k i n ，1 9 9 0 ；r a s i c a l d o g n o ， 1 9 9 2 ) 、液泡膜( p f e i f f e ra n dh a g e r ，1 9 9 3 ：r a m c a l d o g n o ，1 9 9 5 ； a s k e r l u n d ，1 9 9 7 ) 、内质网膜( h s i e h ，1 9 9 1 ；h o n g ，1 9 9 9 ) 、线粒体膜( l i b h ，1 9 9 4 ) 、叶绿体包被( b o n z a ，1 9 9 8 ) 、质体( h u a n g ，1 9 9 3 ；p f e i f f e ra n d h a g e r ，1 9 9 3 ) 上均有分布。其在质膜和内膜系统中的丰度因植物种树、器 官发育程度等不同而不同，例如花椰菜花序组织的c a 2 + _ a t p a s e 主要定位 于液泡膜上( a s k e r l u n d ，1 9 9 2 ；a s k e r l u n d ，1 9 9 7 ) 。 1 2 2 结构 目前的研究己陆续分离到8 个c a ”一a t p a s e 基因。w i m m e r s ( 1 9 9 2 ) 从番 茄中分离到l c a i 基因( l y c o p e r s i c o nc a ”一a t p a s e ) ，编码的c a 2 + - a t p a s e 是 含1 0 4 8 个氨基酸的蛋白，分子量为1 1 6 k d ，具有p 一型a t p a s e 所赋有的所有 高保守功能区域，疏水性分析显示8 个跨膜区段以及在氨基酸4 5 0 和7 5 0 间存在一个胞质环。l i a n g ( 1 9 9 7 ) 从拟南芥叶绿体内膜上分离到另一基因 ( p e a l ，又称a c a l ) ，其编码的多肽与各种哺乳动物p m 型c a ”- a t p a s e 有 4 0 4 4 同源性，但c 末端缺乏钙调节蛋白结合部位，推测其作用在于把 质体中的c a 2 + 运输到细胞质；通过e c a l 所编码的多肽分子量为1 1 6 k d ，在 高度保守的功能区域具有p 一型a t p a s e 的共同特征，且该多肽含有十个跨 山东农业大学硕士学位论文 膜区段，天冬氨酰磷酸化点和两个a t p 结合点位于跨膜区段4 ( t m 4 ) 和跨膜 区段5 ( t m 5 ) 间，c a ”结合的氨基酸残基是高度保守的。a s k e r l u n d ( 1 9 9 7 ) 在花椰菜中发现质膜c a “一a t p a s e 为11 6 k d ，液泡膜c a 2 + - a t p a s e 为i il k d ， 并克隆到11i k d 的c d n a ( b r a s s i c a o l e r a c e ac a ”a t p a s e ，b c a l ) ，b c a i 与 a c a i 有较高同源性，氨基酸序列6 2 相同，并含有钙调节蛋白结合部分。 1 z 3 生化特性和生理功能 生化特性方面，p m 型c a 2 l a t p a s e 每转运1 个c a ”要水解1 个a t p ，为a t p 、 g t p 或i t p 所能化；g t p 或i t p 推动的c a ”转运效率是a t p 所推动c a 2 + 转运的 5 0 6 5 ，但它们的c d + 吸收动力学特性类似，c a 2 l a t p a s e 催化的c a ”运输 动力学曲线是s 形的( r a s i - c a l d o g n a ，1 9 8 9 ) ：可被钙调节蛋白( c a m ) 和酸性磷脂激活，对曙红b ( e r y t h r o s i n b ) 高度敏感，低于1 m o l l 的e b 可 完全抑制其活性( g a r n e l l i ，1 9 9 2 ；t h o m s o n ，1 9 9 3 ) 。液泡膜和质膜上的 c a ”一a t p a s e 以及有些植物( 如胡萝h 悬浮细胞、花椰菜的花、玉米根) 内质 网上的c a ”一a t p a s e 均属于这一类型。e r 型c a 2 - a t p a s e 主要以a t p 为底物， 利用g t p 和i t p 时酶的活性仅为a t p 时的8 ；不能被钙调节蛋白激活，被环匹 阿尼酸( c y c l o p i a z o n i c a c i d ) 和l a ”抑制，对e b 敏感程度比p m 型c a 2 + - a t p a s e 低1 0 倍，但仍比质膜和液泡膜h + - a t p a s e 活性对e b 敏感程度高，后者受抑制 8 5 时，e b 浓度要远高于1 0 0um o l l ，因而对低浓度髓的敏感性是 c a 2 + - a t p a s e 区别于h + - a t p a s e 的有用指标。内质网上c a 2 * - a t p a s e e p 属于这 一类型，两种类型c a 2 + - a t p a s e 最适p h 相似，为7 o 7 5 ( 何龙飞，2 0 0 0 ) 。 细胞在长期进化过程中发展了一组赖以调节细胞内c a ”浓度的精细机 制来维持细胞c a 2 + 的稳定，这组机制总称为钙稳衡。维持此机制正常 运作的成员包括c a ”一a t p a s e ，质子泵，刺激运载体( 如c a 2 + n h + ) 以及离 子通道。即使细胞处于静息态、细胞中各部位的“c a 2 + 处于稳定，这种 稳定的梯度也由跨越每一细胞膜的c a 2 + 的出入平衡所维持着。分布在内膜 上的c a 2 4 _ a t p a s e 作用方向区别于质膜，是把胞质中c a 2 + 转运进入细胞器， 但它们作用结果是共同的，都在于把胞质c a 2 + i 量走，维持较低c a ”。除上述 的基本生理功能外，c a 2 l a t p a s e 还可能是其它二价阳离子的运输通道。 l i a n g ( 1 9 9 7 ) 发现c a ”一a t p a s e 能催化m n 2 + 的运输，使m n 2 + 进入区域化分布而 恢复生物体在高m n 2 + 介质中的正常生长；c h a r d o n n e n s ( 1 9 9 9 ) 在对z n 2 + 的 平邑甜荼根系质膜a t p a s e s 活性的调控及其与根系营养吸收的关系研究 运输机制的研究中也发现，催化z n ”运输进入液泡的是液泡膜上依赖g t p ， 且对矾酸盐敏感的运输蛋白，这种运输蛋白极可能是p m 型c a 2 + - a t p a s e 。 c a ”一a t p a s e 的逆境应答功能也受到关注，大多数逆境胁迫均会导致 c a 2 + c y t 的变化。如盐胁迫下c a ”一a t p a s e 的基因l c a l 和p h 2 7 转录水平 增加；磷饥饿处理5 d ，番茄根l c a l 转录显著增加，但在叶中没有明显变化。 c a 2 l a t p a s e 转录增加的原因在于盐和磷饥饿条件下，都导致 c a ” c y t 上 升，增加c a 2 + 一a t p a s e 活性可加快胞质c a 2 + 往质外体或细胞器中运输，有利 于保持胞质c 矿稳态( m u c h h a l u se t a l ，1 9 9 7 ) 等，这些结果显示c a 2 + - a t p a s e 对逆境具有应答功能，但在不同逆境下，发挥作用的方式是不相同的( 何龙 飞，2 0 0 3 ) 。 1 3 植物a t p a s e s 的调控和相关机制研究 1 3 1 植物质膜旷- a t p a s e 的调控 1 1 - 3 1 质膜因素的调节 植物细胞质膜本身的状态会对p mh l a t p a s e 的活性有间接的影响。 k u n i h i r ok a s a m o ( 2 0 0 3 ) 等发现磷脂双分子层组成的变化会改变p m h - k t p a s e 的k m 值、活化能和转换数。植物质膜中的固醇主要有豆甾醇、 谷甾醇和菜油甾醇3 类，谷甾醇和油菜甾醇抑制水稻根质膜k - a t p a s e 的 | r 转运活性，且随着浓度的提高抑制作用增强；胆固醇在0 3 0m o l l 的 浓度范围内可激活 r 转运活性；豆甾醇对h + 转运活性有双重影响，低浓度 时( - a t p a s e 没 有特异性抑制作用( l i a n ge ta l ；1 9 9 7 ；1 9 9 8 ) 。 1 3 2 2 c 分十一a t p a s e 活性调控的研究进展 1 3 2 2 1 逆境胁迫与c a ”- a t p a s e a t p a s e 是跨膜运输动力的产生者，因此近年来很多研究都集中在胁 迫因子对c a ”一a t p a s e 的影响上面，以期对生产实践做出科学的引导。 1 3 2 2 1 1 低温胁迫下c a 2 + - a t p a s e 的活性变化 j i w a np p a l t a 和s i s w a r i ( 1 9 9 9 ) 用洋葱表皮细胞和马铃薯叶肉细胞 为材料，证明受结冰伤害的最早细胞器是质膜和液泡膜，而提出结冰膜伤 害的假说：质膜和糖的主动运输酶失活可能是结冰伤害的原初部位，为此 生物膜的组成，膜上的功能蛋白( a t p a s e ) 在不同程度的冻害、冷害中的 变化成为研究的热点。在低温胁迫下，生物体的细胞壁迅速发生液化，同时 伴随去极化作用，激活电压依赖型离子通道，导致细胞壁的c a ”通过钙通道 游离进入细胞质( 孙大业，1 9 9 6 ) ，将外界低温信息传入，同时，胞内钙库也 释放c a 2 + 于胞质中( 刘炜等，2 0 0 0 ) 。其中c a = + 的信使作用与c a ”一a t p a s e 活性的关系密切相关，引起关注。 冷处理所引起的c a ”的增加对质膜和钙库膜上的c a 2 + - a t p a s e 能产生 1 6 山东农业大学硕士学位论文 反馈作用，即激活c a 2 _ a t p a s e 活性，从而将过量c a ”泵回细胞外或钙库中 ( 液泡、核周腔和内质网中) ，使细胞中c a 2 + 浓度恢复到低稳态( b u s h ，1 9 9 5 ) 。 低温下冬小麦幼苗c a 2 + _ & t p a s e 活性随c a 2 + 浓度的升高而增加，证明其活性 变化的确是对c a 2 + 信使调节的反馈( 刘炜，2 0 0 4 ) 。林善枝等( 2 0 0 4 ) 对 低温锻炼过程中的毛白杨也得到了相似的结果：质膜和线粒体c a ”一a t p a s e 可能是c a ”一c a m 的作用靶酶，c a 2 + 与c a m 结合形成有活性c a ”一c a m 复合物后 进一步激活并调节质膜和线粒体c a 2 * - a t p 酶，而这种调节的结果是加快质 膜c a ”泵运转，增强a t p 水解作用，促进细胞生理代谢发生适应性变化，从 而使得与抗冻性形成有关的r n a 、蛋白质和脂类等物质合成加强，最终导 致幼苗抗冻性的提高。据此可以认为c a c l 。处理加强低温锻炼诱导的幼苗 抗冻性形成与质膜和线粒体c a 九a t p a s e 活性提高密切相关，c a t c a m 信号 系统参与幼苗质膜和线粒体c a ”一a t p a s e 活性的调节与抗冻性的诱导过 程。 1 3 2 2 1 2 其他胁迫因子的影响 高温胁迫是蔬菜生产中的一个棘手的问题，张宗申等( 2 0 0 1 ) 对热胁 迫下的辣椒叶肉细胞中的c a ”一a t p a s e 研究中发现，c a ”预处理与它能稳定 胁迫下细胞质膜和其它细胞器膜的完整性有密切关系，经过c a ”预处理后 再对辣椒幼苗进行高温胁迫，细胞超微结构受到的伤害比较轻，各种细胞 器膜上的c a 2 + - a t p a s e 活性保持较高的水平，该结果表明c a ”预处理能增强 热胁迫下各种膜器超微结构的稳定性，从而为c a ”一a t p a s e 提供了它在细 胞内赖以存在的结构基础，使其能正常地行使催化功能，在逆境下维持胞 质内c 矿的稳态水平，保证了细胞生理代谢的正常进行。 李阳生和王建波( 2 0 0 1 ) 发现淹水胁迫下，水稻根尖细胞质膜、核膜、 内质网膜、线粒体膜上的c a 2 + - a t p a s e 活性逐渐降低，其主动运输c a 2 + 的能 力下降，这很可能是c a ”在细胞质中积累的原因之一。同时在正常和淹水 胁迫条件下，根尖细胞的质膜形成内褶，而且这些内褶上c a ”一a t p a s e 的活 性比其他部位质膜上更强，这可能是水稻根尖一直处于水淹状态下，根际 相对缺氧，这些内褶的形成可以扩大质膜面积，增加质膜与细胞质的接触 面积，便于氧气及其他物质的跨膜运输，是水稻适应沼生环境的一种机制。 1 3 2 2 2 光周期对c a 2 十- a t p a s e 的影响 平邑甜茶根系质膜a t p a s e s 活性的调控及其与根系营养吸收的关系研究 光周期是植物生长中一个重要的因素，光敏胞质不育小麦是种重要 的具有应用价值的遗传材料，研究发现其花粉败育与c a ”的异常分布有关 ( 盂祥红等，2 0 0 0 ) ：短日照条件下的可育花粉在其发育过程中，花粉的 外壁、内壁及质膜上c a 2 - a t p a s e 的分布量逐渐增加，至三核花粉时期， 花粉的内壁、质膜上分布有大量的c a ”一a t p a s e ；而长日照条件下的不育 花粉，在其发育过c a 2 + _ a t p a s e 的分布量与可育花粉相比要少得多。这一 结果与花粉c a ”分布特点是一致的。因此表明短日照条件下发育后期的可 育花粉质膜c a 2 * - a t p a s e 分布多、活性高，能够维持花粉胞内低水平c a ”； 长日照条件下发育后期的花粉质膜c a ”一a t p a s e 分布少、活性低，不能维 持胞内低水平c a 2 + 状态，造成c 分+ 在花粉细胞质内的大量积累，产生c a ” 中毒，导致细胞内生理生化代谢紊乱，最终造成细胞死亡，花粉表现为败 育。不育花粉细胞质内c a ”大量积累也可能与花粉质膜上的c a ”道异常开 放有关。不育花粉内壁及质膜上c a 2 l a t p a s e 积累量少、活性低，可能与 c a 2 + - a t p a s e 基因的表达、c a m 的分布有关( 孟祥红，王建波等，2 0 0 0 ) 。 综上所述，植物a t p a s e s 在很多生理过程中都发挥着极其重要的作 用，人们对其研究兴趣也多集中在调控因子对其活性的调控以及作用机制 方面的探索上。植物质膜h _ 一a t p a s e 的调控机制正如前文所总结的那样， 十分繁杂，不同方式不同水平的调节因子相互作用，很难将其在整体上把 握清楚：a 有些调节方式，如翻译水平上的，磷酸化去磷酸化等对质膜 盯一a t p a s e 的调控方式上有许多不甚清楚的地方，需要继续研究；b 光， 植物激素，真菌霉素及其他环境因子都可以影响质膜h + _ a t p a s e 的活性， 但其感受外界刺激的信号转到过程还不明朗，与c a ”信号系统的关系也不 明确；c 研究方法上尚需突破，可考虑采用受调节的突变体来比较同型的 质膜h * - a t p a s e 的功能与调控方式。另外虽然现在人们对c a 2 l a t p a s e 的 结构，功能，作用机制，调控机