（分析化学专业论文）氯过氧化物酶的电化学行为及其应用研究.pdf

氯过氧化物酶电化学行为及其应用研究 摘要 氯过氧化物酶( c h l o r o p e r o x i d a s e ，c p o ) 是一种从海洋真菌c 口z c 缸r 勿打秒c 甜卢m 口g d 中提取的具有特殊氨基酸残基的过氧化物酶，已被广泛应用于各种催化反应。为了 解决已有的均相催化反应中酶用量大，酶不能反复利用，以及需要向反应体系中加 入过氧化氢，由此带来的昂贵的设备费等问题，本文借鉴了生物传感器制作中的酶 固定化方法将c p o 固定到电极上，有利于应用电化学方法产生过氧化氢，以及具 有酶用量少等优点。 本文首先利用分子层层组装技术( l a y e r b yl a y e r ，l b l ) ，即利用荷负电的巯 基丙磺酸钠( 3 - m e r c a p t o p r o p 锄e s u l f o n i ca c i d s ，s o d i u ms a l t ，m p s ) 与金电极之间的相互 作用，再与荷正电的聚阳离子( p o l y d i i l l e t h y l d i a l l y l 猢o i l i u mc l l l o r i d e ，p d d a ) 的 静电吸附作用层层组装到金晶振电极( a u q c a ) 或玻碳( g l 弱s yc a f b o n ，g c ) 电 极表面，并实现了c p 0 的固定化。利用石英晶体微天平( q a u n zc r y s t a lm i c r o b a l 蹰c c ， q c a ) 对成膜过程进行了表征，确认c p o 是以单分子层形式固定于自组装膜修饰 的金电极上的。循环伏安测量表明，该修饰电极上固定的c p o 可以进行直接的电 子传递，氧化还原峰电位分别为0 m v 和1 3 5 m v ( v ss c e ) ，峰电流与扫速成正比， 表明是一个表面控制的反应。在g c 电极表面也成功制备了c p o p d d a 修饰膜， c p o 氧化还原峰电位差e p 较之自组装膜修饰的金晶振电极的1 3 5 m v 更小( 约为 6 0 m v ) ，即可逆性稍有改善。 此外，利用双十二烷基氯化胺( d i d o d e c y l d i m e t h y l 觚瑚o n i u mb r o m i d e ，d 姬) 在g c 及热解石墨( p y r o l y t i c 伊a p h i t e ，p g ) 电极表面固定了c p o 。该c p o d d 脚g 修饰电极在氮气中的循环伏安曲线上也观察到c p o 的直接电子传递。然而，较之 自组装膜在金和g c 上固定的c p o ，其可逆性、电极的稳定性更佳。实验结果同时 显示，氧在c p o d n 蚯卯g 修饰电极上的还原电位正移至一o 3 v ，表明对氧气还原 有明显的催化作用。不同p h 溶液的缓冲溶液中循环伏安测量表明，式量电位随溶 液p h 值的增大而负移，呈现一斜率为2 5m v 佃h 的直线关系，表明电子传递反应 的同时伴随有质子的参与。详细的机理尚有待于深入研究。 上海师范大学硕士学位论文 以自组装膜及类生物膜修饰电极为工作电极，考察了电极上固定的c p 0 催化 一氯二甲酮( m 加0 c h l o r o d i m e d o n e ，m c d ) 氯化为二氯二甲酮( d i c h l o r o d i m e d o n e ， d c d ) 的反应效率。基于反应产物d c d 在2 7 8i 蚰处无紫外吸收，依据不同反应时 间反应溶液在2 7 8 姗处的紫外吸收，评价不同修饰电极的催化效率得出，相同的 电极面积，类生物膜修饰电极具有更高的催化效率，一般是自组装修饰电极的四倍。 据此，初步探讨了c p o 的电催化机理，即原位产生的过氧化氢将c p o 氧化成活性 态，结合底液中的氯离子对底物m c d 进行催化氯化。依靠电位驱动原位产生过氧化 氢可避免添加过氧化氢造成酶失活的问题， 关键词：氯过氧化物酶，直接电子传递，自组装，类生物膜，修饰电极，一氯二甲 酮 上海师范大学硕士学位论文 s t u d yo nt h ee l e c t i o c h e m i c a lb e h a v i o r so fc h l o r o p e r o x i d a s e a n di t sa p p l i c a t i o n a b s t r a c t c h l o r o p e m x i d 嬲e ( c p o ) 劬mc 口胁咖y i 淄卢历口g di s av e r s a t i i em o m e 血 h e m o e i l z y m eh 嬲b e e nw i d e l yu s e d f o rc a t a l y t i cr e a c t i o n so fab r o a ds p e c t m mo f s u b s t r a t e sb e c 卸s e0 fi t su n i q u eh y b r i ds t 邝c t i l r c u s eo fe l e 删e m i c a l l yg e n e m t e d h y d r o g e np e r o x i d ea l s h o w se x t e n d e de n z y m el i f c t i m ec 0 m p a r e dt od 硫c ta d d i t i o n h o w c v e r ，t h er e a c t i 叩i sc o s t l y 姐di m p r a c t i c a lf o ri n d u s t r i 2 l la p p l i c a t i o n sb e c a u s e s o l u b l ec p 0w 勰u s e df o r t h ec a t a l ”i cr e a c t i o n 觚dt h e s ee x p e n s i v ee n z y m e sc o u l dn o t b er e u s e d t h ee q u i p m e n tw l l i c hw 嬲u s e dt oa d dh y d r o g e np e r o x i d ea l s 0i se x p e n s i v e i nt l l i s p a p e r t h ec p ow 够b cu s e dt o i i i l m o b i l i z e dw i t ht h ep o l y i o n so n t 0t h e a u - q u a n zc 巧s t a lm i i 啪b a l 锄c c ( q c m ) o r 百a s s yc 缸b o n e l e c t r o d es u 血c eb ys e l f 弱s e m b l e dt e c h i l o l o g y l a y e r e dp o l y c a t i i 呱一c p of i l m sw e 托g r o w r l l 衄a ut r e a t e dw i t h 3 m e r c a p t o p r o p 加e s u l f o i l i ca c i d s ，s o d i u ms a l t ( m p s ) e t h a n o ls o l u t i o n ，t 0p r o v i d ea ne v e n n e g a t i v e l yc h a r g e d s u 血n 锄e l e c t r o d ew 弱m o d i f i e dw i m p o l y d i m e t h y l d i a l l y l a m m o i l i u mc l l l o r i d e ( p d d a ) w l l i c hw 嬲p o s i t i v e l yc h a r g e d a n da l a y e r0 fn e g a t i v e l yc h a r g e dc p ow 弱a d s o 舭do t l l ep o s i t i v es u 血c c 皿e 骶q u e n c y s h i f to fa u q c md e 咖璐t m 锄m o l a y e rf 0 册e dd u 血ge a c ha d s o 印t i n ec y c l i c v o l t 砌e t r i cr e s u l t ss h o w e dt h a ts e l f 弱s e m b l e dl a y e ri sad i f i l s i o n l e s sb e h a v i o lt h e 0 x i d a t i o n r e d u c t i o np c a l 【s ( 臣加= 0m v 印c - - 1 3 5m v ) w i t ha r o u n d1 3 5m vp e a k s e p a r a t i o n ，锄p a r e dw i t ha b o u t6 0m v w i t ht h ef i l mm o d i f i e do ng ce l e c t r o d e a n dt h eb i o m e m b r a n e l i k ec o m p o s i t ef i l m so fc p o 加dd i d o d e c y l d i m e t h y l 锄m o i l i u mb r o m i d e d a b ) a l s ou s e dt 0i m m o b i l i z et h ec p 0 d i r e c te l e c t r o nt r a n s f c r b e t 、e e nc p o 锄de l c c t r o d eh 硒b c e na c h i e v e d a st h er e s u l t ，t h ed d a b c p of i l m s 伽 t h ep ge l e c t r o d ew 勰b e s tr c v e 倦i b l e 觚ds t a b l e ，厶印= 6 0n l v t oi n v e s t i g a t et h ep h d e p e n d e n c e ，c y c l i cv o l t a m m e 时w 嬲p e r f b 咖e da td i 饿r e n tp hp h o s p h a t eb u f ! l ! ；e rs 0 l u t i o n 上海师范大学硕士学位论文 a ni n c r c 筋ei np ho fb u f f e rs o l u t i o n sl e dt oan e g a t i v es h j f ti nb o t ho ft h er e d u c t i o na n d o x i d a t i o np e a kp o t e n t i a l s ，l i n e a rr e l a t i o n s h i p0 ff 0 咖a lp o t e n t i a lv e r s u sp hw i t has l o p e o f 2 5m v p h t l l l ec p om o d i f i e de l e c t r o d e sw i t hs e l f 二a s s e m b l e d m e m b r a n e ( s a m ) a n d b i o m e m b m e - l i k ef i l md d a bw e r ee m p l o y e df o fc h l o r i n a t i o n0 fm o n o c h l o r o d i m e d 0 e ( m c d ，h a v eu va d s o 甲t i o na t2 7 8n m ) t od i d o c i l l o r o d i m e d o n e ( d c d ，n 0u va d s o 叩t i o n a t2 7 8n m ) u s i n gau n i q u ee l e c t r o c h e m i c a ls y s t e mw h i c hu s e du vs p e c t m ma d s o 叩t i o n t 00 b s e et h er e a c t i o n a st h er e s u l t ，c p oi i l l m o b i l i z e dw i t hb i o m e m b r 卸e - l i k ef i l m m o r ee 瓶c i e n tw i t ht h es a m ee l e c t r o d es u m i c ea r c a t h ec a t a l y z em e c h a l l i s mo fc p ow 弱 d i s c u s s e d i nt h i ss y s t e mh y d r o g e np e r o x i d ew a sc o n t i n u o u s l yg e n e r a t e da tt h ee l e c t r o d e w i t hk e e p i n ga t 一0 6 v h y d r o g e np e r o x i d eg e n e r a t e da tt h ee l e c t r o d eo x i d a t et h ec p 0t o a c t i v ef 0 珊t 1 l e nt h ca c t i v ef 0 姗sc o n v e nm c dt 0d c dw i t ht h ec h l o 血i o ni nt h e s o l u t i o n k e yw o r d s ：c h l o r o p e r o x i d a s e ( c p o ) ，d i r e c te l e c t r o nt r a n s f c r ，b i o m e m b f 觚e - l i k c ， s e l f - 髂s e m b l e dm e m b r a n e ( s a m ) ，m o d i f i e de l e c t r o d e ，m o n o c h l o r o d i m e d o n e ( m c d ) 上海师范大学硕士学位论文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了 特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成 果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表示了 谢意。 作者签名懈吼州- 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 一 作者签名：h 堕可可 导师签名： 亲踩 日期：& ， 上海师范大学硕士学位论文 氯过氧化物酶的电化学行为及其应用研究 第一章绪论 1 1 生物酶催化研究的现状 酶作为生物催化剂，反应条件温和，节省能源，设备费用少；通过有限的步骤 可实现化学方法难以完成的反应：一般，酶催化效率高，专一性强，可减少或避免 副反应；酶来自生物体，是生物可降解的、无环境毒害的物质，符合将废弃物控制 在最小限度，实现原子经济的绿色化学要求。尽管酶催化反应具有如此多的优点， 但酶作为生物催化剂在工业生产中的应用并不十分普遍，主要存在以下问题【1 1 。 首先，由于酶是一类生物大分子，许多酶是胞内酶，细胞内部环境通常比较稳 定，而催化反应环境中存在的热、酸、碱、氧化剂、重金属离子等因素都可能导致 酶分子失活，破坏了酶的稳定性。其次，在化学反应体系中应用酶作催化剂，酶的 催化活性和选择性往往并不十分理想，有待进一步提高。此外，一般来说，酶的成 本相对较高，而且种类有限，目前已鉴定的酶有30 0 0 多种，工业上生产的酶有6 0 多种，而真正达到工业规模的只有2 0 多种。寻找成本合适的酶源、以及发现具有 应用潜力的新型酶源是实现酶催化反应工业化的重要前提。现代生物技术和分子生 物学的发展，为解决上述问题提供了可能性。目前，主要的途径是进行酶的化学修 饰、酶的固定化、交联酶技术，生物印迹以及酶的定向进化。【2 】 随着人们对酶生物合成、结构与催化机理的深入了解，把酶法合成引入到有机 合成领域，为有机合成带来了新的机遇和革命。酶法合成的专一性及选择性较化工 合成有明显的优势，利用微生物和酶区域、位点、立体的选择性，为水解、对映体 折分，药物中间体合成等一些化学法难以实现的反应提供了一条便利的途径。经常 用于有机合成反应的酶主要有可用于酯、酰胺和糖苷等水解反应的水解酶、催化氧 化还原反应的氧化还原酶、催化双键的加成或形成的裂解酶、催化各种异构化反应， 包括消旋化反应、顺反异构化等的异构化酶，以及能够催化c o ，c - n ，c - s 和c - c 等化学键的形成的连接酶，又称合成酶【3 】。 上海师范大学硕士学位论文 现今，酶已广泛应用于纺织、医药和三废治理等方面，利用酶催化反应代替化 学催化反应也时有报道。张国平等【4 l 研究了用辣根过氧化物酶( h o r s c m d i s h p e r o x i d 弱e ，h r p ) 对模拟的五氯酚废水进行催化处理。结果表明，h r p 可有效地 去除五氯酚。反应的最佳p h 范围为4 5 ，去除率可达9 5 以上。汪学军等【5 】采 用了一种全新的反相微乳液体系，十六烷基三甲基溴化铵正丁醇异辛烷水， 用h r p 催化合成木质素对甲酚共聚物，证实了反应的可行性。红外光谱的结果表 明，木质素与对甲酚发生了聚合反应。 1 2 氯过氧化物酶及其应用研究现状 c p o 是从海洋真菌妇r f 伽| y c 裕卢m 8 伊中提取的一种特殊的酶，其许多光谱 学和化学特性都与细胞色素p 4 5 0 相同，且兼具有过氧化物酶和细胞色素p 4 5 0 的 结构。但与普通的血红素过氧化氢酶又有显著差别，即c p 0 中铁卟啉环上的第五 轴向配位是半胱氨酸的硫原子，而不是在大多数血红素过氧化物酶中发现的组氨酸 的氮原子。此外，c p o 是以谷氨酸而不是组氨酸来作远端酸碱催化成分【鼬】。因而， c p o 独特的活性位点结构是已知血红素过氧化物酶中应用范围最广的生物催化剂。 可有效地催化氧化去氢、卤化、环氧化、双氧水歧化和氧传递等反应，在有机合成、 药物中间体的生产、以及环境处理和生物传感器等领域均有着广阔的应用前景。此 外，特殊的结构使其具有很高的手性选择性和稳定性【9 1 0 1 ，已逐渐成为现代合成化 学和医药工业中极具吸引力的手性催化剂。 然而，已见的研究报道中c p o 都是在溶液相中发挥催化作用的，这就存在两 大问题。一是酶用量大，成本高；二是如同传统的利用过氧化氢酶的生物催化反应 一样，需要用恒流泵向反应体系中加入过氧化氢所付加的设备，在增加成本的同时 增添了反应可控性的难度。此外，大多还存在反应的转化数( t 0 t a lt l l m o v e rn u m b e r 1 1 附，以产物m o 犯p om o l 表示) 不高等问题。许多专家学者已对此作出了种种努 力。如著名的美国加州大学b e r k e l e y 分校的d o u 百弱s c l a r k 等学者【1 1 j 通过加入表 面活性剂进行乳化来改善c p o 的均匀分散，从而使催化烃类氧化的1 附较其它报 道的值提高了十倍，这是目前最好的结果。h a g e r 研究组将c p o 应用于烯烃环氧化 上也获得了较好的得率f 1 2 】；j o h n 等人将c p o 用于对二甲苯氧化成对苯二酸的催化， 与无机催化剂相比，c p o 催化避免了大量的重金属污染的产生，对环境保护起着积 2 上海师范大学硕士学位论文 极的作用【1 3 】；v hd ev e l d e 报道了用c p 0 的固定化酶在异辛烷中将茴香硫醚立体选 择性地氧化，产率高达9 9 【1 4 1 ；c a m i l o 等则对天然c p o 进行修饰，改善了c p o 酶的稳定性【1 5 】。i v i c a 等【1 6 】试验了一系列实验条件下，希望通过催化氯化反应，在 万古霉素中进一步引入一、两个氯原子，从而改变药物的结构来获得性能更优的抗 生素。然而，值得注意的是仍然需要向反应体系中加入过氧化氢，那么，当加入过 氧化氢的量控制不当( 即大于反应所需的量时) 就会不可避免地导致酶丧失活性、 并可能产生副产物的问题。 由于大多数酶是水溶性的，在催化反应之后，要使酶不发生变性并进行回收是 很困难的。因此存在产品污染、难于重复使用、产品成本较高等问题。固定化酶是 把酶固定在特殊的载体上。已固定化的酶像化学反应所用的固体催化剂那样，既能 发挥它的催化特性，又能多次反复使用，使整个生产工艺可以连续化、自动化，而 且固定化酶也可以提高酶的稳定性。i j u 掣1 7 】利用固定化的h r p 催化合成了聚苯胺， 而且酶可以反复利用。s a k u r a g a w a 等1 1 8 1 9 】通过具有两个功能团的交联剂戊二醛，将 h l 冲固定在脱乙酰壳多糖载体的表面。j i n 等【刎探究了一种用固定化的h r p 催化合 成聚苯胺的新方法，证实得到了与酶溶液中催化的产物是相同的。这种固定化酶， 在p h = 6 o 的缓冲溶液中，室温下贮存7 2h 之后，仍然有相当好的活性，并在反应 结束之后很容易将酶分离回收。 综上所述，将c p o 固定到电极上可以提高酶的稳定性，并可应用电化学方法 在电极上产生过氧化氢，可避免外源过氧化氢使用量不当造成酶的失活，同时也增 加了反应的可控性。综观文献报道，目前还未见c p o 催化机制方面的研究，所以， 将c p o 固定于电极上，也有利于应用各种电化学的手段进行其反应机理方面的研 究。 1 3 修饰电极及其酶固定化方法的研究 由于酶和蛋白质分子结构复杂，氧化还原活性中心往往深埋于封闭或绝缘的肽 链中，一般很难在裸电极上进行直接的电子传递反应。本文设想通过电化学方法原 位产生启动反应所需的过氧化氢，进一步推动c p 0 催化所研究的有机反应，其基 础就是要实现c p o 在电极表面的固定化，同时，为了做到酶的反复利用，希望能 获得c p o 的直接电子传递。 3 上海师范大学硕士学位论文 传统的生物酶的固定化方法主要有物理或化学吸附法【2 1 l 、包埋法【2 2 ，2 3 】、交联法 【2 4 1 和共价键固定法【矧等。然而，每种技术都有自身的优势与不足。且不同的蛋白质 由于其结构也不尽相同，所以，必须寻找最适宜的一种c p 0 固定化方法。总之， 希望固定在修饰电极上的c p o 既能很好地保持其活性，又具有良好的稳定性。纵 观文献，至今还未见有关于c p o 固定化修饰电极的报道。所以筛选出最佳的修饰 电极的制备方法及其进行固定化的c p o 的电化学行为研究是本研究工作成功与否 的关键【掘2 9 1 。 在众多的修饰电极制备方法中分子自组装法具有成膜条件易控，膜取向性好、 排列紧密、有序稳定，组装界面功能化等优点。 1 3 1 分子自组装技术 自组装单分子膜是目前生物传感器和生物电化学中研究非常广泛、对固体表面 进行修饰最为有效的分子有序组装体系。自组装单分子膜是指分子自发地通过非共 价键( 氢键、范德华力、静电力、疏水作用力等) 相互作用，强化学吸附在固液或 气液界面，形成热力学稳定和能量最低的有序体系，其特点是高度有序、定向密集、 组织完好和稳定的分子单层【3 0 j 。同时，自组装分子之间的范德华相互作用以及分子 链内或末端特殊功能团之间的相互作用，也促进了电极表面上成膜分子进行无序到 有序的重组。应用聚离子来进行分子的层层组装最早是由e r 于1 9 6 6 年报道的，而 真正吸引广大科学工作者的研究兴趣则是九十年代初。1 9 9 1 年，d e c h e r 及其合作 者报道了基于阴阳离子静电作用的聚电解质多层膜的制备，称为静电组装技术，拉 开了层层组装( l a y e r b y 1 a y e r ，u i l ) 薄膜研究的序幕【3 。l b l 膜结构容易进行表 征，是研究分子问作用力及组装方法最好的模型，又是走向实用化的器件原型，所 以u 儿超微薄膜的构筑与功能化一直是超分子科学研究的热点【3 2 1 。基于静电组装 技术，卟啉、酞菁等有机分子、有机和无机微粒、生物大分子如蛋白质、酶、病毒 以及树状分子等在内的物质的已经可构筑多功能较稳定复合薄膜【3 3 j 。 目前，常见的自组装单分子膜的类型主要有电极表面硅烷化形成有机硅烷自组 装膜、u ；膜、硫化物类自组装膜等。其中，硫化物在金属表面形成的自组装膜是目 前研究得最广泛、最深入的一类，这是因为硫化物类自组装膜具有一些独特的优点， 如有序性强，不易聚合，成膜条件控制容易，基底制备简单等。除硫醇类外还有巯 4 上海师范大学硕士学位论文 基吡啶【3 4 1 、硫醚【3 5 1 、双硫化合物【矧、苯硫酚【明、脂肪酸【3 4 5 】等都可在金属表面形 成自组装单分子膜。适合于含硫化合物形成自组装单分子膜的基底材料主要是单晶 或多晶的金，此外还包括银【蛔、铁【4 刀和胶体金微粒【鹌】等。 1 3 2 类生物膜 双十二烷基溴化胺( d i d o d e c y l d i m e t h y l 锄m o n i u mb r o m i d e ，d 址) 是一种阳离 子表面活性剂，是一种典型的两亲分子，其分子中含有亲油性的碳氢链和亲水性的 官能团。d d a b 因拥有大的疏水尾链和相对较小的亲水头基，当其作为成膜物质被 铺展到液面上时，可作类似于起皱表面的分子排布。因此，当表面活性剂被通过吸 附、涂布、共价键合及l b 膜转移等方法引入电极表面，可形成有序排列的双分子 层结构，这种结构与生物膜中类脂所形成的双层结构类似，因而被称为模拟生物膜 【4 9 1 。r u s l i i l g s 0 1 等在涂布于热解石墨( p y r o l y t i cg m p h i t e ，p g ) 电极上的d d a b 薄膜 中嵌入肌红蛋白( m y o 醇o b i n ，m b ) ，其与电极之间的电子传递反应可大大加速。其 它一些阳离子和非离子表面活性剂如氯化四丁基铵、氯化十四烷基吡啶、氯化十六 烷基吡啶、氯化十四烷基二甲基苄基铵、溴化十六烷基三甲基铵、乳化剂o p 、 t h t o i 1 0 0 等均能促进血红蛋白( h e m o g l o b i i l ，h b ) 在电极上的电子传递反应这可 能是表面活性剂与h b 相互作用形成的复合物使h b 的多肽链伸展开来，其疏水结 构被打开后使电活性中心暴露，从而加快了电子转移的速率【5 1 1 。 基于自组装技术和类生物膜的特性，近年来以此进行酶、蛋白质等生物分子固 定化的研究也获得了相当的成功。然而，还未见关于在c p o 直接电化学行为研究 中的应用。 1 4 本论文的主要研究工作及创新性 1 4 1 主要研究内容 本文在参考文献的基础上，尝试利用分子自组装技术和d n 钮在金电极、g c 和p g 电极上固定c p 0 ，重点探讨如何使固定在修饰电极上的c p o 保持高活性、 高稳定性，并实现c p o 的直接电子传递。利用石英晶体微天平技术对组装过程进 行监测，以获得自组装的最佳实验条件；利用循环伏安进行c p o 修饰电极的电化 学行为研究，为确定最佳的固定化方法和条件提供信息。 5 上海师范大学硕士学位论文 在对修饰电极上固定的c p o 特性研究的基础上，m c d 氯化为d c d 的有机反 应体系，探索应用电化学方法原位产生过氧化氢作氧供体催化反应的最佳电位设 置、p h 等实验条件，并讨论c p o 参与的电催化反应的机理。 1 4 2 本文的创新性 本课题首次探索c p o 在电极上的固定化，并实现c p 0 与电极之间的直接电子 传递。 拟将修饰电极用于催化氯化反应，由于c p o 是固定在电极上的，酶用量少， 可较长时间保持酶活性，提高催化效率。 拟用电化学原位产生过氧化氢，以解决常规的使用c p o 催化的均相反应中高 浓度过氧化氢的加入引起的酶失活问题。c p o 酶膜结合电化学方法可大大降低成 本。 6 上海师范大学硕士学位论文 第二章c p o 在s a m 修饰电极上的固定化研究 相比传统的共价交联与包埋法，自组装单分子膜固定化方法具有保持生物分子 活性好、性能稳定和制作简便等优点，因而，近年来，在生物传感器和生物电化学 研究中应用广泛。 本文参考文献报道，利用层层组装的方法进行c p o 固定化的研究，并希望在 保持c p o 活性的基础上，能实现直接的电子传递反应。 2 1 实验部分 2 。l 。1 试剂 巯基丙磺酸钠( 3 m e r c a p t o 1 - p r o p 觚e s u l f b n i ca c i d ，s o d i u ms a l t ，m p s ) 购自s i g m a 公司，使用时用乙醇配置。2 5 聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐 ( p o l y d i m e l h y l d i a l l y l 锄m o l l i u mc m o r i d e ，p d e l a ) 购自砧d r i c h 公司。电极洗液的配 制：5 9 的乙醇、4 0 的水和1 的n a o h 。其它试剂均为分析纯。研究溶液均用超 纯水配制( h e a lf 0 r c e 超纯水器，上海康雷分析仪器有限公司) 。 按实验要求用高纯氮除氧或经高纯氧气饱和下进行电化学测试。实验均在室温 下进行。催化试验用的m c d 购自s i 舯a 公司。 c p o 购自s i g m a 公司，使用时用5 0m m o l l 的磷酸缓冲溶液( p h o s p h a t eb u 能r s o l u t i o n ，p b s ) p b s 配制，使其浓度为3 9 5 1 矿m o l l 。c p o 的活性测定利用c p o 的催化氯化反应。即反应底物m c d 在2 7 8 姗处有紫外吸收，而产物d c d 在2 7 8 姗 处没有紫外吸收，通过计算吸光度随时间的变化来计算c p o 的活力。定义c p o 的 一个活性单位( u n i t ) 为在1 m i n 氯化1 斗m o lm c d ，即吸光度每分钟减小o 2 4 6 。由 此，c p o 的活力可按下式计算： 砌= 么a ( 2 7 8n m ) o 2 4 6 丰么t ( m 蛐么m ( e n z y m e ，m 曲 c p o 酶活力测试：常温下将2 9 m lo 1 m m o l l 的m c d( 用p h = 2 7 5 的p b s 配制) 与6 0 啦。1 0 m m o l l 的h 2 0 2 ( 新鲜配制) 混合后，测定2 7 8 衄波长处的吸 7 上海师范大学硕士学位论文 光度。自加入c p 0 溶液始，连续记录2 7 8 衄波长处的吸光度变化( 约1 3 m i l l ) ， 并代入上式计算公式得酶活力( 国际单位砌) 【5 2 j 。 c p o 的纯度测试采用s d s p ! a g e ( 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳) 技 术。用洗涤剂将玻璃板、样品梳、s p a c e r 洗干净，并用两次蒸馏水冲洗数次，再用 无水乙醇擦拭，晾干；将两块洗净的玻璃板之间加入s p a c e r ，装好玻璃板；配制8 0 m l1 0 的分离胶，混匀；向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约2 0m i i l 后胶即聚合；配制3 0m l6 的浓缩胶，混匀；滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样 品梳；装配好电泳仪系统，加入电极缓冲液，加2 儿的c p o 溶液和标准蛋白，施 加电位开始电泳实验；实验结束后用考马斯亮蓝g 2 5 0 染色，然后与标准蛋白比较。 2 1 2 实验仪器 循环伏安测量利用计算机软件控制的m 2 7 3 恒电位仪( 美国e g g 公司) 、 q q 姻1 7 石英晶体微天平分析仪( q u a n zc 巧s t a lm i c r o b a l a n c e 锄a l y s e r ，q c - a ) ( 美国 e g & g 公司) 用于自组装膜的表征。q c m 的测量在每一步修饰之后用氮气吹干电极 表面，在干燥箱中测定。 三电极体系，其中，工作电极使用金晶振电极( a u q c m ，驴= 4m m ) ，铂片 电极作对电极，饱和甘汞电极作参比电极( 故文中所示电位均相对于s c e ) 。 循环伏安测量时，根据需要先在p b s 中通入高纯氮除氧或高纯氧气，并保持氮 气或氧气气氛下测量。实验均在室温下进行。 2 1 3 修饰电极的制备 a u q c m 电极先用2 1 1 配制的乙醇一碱洗液中超声3 0 s ，用超纯水彻底清洗、 氮气吹干后，取一滴5 0 王水于电极表面，保持5 s ，再依次用超纯水和无水乙醇反 复冲洗电极表面各三次，用氮气吹干。将电极装入电极架、置于0 2m g m l 的m p s 乙醇溶液中过夜( 大约1 6h ) ，将电极取出，用无水乙醇和超纯水清洗后，用氮气 吹干电极表面。然后在3 m g m lp d d a 中组装3 0 m i n ，修饰电极记作p d d a - m p s a u ； 将p d d a m p s 厶姐电极再依次置于2 1 1 所配的c p 0 溶液中浸泡1 5h ，3 m g ，m l 的 p d d l a 中组装3 0 m i n ，制得的电极记作p d d a c p o p d d a - m p s ，a u 。每一步组装后 都用水清洗，以除去吸附不牢固的分子。 8 上海师范大学硕士学位论文 作为对照用，将清洗干净的a u 电极在c p o 溶液中浸泡组装1 5h ，所得修饰电 极记作c p 0 a u 。 g c 电极先在甜细金相砂纸上打磨，然后依次用1 o 、o 5 和0 0 3 邮1 的氧化铝 粉在麂皮上抛光，用超纯水作介质置于超声波清洗器中清洗。取出电极冲洗、吹干 后待用。将电极浸在用超纯水配制的3 m 咖lp d d a 溶液中o 5h ，电极记作 p d d g c 。将p d d g c 电极浸于3 9 5x1 旷m o l i 。c p 0 溶液中1 2 h ，取出冲洗， 电极记作c p 0 p d d g c 。每步之间用水清洗，以除去吸附不牢的分子。 以上所制备的修饰电极结构示意于图1 a 略) m o d i f i e dg ce i e c t r o d e 图1p d d a c p o p d d a - m p s a u 和a ，o p d n 气g c 修饰电极结构示意图 f i g1 n es 咖c t i i 他o fp d d a c p o p d d a s a u 蛆dc p 0 p d d g c 脚d 疵d e l c c t r o d e 2 2 结果与讨论 2 2 1p d d a c p o p d d a m p s j a u 修饰电极的电化学行为研究 2 2 1 1q c m 对自组装过程的表征 石英晶体微天平是基于石英晶体的压电效应对其电极表面质量变化进行测量 的仪器。1 8 8 0 年p i e cc u r i e 和j a c q u e sc u r i e 兄弟发现石英晶体具有压电效应。在 石英晶片加一电场，晶片会产生机械变形。相反，若在晶片上施加机械压力，则在 晶片相应的方向上产生一定的电场，这种现象称为压电效应。在石英表面上加上电 位差，就会引起石英表面机械振动。所以，通过s a u e r b r c y 公式1 5 3 】及经验公式计算 得修饰到电极表面的物质的质量及其厚度。 s a u e r b r e ye q u a tio n ： 一一2 疗所力( 朋) 2 一一c ，历 9 上海师范大学硕士学位论文 d ( 丹，力) 一一0 0 1 6 f ( 爿2 ) 而：机频：每单位面积上所附加到单晶表面的质量m 引起的频率变化， n ：振荡谐波数( n = 1 ) ：石英的剪力模数( 2 ，9 4 7 1 0 1 19 ，c m s 。2 ) p ：石英密度( 2 6 4 8g ，c m 3 ) g 灵敏度因子 d ：膜厚 a = 0 1 2 5 6 c m 2 c ，= 1 8 2 1 0 8 m a 石英晶体微天平对p d e a c p o - p d a m p s a u 修饰电极制备过程的测试结果 见表1 。根据计算得到m p s 膜的平均厚度为o 7 姗，p d d a 膜厚度为o 9 咖，c p 0 膜厚度为1 9 i l m ，固定到电极上的c p o 的表面浓度为1 0 5 1 0 一如m 0 1 c m 2 。从c p o 的分子体积来看，c p o 应该是以单分子层组装至电极表面【5 4 1 。 表1q c m 对p d d a p 0 p d d a m p s a u 修饰电极组装过程表征结果 t a b l e1n e 蝴l y s i s 陀s u l to fq c mo ft h em 甜m c a t i o fp d d a - c p o - p d d a - m p s 办札 1 n h i c k n e s s a c t i v j t y0 f m a t e r i a l s 么f ( h z )m ( n 咖n 2 )m ( n 曲 ( 衄)c p o ( m o l e m 2 ) m p s4 3 1 2 0 3 8 9 2 3 6 2 6o 7 p d d a5 91 6 5 1 8 53 2 4 1 7 0 9 c p o 1 1 9 3 3 3 1 7 06 5 3 8 4 1 9 1 0 5 1 0 l o p d d a3 71 0 3 5 9 02 0 3 2 90 5 2 2 1 2p d d l a c p o p d d a - m p 龇a u 电极的电化学行为研究 图2 是有无固定c p o 的修饰电极以及直接在c p 0 溶液中浸泡的a u 电极的循 环伏安图。直接在c p 0 溶液中浸泡的a u 电极上几乎观察不到氧化还原峰( 曲线a ) ， 说明c p o 在裸a l i 电极表面可能发生强烈吸附而发生变性，致使难以观察到电子传 1 0 上海师范大学硕士学位论文 递，也有可能是由于电子传递速度十分缓慢。没有固定c p o 的修饰电极( 曲线b ) 在磷酸缓冲溶液中也未发现任何氧化还原电流峰，表明也没有发生电化学反应。只 有通过层层组装制得的p d d a c p o p d d a m p s a u 修饰电极( 曲线c ) 测得的c v 图上出现了一对明显的氧化还原电流峰，氧化峰电位为0m v ，还原峰电位一1 3 5 m v ， 在1 0 0 m v s 的扫速下4 印为1 3 5 m v ，氧化还原峰电流之比接近1 。可以结论，c p o 在i j 3 l 膜修饰的电极上发生了直接的电子传递反应。 e m vv ss c e 图2c p o a u ( a ) 和无有( c ) 固定a o 的修饰电极在磷酸缓冲溶液中的循环伏安图 f 追2 c y c l j cv o l t a l n 啪伊锄so fc p 0 a u ( a ) ，p d d a - m p s 厶缸( b ) ，p d d j 忱p 0 一p d d a - m p s 厶札( c ) e l c c 缸o d ei n 鞠t i l l 劬i d5 0m m o l lp b s n t a i 血g0 1 m o l lk a ，p h5 s 啪n t ci s1 0 0m v s 图3 是不同扫速下p d d a - c p o p d d a m p s ，a u 修饰电极的c v 图。可以清楚地 看到，其氧化还原峰电流随扫速的增加而增大，但峰电位没有出现明显的移动，峰 电流与扫速成良好的线性关系( 图4 ) ，表明这是一个受吸附控制的电极过程。 1 1 上海师范大学硕士学位论文 日m vv ss c e 图3 不同扫速下p d d a c p o p d d a m p s 儿札修饰电极在磷酸缓冲溶液中的循环伏安曲线 f i g3c y c l i cv 0 i t a 咖。毋脚0 fp d d a - c p 0 - p d d a s 姐i nn 2 哟t i i n t e d5 0m 啪l lp b s c o n t a i n i n g0 1m o l lk c l ，p h5a tt h e 蛆n t e so f2 5 ，1 0 0 ，1 5 0 ，2 0 0 ，2 5 0 ，4 0 0 ，5 0 0 ，7 5 0 ，1 0 0 0m v s 倍i ) 枣 v m vs 。1 图4p d d a c p o p d d a - m p s ，a m 修饰电极上的峰电流对扫速作图( 数据来自图3 ) f i g4 1 1 坞p l o to fi pa tp d d a - c p o p d d a _ m p s ，a uv e 体璐l