（分析化学专业论文）液相色谱热膨胀微流高压梯度泵研究.pdf

复旦大学硕士学位论文2 0 0 3 摘要 本论文以新一代高效液相色谱仪的核心技术- 高压纳流级微量输液泵为研 究目标，提出了基于热膨胀原理的高压梯度泵输液系统新概念。论文系统推导了 液体膨胀产生高压液流的一整套理论模型，首次设计并实现了可用于实际样品分 析的仪器原理样机，并初步用于各种实际样品的梯度分离。 论文首次系统地建立了基于热膨胀理论的输液理论模型。研究了一定温度范 围内恒压条件下，以水为介质的流量输出热膨胀规律，获得了水在0 1 6 0 0 c 膨胀 系数随温度变化的关系曲线：进而将流量输出控制转化为温度程序控制，并建立 了相应的数学模型。理论模型进一步考虑到液体在输出过程中质量的逐步损失造 成的流量偏差，并对其进行了修正。经过系统数学推导，得到了流量与温度的关 系。同时考虑到压力增加对液体输出量的下降，探讨了系统中液体在不同压力下 的可压缩系数对输出流量的贡献，最后得到了流速与温度、时间、压力的关系式 方程。 考虑到实际高效液相色谱系统在样品分析时，达到恒定流速会有一个增压过 程，即按恒定流速工作时，泵压需要从零增加到稳定压力，论文提出了热膨胀泵 在密闭体系、恒流输出、预先积累压力三种情况下流量变化的数学模型，并由此 在后续的梯度恒流泵设计中采用了预先升压输出方法。系统设计还充分考虑到了 由于溶液梯度造成的粘度变化所引起的压力变化以及系统死体积等因素，计算了 恒流输出时各种溶剂梯度洗脱曲线，并编制了相应的计算程序和温度控制程序。 基于上述理论原理，论文首次研制了双热膨胀单元的梯度恒流泵原理样机。 通过实验和计算确定了输出液体精度在1 0 n l 1 0 此级的二元泵最佳体积，采用 高强度金属作为泵体材料并使用了高强度小死体积连接管线和阀件；采用p i d 温度控制系统对膨胀单元进行高精度温度控制，编制了相应的通讯接口控制软 件，以六通阀切换作为两元梯度泵系统溶剂补充，同时还设计了交替输液连续工 作的十通阀切换系统。论文进一步对上述微流泵系统各种性能设计了系列实验， 测定了一些基本参数如恒定升温速率下的流速、不同温度下的压缩体积、泵的输 出压力、单阶和多阶线性梯度曲线的实验验证，同时还对指数梯度的曲线等进行 了计算。 论文还对实际样品在等度、不同线性梯度条件下的重复性进行了考察，保留 值偏差通常在3 以内。另外，采用热膨胀梯度泵对不同产地的中药野菊花水溶 性成分，以及蛋白质酶解多肽等复杂体系样品进行了初步分离。通过这些实验， 复旦大学硕士学位论文2 0 0 3 证明了热膨胀梯度泵具有较好的实用性和商业化前景，特别是在蛋白质组学等生 命科学痕量分析领域具有重要价值。 关键词：液相色谱、微型化、热膨胀、恒流、梯度泵、蛋白质、中药 n 复旦大学硕士学位论文2 0 0 3 a b s t r a c t a d v a n c e si nt h ec o n v e n t i o n a la n a l y t i c a ls e p a r a t i o nm e t h o d ，h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) h a v e b e e nl e dt ot h ed i r e c t i o no fm i n i a t u r i z a t i o n t h e w o r kp r e s e n t e di nt h ep r e s e n t e dt h e s i sh a sb e e nd i r e c t e dt o w a r d st h e o r e t i c a la s p e c t s ， i n s t r u m e n t a ld e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o n so ft h e r m a le x p a n s i o nm i c r of l o wr a t e h i g h p r e s s u r eg r a d i e n tl i q u i dc h r o m a t o g r a p h yp u m p t h ep u m ps y s t e mw a sa p p l i e d o na n a l y s i so fs o m ea r o m a t i cc o m p o u n d sa n dc o m p l e xs a m p l e so fp r o t e o m ea n d t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e s ( t c m ) a n dp r o v e dt ob ep r a c t i c a l a s y s t e m a t i ct h e o r e t i c a lm o d e lw a sf i r s t l yd e v e l o p e df o rc o n v e r t i n gt h ef l o wr a t e o fl i q u i dt ot h e t e m p e r a t u r e c o n t r o li np r e c i s i o n t h et h e o r yw a sb a s e do n f u n d a m e n t a lp h y s i c a lp r o p e r t yo fl i q u i da n dt h er e s u l tw a so b t a i n e db ys t r i c t m a t h e m a t i c a ld e d u c t i o n f i r s t l y , a na p p r o x i m a t ec o n s t a n t f l o wr a t ew a sa t t a i n e di na n a r r o wt e m p e r a t u r er a n g ea c c o r d i n gt ot h el i t e r a t u r e t h e n aw i d e r a n g eo f t e m p e r a t u r ew a sa p p l i e da n di t sr e l e v a n tt h e o r yw a sd e v e l o p e d t h ef a c t o r sa f f e c t i n g f l o wr a t es u c ha st h ed i s c r e p a n c yo ft h ec o e f f i c i e n to ft h e r m a le x p a n s i v i t ya n dd e n s i t y a td i f f e r e n tt e m p e r a t u r ea n dt h el i q u i dc o m p r e s s i b i l i t yw e r ei n v e s t i g a t e dt h e o r e t i c a l l y i nt h eb e g i n n i n go ft h ep r a c t i c a le l u t i o nap o r t i o no ft h ef l o wr a t ew a su s e df o r c o m p r e s s i n gt h ei n n e rp u m pl i q u i da n dr e s u l t e di nd e l a yt i m e t h ed e l a yt i m ei nt h r e e c a s e st h a tw h e nt h ev a l v e sw e r ec l o s e d ，t h ev a l v e sw e r eo p e n ，a n da ni n i t i a lp r e s s u r e w a sp r e s e tw h i l eac o n s t a n tf l o wr a t ew a ss e t ，w a sc o n s i d e r e da n daf e a s i b l em e t h o d w a sc o n c l u d e dt os h o r t e nt h ed e l a yt i m eb yp r e h e a t i n gt h el i q u i d i nt h ep r o c e s so ft h e g r a d i e n te l u t i o nl a r g ed e v i a t i o n si nf l o wr a t ec o u l db ec a u s e da c c o r d i n gt ot h ec h a n g e o ft h ec o m p o s i t i o no ft h em o b i l ep h a s eb e c a u s eo ft h ev i s c o s i t ya n do t h e rf a c t o r s a c o m p r e h e n s i v ee x p r e s s i o no ff l o wr a t et ot e m p e r a t u r eg r a d i e n tw a s a tl a s to b t a i n e db y c o n s i d e r i n gt h et e m p e r a t u r ea n di t sv a r i a t i o n ，t h ep r e s s u r ea n di t sv a r i a t i o n ，a n dt h e m a s sr e d u c t i o ni nt o t a l t h ec a l c u l a t i n gp r o g r a mw a sa l s os e tu p t h ed e s i g no ft h ei n s t r u m e n t a lo ft h ep u m ps y s t e mw a si n t r o d u c e di nt h et l l i r d c h a p t e rf i r s t l y as y s t e ms w i t c h e db yas i x p o r tv a l v ew a sd e s i g n e da n dr e a l i z e d a s y s t e mc o n t a i n i n gat e n p o r tv a l v ew h i c hc a nw o r k sc o n t i n u o u s l yw a sd e s i g n e d t h e p u m pv o l u m er a n g ew a se s t i m a t e df o rt h ec a p i l l a r yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y c o p p e r a n ds t a i n l e s ss t e e lw e r es e l e c t e da st h ep u m pm a t e r i a l t h et e m p e r a t u r ec o n t r o l s y s t e mw a ss e tu pb a s e do np i da l g o r i t h ma n dt h er e l e v a n ts o f t - w a r ew a sc o m p l e t e d i i i 复旦大学硕士学位论文2 0 0 3 s o m eb a s i cp a r a m e t e r so ft h ep u m pw e r ea l s ot e s t e di nt h et h i r dc h a p t e r t h ef l o wr a t e u n d e rc o n s t a n t t e m p e r a t u r eg r a d i e n t ，t h ec o m p r e s s e dv o l u m eu n d e rd i f f e r e n t t e m p e r a t u r e ，t h eo u t p u tp r e s s u r eo ft h ep u m p ，a n dt h ed i f f e r e n tc o n s t a n tf l o ww e r ea l l m e a s u r e di nt h i sc h a p t e r s i m p l el i n e a rg r a d i e n ta n d c o m p l e xt w o s t e pl i n e a rg r a d i e n t w e r ec a l c u l a t e da n dr e a l i z e d t h ed i f f e r e n te x p o n e n t i a lg r a d i e n t sw e r ec a l c u l a t e d a t l a s t ，ac o n s t a n tf l o ww a so b t a i n e dd u r i n gt h ec o m m o ng r a d i e n td i l u t i o nb yc o r r e c t i n g t h et e m p e r a t u r eg r a d i e n td u et ot h ep r e s s u r e i nt h ef o u r t hc h a p t e r , t h ep u m ps y s t e mw a sa p p l i e do nt h ea n a l y s i so fs o m e a r o m a t i cc o m p o u n d sa n dc o m p l e x s a m p l e s ，e s p e c i a l l yp r o t e o m ea n dt r a d i t i o n a l c h i n e s em e d i c i n e s ( t c m s ) t h er s do fr e t e n t i o nt i m ei sa l w a y sl e s st h a n3 t h e e f f i c i e n c yo fg r a d i e n te l u t i o nw a sp r o v e db yt h es e p a r a t i o no ft h ec o m p l e xs a m p l e s b yt h e s ea p p l i c a t i o n s ，t h ep u m p sp r a c t i c a b i l i t ya n dp r o s p e c to fc o m m e r c i a l i z a t i o n w e r ep r o v e dt ob ew o n d e r f u l k e yw o r d s ：l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , m i n i a t u r i z a t i o n ，t h e r m a le x p a n s i o n ，c o n s t a n t f l o wr a t e ，p r o t e o m e ，t c m i v 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第一章液相色谱微型化研究进展1 1 引言1 2 便携式h p l c 进展1 3 微流量输液泵进展2 4 微流量梯度形成方法6 5 其它微型化相关技术进展7 5 1 概况7 5 2 进样器7 5 3 检测器。8 6 本论文选题的意义9 第二章热膨胀微流高压梯度泵的原理探索1 0 1 引言1 0 2 基础理论1 0 3 压力校正1 4 3 1 冲洗的开始阶段增压过程。1 4 3 1 1 一般的活塞式或注射器泵增压情况1 4 3 1 2 热膨胀泵增压变化规律1 5 3 1 3 热膨胀泵输出流量时的增压情况1 6 3 2 冲洗过程中的压力影响1 7 4 方程的统一及程序算法要点1 7 第三章仪器设计及性能测试2 l 1 引言。2 l 2 可用于实际操作的梯度泵系统总体结构的设计2 1 3 硬件的具体设计及改进2 4 3 1 泵体积的确定2 4 3 2 各种不同加热装置的性能比较2 6 3 2 1 泵体材料的选择2 6 3 2 2 加热形式的选择2 6 3 2 3 温控的选择2 7 3 3 实物图2 9 4 基本参数的测量和验证3 0 4 1 泵腔中加热液体的灌注3 0 4 2 流速的测量方法3 0 4 3 测定恒定升温速率下的流速3 0 4 4 恒定流速的实现和测量3 2 4 5 不同温度下液体压缩值的变化3 3 4 6 毛细管液相色谱柱的填制3 4 4 7 不同柱阻力下压力对流速的变化趋势3 4 4 8 预先升温获得初始压力及热泵输出压力的讨论3 5 4 9 梯度的实现：3 7 4 9 1 简单三阶线性梯度3 7 4 9 2 多阶梯度3 8 4 9 3 指数梯度3 9 4 1 0 压力变化情况下梯度的实现4 1 第四章热膨胀泵在实际分析中的简单应用4 4 1 小分子标准样品的分离分析4 4 1 1 毛细管液相色谱进样技术4 4 1 2 小分子样品的等度分析_ 4 5 1 3 小分子的不同梯度分析4 8 2 中药复杂成分的分析5 0 3 蛋白质样品的分析5 6 参考文献5 9 第五章中药野菊花挥发性成分研究6 1 1 引言6 l 2 实验部分6 1 2 1 吸附和脱附条件的优化6 1 2 2 样品制备和项空萃取6 l 2 3g c m s 分析6 2 3 结果与讨论6 2 3 1s p m e 纤维的选择6 2 3 2 萃取条件的优化：6 2 3 3 脱附条件6 2 3 4 方法的准确性6 2 3 5 不同产地野菊花挥发性成分分析6 3 参考文献6 7 致谢6 8 附录6 9 复旦大学硕士学位论文2 0 0 3 1 引言 第一章液相色谱微型化研究进展 1 9 0 6 年，俄国植物学家m i k h a i lt s w e t t 在碳酸钙上分离植物色素，并把这种 方法定义为色谱法。到2 0 世纪6 0 年代，由于新型柱填料，高压输液泵和高灵敏 度检测器的出现，才使液相色谱快速的发展起来，并发展成为高效液相色谱( h i 吐 p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ) 。一个世纪以来，色谱法在原理上没有 很大的改变，仍然是基于不同组分在固定相和流动相之间的不同亲和力而得到分 离。但是，对于h p l c ，由于新型的输液系统，新型液相色谱柱及填料，智能计 算机控制及数据处理，以及高灵敏度检测器的应用，已使其成为应用极其广泛的 高科技仪器。 现在，h p l c 几乎能够分析所有的有机、高分子及生物试样，在目前已知的 有机化合物中，若事先不进行化学改性，只有2 0 的化合物用气相色谱可以得 到较好的分离，而8 0 的有机化合物则需h p l c 分析。目前，h p l c 在有机化 学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保监测、商检和法检等方面都 有广泛的用途，而在生物和高分子试样的分离和分析中更是独领风骚。在短短的 三十多年里，h p l c 从初创一下发展成为成熟而广泛应用的分析方法，的确是化 学史上一件引人注目的事情。分析仪器的最大市场是气相色谱和液相色谱仪。美 国现有近2 0 万台h p l c ，而我国仅有2 3 万台。根据s d i ( s t r a t e g i cd i r e c t i o n s i n t e m a t i o n a l ，i n c ) 的报告，2 0 0 1 年液相色谱的市场总值大约是3 2 亿美元，并且 预计以每年7 9 速度增加。全球总共有9 0 多家公司生产和销售h p l c 仪器及相 关配套设备，包括输液流控设备、色谱柱和检测器等。 2 便携式h p l c 进展 最近几年，生命科学领域发生了引人注目的革命性发展。科学家们在不断 的寻找新技术新方法，通过在基因组学和蛋白组学领域的研究，希望找到能够治 疗人类各种疾病的方法。而液相色谱在这场革命中扮演了一个非常重要的角色， 无论是作为分析技术还是制备工具。但是，h p l c 在生命领域的应用也面临着一 个挑战，就是如何处理极其微量的样品。今后整个分析仪器的发展方向主要是微 型化、集成化，和在此基础上的智能化。在“现代科学仪器前沿技术与分析科学 一香山科学会议第1 4 0 次学术讨论会 ( 2 0 0 0 年5 月) 上，多位院士和教授一致 同意上述观点。 复旦大学硕士学位论文2 0 0 3 对于h p l c 而言，微型化更具有特别的意义，微型化可以减少溶剂( 其中 大部分是有毒有害溶剂) 的消耗量和样品的需要量，同时有较高的质量灵敏度， 并且易与质谱等其它分析检测手段联用。微型气相色谱仪在美国早已经商品化， 在我国也已经有数家实验室及公司正在进行商品化的努力。但微型液相色谱至今 仍在发展之中，其主要难点是微流量高压输液泵，其次是微型高灵敏度检测器以 及进样器和色谱柱。微型液相色谱一般采用微柱或毛细管柱( 毛细管柱是今后的 发展方向) ，对流动相的消耗仅有常规h p l c 的1 到0 1 ，固定相消耗和样品 消耗为常规的l ，因为h p l c 仪器总量非常可观，因此，微型液相色谱仪除了 更加适应微量生物样品的分析外，无论从环保上还是从节能上都具有非常重大的 意义。 正因为有以上这些优点，用于现场检测的便携式h p l c 早有报道，如俄罗斯 的i a i m 和g i b a r a m i 】报道了一种便携式液相色谱仪，该仪器包括：6 0 8 0 r a mx 2 m m 内径填充柱；5l , tm 粒径填料；约5 0 0 0 理论塔板数；双注射器型梯度泵( 2 2 5 m l ，p m a x = 7 m p a ，流量范围0 0 0 5 1 m l m i n ) ：u v 检测器( 检测池尺寸1 6 m m l m m ) 。1 9 9 8 年，俄罗斯的v m t u l c h i n s k y 和d e s t a n g e l o t 2 j 报道了另外一种 便携式液相色谱仪：m i n i c h r o m 。该仪器的一些主要参数如下：检测器：u v 及v i s ，可根据需要安装不同波长的光源系统，主要为2 5 4 n m 和2 8 0 n m ：流量范 围：0 1 2 5 m l m i n ：p m a x = 3 5 0 b a r ；电源要求：1 2 v 直流，1 5 a m p s ：尺寸：宽 4 1 0 m i n x 长2 5 0 m m x 高2 3 0 r a m ；重量：9 5 埏( 不包含附件) ；最大工作时间：8 小时；适应温度范围：l o 3 5 。 但以上仪器大部分的微型化工作只是局限于尺寸上的缩小，而无本质的改 进。因此，至今仍未有较为成熟的商品化便携式h p l c 。1 9 9 9 年3 月w a t e r s 公 司推出了毛细管h p l c 仪，2 0 0 0 年4 月，a g i l e n tt e c h 也推出了毛细管h p l c t 引， 随后，如j a s c o 等公司都相继推出了各自的毛细管h p l c 仪器。毛细管液相色 谱( c h p l c 或c a p l c ) 成为当今液相色谱的主要发展方向。 3 微流量输液泵进展 高压输液泵是整个h p l c 仪器的核心，常规h p l c 的输液泵主要有三种： ( 1 ) 往复式柱塞泵：由电动机带动凸轮( 或偏心轮) 转动，驱动柱塞杆在液 缸里做往复运动，从而定期的将贮存在液缸里的液体以高压排出。其优点是每次 排出的液体容积是一定的，属于恒流泵。其缺点是输出液体的压力和流量随柱塞 的往复运动而产生周期性的脉动。因此，通常采用双头泵或多头泵来消除脉动。 ( 2 ) 注射泵：注射泵是利用步进电机推动液缸里的柱塞向前移动，使缸内的 2 复旦大学硕士学位论文2 0 0 3 液体以高压排出。只要步进电机的转速不变，就能保证流量恒定无脉动，其输出 液体的流量的精确度和重复性较好，但为了实现连续供液和梯度冲洗，一般需要 两台泵交替工作，加工精度高和造价较高也是这种泵的不足。 ( 3 ) 气动泵：气动泵是利用压缩空气作为动力驱动活塞，从而使液缸里的液 体以一定的压力排出，也叫气动放大泵。这类泵输出压力恒定，无脉动，但流量 随柱的渗透性和溶剂的粘度变化而变化。 对于微型化h p l c 而言，微流量高压输液泵是最关键的技术瓶颈。与常规分 离分析系统不同，微型分离分析系统的液体流量在n l m i n 级至5 01 tl m i n 级， 并要求流量和压强可控，并可完成梯度冲洗。具体来说，应符合以下要求【4 】： ( 1 ) 输液脉动小于3 ，重现性误差 1 ，流量准确度误差1 0 ，以保证 保留时间的重复性和定性定量的精度； ( 2 ) 输出压力至少能达到1 0 m p a ，一般应该达到3 5 m p a ，液体流量范围在 5 0 n l m i n 至5 0l al m i n ； ( 3 ) 更换溶剂方便，易于清洗，并且耐酸、碱、有机溶剂等缓冲溶液腐蚀； ( 4 ) 操作方便，易于自动化控制。 就目前的技术和输液泵的激励原理而言，流量在2l al m i n 以下，压强在 3 m p a 以上的液体输送是非常困难的。因为在3 m p a 以上时，由于传统的输液泵 是基于部件之间相对移动来提供压力驱动，而这些可移动部件的微渗漏在1 1 0 1 1 tl m i n 数量级。因此，传统的液相泵在精确输送微流级液流时就存在很大困难。 而采用分流装置也存在一些很难克服的缺陷，如柱前压的改变很容易引起分流比 的改变，况且，分流技术并没有真正的减少溶剂的使用量。 目前已有的商品微流量输液泵主要如下： ( 1 ) 活塞式：包括往复泵、注射泵和气动泵，目前微泵重2 5 0 9 ，分辨率0 1 pl ，每冲程5 0pl ，p m a x = 0 。2 m p a 和p m a x = 3 m p a 两种。在3 m p a 以上时1 tl m i n 以下流量不准确，特别是较高压力下，流量误差更大。 ( 2 ) 隔膜式泵：驱动力通过某种介质推动隔膜，隔膜再压缩或吸入流动相。 主要有隔膜泵( 包括电机、气动、电磁力和压电驱动) 和蠕动泵( 主要是电机驱 动) 。前者在0 2 m p a 以上时不能提稳定的l al m i n 级流量，后者流量误差大，压 强低。最好的微型泵重2 5 0 9 ，分辨率o 1l il ，每冲程5 0 i ll ，p m a x - - 0 0 3 m p a 。 ( 3 ) 齿轮驱动泵：用行星齿轮压缩流动相，最高输出压强3 m p a 。在0 3 m p a 以上时，ul m i n 级流量不准确。最小的微型泵o1 3 7 5 r a m ，分辨率0 2 5ul ， 3 复旦大学硕士学位论文2 0 0 3 每冲程1 5ul ，p m a x = 0 3 m p a 。 在高压下，只有特制的注射泵能够提供准确的ul m i n 级流量，尽管多家公 司，如美国的i s c o 公司的注射泵，m i c r ot e c hs c i e n t i f i c 公司注射往复泵都宣称 能够提供0 o lul m i n 的流量精度和0 1ul m i n 的流量，但那时根据螺杆转动步 长计算得出，在实际应用中也有较大误差。另外，x z h o u1 5 1 报道了一种采用以 步进马达带动极高精确度球螺旋驱动活塞的注射泵。分辨率0 3 n l m i n ，流量范 围0 0 1 2 0 0ul m i n ，无需分流装置，并能进行梯度冲洗。而首先推出商品化毛 细管h p l c 的w a t e r s 公司的c a p l c s y s t e m ，也是采用高精度的注射泵，其流 量范围为1 4 0i jl m i n 。 另一方面，可以通过分流的方式来获得微流。只要分流阀流出口( 通向柱头 和废液口的分压比保持不变，就能获得恒定的流量。但不幸的是，柱前压经常会 改变，特别是在梯度冲洗的情况下，这样为了获得恒定的流量，就必须不断的测 量流量并且不断的改变总流量从而分流后获得恒定流量。如a g i l e n t t e c h 的1 1 0 0 系列c - h p l c 系统p l 。冲洗液通过一个可控的电磁分流阀( e l e c t r o m a g n e t i cp u r g e v a l v e ，e m p v ) 分流，分流后的微流再经过一个流量传感器后进入柱头。流量传 感器不断的测量分流后的微流量并通过电脑反馈给e m p v ，随时对分流比进行调 节，从而获得一个稳定的微流。这种方法对于反馈控制要求较高，流量传感器也 有一定的流量范围，过高或过低流量都无法准确测量，特别是在高压下低于li l l m i n ，有明显的误差，且流量传感器被污染后极易失效。最重要的是，这种分 流的方法并没有减少有毒害溶剂的使用量。也有文献报道【6 j 采用高分流比( 1 ：2 0 0 0 ) 来获得纳升级流量( 5 0 5 0 0 n l m i n ) 并用于h p l c 。包括上面不采用分流技术的微 量泵，由于大大提高了控制和加工精度，其整体设备非但没有精简，反而复杂化 了，这对于进一步发展成为现场检测的便携式微型液相色谱仪较为不利。 由于我国工业基础和发达国家相比有较大差距，高精密度的机械加工存在较 大困难，常规流量高压液相色谱泵仍属起步阶段，更不要说将上述机械泵微型化 了。因此，有必要寻找一种采用新型激励方式的输液系统，以绕过特殊材料和高 精密度的机械加工的技术问题，实现跨越式发展。如前所述，由于各种微型机械 泵都存在不同的缺点，国际上也有很多小组正在研究各种不同激励方式的输液 泵，特别是一些无活塞无阀的微型泵，这样就可以避免阀部件之间相对移动造成 的渗漏，并且可以避免机械磨损。 ( 1 ) 收缩扩张型微泵【7 8 】：是比较典型的无阀型微泵，它以收缩和扩张的不 同形状通道代替了单向阀，利用因流道不对称所引起的压力损失的不对称性来实 现流体的泵送，但这类泵的反向止流性能较差。 4 复旦大学硕士学位论文2 0 0 3 ( 2 ) 电液动力微泵( e h d 泵) ：电液动力泵的原理是通过诱导液体中的电荷 运动而产生动量，带动流体运动。微型电液动力泵按其驱动电压类型可分为两种， 一种是在平行电极间施加直流电压的e h d 泵，另一种是在电极阵列上施加不同 相位行波电压的e h d 泵。e h d 泵的原理比较新颖，但这种泵对液体的导电特性 有特殊的要求，往往还需要在液体中注入离子，这使其应用受到很大限制。 ( 3 ) 热驱动微泵：是利用流体的热特性，例如气动压力【9 】或者相变来驱动 工作流体。热气驱动的无阀蠕动泵主要由加热基片、膜基片和管道基片组成。膜 片与管道之间的间隙处于常开状态，加热驱动将使间隙关闭，膜片的顺序动作促 使流体定向流动。其加热部分也可不用电加热，而改用激光加热，成为激光热驱 动微泵。通过对微细管内液体进行循环周期性加热，利用流体周期性的相变可以 使流体沿热源移动的方向泵送。对于特征尺度为2 0 0um 的微泵，其泵送流量可 达3 4ul m i n ，最大泵压可达2 0 k p a 以上。 ( 4 ) 基于粘性的微泵：由于尺度减小，流体的粘性特性也会发生变化，可以 利用这一点来实现定向泵送。这种泵利用由于旋转轴与上下两端壁面的距离不同 所造成的粘性力的不同从而实现定向的净流量【1 1 1 。这种泵常常应用在两端压差很 小的情况下。另一种利用粘性作用来实现定向泵送的微泵是利用液体粘度随温度 变化而发生改变的特点，当膜片挤压流体时，加热出口处流体，使之粘性阻力下 降，使流体更易从出口流出，当膜片复原吸入流体时，加热入口处流体，使流体 更易从入口处流入，这样就实现了流体的定向泵送。此微泵的测试泵送流量最大 可达5 5l al m i n 。 ( 5 ) 电磁式微型泵直流电磁微型泵d c m h d 1 2 】：其驱动力为l o r e n t z 力。 ( 6 ) 形状记忆合金薄膜驱动的微泵。 上述各类不同激励机制的微泵可谓种类繁多。方肇伦在最新出版的书中也介 绍了很多种不同类型的微泵【i 引，在此不一一列举，但现在均无法用于h p l c 的 高压微流输送。现有技术中其它可以产生较高压力的，。可用于h p l c 的输液系统 主要有以下两种： ( 1 ) 电渗泵【1 4 】是利用载流的电渗驱动原理，结合电色谱( e c ) 、毛细管电泳 ( c e ) 、液相色谱柱技术制成的输液微泵，是新颖的流体和样品输送手段。根据电 渗流稳定流动时电场力与粘性力达到平衡这一流体力学假设出发，可以导出填充 微通道的电渗理论公式。当填料粒径较大时，流路孔径足够大( 孔径大于2 0 倍的 双电层厚度) ，流体在填充微通道的流形和开管毛细通道的电渗流形一样，即可 维持近似“塞子型”流形不变。可产生3 0 6 0 m p a 的输出压力，几十n l m i n 3 o i il m i n 的流量。但要产生高液压必须用高电压，一方面容易产生焦耳热而生成 复旦大学硕士学位论文2 0 0 3 气泡使电渗流中断：另外电流也会对溶液组成造成影响，另一方面不利于微型化。 ( 2 ) 密闭容器内液体热膨胀产生微流： c h r i s t e re r i c s o n 和s t e l l a nh j e r t e n l l 5 】介绍了通过加热密闭容器内液体，基于 液体热胀冷缩的原理产生微流量，通过控制升温速率的方法控制流量，用于 h p l c 的尝试。q ( t ) 为水的体积膨胀常数，是温度的函数，在较窄的温度区间里 ( 如4 0 5 0 c ) ，由于q ( t ) 变化不大，采用恒定的娑来得到恒定的流量。结构 讲 见图1 1 。 图l l 单路简单热膨胀泵结构图 在图1 1 中，加热腔体s 采用螺旋状的不锈钢管( 0 7 5 r a m 内径，1 5 9 r a m 外径，2 4 9 m 长) ；加热源采用水浴加热：f t 为可开启的开关，可用来灌注液体 或清洗泵腔：r 作用是调节控制阀p 1 、p 2 、p 3 内体积；s y 是注射器；g 是一段 聚四氟乙烯管；s v 是一个三通阀；t 是一小段聚四氟乙烯管。 在这套装置中，梯度的形成方法是先用注射器s y 在毛细管g 内分段注入不 同盐浓度的缓冲液，预先在毛细管内形成梯度，然后通过水浴加热进行连续床柱 离子交换色谱或疏水相互作用色谱梯度冲洗。流速的测定采用密封的数字式微天 平累加流出液体的质量来计算。 4 微流量梯度形成方法 在微流级甚至更低流量时，产生梯度主要有以下几种方法：一是先在一段毛 6 复旦大学硕士学位论文2 0 0 3 细管管内分段注入不同混合比溶剂，预先在毛细管内形成梯度，然后用一个活塞 泵将其压入色谱柱进行梯度冲洗【1 6 l7 1 ，c h r i s t e re r i c s o n 即是采用这种方法。另外 一种方法是指数稀释法1 1 8 , 1 9 及其衍生方法 2 0 , 2 1 】。z h a n g 等发展了该方法，使其 能够形成任意梯度曲线变化的流量：但是这种指数稀释法计算方法复杂，从结果 来看，因存在一个动态稀释过程，也不易重复。类似指数稀释方法还有用于形成 纳流级梯度的报道【2 3 , 2 4 。a g i l e n t1 1 0 0 毛细管液相微流泵则采用常规流量下混合 后分流的方法，微流式采用压力传感器反馈控制的方法，但这种方法其实不是真 正意义上的微流泵，溶剂消耗量仍然很大。 其它微型化相关技术进展 5 1 概况 我们观察一下国际上整个液相色谱的最新情况。在最近的几年，液相色谱仪 器生产厂家，特别是色谱柱制造商，把主要的研发力量用在解决生物分子的分离 分析问题上。他们的产品也可以用于常规的分析，但其主要应用还是在生物分子 分析领域。由于生物样品大都是微量级的，在p i t t c o n 展会上，用于分析微量样 品的毛细管柱以及n a j l o - l c 柱是展会的重要内容，与常规液相色谱比较，c a p l c 和l l a n o l c 要求更高的灵敏度，并且可用于l c m s 以及l c m s m s 联用。很多 用于n a n o l c 的附件，包括阀件、混合器、连接管和类似的产品也在展会上层出 不穷。具体而言，同往年一样，每年都有新的成套的液相色谱柱推出，而近年来 m i c r o - 和n 8 1 1 0 h p l c 柱是展会的主角。这些柱子一般是模仿气相色谱柱的熔硅 毛细管柱或者f u s e d s i l i c a - l i n e d 不锈钢毛细管柱，尺寸有0 3 2 m m ，0 5 3 m m ，和 0 7 0 r a m ：采用3um 或5um 粒径填料。这些柱子的主要优点是非常易于与m s 联用，因为其流量根据不同的柱子尺寸可控制在5 5 0ul r a i n 。毛细管液相色谱 仪和一些改装过的常规h p l c 仪都可以使用以上尺寸的色谱柱。因此，制造商同 时推出了大量新型的配套零部件，如阀、接头、混合器、连接管等以保证死体积 最小化。这些小尺寸的柱子的另外一个优点，如前所述，就是