（果树学专业论文）苹果铁高效基因型生物技术的研究——铁高效基因的克隆.pdf

摘要 本实验以小金海棠为试材，利用改进的s d s 一苯酚法提取到高质量的根系 总r n a ，然后通过m r n a 差异显示技术获得了6 9 条差异条带。将这些差异带 回收再扩增后，进行反向n o r t h e r n 杂交排除假阳性差异带。通过检验，共获得 阳性克隆7 条。其中，有2 条在缺铁胁迫下表达量增加，有5 条为缺铁胁迫下 特异表达的。用p g e m tv e c t o rs y s t e mj ( p r o m e g ac a t # a 3 6 0 0 ) 试剂盒将这7 条 差异带c d n a 片断连接于p g e m t 质粒，然后电转宿主细胞d h 5 c t ，利用蓝白斑 进行筛选；每条差异带随机挑选8 个白斑提取质粒进行测序，并对结果通过 g e n b a n k 进行同源性比较，得到了差异片断的序列及其同源信息。 关键词：小金海棠m r n a 差异显示反向n o r t h e r n 杂交铁相关基因 基茵每列 v 夭 a b b r e v i a t i o n a aa m i n oa c i d b p c d n a d e p c d n a e b e d t a k b k d 0 d o l i g o ( d t ) s d s 1 h s b a s e p a i r c o m p l e m e n t a r y d n a d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d o m i n e e ra c e t i ca c i d k i l o b a s e k i l od a l t o n o p t i c a ld e n s i t y o l i g o d e o x y t h y m i d y l i c a c i d s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e 2 - a m i n o - 2 ( h y d r o x y m e t h y l ) - 1 ，3 一p r o a n e d i o l 2 前言 铁是植物必需营养元素之一，是植物体内各种氧化还原酶、光合作用、呼 吸作用及电子传递过程中多种酶的重要组成部分，同时还是叶绿素的组成成分； 所以，铁在植物体内具有不可替代的作用，为植物生长拉育所必需。植物缺铁 表现为叶片黄化，其典型症状为叶肉组织变黄，叶脉仍然保持绿色：缺铁严重 时还影响了作物的产量和品质，甚至导致植物死亡( m o r d e r t ，1 9 9 1 ) 。 植物能吸收利用的铁必须以可溶性f e ( 1 1 ) 化合物形态存在。但在石灰性 土壤中，可溶性铁的浓度仅为1 0 1 1 m ( l i n d s a ya n dc h w a b ，1 9 8 2 ) ，且铁以难溶的 f e ( i i i ) 化合物形态存在，这远不能满足植物的生长发育需求( r o m h e l da n d m a r s c h n e r , 1 9 8 6 ) 。因此，植物缺铁在石灰性土壤上表现尤其严重，而石灰性土 壤占世界土地面积的1 3 以上，所以植物缺铁失绿症是一个困扰整个世界农业 的难题( c o c h e n ，e ta l ，1 9 9 7 ) 。 至今，植物营养工作者为矫治植物缺铁失绿症进行了大量的探索。自从 1 8 4 5 年发现植物缺铁失绿症以来一个多世纪的实践已经证明，传统的采用物质 投入为主的“资源路线”来矫治植物缺铁失绿症费时费力、代价昂贵，且受诸 多因素的限制，所以效果较差。而在2 0 世纪7 0 年代兴起的“生物学路线”，即 筛选吸收利用铁能力强的基因型，已成为解决植物缺铁失绿症根本性的有效途 径( 韩振海等，1 9 9 1 ) 。同时随着生物技术的发展，基因重组已经实现，完全有 可能通过生物技术途径解决植物缺铁失绿症。 果树也受到缺铁失绿症的危害，且发病程度重，受到的危害较大( 韩振海 等，1 9 9 1 ) ，所以如何解决果树缺铁失绿症是果树生产上的一个重要问题。 本试验就是基于以上情况而提出。通过对苹果铁高效基因的筛选和克隆， 为果树铁素营养的分子生理机制提供分子层次的物质依据。 1 植物缺铁适应性反应机制研究进展 通常认为植物对铁的吸收机制有两种( r o m h e l d a n dm a r s c h n e r , 1 9 8 6 ，1 9 9 4 ； j o l l e ue ta l ，1 9 9 6 ) ：机制i 和机制i i 。机制i 存在于双子叶植物和非禾本科单子 叶植物中；机制i i 存在于禾本科植物中。 机制j 型植物对缺铁胁迫的适应性变化包括形态学和生理学变化。形态学 变化包括：侧根和根毛形成增加，根表皮运输细胞形成增多( k r a m e r , e t a 1 1 9 8 0 ：l a n d s b e r g ，1 9 9 4 ) ，从而加强了对铁的吸收面积，在一定程度上加强了对 铁的吸收，增强了抗性。生理学的变化主要有( j o l l e y , e ta l ，1 9 9 6 ) ：根际酸化。 p h 值每下降一个单位( 4 o ) ，三价铁的溶解度升高1 0 0 0 倍。还原性化合物 和螯合物质的释放增加。虽然这些物质单独不能满足植物对铁的吸收利用，但 如果与h + 的释放相结合，则能显著的提高f e ”的可溶性和f e ”的吸收。铁还 原能力及铁还原酶系统活力的增强。p e r t a 等( 1 9 9 4 ) 认为，存在于植物细胞 质膜上的铁还原酶系统把f e ”还原成f e ”是机制i 型植物吸收利用铁的先决条 件。而c h a n e y 等早在1 9 7 2 年就已提出，机制i 型植物对铁的吸收分两步进行： 第一步，f e ”还原成f e “；第二步，以f e ”的形态吸收运输铁。此外，j o l l e y ( 1 9 9 2 ) 和y i n gy i ( 1 9 9 6 ) 等从遗传上证明了三价铁螯合物还原酶为机制i 型植物吸收 利用铁所必需。由此可以看出，缺铁胁迫下铁还原酶活性的提高是机制i 型植物 最典型的特征。 机制i i 型植物对缺铁胁迫的适应性变化主要有：诱导根系释放被称为植 物高铁载体的物质。这种物质能够直接螯合不溶性三价铁成为可溶性铁复合物。 机制1 1 型植物的质膜中有高亲和力的铁运输系统。机制i i 型植物比机制i 型 植物对铁的吸收更为有效，是因为机制1 1 型植物对环境p h 值的依赖性更小，而 且其对铁的吸收不需把f e 3 + 还原成f e “。 2 铁胁迫下铁还原酶系统及特异蛋白的研究进展 1 9 7 2 年c h a n e y 等首先提出，细胞外铁的还原可能由定位于植物细胞质膜 上的一种酶系统所控制。到1 9 8 5 年b i e n f a i t 等提出了植物细胞质膜上有两种还 原系统：一种称为标准氧化还原系统。这种系统存在于所有植物当中，能还原 4 氧化还原电位较高的电子受体，以n a d h 和n a d p h 为电子供体：一种称为可 诱导还原系统。此系统仅存在于机制i 型植物当中，而且仅在缺铁诱导下形成， 以n a d h 为电子供体。以后又获得了机制i 型植物的细胞质膜上存在由氧化还 原系统调节的铁还原酶的证据( p e 仃a ，e ta l ，1 9 9 4 ) 。试验证明在低铁胁迫下，铁还 原酶的活性比正常供铁高5 倍，比无铁高2 0 倍，证明了此酶是可诱导的；同时 y o l a n d ag o g o r e n a 等( 2 0 0 0 ) 将此酶定位在根增粗区，而b i e n f a i t ( 1 9 8 8 ) 把它定位在 根表皮细胞上。h o l d e n 等( 1 9 9 4 ) 证明番茄根细胞质膜上的铁还原酶由一个3 5 k d 的蛋白多肽和一个7 0 k d 的蛋白多肽组成。此外，有试验证明缺铁植物根细胞 质膜上i + a t p 酶与f e ( i i i ) 还原酶很可能是协同起作用的。两种酶的相互协 调，导致了缺铁胁迫下持续不断的根际酸化的增强和根系f e ( i i i ) 还原力的增 加( 刘书娟等，1 9 9 6 ) 。 关于缺铁胁迫下植物特异蛋白的研究也早已进行，并取得了一系列的成果。 早在1 9 8 8 年，s a t o s h i 等通过对缺铁大麦根系蛋白进行电泳发现了6 条与缺铁 相关的蛋白，这些蛋白为：5 3 k d 、5 2 k d 、3 1 k d 、3 0 k d 、2 6 k d 、2 5 k d ，并 证明了5 3 k d 和5 2 k d 多肽的功能，而2 6 k d 和2 5 k d 多肽只在缺铁时出现。 a r u l a n a n t h m 和t e r r y ( 1 9 8 8 ) 在缺铁胁迫下的甜菜根中发现了与缺铁有关的2 5 k d 和3 4 k d 多肽，并推测其中一条为f e 3 + 还原酶，一条为f e 2 + 运输蛋白。而 b i e n f a i t ( 1 9 8 8 ) 在番茄野生型( f e r ) 和对缺铁敏感的突变株f i e f ) 的蛋白电泳比较 中，发现了两种依赖于f e r 基因的蛋白。1 9 9 6 年e i d e t 等从玉米中分离出一个 3 2 k d 的多肽，b a g n a r e s 和b a s s o 在缺铁胁迫下的玉米根中分离纯化出一种2 8 k d 与n a d h 三价螯合铁还原酶有关的蛋白。1 9 9 7 年s c h m i d e 等在番茄根系中发现 有7 种多肽在缺铁胁迫下表达量显著增加，并认为这些蛋白不是定位在细胞质 膜上就是可溶性的。1 9 9 8 年s u z u k i 等也在缺铁胁迫的大麦根系中发现了七种蛋 白，并证明其中w 蛋白为f d h ( 甲醇脱氢酶) 。同时克隆并测序了这一编码f d h 的c d n a 克隆。 所有这些关于铁还原酶和特异蛋白的研究，为进一步研究植物缺铁适应性 机制及克隆特异基因进行分子水平上的研究奠定了基础。 3 关于缺铁胁迫下特异基因的研究进展 关于植物铁效率基因的研究也已经开始，并取得了一系列的成果。早在1 9 8 7 年，z a i t e r 等通过对菜豆的研究发现，植物铁效率基因由两对显性互补的主效基 因所控制。下面从酵母、机制i i 型植物和机制i 型植物的有关基因的研究情况 进行综述。 3 1酵母铁转运系统中的相关基因研究进展 酵母菌的吸铁机制与植物有许多相似之处，也必须将f e “还原为f e ”才能吸 收利用( 印莉萍等，1 9 9 9 ) 。a n d r e wd o n c i s 等( 1 9 9 0 ) 首先从酵母的突变株( f r e d 一1 ) 中利用缺陷互补技术克隆到与三价铁还原酶活性有关的、包含有f r e l 基因的 一个3 5 k b 的d n a 片段。之后人们陆续获得了f r e l 、f r e 2 等与铁吸收相关的 基因并对它们进行了进一步的研究( 表1 ) 。 表1 酵母铁转运系统中的相关基因 ! ! ! 坦! q ! ! 箜! ! i ! g 盟! 墅鲤! ! ! ! 尘塑! p ! 堂! 也! ! 箜! 基因突变株来源功能细胞定位染色体定位氨基酸残基信号肽同源基因 g e n e sm u t a n tl i n ef u n c t i o n l o c a t i o nl o e 蜘o ni n i 目g m o f s i g n a lh o m o l o g o u s m 型! 也型塑竺凹型堂咝蝼 f r e iy c p s 0 还原f b 质膜 - 6 8 6 有2 1 a ac y t 5 5 8 f r e 2 f r e l - , f i e l 还原f e ( m ) 质膜 v i 7 1i有, 2 3 a a 卸l + ，f r e i f f r if 时1 - 1 高亲和力哪) 转质膜v4 0 4雨r , 2 1 a af t h l 运蛋白 f e t 3d y l 5 0 多锕氧化酶质膜 6 3 7 d e y1 3 7 眦协助f i r i 转运 f e 0 0 f e t 4d e y l 3 9 4 c t r lb t r u n b l c c c 2c s g l 低亲和力f c ( ) 转 运蛋白 高亲和力铜转运 蛋白 提供q 产给f e t 3 蛋 白 质膜 质膜 细胞质膜 外侧面 5 5 2 4 0 6 1 0 0 5 有多种氧化酶 尢 - 无 c o p a , c o p b 有p - a t p a s e a f t i m 2 ，y 1 8 转录调节因子 v l l l6 9 0 无 m a c i y j j l ，y j j 2 转录调节因子细胞核417 a c e l , a m t i m f t i y m r l 7 7 w 线粒体转运蛋白 线粒体膜 有广泛存在 m f l 2y p l 2 2 4 c 垒i l i 立体转运蛋白高线粒体膜 有广泛存在 尔基体成熟蛋白 v p s 4 1 f e t 2 分选定位高尔基体 i v 9 9 2无广泛存在 6 32 机制i i 型植物铁效率有关基因的研究进展 m o r i 等( 1 9 9 3 ) 在缺铁胁迫的大麦根系细胞中分离得到了几个相关基因： n a a t ( 烟酰胺基转移酶) 、f d h ( 甲醇脱氢酶) 、a p r t l ( 腺嘌呤磷酸核糖转移酶) 、 a d h ( 乙酰脱氢酶) 、和i d s l 、l d s 2 、i d s 3 三个基因，并对i d s l 、i d s 2 、i d s 3 进行 了序列分析，然后以i d s 2 一c d n a 为探针从大麦基因组文库中筛选出i d s 2 一g e n o m i c d n a ，在其o r f5 - 端上游区发现了一个金属调控元件。并说明i d s l 与金属硫 蛋i ! i ( m t ) 基因相似，i d s 2 基因可能是控制从麦根酸形成3 一上羟麦根酸的酶，l d s 3 可能是控制麦根酸合成酶的基因。 印莉萍等在1 9 9 6 年构建了一个缺铁诱导的玉米根e d n a 文库，并证明其中 有f e ( i i ) 一t r a n p o r t e r 基因：1 9 9 7 通过对有铁和缺铁c d n a 文库的差示筛选，获 得了f d r l 和f d r 2 两个在缺铁条件下加强表达的基因；1 9 9 8 年根据豌豆、水稻 的f e ( 1 i ) 一t r a n s p o r t e r 基因片段重新设计了引物，以玉米根c d n a 为模板，得到 6 5 0 b p 的f e ( i i ) 一t r a n s p o r t e r 基因片段。2 0 0 0 年再次通过差示筛选，获得f d r 3 c d n a 克隆，并对其进行了全序列分析。f d r 3 一c d n a 没有同源序列，在缺铁条件下提 前和加强表达( 表2 ) 。 表2机制型植物铁效率有关基因 t a b l e2 i r o n - e f f i c i e n t g e n e s f o u n di np l a n t sb e i n gc l a s s i f i e da s s t a g e i i 基因 相应蛋白功能来源 一鱼! ! ! ! 垦! 塑! ! ! ! ! ! ! g 塑塑堕! ! ! ! ! i ! !q ! ! g 也 n a s 尼克酰胺合成酶缩合3 分子的s 大麦 腺苷甲硫氢酸 n a a t 烟酰胺基转移酶 大麦 a d h 乙酰脱氢酶 大麦 f d h 甲醇脱氢酶 大麦 a p r i l腺膘啶磷酸核糖转移酶 大麦 i d s l 大麦 i d s 2 催化麦根酸转化成3 - 上羟麦根酸的酶 大麦 l d s 3 麦根酸合成酶 合成麦根酸大麦 f d r l 玉米 f d r 2 玉米 f d r 3 玉米 j 旦鱼茎里；l 里墼墼氢堕 盔耋 3 3 机制i 型植物铁效率基因的研究进展 关于机制i 型植物铁效率基因的研究开展的比较晚，直至最近才展开。1 9 9 6 年e i d e 等第一次成功地克隆到双子叶植物拟南芥中f e ( i i ) 专一转运蛋白基因 i r t l ，对i r t l 基因的序列分析表明，它所编码的蛋白f e ( 1 【) 一t r a n s p o r t e r 为包含 2 1 a a 的信号肽，含有8 个疏水跨膜结构域。i r t l 在缺铁胁迫下的根内表达加强。 c o h e n 等于1 9 9 8 年又从豌豆根中分离到一个f e ( i i ) 专一转运蛋白基因r i t l ，也 在缺铁胁迫下的根内表达增强，r i t l 与i r t l 有很强的同源性。 1 9 9 7 年r o b i n s o n 等在拟南芥中分离克隆了f e ( i i i ) j 丕原酶基因( 丘讪) ，在缺铁 诱导下，此基因的m r n a 在根和叶中都有积累。同年，g i r i t c h 等在番茄突变株 的根系中筛选到一个编码与l y s y l t r n a 合成酶相似的蛋白、并受铁水平调控的 基因l e t , y s r s 基因。1 9 9 9 年r o b i n s o n 等又从缺铁胁迫下的拟南芥根中分 离克隆出了个f r o i 基因( 表3 ) 。 表3 机制i 型植物铁效率基因 里! ! ! ! 翌! ：! 堡! 堕篓g ! 塑! 鱼婴! 堕! 塑堡! ! ! 竖! ! 竺! ! ! 鲤塑! ! 望! ! 基因相应蛋白功能来源 鱼! ! !竺! 壁! p ! ! ! ! 竖p 竺塑地! 竺璺! ! !q ! ! g 虫 i r t i f e ( i i ) - t r a n s p o t e rf e ( i i ) 转 拟南芥 r i t l f e ( i i ) - t r a n s p o t e rf e ( i i ) 转 豌豆 f r o h f e ( i i ) 还原酶还原f e ( i i ) 螯合物 拟南芹 f r 0 1 一一拟南芥 l e l y s r s一一番茄 4 苹果铁高效基因型研究进展 果树由于树体高大，具有营养贮藏特性，所以一旦发生缺铁失绿，发病程 度较重。而导致果树产量、品质严重下降，管理费用增加，严重影响了果树产 业的经济效益，而传统的矫治方法费时费力、花费高、效果差。筛选和利用铁 高效果树基因型是根本解决这一果树产业难题的途径( 韩振海和沈隽，1 9 9 1 ) 。 小金海棠是中国农业大学园艺植物研究所经过多年努力筛选到的全球第一 个苹果铁高效基因型。小金海棠在缺铁胁迫下，表现出典型的机制i 型植物的 缺铁适应性反应( 韩振海，1 9 9 1 ；刘书娟，1 9 9 3 ；平吉成，1 9 9 4 ) 。与铁低效基 因型山定子相比，在缺铁胁迫下，小金海棠根系a t p 酶活性高，根系分泌物的 电导率高，对铁的亲和力和吸收能力较强( 王永章，1 9 9 4 ) ；其根系对f e ( i i i ) 的 还原能力高于山定子3 倍( 韩振海等，1 9 9 5 ) ；根系自由空间铁积累量大，且对 此铁的活化利用能力强( 张福锁等，1 9 9 6 ) 。同时小金海棠在低铁处理时具有高 效的根阳离子交换量( c e c ) ( h a n e ta l ，1 9 9 8 ) 。 有关小金海棠分子生物学方面的研究也已展开。1 9 9 4 年平吉成通过聚丙烯 酰胺凝胶电泳观察n d , 金海棠在缺铁胁迫2 0 天后，出现一条分子量较低的特异 蛋白带。2 0 0 0 年朱京涛证实了小金海棠根系在缺铁胁迫下存在f e c n 还原酶系 统和f e e d t a 还原酶系统，缺铁使这两种酶活性明显提高，同年，于青一通过 s d s - - p a g e 电泳发现小金海棠在缺铁胁迫下有1 8 k d 、3 6 k d 和1 1 0 k d 三条多 肽表达明显增高，这三条多肽与缺铁适应性反应相关。同时还初步证明了这三 条特异多肽只是在缺铁胁迫下表达量有明显增加，而不是从头重新合成的。2 0 0 1 年解自典构建了在缺铁胁迫下的小金海棠c d n a 文库。 9 材料和方法 1 试验材料 水培条件下分别缺铁处理和正常供铁小金海棠( m a l u s x i a o j i n e n s i s c h e n g e tj i a n g ) 新生白色根。 2 所用试剂 k a c ；l i c i ；s d s ；e d t a ；t r i s 硼酸：丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；尿素；e d t a ； m m l v 反转录酶；t a q 酶；d n t p s ；d e p c ；杂交液( 北京博大生物技术有限公司) f a3 2 p d c t p ；p g e m t v e c t o rs y s t e ml ( p r o m e g ac a t # a 3 6 0 0 ) 试剂盒。 所用锚定引物：o l i g od t l 2 m n ( m = a ，g ，c ；n = a ，g ，t , c ) 所用随机引物： 1 5 t a c a a c g a g g1 3 5 g r r t l t c g c a g 2 5 t g g a l v r g g t c1 4 5 g a t c a a g t c c 3 5 c t i t c t a c c c1 5 5 g a t c c a g t a c 4 5 t t l l g g c t c c1 6 5 g a t c a c g t a c 5 5 g g a a c c a a = r c1 7 5 g a t c t g a c a c 6 5 a a a c t c c g t c1 8 5 g a t c t c a g a c 7 5 t c g a l a c a g g19 5 g a t c a t a g c c 8 5 t g g t a a a g g g2 0 5 g a r c a a t c g c 9 5 t c g g t c a i 、a g2 1 5 g a t c l a a c c g 】0 5 g g t a c a t l l a g 2 2 5 g a t c g c a t t g l15 1 a c c l a a g c g 2 3 5 g a t c g c a 兀g 1 2 5 c t g c t t g a t g 2 4 5 g a t c a t g g t c 3 所用主要仪器 g l - 2 0 g i i 型高速冷冻离心机( 上海安亭科学仪器厂) t e c h n e p c r 仪： 1 0 s a n y o 超低温冰箱； 7 6 0 型紫外分光光度计； d y y i i i 垂直式电泳槽和d y y 一1 0 型( e c p 3 0 0 0 ) 三恒高压电泳仪( 北京 六一仪器厂) ； 杂交炉； a b i p r i s s m t m 3 7 7 9 6d n a s e q u e n c e r 4 试验路线 缺铁处理小金海棠初生根正常供铁小金海棠初生根 士 提i t l 营, r n a提取总r n a 0 m r n a c d n a 杂交分子 3 一t 1 2 m n 日 切胶回收目的条带二次扩增 士 琼脂糖凝胶电泳纯化目的c d n a 片段 反向n o , h e m 杂交，排除假阳性 阳性克隆序列测定 图1 试验路线示意图 f i g 1s y s t e m a t i cr o u t eo f t e s t 5 实验方法 51r n a 的提取与处理 5 1 1 r n a 的提取：改进的s d s 。苯酚法( 刘彦华，1 9 9 9 ) 5 1 2 去除总r n a 中混杂的d n a 具体如下： r n a 溶液 5 0 0 i x l 10 p q i r n a s e - f r e ed n a s e b u f f e r7 0ul r n a s i n ( 4 0 u u n 3u l r q i r n a s e - f r e e d n a s e 5ul d e p c 水 1 2 2 u l 以上混合溶液在3 7 。c t t j ( 浴3 0 m i n 降解d n a ；分别用等体积苯酚、苯酚 氯仿( 1 ：1 ) 、氯仿抽提，以去除d n a s e 和蛋白；抽提后的溶液中加入1 1 0 体 积3 mn a a c 和两倍体积无水乙醇，2 0 。c 放置l h r 沉淀r n a ，4 。c 离心3 0 m i n ； 7 5 z 醇洗涤两次，吹干，d e p c 处理水溶解，经电泳和紫外检测后储存于7 0 。 5 2 d d r t p c r 参照l i a n g 等( 1 9 9 2 ) ，略作修改。 5 2 1 s s - c d n a 的合成 反转录体系( 参照m m l v 反转录酶说明书) ： 5 0 01 - 1lp c r 管中加入 1ul5 0 0 ug m l3 - t 1 2 m n lu g 总r n a 5u l m m l v 反转录酶b u f f e r 】2 5 j】0 m md n t p s 0 5u l5 0 u p 1 r n a s i n 加d e p c 水至2 4 u l ，6 5 。c 温育5 m i n 后，在3 7 。c 下温育1 0 m i n ，然后加入 1 u l m m l v 反转录酶( 2 0 0 u u 1 ) 。在3 7 下温育6 0 m i n 后，9 5 下温育5 r a i n 。 2 而后置于冰上，一2 0 。c 保存备用。 52 2 c d n a 扩增反应 p c r 反应体系( 参照l i a n g 等，1 9 9 2 。略作修改) ： 2 pj】0 x p c rb u f f e r 4 ui1 0 0 u m d n t p s 1 2 ui 2 5 m m m g c h 3p - l 2 0 u m 随机引物 6 pl 1 0 p m 锚定引物 2 pl c d n a ( 反转录产物) 0 2 ui 5 u u l t a q 酶 1 6 i tid e p c 水 轻轻混匀，离心片刻收集液滴，锚定引物o l i g od t l 2 m n ( m 咄，g ，c n = a ，g ，c ) ( o l i g od t l 2 a a 除外) 在如下p c r 程序中进行扩增： 9 5 9 4 4 0 7 2 9 4 4 5 7 2 预变性 5 个循环 3 5 个循环 7 2 延伸7 m i n ，4 c 保存。 o l i g od t l 2 m n ( m 2 a ，g ，c ；n = t ) 和o l i g od t j 2 a a 在如下p c r 程序中 进行扩增： 9 5 9 4 4 2 7 2 2 m i n 预变性 4 5 s7 f 2 m i n - 4 0 个循环 4 5 sj 7 2 。c 延f 申7 m i n ，4 c 保存。 5 2 3 c d n a 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 3 n 疵叫蛐1嗡一 孙“知钙盯纽钻 1 0ulp c r 产物，2hl 加样缓冲液混合后，6 变性聚丙烯酰胺凝胶进行电 泳，1 t b e ，8 0 w 电泳至溴酚蓝迁移至凝胶底部。 52 4 对聚丙烯酰胺凝胶进行银染( 参照魏群，1 9 9 9 ) 1 每次新鲜配制下列溶液： 凝胶固定液：1 0 冰乙酸 显影液：在2 l 去离子水中加入6 0 9 n a 2 c 0 3 ，3 m 1 3 7 醛，4 0 0 ul 硫代硫酸 钠( 1 0 m g m 1 ) ，放置水浴预冷至1 0 一1 2 。 染色液：将2 9a g n 0 3 、3 m 1 3 7 甲醛溶于2 l 去离子水中。 2 电泳结束后，小心掀开玻璃板，凝胶固定在短玻璃板上。 3 将凝胶连同玻璃板放到平底塑料皿中，加凝胶固定液淹没凝胶，固定3 0 分钟以上，可以缓慢水平摇动。固定结束后，回收固定液作为显色定影剂。 4 用双蒸水漂洗凝胶3 次。 5 加入染色液缓慢摇动3 0 分钟以上。 6 用双蒸水漂洗8 秒钟加入预冷的显影液并缓慢摇动至条带出现，通常在 5 6 分钟出现。 7 向塑料皿中加入等体积凝胶固定液以终止显色反应，缓慢摇动2 3 分钟。 8 用双蒸水漂洗2 次。 9 凝胶在空气中干燥后，可在灯箱上识读序列。 5 2 5 回收、重扩增差异片段( 参照奥斯伯等，1 9 9 8 ) 对应差异条带切下，加4 0u1 t e 盖紧管口，沸水浴1 0 m i n 以洗脱d n a 。以 此d n a 为模板进行重扩增。扩增体系： 5ul1 0 x p c r b u f f e r 3u l 2 5 r a m m g c l 2 0 2 5ul1 0 m md n t p s o 5u l 2 0 “m 随机引物 1u 1 1 0 l a m 锚定引物 3 7 p l e d n a ( 反转录产物) 0 ，5p l5u l t a q 酶 1 4 2 7 5u ld e p c 水 p e r 程序同c d n a 扩增反应。 5 3 假阳性的排除 反向n o r t h e r n 杂交分析( m a r t i n l a u r e n t ，1 9 9 5 ) 。 54 克隆和测序 用p g e m t v e c t o rs y s t e ml ( p r o m e g ac a t # a 3 6 0 0 ) 试剂盒将特异c d n a 片断 连接于p g e m t 质粒，然后电转宿主细胞d h 5 c t ，利用蓝白斑进行筛选，随机挑 选8 个白斑提取质粒进行测序。 结果与分析 1 r n a 的提取 r n a 的纯度和完整性是进行d d r t - p c r 的关键。r n a 的纯度通过紫外吸 光值a 2 6 d a 2 8 0 的比值进行检测。本试验需要a 2 6 0 a 2 8 0 的比值在1 7 2 0 之间，通 过改进的酚氯仿法( 刘彦华，1 9 9 8 ) ，可以得到纯度较高的r n a ( 表4 ) 。 表4 小金海棠根r n a 紫外检测结果 ! ：! ! ：! i ! 也：! ! ! 坠! ：! ! 兰兰：筮2 丝篁i ：! ! ! ： 一一 鲨堡 垒! ! ! 垒! ! !垒! ! ! 垒! 竺 吸光值 o 1 8 6 o 0 9 7 1 9 1 7 垩堂竺堡 ! ：! 竺! ：! ! ! ! ：! ： r n a 的完整性通过1 琼脂糖凝胶电泳进行检测，正常情况下，完整性良 好的r n a 含有2 8 s 和1 8 s 两个特征谱带出现。且2 8 s 和1 8 s 谱带宽度之比应为 2 ：l ，如果宽度比相反，则说明r n a 有降解。 ct 图2 小金海棠根总r n a 凝胶电泳结果 c ：对照：t ：处理 f i g 2e t h i d i u mb r o m i d es t a i n i n go f t o t a lr n af r o mm x i a o j i n e n s i sr o o t s c ：c o n t r o l ；t ：t r e a t m e n t 从图2 中可以看出，本试验所得r n a 的两条特征谱带清晰，2 8 s r n a 电泳 条带的宽度和亮度大于1 8 s r n a 带，说明该r n a 基本上没有降解，r n a 的质 1 6 量符合实验要求。 r n a 的定量由a 2 6 0 来确定，1 0 d a 2 6 0 4 0 p , g m l 。 2 d d r i - p o r 本试验采用标准方案，即采用2 4 条随机引物和1 2 条锚定引物进行差异显 示分析，以便得到比较多的差异条带，同时也可以比较不同引物组合差异显示 的效果。 用1 2 2 4 条引物组合分别对缺铁和正常供铁的小金海棠根总r n a 进行反 转录p c r ，然后采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后采用银染法进行染色，最 后得到扩增条带多，差异带多的几组引物组合( 图3 ) 。 图3 小金海棠根c d n a 的d d r t p c r 结果 f i g 3r e s u l t o f d d r t - p c r o f m x i a o j i n e n s i sr o o t s c d n a 结果表明，锚定引物o l i g o d t l 2 c a 可与2 4 个随机引物中的任意一个组合， 扩增得到大量条带，并有少量差异带；锚定引物o l i g o d t l 2 m t ( 其中m = a ，go rc ) 也可以得到大量的条带，且差异带也多。其它锚定引物扩增结果条带较少且无 差示带。 3 特异条带的分析 将从以上引物组合中得到的差异条带回收，再扩增，用反向n o r t h e r n 方法 验证：杂交结果如图4 所示。 图4 与铁相关的小金海棠根e d n a 的反向n o r t h e r n 杂交结果 c ：对照；t ：处理 片段1 和3 在缺铁胁迫下表达量增加：片段2 、4 - 7 在缺铁胁迫下特异表达 f i g 4r e s u l to f r e v e r s en o r t h e r nb l o t t i n go f a g x i a o j i n e n s i sr o o t s e d n af r a g m e n t s c ：c o n t r o l ；t ：t r e a t m e n t b a n d la n db a n d 3e x p r e s s e da th i g b c rl e v e lu n d e ri r o n d e f i c i e n c ys t r e s s ； b a n d 2a n db a n d 4 - 7s p e e i f i c a u ye x p r e s s e du n d e ri r o n d e f i c i e n c ys t r e s s 结果表明，有3 种类型的e d n a 片段：假阳性片断；在小金海棠缺铁 情况下特异表达的带有5 条，但是有4 条杂交信号弱，表明只是微量表达； 有2 条只是在缺铁小金海棠根内表达量增加，其杂交信号在缺铁时非常强，但 在正常供铁时非常弱。 4 真阳性片段的克隆与测序 将经反向n o r t h e r n 杂交验证后的差异表达e d n a 条带克隆入p g e m te a s y 载体，进行测序后，与g e l l b a n k + e m b l + d d b j + p d b 的已知序列进行同源性比 较，并推断其功能。如图5 所示，2 条在缺铁胁迫下表达量增加的阳性克隆带 具有相同的序列，并与2 6 s r r n a 序列的同源性达9 9 左右；可以说，这2 条 带皆为2 6 s r r n a 。而另外5 条在缺铁胁迫下特异表达的阳性克隆带因正在测序 中，故其序列及可能的功能尚不清楚。 b a n d l 1 0 2 03 0 4 0 5 o。6 。ot 7 j 。 i i i - i 。l i i il l ii u l j l u - l l u j l u j - l - u _ l u l “ j 。1 。1 ：一 tt a a a n c c c c c n tt t t a a n a g c c c c c c c a t a t g g t c g a c c t g c a g g c g g c c g c n c t a g t g a t l g g a g a l j 0 t t g t g c a c g g t g g g g a g t t t g g ct g g g g c g g c a c a t ct g t t a a a a g a t a a c g c a g g t g t c c t a a g a t g a 61 7 1 c t c a a c g a g a a c a g a a a t c t c g t g t g g a a c a a a a g g g t a a a a g ct c g t t t g a t t ct g a t t t c c a g t a c g a2 1 0 a t a c g a a c c g t g a a g c g t g g c c t a t c g t c c t tt a g a c c t t c g g a a tt t g a a g c t a g a g g t g t c a g a a a2 8 0 a g t t a c c a c a g g g a t a a ct g g c t t g t g g c a g c c a a g c g t i c a t a g c g a t g i i g c t i t t t g a i c c i i c g a t 3 5 0 3 6 0 3 7 03 8 03 9 0 q 0 0 q 1 0q 2 u g t c g g c t c t t c c t a t c a t t g t g a a g c a g a att c a c c a a g t g t t g g a t t g t t c a c c c a c c a a t a g g g a a c gq 2 0 r g a g c t g g g a t t a g a c c g t c g t g a g a c a g g t t a g t t t t a c c ct a c t g a t g a c a g t g t c g c a a i a g t a a ttq 9 0 c a a c c t a g t a c g a g a g g 从c c g t t g a t t c g c a c a a tt g g t c a t c g c g c t c g g t t g 从a a g c c a g t g g c g c 5 6 0 g a a g c c a c c g t g c a c a a g a t c t c c 舷t c c c g c g g c c a t g g c g g c c g g g a g c a t g c g a c g t c g g g c c c a a t6 3 0 b a n d 3 1 0 2 0 3 0 q o5 0 i ， 6 0 7 o i l ii _ i 。iii - ui iu 上u h j _ u 上u 山_ 上山u j _ _ l 弘l u 山“山u _ l 工一u 山u _ g c g t t g g g a g ct ct c c c a t a t g 8 t c g a c c t g c a g g c g g c c g c a ct a g i g a l l t g g a g a t ctt g t g c a c g g 7 0 g g c tt c g c g c c a c t g g c t ttt c a a c c a a g c g c g a t g a c c a a t t gt g c g a a t c a a c g g t t c ct c t c gt a c 1 4 o a g g tt g a a t t a c i a tt g c g a e a c t g t c a t c a g t a g g g t a a a a c t a a c c t g t c t c a c g a c g g fc t a a a c c2 1 u a g c t c a c g t t c c c t a tt g g t g g g t g a c a a t c c a a c a c t t g g t g a a t t ct g c tt c a c a a t g a t a g g a a g2 8 0 、g c c g a c at c g a a g g a t c a a a a a g c a a c g t c g c t a t g a a c g c t t g g c t g c c a c a a g c c a g tt a t c c ct gr3 5 0 3 6 03 7 0 3 8 03 9 0 4 0 04 1 0 4 2 0 ；g t a a ctt t i c t g a c a c ct c t a g c t t c a a a t t c c g a a g g t c t a a a g g a t c g a t a g g cc a c g c t tt c a c g g4 2 0 1 c g t a t t c g t a c t g g a a a a t c a g a a i c a a a c g a g c t i it t a c c c 【t t t t g tt c c a c a c g a g a i tt c t g g0 , 9 0 ct c gt t g a g ctt c at c t m a g a c a c c t g c g t t a t ct t t t a a c a g a t