（病原生物学专业论文）克鲁维酵母ars序列结构与功能的研究.pdf

克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 中文摘要 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 目的：通过构建酵母a r s 随机突变体库，从中筛选出具有较强的转 化效率的a r s 序列，用以构建新型高效的克鲁维酵母基因工程载体。 方法：针对已知a r s 序列设计引物，用含有已知a r s 序列的质粒 p h k b l 9 u a 为模板，利用p c r 扩增出a r s 片段。再以该a r s 片段 为模板，进行突变p c r 反应，得到a r s 随机突变体库。将整个突 变体库与酵母的穿梭质粒载体连接，转化大肠杆菌e c o l id h 5 c t 进行 扩增。抽提大肠杆菌转化子质粒并用限制性内切酶初步鉴定重组质 粒。将重组质粒转化宿主克鲁维酵母菌h k y 0 3 9 。同时以不含突变 a r s 的载体质粒作为对照，比较转化效率。挑取转化效率明显提高 的酵母转化子，再抽提酵母菌质粒并转化大肠杆菌。抽提大肠杆菌 转化子质粒进行d n a 序歹0 测定。把经测序证实有突变的质粒再转化 克鲁维酵母菌以进一步验证a r s 序列突变与转化效率提高之间的相 关性。 结果：成功地构建出适用于筛选a r s 序列的随机突变体库，并从中 筛选出了具有较强转化效率的新a r s 序列，进而成功地构建了新型 高效的克鲁维酵母转化载体。 结论：1 首次成功地构建了适用予筛选克鲁维酵母a r s 序列的随机 突变体库；2 首次利用突变p c r 方法成功筛选出具有较强转化效率 的克鲁维酵母新a r s 序列；3 首次研究了克鲁维酵母a r s 序列结 构与功能的关系；4 首次成功构建了克鲁维酵母的新型高效转化载 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究中文摘要 体。本工作为研究a r s 序列的结构与功能及d n a 复制机制的基础 理论提供了重要实验依据，对于构建新型的酵母高效表达载体具有 重要的意义。 关键词：酵母自主复制序列( a r s ) ；克鲁维酵母；随机突变体库；突 变p c r 。 作者：杨虹 指导教师：徐培君，霍克克 i i 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 英文摘要 s t u d yo nt h e a r ss t r u c t u r ea n df u n c t i o ni ny e a s tk l u y v e r o m y c e s a b s t r a c t o b j e c t i v e ：o nt h eb a s i so f t h er a n d o mm u t a g e n e s i sl i b r a r yo f a r s ，w e w i s ht op r e p a r a t i o nb ys c r e e n i n gn e wa r ss e q u e n c ew h i c hn o to n l yh a v e h i g h e ra r sa c t i v i t y ，b u ta l s od i s p l a yh i g h e rt r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c y ， i no r d e rt oc o n s t r u c t e dn e wg e n er e c o m b i n a t i o nv e c t o rw h i c hh a v eh i g h e r e f f i c i e n c yi nt h en o n c o n v e n t i o n a ly e a s te x p r e s s i o ns y s t e m m e t h o d s ：w eg o tp u r i f i e dp l a s m i d1 9 u aa n dt h e na m p l i f i e dt h ea r s s e q u e n c eb yp c r ，b ys e a r c h i n gt h ea l r e a d yk n o w ns e q u e n c ea n dt h e n d e s i g n i n gp r i m e r s t h ef r a g m e n ta r s w a sg o t ，a n du s e di ta st e m p l a t et o a m p l i f i e db yp c rr a n d o mm u t a g e n e s i s ，w h i c hc r e a t e d t h er a n d o m m u t a g e n e s i sl i b r a r i e so f t h ea r s t h el i b r a r i e sw e r el i g a t e dt oas h u t t l e v e c t o r , a n d t h er e c o m b i n a n t p l a s m i d s w e r e a m p l i f i e db yb e i n g t r a n s f o r m e di n t oe c o l id h 5 a t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw h i c h c o n t a i n e dm u t a t i o n so fa r sf r a g m e n t sw e r ee x t r a c t e da n da r sa c t i v i t y w a sa s s e s s e db yt r a n s f o r m i n gs t r a i n 足f r a g i l i ss t r a i nh k y 0 3 9 ，w h i l e t r a n s f o r m a t i o n sf r e q u e n c yw a sc o m p a r e dw i t ht h a to fv e c t o rp l a s m i d f r e eo fm u t a g e n e s i sa r sf r a g m e n t t h e nt h ey e a s tp l a s m i d sw i t hh i g h f r e q u e n c y w e r ee x t r a c t e d ，t r a n s f o r m a t e di n t oe c o l id h 5 t ta n d s e q u e n c e d t h e n t h i s p l a s m i d s w e r e a p p r o v e dm u t a g e n e s i s a n d t r a n s f o r m a t e di n t o 丘f r a g i l i sf o rc o n f i r m e dm o r er e l a t i v i t yb e t w e e n 1 1 1 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 英文摘要 m u t a g e n e s i sa n dt r a n s f o r m a t i o n se f f i c i e n c y r e s u l t s ：s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dt h er a n d o mm u t a g e n e s i sl i b r a r yf o r s c r e e na r so fk l u y v e r o m y c e sy e a s ta n dt h en e wa r sw i t hh i g h e r e f f i c i e n c yw e r es c r e e n e d a l s ot h e n e wk l u y v e r o m y c e sv e c t o rw i t h h i g h e re f f i c i e n c yw e r es u c c e s s f u l l yb u i l d e d c o n c l u s i o n ：1 t h i sw o r kf i r s ts u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dt h er a n d o m m u t a g e n e s i sl i b r a r yf o rs c r e e na r so f k l u y v e r o m y c e sy e a s t ；2 t h en e w a r so fk l u y v e r o m y c e sy e a s tw i t h h i g h e re f f i c i e n c y w e r e f i r s t l y s c r e e n e d ；3 i ti s f i r s tr e s e a r c ho nt h e r e l a t i v i t yb e t w e e nt h e a r s s t r u c t u r ea n df u n c t i o n ；4 t h ef i r s t s u c c e s s f u l l yb u i l d i n g o fn e w k l u y v e r o m y c e sv e c t o rw h i c hh a v eh i g h e re f f i c i e n c y t h i ss t u d yp r o v i d e dg r e a ts i g n i f i c a n c et or e s e a r c ho ft h er e l a t i v i t y b e t w e e nt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fa r s ，d n a r e p l i c a t i o nb a s i ct h e o r y , a n dc o n t r i b u t e st ot h eb u i l d i n go fn e w g e n er e c o m b i n a t i o nv e c t o rw h i c h h a v eh i g h e re f f i c i e n c yi nt h en o n c o n v e n t i o n a ly e a s te x p r e s s i o ns y s t e m k e y w o r d ：a r s ，k l u y v e r o m y c e s ，r a n d o mm u t a g e n e s i sl i b r a r y ，p c r m u t a g e n e s i s w r i t t e n b yy a n gh o n g s u p e r v i s e db y x up e i j u n i v h u o k e k e 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学 或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律 责任。 研究生签名：本她 日 期：诎生业 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文 合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本 人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文 外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分 内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名：拉丝匕日期y 坐 导师签名： ! ! 圭墨日期：p 。璺旦兰 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 引言 酵母是一类低等真核生物，既具有类似原核生物的生长特性， 又具有一般真核生物的分子生物学和细胞生物学特性。科学研究中 最常用的酵母有，酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 和粟酒裂殖 酵母( s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ) ，除这两种酵母以外的酵母菌都 统称为非常规酵母。非常规酵母作为一类生物资源，近年来已引起 人们的强烈兴趣。从广泛存在的非常规酵母菌中建立新的载体一宿 主系统，以便扩大酵母菌在基因工程中的应用。本实验所涉及的脆 壁克鲁维酵母( k l u y v e r o m y c e s f r a g i l i s ) 就是由我国自主开发的一种 非常规酵母基因工程体系。 a r s ( a u t o n o m o u s l yr e p l i c a t i n gs e q u e n c e ) 是能有效转化酵母 并能在细胞内自主复制的一段d n a 序列。它首次在酵母t r p l 基因 紧密连锁的d n a 顺序中发现，含有a r s 的游离型质粒能高效转化 酵母并独立于宿主染色体而存在”。对酵母a r s 的研究，发现新的 具有较强活性a r s 序列，对构建新型非常规酵母基因工程载体有重 要的实用价值。 自s t r u h lk 等人于1 9 7 9 年首创将酵母的a s r 序列用于构建酵 母转化载体后，t y eb k 等人于1 9 8 0 年也对酿酒酵母a r s 序列进行 深入研烈1 2 1 。从此，多种不同的a r s 序列在细胞染色体和质粒d n a 复制中的作用得到了世人的重视，并被用于在许多不同物种中构建 基因转化的系统。1 9 8 2 年d a s 和h o l l e n b e r g 等人首次从乳酸克鲁 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 引言 维酵母中壳隆到了染色体a r s 序列( k a r s ) ，并用于构建了该菌株 的转化载体系统。此后，该转化系统被用于表达了多种有重要药用 价值的基因【3 】o 我国科学家自上世纪9 0 年代起开始研究酵母的a r s 。其中，匡 达人等克隆了酿酒酵母第v 号染色体的a r s 序列，霍克克等克隆了 乳酸克鲁维酵母中k i l l e r 质粒的a r s 序列，并对其结构和功能进行 了研究 4 - 5 1 。 目前国内外常用的酵母载体大多由克隆自酵母的天然a s r 序列 构成。这些天然的a r s 序列存在着转化效率较低和稳定性较差的问 题。本研究拟采用p c r 致突变体法先建立一个a r s 序列的随机突 变体库，进而通过d n a 重组，利用质粒测定法研究a r s 结构与功 能的关系，从而筛选出具有较强的转化效率的a r s 序列。这对于研 究真核d n a 复制的基础理论和构建新型高效的非常规酵母基因工 程载体都有重要的理论意义和应用前景。 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 技术路线 含p 1 9 u a 的大肠杆菌 提取质粒 士 技术路线 从g e n e b a n k 检索已知a r s 序列 1 l 以质粒为模板 设计引物( 同时引入两个酶切位点) l + p c r 扩增目的a r s 序歹i i j p c r 产物与i g e m - - t 载体连接，并转化e c o l id h 5 a 士 抽提转化子质粒，测定d n a 序列 以测序正确的a r s 序列为模板 0 进行突变p e r 反应 士 得到随机突变体库 古 纯化后进行限制性内切酶双切 含p h k b 3 7 0 的大肠杆菌 抽提质粒 士 限制性内切酶双切 士 割胶回收 割胶回收 l 连接酶1 6 连接过夜j 0 转化e c o l id h 5 a 士 酶切鉴定得到重组质粒 收集所有转化予扩增培养 士 抽提质粒，全部转入酵母菌h k y 0 3 9 士 抽提酵母质粒，并转化e c o l id h 5 a 士 抽提e c o l i 转化子质粒 d n a 序列测定和生物信息学分析 0 e c o l i 转化子质粒再转化酵母，验证转化效率 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 结果 结果 1 质粒p 1 9 u a ，p h k b 3 7 0 的提取与纯化 用质粒小抽试剂盒进行质粒提取，可得到纯度较高的产物。所得 产物以o 8 琼脂糖凝胶电泳，e b 染色后进行凝胶成像分析( 图3 ) 。 mab 图3 ：质粒图谱 m ：h i n di i im a r k e r a ：p h k b 3 7 0 b ：p 1 9 u a 2 p c r 进行a r s 的克隆 根据已知的a r s 序列，设计引物，同时在两端引入两个酶切位 点( x b a li 和p s ti ) 以p 1 9 u a 质粒为模板，扩增出约5 5 4 b p 左右的 a r s 片段( 图4 ) 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 结果 5 0 0 b p mabc d 图4a r s 序列的p c r 扩增结果 m ：d l 2 0 0 0m a r k e r a o ：扩增出的a r s 片段 3 、p c r 产物与原a r s 序列进行同源序列比较 p c r 得到的a r s 片段纯化后与p g e m t 载体连接后转化 e c o l i d h 5 a ，经蓝白斑筛选，送转化子测序。与已知的a r s 序列进 行同源性比较： i d e n t i t i e s = 5 0 5 511 ( 9 8 ) + 为核酸序列有差异者；q u e r y ：代表1 9 u a 的a r s ：s b j c t ：代表 扩增出的a r s l q u e r y ：4 4a a a c a a a c t t c t g t a c a t a t t t t a t c a c a t t t a t c a c a a a c a t c a t c c c a a c c t a a t a a a1 0 3 | | | | | | | | | | | | s b j c t ：1a a a c a a a e t t e t g t a c a t a t t t t a t c a e a t t t a t c a c a a a e a t c a t e e c a a c c t a a t a a a6 0 q u e r y ：1 0 4a c a c a t a t t g t t t t a a t a a c t a a a c t a t a t t t a g g a t c t t t t t e t a a t a a a t a t a t a e a a1 6 3 | | | | i l s b j c t ：6 1a e a c a t a t t g t t t t a a t a a c t a a a e t a t a t t t a g g a t c t t t t t c t a a t a a a t a t a t a c a a1 2 0 q u e r y ：1 6 4g t t t c t t t a g t a g g a a e a t t a g g a t a e e a a a t t c c t g a a g g c a a a t a t t t a a a a t t a a a a2 2 3 | | | | | | s b j e t ：1 2 1g t t t e t t t a g t a g g a a c a t t a g g a t a c e a a a t t c c t g a a g g c a a a t a t t t a a a a t t a a a a1 8 0 1 6 塞苎丝壁里垒璺! 生型堕塑兰生丝堕壅 堕墨 q u e r y ： 2 2 4t c a c a a a c c t t g t t a c t c a t a a t a t a t c t a g c a g a t a t a c t 9 9 8 a a g t a t t c c a g a t g t t2 8 3 1 1 | 1 1 1 s b j c t ： 1 8 1t c a c a a a c c t t g t t a c t c a t a a t a t a t c t a g c a g a t a t a c t g g a a a g t a t t c c a g a t g t t2 4 0 q u e r y ：2 8 4a a t t t t a a a c c t g a a z t t t c e a t t t t a a c t g c a a a a t t a t a a c t a t t t c t t a t t c c t a t a3 4 3 | | | l i i | l | s h j c t ：2 4 1a a t t t t a a a c c t g a a t t t t c c a t t t t a a c t g c a a a a t t a t a a c t a t t t c t t a t t c c t a t a3 0 0 丰年车丰 q u e r y ：3 4 4c a t a a a t g a a a g t t t a a a t a t c t t t c a t c a a a a a g c t e t t c a t t a t c a t a a t a t t t a a t a4 0 3 l| 1 1 l | 1 i i s b j c t ：3 0 1c a t a a a t g a a a g t t t a a a t c a t c t t c a t c a a a a a g c t c t t c a t t a t c a t a a t a t t t a a t a3 6 0 q u e r y ：4 0 4a a a t t t t c a t a a t c t g a a t a a t a a g c a t a a g t a c a t g e t t t a a a a t a a t c t g a a a g a t t a4 6 3 | 1 | | | | s b j c t ：3 6 1a a a t t t t c a t a a t c t g a a t a a t a a g c a t a a g t a c a t g c t t t a a a a t a a t c t g a a a g a t t a4 2 0 $ 吼l e r y ：4 6 4t t a t c t a a t t g c t a a a c a c a t t t t t a a t t a a a a t g a a g a t a t a t c a t a t a t t t a g t g t t t5 2 3 | f l f | f f s b j c t ：4 2 1t t a t c t a a t t e t a a a c a c a t t t t t a a t t a a a a t g a a g a t a t a t c a t a t a t t t a g t g t t t4 7 9 q u e r y ：5 2 4c g t t a t c t a a t a a c a t t a t g t g c t g c t g c a g5 5 4 j l j | l s b j e t ：4 8 0 一g t t a t c t a a t a a c a t t a t g t g c t g c t g c a g5 0 9 4 制各a r s 随机突变体库 以p c r 产物a r s 为模板，进行p c r 法制备随机突变体库，以突 变p c r 反应体系进行突变p c r ，得到不同m g c l 2 浓度下与模板大小 一致但序列随机突变的p c r 产物片段( 图5 ) 。 壅量丝壁堡垒墅堡型丝塑皇垫堕曼塞 一一j 鱼曼一 5 0 0 b p mab cd 图5 ：不同m g c l 2 浓度下突变后a r s m ：d l 2 0 0 0m a r k e r a ：m g c l 2 ：1 2 0 m m o l 1 ( a r s “) b ：m g c l 2 ：7 0 m m o l 1 ( a r s ) c ：m g c l 2 ：9 5 m m o l l( a r s 3 ) d ：m g c l 2 ：4 0 m m o l 1 ( a r s 4 ) 5 限制性内切酶双切及回收 上述各产物经割胶回收后，与p h k b 3 7 0 分别进行p s ti 和x b a l i 双酶切( 图6 ) 。 ma bc dam 5 0 0 b p o 图6 - 1 ：突变产物双切( p s ti x b a li ) m ：d l 2 0 0 0m a r k e r a ：a r s b ：a r s c ：a r s “ d ：a r s 9 5 一4 3 6 1 b p 图6 - 2 ：载体( p s t i x b a l l ) m ：h i n di i im a r k e r a tp h k b 3 7 0 1 8 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 结果 上述各酶切产物进行割胶回收片段，p h k b 3 7 0 回收大片段。胶 回收后( 图7 ) 。( 其中a r s 7 酶切后未胶回收到目的片段，可能突变 后的浓度过低所致) 。 mabcdm a 5 0 0 b p + 图7 1 片段胶回收后 m ：d l 2 0 0 0m a r k e r a ：a r s “ b ：a r s 9 5 c ：a r s 。 d ：a r s 4 3 6 1 b p 图7 - 2 载体胶回收后 m ：h i n di i im a r k e r a ：载体回收后 6 重组质粒的酶切鉴定 用x b a li 单酶切鉴定a r s 4 ，a r s 9 ，a r s l 2 分别与p h k b 3 7 0 连 接重组后转入e c o l id h 5 a 后的转化子。分别标记：i ，i i ，i i i 组。 随机挑取三组重组质粒，共1 3 个转化子，琼脂糖凝胶电泳( 图8 ) 。 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 结果 abcdme f ghij 图8 ：x b a l i 单酶切重组质粒 a 和下排d ：p 3 7 0 载体对照 m ：h i n di i im a r k e r 上排b j ：l 一9 号转化子 下排e h ：l o 一1 3 号转化子 结果插入率高于8 0 以上，证明重组成功。可以进行下一步的 酵母转化。 7 收集三组所有转化子，抽提质粒，用乙醇浓缩沉淀 用质粒大量抽提试剂盒，严格说明书操作。得到质粒再用无水乙 醇沉淀一2 0 。c 过夜，以得到较高的质粒浓度。并与p h k b 3 6 8 做浓度 对照，以得到较一致浓度( 图9 ) 。 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究结果 图7 ：进行半定量浓度鉴定 m ：h i n di i im a r k e r ( 2 u l 上样量) a ：p h k b 3 7 0 ( 2 u l 上样量) b ：p h k b 3 6 8 ( 2 u l 上样量) c ：第3 组重组质粒( 2 u l 上样量) d ：第2 组重组质粒( 2 u l 上样量) e ：第1 组重组质粒( 2 u l 上样量) 严格控制各样品的上样量，根据h i n di i im a r k e r 条带半定量显 示，2 3 1 3 0 b p 处条带约为5 0 0 n g 2 u l ，因重组质粒和对照质粒匀远远 亮于m a r k e r 的2 3 1 3 0 b p 条带，目测估计各质粒浓度约l u g 2 u l 。 8 酵母转化效率比较 将三组重组质粒与对照质粒同时转入克鲁维酵母感受态细胞中， s d ( g l u ) 选择培养基，3 0 。c 培养2 3 d 后，计数每块转化平板上的 转化子数目。结果表明，只有第1 组( a r s 4 ) 和第1 i i 组( a r s l 2 ) 转入酵母后比对照组明显转化率高( 图1 0 ) 。 塞苎丝壁堡垒墨! 壁型竺塑兰堡墼翌塑型整一 图1 0 1 第1 组结果 图1 0 - 2 第1 i i 组结果 图1 0 3p 3 6 8 对照组结果图1 0 一4第1 i 组结果 同时我们发现第1 i i 组转化子生长速率较快( 在相同的培养天数 内，转化子菌落较大) 。结果见表1 。 表1 转化克鲁维酵母的单菌落个数 9 较强a r s 核酸序列测定及同源性比对 塞! 丝壁堡垒璺! 壁型竺塑皇兰丝翌壅 竺墨一 在转化率明显高于对照组的第1 组和第i 组转化子中，随机挑 取各1 4 管单克隆抽提酵母质粒后，分别转入e c o l id h 5 a 中。得到 a 1 _ a 5 和c 1 c 5 共十个转化子。挑取单菌落进行d n a 测序，与 a r s 序列对比，得到以下突变类型序列。见表2 。 表2 - 1 m g c l 2 浓度为4 0m m o l l 条件下得到的突变类型 序列 垄垒堕圭塑壅壅篁兰墨鲞型 名称突变位置 突变类型 序列 垄垒墨! 圭堕窭窭垡墨墨耋型 名称突变位置突变类型 表2 - 2m g c l 2 浓度为1 2 0m m o l 1 条件下得到的突变类型 塞苎些壁墨垒璺! 生型竺塑兰垫丝堑塞 一j 堕墨一 1 丽_ 函丽面硬丽语历甄1 两磊丽j 砸萄蘧砸匿： 名称突变位置 突变类型 名称 突变位置 突变类型 c 11 4g 。c c 21 4 g _ c 2 4 t 一a2 4 t a 3 6 3a c 2 9 1 a - g 3 6 4 t + a3 6 3a _ c 3 6 5c _ t 3 6 4t _ a 3 6 6t c 3 6 5c _ t 4 5 7 a _ g 3 6 6t _ c 4 5 9 a + g 4 7 4 g _ 缺失 4 7 4g 。c 4 5 7 a - - 4 g 4 7 5c _ t 4 5 9 a g 4 7 6 t 一a 4 9 9a 缺失 5 2 4c _ 缺失 5 3 4t 一a c 31 4 g 。c c 4 9 0t _ 缺失 2 4t _ a3 6 3a _ c 2 9 1 a g 3 6 4t _ a 3 6 3 a 。c3 6 5c t 3 6 4t - a3 6 6t _ c 3 6 5c _ t 4 5 7 a - 窟 3 6 6 t c4 5 9 a 。g 4 7 4g 一缺失4 7 4 g 一缺失 4 5 6a _ g 4 5 8a _ g 2 9 9 t g c 53 0 0 t g 3 6 3a _ c 3 6 4t 。a 3 6 5c _ t 3 6 6t _ c 4 0 8 t 。g 4 5 0a 。g 4 5 6a 4g 4 5 8 a _ g 4 7 4 g - 缺失 从上述1 0 个序列中可以看出在两种浓度下的突变主要发生 在原a r s 的以下几个位点中： 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 结果 ( 1 ) 1 0 个序列的3 6 3 - - 3 6 6 都发生了由a t c t c a t c 的突变； ( 2 ) 有8 个序列的4 5 7 ，4 5 9 ，4 7 4 分别发生由a _ g ，”g ， 旷缺失的突变； ( 3 ) 有5 个序列的1 4 ，2 4 上发生了由g c ，t a 的突变 1 0 得到的新载体再转化酵母，验证转化效率 为了验证构建的新载体是否能有效提高对克鲁维酵母的转化效 率，我们按照方法1 4 ，把得到的新a r s 序列再转化酵母菌，仍以 p h k b 3 6 8 为对照，比较突变后的a r s 序列对转化效率的影响，各 转化结果如图1 1 。 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 结果 a 1 a 5 图1 1 1 a 4 c 1 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究结果 c 2 p h k b 3 6 8 对照 图1 1 2 c 3 c 5 阴性对照 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究结果 a 14 2 l o 。 a 2 3 8 1 0 2 a 3 无菌落 a 46 小 a 5 无菌落 c 1 9 6 x 1 0 。 c 27 1 1 0 2 c 37 o 1 0 。 c 44 0 x 1 0 。 c 55 4 1 0 2 p h k b 3 6 8 3 0 1 0 2 结果表明，新构建的载体中a 1 ，a 2 ，c 4 和c 5 均比原载体 p h k b 3 6 8 对克鲁维酵母的转化效率有明显的提高，其中c 1 ，c 2 和 c 3 的转化效率有大幅度的提高，转化效率提高了2 3 倍以上。 利用所构建的两个a r s 随机突变体库，成功筛选得到强转化效 率的新a r s 序列：a 1 ，a 2 ，c 1 ，c 2 ，c 3 ，c 4 和c 5 共七个序列。 序列比对如下： 塞! 丝壁堡垒墅壁型苎塑皇兰丝! 壅 竺墨 a 1 ： a 2 ：c c l ： c c 2 ：c c 3 ：c c 4 ： c 5 ： c + 表示发生了碱基突变；一表示单个碱基的丢失 原a r s 序列： t c l 、a g a a c l l a g t g g a t c t t c t a r r a a a a a r r a t a g a t a a t c l a a a a c a a a c t t c t g l i a c a t a r t v 丌1 a t c a c a r r 汀a c a a a c a t c a t c c c a a c c l l a a t a a a a c a c a l a t r g r r n 强a 1 1 a a c t 从a c t a l a r 兀a g g a t c r 几1 t c 丁a a 弘a a 耵a t a c a a g t l v i r n g 1 1 a g g a a c a t t a g g a t a c c a a a l v i c t g a a g g c a a a t a t n a a a 丌a a a a t c a c a a a c c 盯g t l a c t c a t a t i ：a t c t a g c a g a n 1 a c t g g a a a g 仉t t c c a g a 了口1 1 a a t t t t a a a c c t g a a r 丌1 c c a t t t t a a c t g c a a a a r n a a c t a r 兀v r c l l a t t c t a t a c a t a a a t g a a a g t t t a a a t t c r n r c a t c a a a a a g c t c l v r c a l l a t c a t a a 置a r r i a a t a a a a t t t t c j 蛆1 a a t c t g a a t a a t 久a g c a t a a g t a c a 赋1 1 t a a a m a t c t g a a a g n n h t t a t c t a a t t g c t a a a c a c a t r n l l a a r 兀a a a a t g a a ga ，r a t a t c a m 钔a r r n 广a o t b t t t c g t 丑气t c t a a t a a c a t t a t g t g c t g c t g c a g ， 豫怕 似驰 m 。+m。 鸵 a +挣+m。姒蝴o+帅o。 mh g 。 s 媪 一 一一 一 一n g g g g g g g g g g g g a 主 眦眦 眦 差| 眦 g g 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 讨论 讨论 自然界中生命遗传物质的存在方式不同，却都有将遗传信息精确 传递给后代的能力。其d n a 复制起始的活化被限制在细胞周期s 期的 一个时段内嘲。d n a 复制起点也可以指顺式调控序列( c i s a c t i n g s e q u e n c e ) ，如复制子或复制原点。在酵母中，复制子被定义为能高 效转化酵母并能在细胞内自主复制的一段d n a 序列，独立于宿主染色 体而存在 8 , 1 q 。这样的d n a 片段也称为自主性复制序列( a u t o n o m o u s l y r e p l i c a t i n gs e q u e n c e ，a r s ) 。 a r s 由一个核心序列( a 区) 和几个辅助序列( b 区) 组成。沿 着整个区域的系统突变分析，1 7 b p “中心”区域的突变都可降低或消除 原点功能，这个区域称为a l 又( d o m a i n ) ，包括由a - t 组成的1l b p 保守 序列( 5 。( a f t ) 1 广r a ( t c ) ( a g ) r r t ( a f t ) 3 ) 。其保守 序列是酵母的a r s 的一致序列( a r sc o n s e n s u ss e q u e n c e ，a c s ) 。 a c s 作为a r s 组分中唯一较高保守性的d n a 序列，反映了它在功能上 的重要性，任何突变都可降低或消除a r s 活性。对d n a 复制是必需 的但非充分的，对点突变十分敏感。其侧翼序列不保守，但对a r s 活性却非常重要p 11 1 。 在a c s 的3 链t 富集区通常有b 区。三个相邻元件命名为b 1 b 3 ， 内有易解链元件( d n au n w i n d i n ge l e m e n td u e ) ，结构复杂，内含 多个a c s 同源序列。有人认为它不是必需的，但对a r s 功能有重要 调节作用【1 2 1 。只要a 区存在，任意两个b 元件都可以使原点具有功能。 克鲁维酵母a r $ 序列结构与功能研究 此外，在a r s 的5 端通常还有c 区，但其功能尚不清楚。缺失 分析结果显示，保持a r s 活性的最小必需序列应包括完整的a 区及b 区。b 区和c 区可以提高a 区的效率。 本实验通过制造a r s 的随机突变，建立随机突变体库增加了筛 选较强a r s 的机率。进而利用质粒测定法，通过d n a 重组，将可 能含有新的a r s 的d n a 片段构建入事先切去了3 0k bs a li 插入片 断的p h k b 3 7 0 质粒中，然后转化细胞，比较其对细胞的转化效率， 从功能上鉴定复制起始子的活性。通过测序得到新的a r s 片段并进 行序列同源性比对，得到了七个较强转化效率的新a r s 序列。分析 突变发生的位置显示：( 1 ) 镁离子浓度为4 m m o l 1 时较易发生1 0 6 ， 4 2 3 位置上a g 的突变。( 2 ) 镁离子浓度为1 2 m m o l 1 时则较易发生 1 4 位置上g c ；2 4 位置上t a ；4 5 7 ，4 5 9 位置上a g 的突变。( 3 ) 两种浓度下都发生了3 6 3 3 6 9 位置上a t c t - - c a t c 的突变。以上类型 的突变都没有发生在a r s 的中心区域，因此都不会破坏a r s 的功 能。而这些突变a r s 的转化效率都有所增加，但提高的幅度有所不 同，表明发生突变的这些位置可能为中心区域的辅助序列，可以帮 助提高中心区的效率。本研究从d n a 复制的基础理论上首次进行了 a r s 的结构与功能分析研究，并成功应用于构建新型高效的克鲁维 酵母表达载体中。为进步研究真核d n a 复制与转录机制及构建克 鲁维酵母基因工程高表达系统都具有重要的意义。 克鲁雏酵母a r $ 序列结构与功能研究 讨论 小结 本文以酵母a r s 序列为研究对象，利用突变p c r 技术建立适 合于筛选较强a r s 活性的基因文库，对筛选出的a r s 序列进行测 序及同源性比对，结果表明： 1 本实验首次成功构建了适用于筛选克鲁维酵母a r s 序列的 随机突变体库； 2 首次利用突变p c r 方法成功筛选出具有较强转化效率的克 鲁维酵母新a r s 序列； 3 首次研究了克鲁维酵母a r s 序列结构与功能的关系； 4 首次成功构建了克鲁维酵母的新型高效转化载体。 克鲁维酵母a r s 序列结构与功能研究 参考文献 参考文献 【1 】s t r u l lk ，s t i n c h o o m bdt ，s c h e r e r se ta 1 h i g h - f r e q